Machine learning-ondersteunde Raman Spectrale Analyse van Serotonine-responsieve ssDNA-SWCNT Nanosensor voor Verbeterde Selectiviteit tegen Dopamine

Summary

Het protocol beschrijft de Raman-spectrale analyse van de ssDNA-omhulde SWCNT-nanosensor, waardoor de verbeterde selectieve meting van serotonine tegen dopamine mogelijk is met behulp van een machine learning-model.

Abstract

Serotonine (5-hydroxytryptamine, 5-HT) speelt een cruciale rol bij neuromodulatie, maar huidige detectiemethoden hebben moeite om realtime detectie van 5-HT met hoge gevoeligheid en selectiviteit te bieden. We hebben eerder een nabij-infrarood serotonine-nanosensor (nIRHT) ontwikkeld, die bestaat uit een ssDNA-omhulde, enkelwandige koolstofnanobuis die 5-HT gevoelig detecteert. De fluorescentierespons van nIRHT kan echter geen onderscheid maken tussen 5HT en dopamine (DA), waardoor de praktische toepassingen beperkt worden. In deze studie overwint Raman-spectroscopie gecombineerd met machine learning deze selectiviteitsuitdaging. G-band spectrale kenmerken toonden duidelijke signaturen voor 5HT versus DA-binding aan nIRHT, waarbij DA zorgt voor een grotere G-band onderdrukking. We gebruikten differentiële Raman (ΔRaman) om analyte-specifieke spectrale veranderingen te isoleren en trainden drie machine learning-modellen voor classificatie. Het random forest-model met ΔRaman behaalde optimale prestaties met 95,8% nauwkeurigheid, waarmee het modellen met ruwe Raman-spectra aanzienlijk overtrof. Deze benadering toonde verbeterde specificiteit, met verwaarloosbare reacties op acetylcholine, GABA en glutamaat, en bereikte een detectielimiet van 0,1 μM geschikt voor fysiologische toepassingen. Deze op Raman gebaseerde benadering transformeert de niet-selectieve nIRHT-fluorescentiesensor in een platform dat robuuste neurotransmitterdiscriminatie kan uitvoeren, waarmee selectiviteitsproblemen worden overwonnen in enkelwandige koolstofnanobuis (SWCNT)-gebaseerde moleculaire detectie.

Introduction

Serotonine (5-hydroxytryptamine, 5-HT) is een cruciale neurotransmitter die stemming, cognitie, slaap en eetlust reguleert, waarbij disfunctie betrokken is bij depressie, angst en andere neuropsychiatrische stoornissen¹. Realtime monitoring van serotoninedynamiek in biologische systemen blijft uitdagend vanwege de milliseconde tijdschaal van synaptische transmissie en de complexe chemische omgeving van neuraal weefsel². Ondanks aanzienlijke vooruitgang in technologieën voor het detecteren van neurotransmitters blijft het bereiken van zowel hoge gevoeligheid als moleculaire selectiviteit voor serotonine aanzienlijke analytische uitdagingen met zich meebrengen.

Huidige serotoninedetectiemethoden variëren van traditionele analytische technieken tot opkomende nanosensorplatforms. High-performance vloeistofchromatografie met elektrochemische detectie (HPLC-ED) blijft de gouden standaard en bereikt detectielimieten van 0,056 nM met uitstekende reproduceerbaarheid³. HPLC vereist echter uitgebreide monstervoorbereiding en analysetijden van 15-30 minuten, waardoor realtime monitoring^ongeschikt is. Fast-scan cyclische voltammetrie (FSCV) maakt subseconde-temporele resolutie mogelijk bij koolstofvezelmicro-elektroden, maar lijdt aan elektrodevervuiling en beperkte selectiviteit tussen structureel vergelijkbare neurotransmitters ^5,6. Recente ontwikkelingen in genetisch gecodeerde fluorescerende sensoren, waaronder iSeroSnFR⁷ en GRAB-5HT⁸, bereiken opmerkelijke gevoeligheid en dynamisch bereik, maar vereisen genetische modificatie van doelweefsels, waardoor de klinische translatie wordt beperkt.

Enkelwandige koolstofnanobuis (SWCNT) optische sensoren zijn naar voren gekomen als veelbelovende platforms voor labelvrije neurotransmitterdetectie⁹. DNA-gefunctionaliseerde SWCNT's vertonen nabij-infrarood (nIR) fluorescentiemodulatie bij analytebinding, waardoor detectie mogelijk is in het weefseltransparante venster (900-1400 nm)^10,11. Landry's groep ontwikkelde de nIRHT-sensor door systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking (SELEC), waarbij ~10^{à 10} unieke ssDNA-sequenties werden gescreend om serotonine-responsieve constructen^te identificeren. Deze sensor bereikt micromolaire gevoeligheid met 200% fluorescentieverbetering bij serotoninebinding, en werkt onafhankelijk van dopamine- of serotonineoxidatie. Om oxidatieve interferentie uit te sluiten, bevestigde onze vorige studie de stabiliteit van deze neurotransmitteroplossingen; UV-Vis- en NMR-analyses toonden geen oxidatieve veranderingen of nieuwe piekvormen aan vergeleken met puur 5HT¹². Bovendien zijn de korte incubatietijd en neutrale pH-omstandigheden in het systeem ontworpen om significante chinonvorming te voorkomen. Evenzo was de Strano-groep pionier in coronafase moleculaire herkenning (CoPhMoRe), waarbij werd aangetoond dat (GT)₁₅-omhulde SWCNT's dopamine detecteren bij concentraties¹¹ nM. Onze groep heeft dit vakgebied onlangs verder ontwikkeld door middel van machine learning-geleide optimalisatie, waarbij we een 2,5-voudige gevoeligheidsverbetering hebben behaald met high-throughput screening van systematisch gemuteerde sequenties¹⁴.

Ondanks deze vooruitgang blijft er een fundamentele beperking bestaan in de onvoldoende selectiviteit tussen serotonine en dopamine. Beide neurotransmitters bevatten aromatische ringen en ethylamineketens, die slechts één hydroxylgroep¹⁵ van één verschil maken. Huidige fluorescentie-gebaseerde SWCNT-sensoren bereiken doorgaans selectiviteitsverhoudingen onder de 5:1, onvoldoende om co-vrijgegeven neurotransmitters in synaptische omgevingen te onderscheiden¹⁶. Deze selectiviteitsuitdaging is bijzonder belangrijk omdat serotonine en dopamine vaak samenvallen in hersengebieden die beloning en motivatie regelen¹⁷.

Ramanspectroscopie biedt aanvullende chemische informatie via vibratiemodusanalyse van het SWCNT-analytecomplex¹⁸. De G-band (~1580 cm⁻¹) van SWCNT's splitst zich op in G⁺- en G⁻-componenten, met frequenties die gevoelig zijn voor moleculaire adsorptie en elektronische doping¹⁹. Een eerdere studie toonde aan dat niet-covalente oppervlakteactieve stoffen op SWCNT duidelijke Raman-spectrale veranderingen in het G-band gebied²⁰ induceren.

In dit werk demonstreren we machine learning-ondersteunde Raman-spectrale analyse van de nIRHT-sensor om een verbeterde selectiviteit tussen serotonine en dopamine te bereiken. We karakteriseerden systematisch concentratieafhankelijke Raman-responsen van 0,01 tot 100 μM, waarbij we verschillende spectrale vingerafdrukken voor elke neurotransmitter onthulden. Drie machine learning-modellen—convolutioneel neuraal netwerk (CNN), support vector machine (SVM) en random forest (RF)—werden getraind op spectrale datasets om de identiteit van analyten te classificeren. Cruciaal is dat we differentiële Raman-verwerking introduceren, waarbij basissignalen worden verwijderd om analyte-specifieke kenmerken te isoleren. Het geoptimaliseerde RF-model met DR-verwerking bereikt 95,8% classificatienauwkeurigheid, wat een aanzienlijke vooruitgang in moleculaire discriminatie vertegenwoordigt. Deze multimodale benadering, die nIR-fluorescentiegevoeligheid combineert met Raman-chemische specificiteit, biedt een route naar realtime, selectieve serotoninemonitoring in complexe biologische omgevingen.

Protocol

1. ssDNA-gefunctionaliseerde SWCNT nIRHT nanosensor fabricage

1. Combineer 1 mg enkelwandige koolstofnanobuisjes (SWCNT's), 100 μL van 1 mM E6#9 ssDNA en 900 μL 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een buis van 1,5 mL.
   VOORZICHTIG: Droog SWCNT-poeder vormt een potentieel inademingsgevaar. Behandel het poeder in een gecertificeerde chemische dampkap en draag passende persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder een mondkapje en handschoenen.
2. Dispergeer het mengsel 5 minuten met een badsonicator. Sonicaer het mengsel met een tip-sonicator uitgerust met een 3 mm sonde op 50% amplitude gedurende 30 minuten in een ijsbad.
3. Centrifugeer de sonicatieoplossing op 21.500 x g gedurende 1 uur om niet-dispergeerde SWCNT's neer te slaan. Verzamel voorzichtig 850 μL van het supernatant en breng het over in een nieuwe buis.
4. Meet de absorptie van de verzamelde SWCNT-suspensie bij een golflengte van 632 nm. Bereken de concentratie met behulp van de SWCNT-extinctiecoëfficiënt van 0,036 (mg/L)⁻¹ cm⁻¹. Bewaar de uiteindelijke nIRHT-sensoroplossing bij 4 °C tot verder gebruik.

2. Raman-spectrameting

1. Laad 90 μL van de 10 mg/L nIRHT-dispersie in een 96-well-plaat. Meet het Raman-spectrum van de sensor in een PBS-buffer met behulp van een 532 nm laserexcitatiebron. Stel dit opgenomen spectrum als basislijn in.
   VOORZICHTIG: Het is cruciaal om het laservermogen strikt op 10 mW en de golflengte op 532nm te houden bij het onderzoeken van levende biologische monsters. Hogere laservermogens kunnen ernstige fototoxiciteit veroorzaken en de levensvatbaarheid van cellen aantasten. De 532 nm laser bij 10 mW die in dit protocol wordt gebruikt, is goed gevestigd als veilig en niet-destructief voor levende-cel analyse, waarbij gevoelige organellen²¹ en de elektrofysiologische activiteit van primaire neuronen²² behouden blijven, terwijl robuuste Raman-signaalacquisitie wordt gegarandeerd.
2. Spike elke 90 μL sensoroplossing (10 mg/L) met 10 μL van de analyteoplossing om de uiteindelijke concentraties van 0,01, 0,1, 1, 5, 10, 50 en 100 μM te bereiken. Wacht 5 minuten na de toevoeging van de analyte om voldoende incubatie mogelijk te maken.
3. Meet de Raman-spectra van de geïncubeerde monsters. Bereid monsters voor in drievoud voor elke concentratie en herhaal stappen 2.1 tot 2.2 om reproduceerbaarheid te waarborgen.

3. Op machine learning gebaseerde data-analyse

1. Stel de dataset samen uit in totaal 208 Ramanspectra, bestaande uit 77 dopamine (DA) reacties, 76 serotonine (5HT) responsen en 47 controlegroepen (PBS) reacties.
2. Voer achtergrondsubtractie uit op het G-bandgebied van de spectrale data. Normaliseer de achtergrond-afgetrokken data op basis van de G+-band piek.
3. Pas een mediaanfilter toe om ruis in de genormaliseerde spectra te verminderen. Isoleer spectrale veranderingen (ΔRaman) door het genormaliseerde controlespectrum af te trekken van elk met analyten behandeld spectrum.
4. Ontwikkel een Convolutioneel Neuraal Netwerk (CNN), een Random Forest (RF) en een Support Vector Machine (SVM) model voor de ternaire classificatie van 5HT, DA of de controle.
5. Splits de hele dataset op in trainings-, validatie- en testsets met een verhouding van 6:2:2.
6. Configureer de CNN-architectuur met drie 1D-convolutielagen die gebruikmaken van een ReLU-activatiefunctie en een maximale poolinggrootte van 2, gevolgd door twee volledig verbonden lagen.
7. Configureer de SVM met behulp van een Radial Basis Function (RBF) kernel voor niet-lineaire classificatie.
8. Configureer het RF-model met behulp van standaard hyperparameters.
9. Train de geconstrueerde modellen met 5-voudige kruisvalidatie. Bereken de gemiddelde prestatie-indicatoren over alle 5 niveaus om statistische robuustheid te waarborgen.
10. Kies het model dat de hoogste nauwkeurigheid op de validatiegegevens oplevert voor de eindanalyse.
11. Evalueer het geselecteerde model op de testset om de generalisatiecapaciteit te verifiëren.
12. Bepaal de indirecte detectielimiet (LOD) door sequentieel gegevens uit de trainingsset uit te sluiten die onder een concentratiedrempel van 0,1 μM liggen.
13. Test het getrainde model op het volledige concentratiebereik, inclusief concentraties onder de criteria, om de uiteindelijke LOD vast te stellen.

Results

De E6#9 ssDNA-gefunctionaliseerde SWCNT-nanosensor (nIRHT), eerder ontwikkeld via de SELEC-methodologie, toont reversibele nIR-fluorescentieverbetering bij 5HT-binding, waardoor realtime 5HT-beeldvorming in vitro en ex vivo¹² mogelijk is. De E6#9-sequentie (5'-CCCCCCAGCACCAGCACACACTCCCCCC-3') wikkelt zich om SWCNT's om bindingsplaatsen voor 5HT te creëren. Deze sensor mist echter specificiteit: zowel 5-HT als DA resulteren in een vergelijkbare in...

Discussion

Raman-spectroscopische analyse leverde een significante verbetering op in de specificiteit van de nIRHT-sensor, een vermogen dat niet mogelijk was met zijn conventionele fluorescentierespons. We observeerden dat DA een meer uitgesproken onderdrukking van de G⁻-band (1570 ^cm-1) induceerde vergeleken met 5HT. Deze differentiële signaturen ontstaan waarschijnlijk door variërende moleculaire oriëntaties en bindingsgeometrieën op het SWCNT-oppervlak. Specifiek vormt de catecholmoie...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HiPCo raw	Nanointegris
iDus1.7 InGaAs	ANDOR	DU490A-1,9
Ramantouch	Nano Photon
Vibra Cell 130	SONICS