Methodenartikel

Multianimal Magnetic Resonance Imaging voor tumormetingen in alvleesklierkanker muismodellen

1.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69927

⸱

3 februari 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Precision Health Program, Michigan State University, 2Department of Radiology, College of Human Medicine, Michigan State University, 3Veterinary Diagnostic Laboratory, College of Veterinary Medicine, Michigan State University, 4Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Biomedical Imaging, Advanced Molecular Imaging Facility, Michigan State University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol gebruikt een meerkamerbed voor parallelle magnetische resonantiebeeldvorming (MRI) van maximaal vier dieren om pancreasadenocarcinoomtumoren te detecteren in genetisch gemodificeerde muismodellen. Dit multianimal MRI-protocol is snel en kosteneffectief voor het opsporen en meten van tumoren, wat de dierselectie voor preklinische studies en longitudinale monitoring van tumorgroei vergemakkelijkt.

Samenvatting

Geavanceerde in vivo beeldvormingsmethoden, zoals magnetische resonantiebeeldvorming (MRI), zijn essentiële onderzoeksinstrumenten om tumoren effectief op te sporen in preklinische muismodellen. MRI geeft gedetailleerde anatomische informatie over de locatie en grootte van de tumor. Deze beeldvormingsmethode is echter duur en tijdrovend. Om deze toegangsbarrière te overwinnen zonder de beeldkwaliteit in gevaar te brengen, werd een multianimal MRI-protocol ingevoerd. Dit protocol gebruikt een vierkamer-inzetstuk om in één enkele acquisitiesessie hoogresolutie multianimal anatomische MRI-scans te verkrijgen. Het tegelijkertijd visualiseren van meerdere muizen vermindert de tijd en kosten van deze procedure. Dit protocol beschrijft een multianimal MRI-workflow die is ontworpen om de efficiëntie van tumordetectie en longitudinale tumormonitoring te verhogen in een genetisch gemodificeerd Kras-gestuurd, p53-verwijderd (KPC) muismodel van pancreasductaal adenocarcinoom. Dit goed gevestigde, klinisch relevante KPC-model heeft onschatbare inzichten gegeven in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan pancreascarcinogenese, tumorprogressie en therapieresistentie. Als proof-of-concept wordt dit protocol toegepast om het therapeutische voordeel van het standaard chemotherapeutisch middel, gemcitabine, in het KPC-model te valideren. Toekomstige toepassingen van dit MRI-geleide preklinische studieontwerp worden kort besproken om de therapeutische effectiviteit van combinatietherapieën te evalueren.

Inleiding

Pancreasductaal adenocarcinoom (PDAC) blijft een van de dodelijkste maligniteiten. Ondanks bescheiden verbeteringen in overleving in de afgelopen jaren is de 5-jaarsoverlevingskans nog steeds slechts 13%. In de meeste gevallen wordt PDAC in een gevorderd stadium vastgesteld, vaak met lokale invasie of verre metastase, wat de behandeling bemoeilijkt. De ziekte is biologisch divers en wordt gekenmerkt door zeer invasieve tumorcellen, een dichte desmoplastische stroma en slechte vascularisatie 2,3,4. Deze complexe tumormicro-omgeving blijft pogingen belemmeren om de cellulaire en niet-cellulaire componenten die de ziekteprogressie beïnvloeden volledig te karakteriseren. Om dit aan te pakken, zijn effectieve preklinische modellen nodig die de progressie van menselijke ziekten en desmoplasie nauwgezet nabootsen.

Verschillende muismodellen kunnen worden gebruikt om de biologie van kankerprogressie te bestuderen en de werkzaamheid van nieuwe therapieën te evalueren 5,6. Het door KRas aangedreven genetisch gemodificeerde muismodel (GEMM) ontwikkelt spontaan alvleeskliertumoren die veel pathofysiologische en moleculaire kenmerken van menselijke PDAC 3,7,8,9,10,11 recapituleren In het bijzonder het door Kras aangestuurde, p53-verwijderde KPC-model (LSL-KrasG12D; p53lox/+; Pdx1-Cre) is een goed gekarakteriseerde PDAC GEMM 7,8,9. Tumorbeeldvorming is een belangrijk onderdeel van preklinische studies. Tumordetectie en meting van tumorgrootte maken het mogelijk om dieren te selecteren voor preklinische studies, longitudinale monitoring van tumorgroei en ziekteprogressie, en beoordeling van de behandelingsrespons mogelijk.

Geavanceerde in vivo beeldvormingsmodaliteiten zoals echografie (US), bioluminescentie (BLI), computertomografie (CT), fluorescentiebeeldvorming (FLI), positronemissietomografie (PET) en magnetische resonantiebeeldvorming (MRI) kunnen worden gebruikt voor tumorbeeldvorming in het KPC-model en vergelijkbare PDAC-modellen 12,13,14,15,16. Toch kan tumorbeeldvorming in het KPC-model uitdagend zijn, en elk van deze beeldvormingsmethoden biedt unieke sterke en beperkte punten. Optische beeldvormingstechnologieën, zoals bioluminescentie (BLI) en ultrasone beeldvorming (VS), zijn niet-invasief en kosteneffectief. Hun beperkte ruimtelijke resolutie, vooral voor inwendige organen, kan echter leiden tot een slechte correlatie met tumorvolume12, 15, 17, 18. Bioluminescentie vereist genetisch gemodificeerde cellen die luciferase-signalen uitdrukken, wat ook afhankelijk is van substraatafgifte, bloedstroom en zuurstoftoediening van het weefsel. Een computertomograaf biedt snelle beeldvorming met minimale bewegingsartefacten, maar slechte zachte weefselcontrasten zonder contrastmiddelen. Jodeerde contrastmiddelen kunnen toxiciteit veroorzaken bij muizen. Fluorescentiebeeldvorming vereist contrastmiddelen/fluorescentieprobes, en autofluorescentie van buikorganen vermindert de gevoeligheid.

Vanwege de beperkingen die gepaard gaan met andere beeldvormingsmethoden, wordt magnetische resonantiebeeldvorming (MRI) algemeen beschouwd als de meest betrouwbare techniek voor het beoordelen van diepgewortelde tumoren, met superieure zachte weefselcontrast en moleculaire gevoeligheid voor interne anatomische structuren 13,14,15,19. Standaard preklinische MRI-protocollen brengen echter hoge operationele kosten en lange verwervingstijden met zich mee, en kunnen voor veel onderzoekslaboratoria een belemmering vormen. Meerdierlijke MRI kan deze toegangsbarrière overwinnen door de voorbereidingstijd voor het dier vóór de scan (anesthesie), de scantijd en het herstel van dieren na de scan te verkorten. Dit protocol toont de technische haalbaarheid van PDAC-tumorbeeldvorming aan (Figuur 1, Figuur 2, Figuur 3 en Figuur 4) en het gebruik van beeldbevindingen om dieren te rekruteren voor chemotherapeutische behandeling met gemcitabine (Figuur 5). PDAC-tumoren vertonen meerdere inherente mechanismen die bijdragen aan resistentie tegen standaardbehandeling (SOC) chemotherapiemiddelen. zoals gemcitabine, gemcitabine/nab-paclitaxel, of FOLFIRINOX 2,3,4. Dit protocol biedt een geschikt en robuust platform om nieuwe therapeutische middelen en SOC-chemotherapie te evalueren om veelbelovende combinatieste vinden die de behandelingsrespons bij patiënten kunnen verbeteren.

Protocol

Alle beschreven experimenten werden uitgevoerd volgens protocollen goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van Michigan State University. Alle procedures met levende dieren voldoen aan de vastgestelde richtlijnen om het welzijn en de humane behandeling van dieren te waarborgen. Dit protocol beschrijft het gebruik en de behandeling van het KPC-muismodel van PDAC: LSL-K-Ras G12D (Krastm4Tyj); p53lox/lox (Trp53tm1Brn); Pdx1-Cre (Pdx1-cre6Tuv)9.

1. Voorbereiding op dieren vooraf

  1. Zorg voor een goede genotyperingsverificatie van KPC-muizen vóór gebruik. Transporteren experimentele muizen van de dierenfaciliteit naar de beeldvormingsfaciliteit.
  2. Verdoof tot vier muizen in een voorverwarmde afgesloten inductiekamer met 1,5-2% isofluraan en 0,8-2 L/min zuurstof. Bevestig de anesthesie door een schadelijke prikkel toe te passen (teenknellen).
  3. Breng oogvocht aan op beide ogen van elke muis om hoornvliesdroog te voorkomen.

2. Meerdierlijke MRI-bed opzetten

  1. Plaats twee verdoofde muizen in een ventrale positie op het onderste deel (links en rechts) van het 3D-geprinte bedinzetstuk, dat is bevestigd aan de standaard enkelvoudige PET/MRI-scanhouder van de leverancier. Zorg ervoor dat de dieren met rechte stekels en ledematen gepositioneerd zijn.
    OPMERKING: Er werd een 3D-printer gebruikt om de bedinzetstukken te printen (Supplemental File 1 en Supplemental File 2).
  2. Verbind de luchtinlaat in het leveranciersbed met de neusconussen met buis (binnendiameter 1/16", buitendiameter 1/8"), en smeerkoppelingen (bijv. 7 x 1/16"-mannelijk, 2 x 1/16" vrouwelijk, 2 vrouwelijk-vrouwelijke connectoren, 2 T-socket-naar-socket connectoren).
  3. Bevestig de muiskop in een neuskegel om de anesthesie te behouden (1,5-2% isofluran, 0,8-2 L/min zuurstof). Bedek de onderkant met de bovenkant van de 3D-geprinte bedinzetstukken (Figuur 2B).
  4. Plaats de andere twee verdoofde muizen in een ventrale positie op het bovenste deel (links en rechts) van het 3D-geprinte bedinzetstuk.
  5. Bevestig de muiskop in een neuskegel om de anesthesie te behouden (1,5-2% isofluran, 0,8-2 L/min zuurstof).
  6. Plak het ademhalingsmonitoringspad op de muis linksboven. Zorg ervoor dat het monitoringspad op buikhoogte zit, niet op de borst, om de ademhaling te meten zonder een signaal van de hartslag.
  7. Stel het isofluraneniveau zo in dat het gedurende de echo een ademhalingsfrequentie van 30-40 bpm handhaaft, meestal 1,5-2%. Als de ademhalingsspoor niet zichtbaar is of de amplitude te laag is, zorg er dan voor dat het pad stevig op zijn plaats wordt gehouden door de tape en dat alle verbindingen in de slang goed zitten.
  8. Bedek het bed om de multianimal MRI-kamer af te maken (Figuur 2B).
    OPMERKING: Het door de leverancier geleverde single-rat PET/MRI-bed is uitgerust met circulerende warme lucht om de lichaamstemperatuur van de dieren (~35-37 °C) te behouden. Tot vier muizen kunnen gelijktijdig worden gescand met 3D-geprinte inzetstukken. De exacte instellingen van de warmwatertemperatuur, evenals de luchtinlaat en luchtafvoer, hangen af van de opstelling op elke locatie, inclusief de afstand van de controlekamer tot de MRI. Deze kunnen op elke locatie worden opgezet met behulp van een reeks pilotscans waarbij de temperatuur gedurende de hele studie wordt gemonitord en vervolgens gestandaardiseerd voor elke studie.

3. Prescan opstelling en beeldvormingskalibratie

  1. Zorg ervoor dat de muizen in het midden van de MRI-spoel in de lengte zitten door de rode laser uit te lijnen met het midden van het meerkamerbed voordat je de bedhouder in de boring stuurt.
  2. Wijs een label toe aan de scan met behulp van de muis-ID en scandatum in het volgende formaat: Spanning, Muis-ID, Scandatum.
  3. Stel een T1-gewogen FLASH-scan op met één axiale slice, twee coronale slices en twee sagittale slices om de muizen in het vierkamerbed te visualiseren en het beeldgebied te definiëren met de volgende instellingen: TR/TE 50/2,4 ms, 2 gemiddelden, flip angle 20°, resolutie 0,313 mm, 1 mm slice dikte, scantijd 13 s.
  4. Controleer of het hele muizenlichaam in het gezichtsveld is en dat de muizen recht staan. Zo niet, herhaal dan de muispositioneringsstappen en/of verplaats het muisbed in of uit de boring.
    OPMERKING: Deze parameters waren gebaseerd op de specificaties van het gebruikte MRI-systeem. Deze parameters kunnen indien nodig worden aangepast om de beeldacquisitie te optimaliseren volgens experimentele eisen en/of de mogelijkheden van het MRI-systeem.

4. Multianimal magnetische resonantiebeeldvorming

  1. Stel de T2-gewogen snelle spin echo-sequentie in met de volgende parameters: Herhalingstijd (TR): 3.200 ms, Echo-tijd: 46 ms, Aantal gemiddelden: 10, In-plane resolutie: 300 x 300 μm, Aantal coronale slices: 14, Intraslice gap: 0,3 - 0,7 mm, Vetonderdrukking: ingeschakeld, Zeldzame factor: 8, slice-pakketten: 2, Totale beeldverwervingstijd: 14 min.
  2. Klik op het midden (translatie) en de rand (rotatie) van de gele en groene vakjes op de localizerafbeelding om de positie van het slice-pakket aan te passen om de dekking van de alvleesklier en andere buikorganen voor de boven- en onderste set dieren te optimaliseren.
  3. Controleer of alle vier de muizen correct zijn uitgelijnd in de multianimal bedopstelling voordat je verder gaat met scannen.
  4. Monitor de ademhaling gedurende de beeldvormingssequenties en pas indien nodig het isofluranniveau aan.
  5. Controleer na de MRI-scan of de beeldkwaliteit voldoende is. Zoek naar bewegingsartefacten, die als vervaging worden weergegeven als een muis tijdens de scan bewoog. Controleer of de buik volledig bedekt is. Indien nodig, verplaats de muizen en doe de scan opnieuw.

5. Muizenherstel

  1. Wanneer de scan is voltooid en gecontroleerd, verwijder je het bed uit het MRI-systeem.
  2. Open de bovenkant van het multikamerbed. Verwijder de ademhalingsmonitor van de linkerbovenste muis en breng de dieren van de boven- en onderkant van de 3D-geprinte inserts naar de herstelkooi.
  3. Plaats dieren in een herstelkooi boven een 37 °C verwarmingskussen voor herstel na de narcose.
  4. Monitor de ademhalingsfrequentie en beweging om volledig herstel van de narcose te waarborgen voordat muizen worden teruggebracht naar thuiskooien. Tekenen van herstel zijn onder andere normale ademhaling en beweging (lopen).

6. Verwerking en analyse van bestanden in magnetische resonantie beeldvorming

  1. Exporteer de DICOM-beelden van MRI-software naar een beeldanalyseprogramma om de beelden van één afbeelding met vier muizen bij te snijden naar één afbeelding per individuele muis.
  2. Open in de software de afbeelding van de bovenste set dieren in de View-module . De automatische venster-/niveau-instellingen zijn voldoende, maar pas indien nodig in het algemene tabblad beeldweergave aan, zodat de muizen zichtbaar zijn. Teken in het VOI-tabblad handmatig een ruim vakje rond de rechterbovenmuis met behulp van een kubus-analytisch object; snijd vervolgens de afbeelding rond dat vakje bij het tabblad Masking and contouring operations . Bij het opslaan van het nieuwe bestand bewerk je de DICOM-metadata en bestandsnaam naar de juiste muis-ID; herhaal dan voor de muis linksboven met dezelfde afbeelding, open de afbeelding voor de onderste set muizen, en herhaal de ROI-bijsnijding en het opslaan.
    OPMERKING: De VOI hoeft niet precies te zijn.
  3. Gebruik MRI-viewersoftware om beelden te analyseren die in DICOM-bestanden zijn opgeslagen.
  4. Analyseer beeldvormende sneden van dorsaal naar ventral of van ventral naar dorsaal. Lokaliseer de milt en maag om een juiste context te creëren voor het identificeren van alvleesklier- en/of alvleeskliertumoren.
  5. Definieer "Regio van Belang" (ROI) door een lijn te trekken op de tumorgrens en voer semi-geautomatiseerde segmentatie uit om het tumorvolume te berekenen. Let op vloeistofcysten en andere hyperchromatische bevindingen (Figuur 3 en Figuur 4).
    OPMERKING: Een MRI-viewer moet worden gebruikt om DICOM-bestanden te analyseren.

7. Gemcitabinebehandeling

  1. Wekelijks MRI-scans van KPC-dieren totdat de tumor begint te vormen en kan worden gedetecteerd (volume van ≥20 mm3). Controleer voordat je scant of muizen in goede gezondheid verkeren (geen overmatig gewichtsverlies of tekenen van stress, ademhalingsproblemen en/of hijgen).
  2. Stel een behandelregime op zodra aan de tumorcriteria is voldaan.
    OPMERKING: Voor de behandelde groep werd gemcitabine intraperitoneaal (i.p.) geïnjecteerd in een dosis van 100 mg/kg twee keer per week.
    VOORZICHTIG: Gemcitabine is een cytotoxisch chemotherapeutisch middel. Behandel met passende persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), waaronder handschoenen en een labjas. Voer besmette spuiten en materialen af volgens de institutionele protocollen voor gevaarlijk afval.
  3. Voer wekelijks MRI-scans uit (na secties 1-6) om de tumorrespons op gemcitabine te monitoren.
  4. Offert dieren wanneer de tumor voldoet aan de criteria voor euthanasie, gebaseerd op volumemetingen uit MRI-analyse (Sectie 6) en/of andere symptomen.
  5. Wanneer je een MRI-scant van behandelde muizen, plaats je een beschermende barrière om de mogelijke overdracht van het chemotherapeutische middel via uitscheidingen te voorkomen. Tijdens en na het werken met gemcitabine volg je goede persoonlijke hygiënepraktijken. Gooi gebruikte lege spuiten weg in een chemotherapie-scherpe verpakking.
  6. Na het voltooien van het werk spuit je alle anesthesieapparatuur, MRI-bedden en alle werkoppervlakken met 70% ethanol. Plaats chemisch besmette beschermbarrières en handschoenen die tijdens de beeldvorming zijn gebruikt in een plastic zak, bind de zak af en plaats deze in een vezelvat voor verbranding.
  7. Plan beeldvormingssessies vóór de volgende behandelronde om blootstelling aan het chemotherapeutisch middel te minimaliseren.
    OPMERKING: Een frequentie van MRI-scans om de week kan worden overwogen, afhankelijk van de tumorgroeisnelheid en het behandelschema. Reacties op behandeling door tumorkinetiek kunnen worden beoordeeld met longitudinale beeldvorming (Figuur 5).

Resultaten

KPC-dieren ontwikkelen alvleeskliertumoren na 12 weken van9-jarige leeftijd. Met behulp van een multikamer-MRI-bed werd tumorscreening van KPC-muizen gestart op 10 weken leeftijd. Dit maakte het mogelijk om dieren te rekruteren die zich presenteerden met tumoren van ongeveer 200 mm3 voor de preklinische studie met de gemcitabinebehandeling. Verschillen in tumorkinetiek en variaties in tumorpresentatie werden waargenomen. De meeste KPC-tumoren vertoonden een solide groeipatroon met één of een overheersende focus (Figuur 4A), wat de rekrutering van dieren voor behandelingen en tumorvolumebeoordeling vergemakkelijkte. Echter, er werden ook dieren waargenomen met meerdere kleine, solide tumoren verspreid over de gehele alvleesklier (Figuur 4A). Sommige PDAC-gevallen kunnen ook intratumorale cystische laesies vertonen, gevuld met vocht, vergezeld van peritumorale niet-neoplastische cystische laesies en vochtretentie als gevolg van ductale blokkades van de galblaas en/of alvleesklier. (Figuur 4A).

Na de werving werden dieren willekeurig ingedeeld in twee experimentele groepen: een controlegroep zonder behandeling en een behandelde groep die intraperitoneale (i.p.) toediening van gemcitabine kreeg in een dosis van 100 mg/kg tweemaal per week. Van het totaal van de 23 in aanmerking komende dieren werden 4 vrouwtjes en 7 mannetjes toegewezen aan de controlegroep, en 6 vrouwtjes en 6 mannetjes aan de behandelde groep. Wekelijkse MRI-scans werden uitgevoerd met het multianimal bedsysteem (Figuur 5A), waarmee we continu de veranderingen in tumorgroeikinetiek in zowel de controlegroep als de behandelde groep konden monitoren (Figuur 5B).

De verwerkte beeldvormingsgegevens tonen aan dat tumoren in het met gemcitabine behandelde KPC-model een langzamer groeipatroon hadden vergeleken met de onbehandelde controlegroep (Figuur 5C), wat geassocieerd was met een statistisch significante (Log rank test, p = 0,04) toename van de algehele overleving van de behandelde cohort (Figuur 5D). De mediane overleving voor onbehandelde KPC was 20 weken, terwijl de behandelde groep een verlenging van de mediane overleving van meer dan 23 weken liet zien (Figuur 5D).

Figuur 1
Figuur 1: Werkwijze van multianimal magnetische resonantiebeeldvorming, beeldverwerking en analyse. Belangrijke stappen van het multianimal MRI-protocol worden benadrukt, van prescanvoorbereiding tot beeldgeleide preklinische studies. Tot 4 dieren worden verdoofd in een inductiekamer (precan-voorbereiding) en klaargemaakt voor plaatsing in een multianimal-bed (multianimal MRI-bedopstelling). Een prescan van de dieren in een 2 x 2 configuratie (2 in het bovenste compartiment, 2 in het onderste compartiment) gevolgd door een magnetische resonantiescan (MR-beeldvorming). De beeldgegevens van elk dier worden opgeslagen als individuele bestanden en onafhankelijk geanalyseerd (beeldanalyse). Beeldfinding en tumorgrootte worden gebruikt om dieren te selecteren voor preklinische studies en om de behandelingsrespons te monitoren (preklinische onderzoeken). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Belangrijke stappen voor multianimal MRI van installatie tot scan. (A) Bovenpaneel, assemblage van het op maat gemaakte multianimal MRI-bedsysteem. Op maat gemaakte 3D-geprinte bedinzetstukken met geïntegreerde anesthesiepoorten passen in een standaard enkelvoudige PET/MRI-bedhouder. Onderste paneel, deze 3D-geprinte inzetstukken delen het bed in twee kamers, waardoor gelijktijdige beeldvorming van maximaal vier dieren mogelijk is: dieren 1 en 2 bovenop de bovenste inzetstuk, en dieren 3 en 4 bovenop de onderste inzetstuk. Het transversale vlak en het frontale aangepaste vlak van de 3D-printerinserts uit de STL-viewer worden getoond. (B) Sequentiële plaatsing van muizen in een multi-kamer MRI-bed (van boven naar beneden). Bovenste afbeelding: twee dieren die in ventrale positie op het onderste deel (links en rechts) van de 3D-geprinte inzetplaat worden geplaatst, die zich in het door de leverancier geleverde PET/MRI-bed bevindt. Middelste afbeelding, de andere twee muizen worden in ventrale positie geplaatst op het bovenste deel (links en rechts) van de 3D-geprinte insert; De muis die aan de linkerkant van de bovenste insert staat, heeft een ademhalingsmonitor bevestigd. Onderste afbeelding: voltooide assemblage van vier dieren met de omslag bovenop. Alle dieren hebben hun hoofden vastgezet in een neuskegel om de anesthesie te behouden (1,5-2% isofluran, 0,8-2 L/min zuurstof). Definitieve indeling van alle vier de dieren in de MRI-bedhouder met anesthesietoediening, warmwaterverwarmer en vitale functies monitoringsysteem om MRI-scans en gegevensverzameling van alle dieren in één sessie mogelijk te maken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3: Dataverzameling en verwerking van multianimal MRI-scans. (A) Representatieve weergave (mediaal vlak) van de initiële MRI-scan van alle vier de dieren. (B) MRI-scan (dorsale vlak) van alle vier muizen in een meerkamerbed: twee muizen onderaan (3, 4) en twee muizen bovenop (1, 2) van de 3D-geprinte inserts. (C) Laatste hoge-resolutie MRI-bestand van elke individuele muisscan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4: Diverse presentaties van PDAC-tumoren: een geïntegreerde MRI- en histologieanalyse. (A) Representatief MRI-beeld (dorsale vlakke) die de anatomische variabiliteit van PDAC-tumoren illustreert (van links naar rechts): normale alvleesklier, multifocale tumoren met vochtgevulde cystische laesies, en een vaste tumormassa. Anatomische organen zijn als volgt kleurgecodeerd: maag (geel), milt (groen), tumor (paars), vochtophoping door verstopping van het kanaal (blauw). Witte schaalbalk = 1 cm. (B) Histologische secties van H&E-gekleurde tumoren naast celklassen op basis van computerondersteunde getrainde classifier-overlays, waarbij de histopathologische kenmerken van de tumoren worden benadrukt die overeenkomen met de MRI-bevindingen. Tumor (T)-gebied zwart omlijnd voor alle monsters wanneer de tumor aanwezig is. Celklassen worden weergegeven in kleur: normaal alvleesklierweefsel (grijs), tumor (rood) en immuuncellen (geel). Zwarte schaal balk = 0,5 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5
Figuur 5: Multianimal MRI-applicatie voor dierrekrutering en tumorgroeimonitoring tijdens gemcitabinebehandeling. (A) Tijdlijn van het experimentele ontwerp: Dieren (14+ weken oud) werden gerekruteerd nadat een MRI-scan een tumor ≥ 200 mm3 had vastgesteld. Muizen uit de behandelde groep kregen gemcitabine (100 mg/kg, i.p., b.i.w.) totdat ze aan de euthanasiecriteria hadden voldaan. Gedurende het hele experiment werden multidierlijke MRI-scans uitgevoerd voor alle dieren om de tumorgroeikinetiek te monitoren. (B) Representatieve MRI-beelden (dorsale vlakke) die de tumorprogressie tonen voor één dier uit het onbehandelde dier en één dier uit de behandelde groep, van dag 0 tot de laatste dag van het experiment (overlevingseindpunt). Witte schaalbalk = 1 cm. (C,D) Grafieken die tumorgroeikinetiek illustreren (C, n = 4 [2 F, 2 M] vs. 4 [2 F, 2 M]) en de algehele overleving (D, n = 11 [4 F, 7 M] vs. 12 [6 F, 6 M]) in de controlegroep die niet behandeld en behandeld is. De statistische significantie voor Kaplan-Meier overlevingscurves werd bepaald door de Log-rank (Mantel-Cox) test (* p < 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Supplemental File 1: STL-bestand voor 3D-printen van de onderste insert met geïntegreerde anesthesiepoorten die past in een standaard enkelrat PET/MRI-bedhouder. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Supplemental File 2: STL-bestand voor 3D-printen van de bovenste insert met geïntegreerde anesthesiepoorten die past in een standaard enkelrat PET/MRI-bedhouder. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Dit protocol maakt gebruik van een standaard PET/MRI-bed van de leverancier, aangepast met op maat gemaakte 3D-geprinte inzetstukken, waarmee tot vier muizen gelijktijdig kunnen worden gescand (Figuur 1). Deze multianimal-configuratie vermindert niet alleen de dure MRI-scantijd aanzienlijk, maar ook de totale duur van de procedure. Het maakt de parallelle voorbereiding mogelijk (anesthesie, positie in bed en het laden van het bed), het scannen en terughalen van vier dieren in één sessie, vergeleken met de extra tijd die nodig is voor het voorbereiden, scannen en terughalen van elk dier afzonderlijk in vier afzonderlijke sessies. De opstelling omvat ook individuele neuskegels voor gecontroleerde anesthesietoediening aan elk dier, speciale vitale monitoring voor één dier, en geïntegreerde verwarmingsmogelijkheden om de lichaamstemperatuur van alle gescande muizen te behouden (Figuur 2). De 3D-geprinte inserts zorgen voor consistente dieruitlijning en verbeteren de consistentie van segmentatie. Realtime ademhalingsmonitoring maakt continue beoordeling en aanpassing van de anesthesie tijdens de scanning mogelijk, waardoor bewegingsartefacten worden geminimaliseerd.

Dit protocol werd gebruikt om de progressie van pancreastumoren te detecteren en longitudinaal te monitoren in het KPC-model (Figuur 5A-C), behandeld met het chemotherapeutisch middel gemcitabine, en diende als een proof-of-concept preklinisch onderzoek. Gemcitabine, alleen of in combinatie, is een eerste- of tweedelijnsbehandeling voor patiënten met lokale of uitgezaaide alvleesklierkanker 28,29,30. Deze resultaten bij met gemcitabine behandelde dieren komen overeen met eerdere rapporten, die ook een overlevingsvoordeel hebben aangetoond31. Belangrijker nog, dit protocol biedt een geschikt en robuust platform om combinatietherapieën van nieuwe therapeutische middelen en SOC-chemotherapie te bestuderen in het KPC-model of vergelijkbare modellen van PDAC. Deze combinatietherapieën kunnen kleine molecuulremmers, immunotherapie, siRNA's, microRNA-activiteitsmodulatoren en andere therapeutische oligonucleotiden zijn tegen belangrijke moleculaire doelen 20,21,22,23,24,25,26,27. Deze combinatietherapieën kunnen ook genetisch gemodificeerde doelwitten bevatten om hun interactie met SOC-chemotherapie of andere therapieën in een vroeg ontwikkelingsstadiumte begrijpen 9,20,32.

Hoewel de focus van dit protocol ligt op de beeldvorming van de alvleesklier en andere buikholtorganen, kunnen dit multidierprotocol en beschreven MRI-sequenties worden toegepast voor anatomische karakterisering van andere muismodellen van kanker, zoals borstkanker en glioblastoom, of andere ziekten met betrekking tot de nier, en/of lever33. We zijn op de hoogte van andere protocollen die multianimal MRI-scanning 18,34 beschrijven. Zo beschreven Dazai et al. neuroanatomische MRI-scans van maximaal zevenmuizen 18. Hoewel deze opstelling hersenbeeldvorming van zeven dieren mogelijk maakt, is het niet mogelijk om individuele controle van anesthetica en temperatuur per muis te doen. Hun behuizing is ontworpen voor muizen die minder dan ongeveer 32 g wegen; Daarentegen ondersteunt ons meerkamerbed een breder scala aan muizenlichaamsgroottes. Afhankelijk van het beoogde orgaan, scantijd en resolutie kan het protocol van Dazai et al. enkele voordelen bieden ten opzichte van het hier beschreven protocol.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten om te melden.

Dankbetuigingen

Dit werk werd deels ondersteund door de National Cancer Institute R01 CA258314 subsidie en de MSU Tetrad Initiative for Interdisciplinary Research subsidie 2024 aan LFS. We zijn dankbaar voor de technische ondersteuning van het MSU Precision Health Program Tissue Analysis Core, het Institute for MSU Quantitative Health Science and Engineering/Precision Health Program Advanced Molecular Imaging Facility, MSU Campus Animal Resources, MSU Veterinary Diagnostic Laboratory en het MSU Quantitative Bio Element Analysis and Mapping (QBEAM) Center.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3D printer StratasysJ750 Voor multi-dier MRI bed inzetstukken
Gemcitabine HClApexBioA1402-500Voor ip injecties 
HOROSHOROShttps://horosproject.org/Voor MRI analyse
IsofluraneCovetrus11695067772Voor muizenanesthesie
Isoflurane vaporizerSOMNI ScientificVS6002Voor muizenanesthesie
Lo-Dose U-100 Insulin SyringesBD14-826-79Voor ip injecties 
luer lock tube couplings, nylon straight plugs, barbed voor 1/16" tube ID x7McMaster51525K521Voor multi-dier MRI bed assemblage
luer lock tube couplings, plug, voor 1/16" bardbed tube ID x2McMaster7466N11Voor multi-dier MRI bed assemblage
male naar male luer connector x2SAIMMLVoor multi-dier MRI bed assemblage
MR-compatibel klein dier monitoring en gating systeemSAIIModel 1030monitor dieren tijdens MRI
MRI bed adapterBrukerT150743leverancier geleverde MRI bed component
MRI coil, 72 mm IDBrukerT20209V3leverancier geleverde MRI coil
Multimodaliteit wieg middelgrote ratBrukerT151629leverancier geleverde MRI bed
oftalmische smering Covetrus75848Voor gebruik tijdens anesthesie
ParaVision 360 softwareBrukerhttps://www.bruker.com/en/products-and-solutions/preclinical-imaging/paravision-360.htmlVoor MRI analyse
PMOD 4.2Brukerhttps://www.bruker.com/en/products-and-solutions/preclinical-imaging/pmod.htmlVoor MRI analyse
preklinisch MRI systeem BrukerBioSpec 70/30Voor MRI
Stratasys Vero Clear harsStratasysRGD810Voor multi-dier MRI bed fabricage
Tee Socket-to-Socket Connectors, Luer Lock Tube x2McMaster51525K443Voor multi-dier MRI bed 
slang (binnendiameter 1/16", buitendiameter 1/8")BrukerT12330Voor multi-dier MRI bed assemblage

Referenties

  1. Siegel, R. L., Giaquinto, A. N., Jemal, A. Cancer statistics, 2024. CA Cancer J Clin. 74 (1), 12-49 (2024).
  2. Lafaro, K. J., Melstrom, L. G. The paradoxical web of pancreatic cancer tumor microenvironment. Am J Pathol. 189 (1), 44-57 (2019).
  3. Kleeff, J., et al. Pancreatic cancer. Nat Rev Dis Primers. 2, 16022(2016).
  4. Collisson, E. A., Bailey, P., Chang, D. K., Biankin, A. V. Molecular subtypes of pancreatic cancer. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (4), 207-220 (2019).
  5. Grimm, J., Potthast, A., Wunder, A., Moore, A. Magnetic resonance imaging of the pancreas and pancreatic tumors in a mouse orthotopic model of human cancer. Int J Cancer. 106 (5), 806-811 (2003).
  6. Ireson, C. R., Alavijeh, M. S., Palmer, A. M., Fowler, E. R., Jones, H. J. The role of mouse tumour models in the discovery and development of anticancer drugs. Br J Cancer. 121 (2), 101-108 (2019).
  7. Westphalen, C. B., Olive, K. P. Genetically engineered mouse models of pancreatic cancer. Cancer J. 18 (6), 502-510 (2012).
  8. Cook, N., Olive, K. P., Frese, K., Tuveson, D. A. K-ras-driven pancreatic cancer mouse model for anticancer inhibitor analyses. Methods Enzymol. 439, 73-85 (2008).
  9. Schipper, J., et al. Loss of microRNA-21 leads to profound stromal remodeling and short survival in K-ras-driven mouse models of pancreatic cancer. Int J Cancer. 147 (8), 2265-2278 (2020).
  10. Uprety, D., Adjei, A. A. KRAS: from undruggable to a druggable cancer target. Cancer Treat Rev. 89, 102070(2020).
  11. Buscail, L., Bournet, B., Cordelier, P. Role of oncogenic KRAS in the diagnosis, prognosis and treatment of pancreatic cancer. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 17 (3), 153-168 (2020).
  12. Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106(2009).
  13. Farr, N., et al. Noninvasive characterization of pancreatic tumor mouse models using magnetic resonance imaging. Cancer Med. 6 (5), 1082-1090 (2017).
  14. Yin, T., Liu, Y., Peeters, R., Feng, Y., Ni, Y. Pancreatic imaging: current status of clinical practices and small animal studies. World J Methodol. 7 (3), 101-107 (2017).
  15. Rojas, J. D., et al. Validation of a combined ultrasound and bioluminescence imaging system with magnetic resonance imaging in orthotopic pancreatic murine tumors. Sci Rep. 12 (1), 102(2022).
  16. Vohra, R., et al. Evaluation of pancreatic tumor development in KPC mice using multiparametric MRI. Cancer Imaging. 18 (1), 41(2018).
  17. Serkova, N. J., et al. Preclinical applications of multi-platform imaging in animal models of cancer. Cancer Res. 81 (5), 1189-1200 (2021).
  18. Dazai, J., Spring, S., Cahill, L. S., Henkelman, R. M. Multiple-mouse neuroanatomical magnetic resonance imaging. J Vis Exp. (48), e2497(2011).
  19. Iwano, S., et al. Single-cell bioluminescence imaging of deep tissue in freely moving animals. Science. 359 (6378), 935-939 (2018).
  20. Sempere, L. F., Powell, K., Rana, J., Brock, A. A., Schmittgen, T. D. Role of non-coding RNAs in tumor progression and metastasis in pancreatic cancer. Cancer Metastasis Rev. 40 (1), 1-20 (2021).
  21. Smith, E. S., et al. Clinical applications of short non-coding RNA-based therapies in the era of precision medicine. Cancers (Basel). 14 (6), 1588(2022).
  22. Sempere, L. F., Keto, J., Fabbri, M. Exosomal microRNAs in breast cancer towards diagnostic and therapeutic applications. Cancers (Basel). 9 (7), 71(2017).
  23. Sempere, L. F., Azmi, A. S., Moore, A. MicroRNA-based diagnostic and therapeutic applications in cancer medicine. Wiley Interdiscip Rev RNA. 12, e1662(2021).
  24. Nakisa, A., et al. Tumor-associated carbohydrate antigen 19-9 (CA 19-9), a promising target for antibody-based detection, diagnosis, and immunotherapy of cancer. ChemMedChem. 19 (24), e202400491(2024).
  25. Miller, A. L., Garcia, P. L., Yoon, K. J. Developing effective combination therapy for pancreatic cancer: an overview. Pharmacol Res. 155, 104740(2020).
  26. Dreyer, S. B., Beer, P., Hingorani, S. R., Biankin, A. V. Improving outcomes of patients with pancreatic cancer. Nat Rev Clin Oncol. 22 (6), 439-456 (2025).
  27. Nevala-Plagemann, C., Hidalgo, M., Garrido-Laguna, I. From state-of-the-art treatments to novel therapies for advanced-stage pancreatic cancer. Nat Rev Clin Oncol. 17 (2), 108-123 (2020).
  28. Koltai, T., et al. Resistance to gemcitabine in pancreatic ductal adenocarcinoma: a physiopathologic and pharmacologic review. Cancers (Basel). 14 (10), 2486(2022).
  29. Casper, E. S., et al. Phase II trial of gemcitabine (2,2′-difluorodeoxycytidine) in patients with adenocarcinoma of the pancreas. Invest New Drugs. 12 (1), 29-34 (1994).
  30. Moore, M. Activity of gemcitabine in patients with advanced pancreatic carcinoma: a review. Cancer. 78 (3 Suppl), 633-638 (1996).
  31. Ho, T. T. B., et al. Combination of gemcitabine and anti-PD-1 antibody enhances the anticancer effect of M1 macrophages and the Th1 response in a murine model of pancreatic cancer liver metastasis. J Immunother Cancer. 8 (2), e001367(2020).
  32. Kempinska, K., et al. Genetic ablation of microRNA-10b improves treatment outcomes in mouse models of pancreatic cancer. Cancer Res. 84 (6 Suppl), Abstract 467 (2024).
  33. Fan, J., et al. Species-specific hepatic uptake of [64Cu]Cu-EOB-NOTA, a newly designed hepatospecific PET agent. Mol Imaging Biol. 27 (3), 305-312 (2025).
  34. Ramirez, M. S., Esparza-Coss, E., Bankson, J. A. Multiple-mouse MRI with multiple arrays of receive coils. Magn Reson Med. 63 (3), 803-810 (2010).

Herprints en machtigingen

Tags

MRI van meerdere dierenpancreaskankermodellentumormetingKPC-muismodelpreklinische beeldvormingtumormonitoringgemcitabinebehandelinganatomische beeldvormingbepaling van het tumorvolume
Multianimal Magnetic Resonance Imaging voor tumormetingen in alvleesklierkanker muismodellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.