Geautomatiseerde ultraverdundmetingen van zelfassociatie voor de identificatie van antilichamen met gunstige eigenschappen van een hooggeconcentreerde oplossing

Samenvatting

Hier beschrijven we een high-throughput adaptatie van een antilichaamcolloïdale stabiliteitsassay op schaal om grote datasets te genereren en AI/ML-ready ontwikkelbaarheidsvoorspellingen te ondersteunen.

Samenvatting

Een van de belangrijkste uitdagingen in antistofengineering is de ontwikkeling van analytische screeningsmethoden om colloïdale stabiliteit te beoordelen, zodat biologische middelen geschikt zijn voor formulering en toediening met hoge concentratie. Charge-stabilized self-interaction nanoparticle spectroscopy (CS-SINS), een aangepaste versie van de conventionele affinity-capture self-interaction nanoparticle spectroscopy (AC-SINS), is aangepast als een robuuste colloïdale stabiliteitsbeoordeling voor het voorspellen van het gedrag van hoge concentratie oplossingen. Deze methode maakt cruciale vroege ontwikkelingsbeslissingen mogelijk door colloïdale stabiliteitsproblemen te identificeren voordat er aanzienlijke middelen worden geïnvesteerd, waardoor het verloop van downstream aanzienlijk wordt verminderd en de selectietijdlijnen van kandidaten worden versneld. Deze studie toont aan dat de assay naadloos integreert in bestaande ontdekkingsworkflows en parallel kan worden uitgevoerd met typische vroege assays vanwege de minimale monstervereisten, wat waardevolle gegevens levert om gedrag bij hoge concentraties te voorspellen zonder andere karakteriseringsinspanningen te compromitteren. Er is aangetoond dat routinematige metingen van dynamische lichtverstrooiing (DLS), naast de verschuiving in de plasmonresonantiegolflengte, de betrouwbaarheid van de hier beschreven HTP-methode kunnen verbeteren. Gezamenlijk wordt verwacht dat de kruisvalidatie met DLS-metingen en geautomatiseerde analyseprogramma's de betrouwbare selectie van kandidaat-antistoftherapieën voor verschillende modaliteiten zal vergemakkelijken.

Inleiding

Bij de ontwikkeling en formulering van therapeutische antilichamen zijn opalescentie en viscositeit belangrijke overwegingen bij het ontwikkelen van een patiëntgericht commercieel product 1,2,3,4,5,6,7,8. Klassiek zijn grote hoeveelheden eiwit nodig om deze eigenschappen direct in hoge concentratie te observeren, waardoor optimale leadidentificatie in de vroege stadia van antistofontdekking, wanneer de beschikbaarheid van eiwitten beperkt is, effectief wordt verhinderd. Betrouwbare identificatie van deze fenomenen is cruciaal voor ontwikkelbaarheidsbeoordelingen om slecht gedrag bij hoge concentratie oplossingen stroomafwaarts^{te beperken} 1,2,3,4,5,6,7,8. Daarom is er aanzienlijke interesse in methoden met hoge doorvoer, lage concentratie die voorspellend zijn voor slecht oplossingsgedrag bij hoge concentratie 9,10,11,12,13,14,15,16. Een van deze methoden, kD-DLS, is betrouwbaar gebleken voor het voorspellen van eigenschappen van hoge concentraties, maar voldoet niet aan de lage eiwitinname en hoge doorvoervereisten van vroege workflows^12,13.

Onlangs is aangetoond dat een ultra-low consumption goud-nanodeeltjes-gebaseerde assay, bekend als CS-SINS, een sterke correlatie heeft met de resultaten van de kD-DLS-experimenten en redelijk effectief is in het voorspellen van slechte oplossingseigenschappen bij hoge concentratie¹⁶. Deze kenmerken maken CS-SINS een ideale kandidaat voor ontwikkeling als een high-throughput screeningtool. De CS-SINS-assay maakt gebruik van een vangantilichaam dat op gouddeeltjesoppervlakken is geïmmobiliseerd om kandidaatantilichamen te verankeren via hun Fc-regio's, waardoor de Fab-armen toegankelijk blijven voor oplossingsinteracties. Deze configuratie betekent dat Fab-Fab-interacties het gemeten zelfassociatiesignaal domineren, wat voordelig is aangezien studies aantonen dat Fab-domeinen voornamelijk bijdragen aan de zelfassociatiekenmerken van mAb, waarschijnlijk vanwege de complementariteitsbepalende regio (CDR) oppervlakte-eigenschappen 17,18,19,20,21,22,23. Deze mechanistische basis maakt CS-SINS uitstekend geschikt voor het voorspellen van colloïdale stabiliteitsrisico's die relevant zijn voor formuleringen met hoge concentraties. Alternatieve HTP-methoden, waaronder stand-up monolayer adsorptiechromatografie (SMAC), een grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) kolomgebaseerde benadering die zelfassociatie met een generieke stationaire fase nabootst, en cross-interaction chromatografie (CIC), omvatten kolomvoorbereiding en grote monstervereisten 17,24,25,26,27.

De hier beschreven methode beschrijft een plaat-valide opstelling van de CS-SINS-assay en maakt HTP-screening mogelijk via laboratoriumautomatisering en analyse, waarbij de voordelen van bestaande methoden worden gecombineerd en de betrouwbaarheid van de resultaten worden verhoogd. Deze studie toont ook aan hoe verschillende monstertypen hoogwaardige resultaten opleveren vanwege de aard van de verrijking van zelfinteractie in de assay, waarmee wordt aangetoond dat de methode onafhankelijk is van eiwitbronnen. Verder overwegen we hoe eerdere communicatie van colloïdale eigenschappen aan projectteams het strategisch multispecifieke antistofontwerp verder kan ondersteunen 28,29,30,31,32,33,34.

De studie van de eigenschappen van oplossingen met hoge concentratie wordt doorgaans later uitgevoerd in campagnes voor het selecteren van meerdere kandidaten, na de selectie van de lead en het voltooien van de engineering (Figuur 1A). Vroege voorspelling van deze eigenschappen is haalbaar geworden met methoden zoals CS-SINS, die enkele microgrammen monster vereisen, waardoor colloïdale stabiliteitsrisico's met ultraverdunde metingen worden voorspeld¹⁶. De introductie van vroege ontwikkelbaarheidsscreening (Figuur 1A), wanneer de kandidatenpool groot is, en parallelle datageneratiecampagnes voor zowel monospecifieke als multispecifieke formaten kunnen het geneesmiddelenontdekkingsproces beter informeren^31,32. HTP CS-SINS past parallel aan binding en functiebepaling in het bestaande molecuulscreeningsparadigma, en voegt daardoor toe aan het informatiepakket zonder bestaande workflows te verstoren of te vertragen. De selectie van de leidende kandidaat met nadruk op gunstige colloïdale eigenschappen zal de selectieprogressie beïnvloeden zoals weergegeven in Figuur 1B.

In de voorgestelde workflow voor vroege ontwikkelbaarheidsscreening houdt leadidentificatie rekening met het volledige beeld van gunstige geneesmiddeleigenschappen, waaronder productie en toegang tot patiënten, waardoor de ontwikkeling van downstream wordt gestroomlijnd. De hoogconcentratie-eigenschappen van biologische middelen kunnen hun toedieningsroute bepalen: intraveneuze injecties die ziekenhuisbezoeken vereisen of subcutane injecties, die thuis door de patiënt kunnen worden toegediend, maar vaak een hooggeconcentreerd product^35,36 vereisen. Ontwikkelbare mAbs met lage zelfassociatie worden vaak geformuleerd op >100 mg/mL ^5,35. Formuleringsoptimalisatie met hulpstoffen, zoals visco-reducerende middelen, kan colloïdale stabiliteitsrisico's voor gewenste kandidaten met slechte oplossingseigenschappen in de CMC-ontwikkelingsstadia^34,35 overwinnen. Dit brengt echter uitdagingen met zich mee in de biofarmaceutische productie en verlengt de tijdlijn voor succesvolle geneesmiddelgoedkeuringen³⁶. Hulpstoffen waarvan bekend is dat ze de viscositeit verlagen (zoals zouten en aminozuren) kunnen ook de stabiliteit van eiwitten beïnvloeden, waardoor de eerder gekarakteriseerde ontwikkelbaarheidsprofielen veranderen en het proces verder wordt bemoeilijkt^36,37. Daarnaast kunnen te veel hulpstoffen de patiëntenpopulatie beperken door immunogeniciteitsoverwegingen, diverse veiligheidszorgen, of de therapietrouw beïnvloeden en nieuwe uitdagingen in de productieruimte^met zich meebrengen^. Starr et al. publiceerden voor het eerst de CS-SINS-methode, waarin de optimale massafractie van PLL en IgG werd beschreven als 0,03 en nanodeeltjesstabilisatie werd bevestigd door zeta-potentiaalmetingen voor mAb-zelfassociatie in histidineformuleringen¹⁶. Opmerkelijk is dat het toevoegen van te veel PLL overstabilisatie in de assay veroorzaakt en de waarneming van mAb-zelfinteractie voorkomt (verbetering van de stabiliteit van goudnanodeeltjes door PLL wordt weergegeven in aanvullende figuur 1). Het gebruik van histidineformuleringen zonder zout minimaliseert elektrostatische screening (waardoor de Debye-lengte wordt vergroot), wat het bereik van intermoleculaire interacties uitbreidt, waardoor zwakke zelfassociatiesignalen worden versterkt en hoogconcentratiegedrag wordt nagebootst wanneer antistoffen dichter bij elkaar zijn. In het algemeen worden formuleringen met lage ionische sterkte geprefereerd voor formuleringen met hoge concentratie waarbij zelfassociatie niet wordt waargenomen.

Grote PLL-polymeren voorkomen dat meer capture mAbs op de oppervlakken van de gouden nanodeeltjes worden geïnvesteerd, wat het plasmonische verschuivingsvenster vernauwt en een geavanceerder curve-fittingprogramma en analyse vereist voor latere data-analyse. Deze studie maakte gebruik van een webportaaltool die synchroniseert met interne databases. Het belangrijkste voordeel van deze aanvangskosten is het data-opbouwpotentieel van een grote sequentiepool om de diversiteit aan kandidaten stroomafwaarts te maximaliseren en knelpunten in de duurdere ontwikkelingsstadia^{te beperken.} De CS-SINS-test die we hier beschrijven valt op als een HTP-compatibele methode, waarvan is aangetoond dat deze goed correleert met late-stadium colloïdale stabiliteitsassays¹⁶. AI-ondersteunde profilering is in ontwikkeling voor het doordachte ontwerp van multispecifieke programma's voor toekomstige programma's en voor het begrijpen van de individuele bijdragen van elk domein in complexe formaten 41,42,43,44. Deze inspanningen zullen gezamenlijk invloed hebben op meta-analyses en een meer gedetailleerde bepaling van colloïdale stabiliteitseigenschappen voor antistoftherapieën, en daardoor uiteindelijk tijd besparen in de vroege R&D-fasen.

Protocol

Figuur 2 toont de voorbereiding van nanodeeltjesconjugatie, Figuur 3 toont de workflow in zijn geheel, Figuur 4 brengt het laboratoriumautomatiseringsproces in kaart en Figuur 5 bevat een diagram van de data-analysepijplijn. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Voorbereiding van buffers

OPMERKING: Week 1 (voorbeeldvoorbereiding)

1. Bereid histidine voor (10 mM), pH 6,0 (monster en assaybuffer).
   OPMERKING: Deze stappen worden op dag 1 uitgevoerd.
   1. Los 5 mM L-histidine monohydrochloride monohydraat en 5 mM L-histidine op in ultrazuiver water. Voeg zoutzuur druppelgewijs toe tijdens het roeren totdat de pH 6,0 bereikt, gemeten met een gekalibreerde pH-meter.
   2. Filter de oplossing onder vacuüm door een 0,22 μm poriegrootte filter en verzamel het filtraat in een steriele fles.
   3. Meet de geleidbaarheid voor kwaliteitscontrole en zorg voor een meting van ongeveer 500 μS/cm.
2. Bereid kaliumacetaat voor (20 mM), pH 4,3 (capture mAb conjugatiebuffer).
   1. Los kaliumacetat op in ultrazuiver water en stel de pH aan naar 4,3 met glaciale azijnzuur.
   2. Steriliseer de oplossing door vacuümfiltratie via een 0,22 μm poriegroottefilter zoals beschreven in stap 1.1.2.
3. Maak poly-L-lysine klaar.
   1. Bereid een bouillonoplossing van 5 mg/mL in ultrazuiver water en bewaar bij −20 °C tot gebruik.

2. Dialyse van alle monsters (kandidaat-mAbs)

OPMERKING: Voer deze stappen uit op dag 2–5.

1. Voorweek 100 μL of 300 μL dialysators in 10 mM histidine, pH 6,0, gedurende 5 minuten.
2. Breng alle monsters (50–100 μL) over naar dialysecassettes. Dompel de cassettes onder in een 10 mM histidinebuffer, pH 6,0 (700 mL per doos), voeg roerstaven toe aan de reservoirs, plaats de reservoirs op magnetische roerplaten en incubeer bij 4 °C gedurende 2 uur en 15 minuten.
3. Voer zeven bufferwissels uit met 10 mM histidine, pH 6,0, elke 2 uur en 15 minuten, of vier nachtelijke bufferwisselingen om een grondige verwijdering van zout uit de monsters te garanderen.
4. Haal de monsters op, doe ze over in schone matrixflesjes en bewaar ze bij 4 °C totdat de CS-SINS-test is uitgevoerd.
5. Meet de monsterconcentraties en registreer de polydispersie-informatie na dialyse. Bereken de gecorrigeerde concentraties door de ruwe absorptiewaarden bij 280 nm te delen door de absorptie bij 280 nm voor een oplossing van 1 mg/mL.
6. Bereid het vloeistofbehandelaar invoerbestand voor met de putadressen en concentraties (μg/mL), inclusief de controles.

3. Buffer-uitwisseling van capture mAb (Figuur 2, stap 1)

OPMERKING: Voer deze stappen uit op dag 1 van week 2 (assay).

1. Verwijder de opslagbuffer uit 2 mL ontzoutkolommen door 2 minuten te centrifugeren op 1.000 × g bij kamertemperatuur. Bereid twee ontzoutingskolommen voor voor elke benodigde 700 μL capture mAb. Verwijder de doorstroming na elke centrifugatiestap.
2. Was de kolommen drie keer met 1 mL 20 mM kaliumacetaat buffer, pH 4,3. Centrifugeer de kolommen 2 minuten bij 1.000 × g tijdens elke was.
3. Voeg 700 μL capture mAb (geitenanti-mens Fcγ-specifiek antilichaam) toe aan elke kolom en elueer in een verse 15 mL buis door 2 minuten te centrifugeren op 1.000 × g.
4. Verzamel het gezalte eluaat, breng het aan op een tweede evenwichtige ontziltingskolom en centrifugeer nog eens 2 minuten op 1.000 × g.
5. Combineer alle geëlueerde monsters.
6. Meet de concentratie van de capture mAb-oplossing na het ontzouten zoals beschreven in dag 2–5, stap 2.5.
7. Verdun de capture mAb-voorraadoplossing tot 0,8 mg/mL met 20 mM kaliumacetaatbuffer, pH 4,3, en leg apart tot gebruik.

4. Bereiding van een werkvoorraad poly-L-lysine

1. Verdun een kleine aliquot van de poly-L-lysinevoorraadoplossing tot 2,66 mg/mL met ultrazuiver water.

5. Concentratie van goudnanodeeltjes (Figuur 2, stap 2)

1. Bereid 1,2 mL aliquots van de standaard ophanging in 1 mL buizen of 4,8 mL aliquots in 5 mL buizen met polypropyleen microcentrifugebuizen die 20 nm goudnanodeeltjes bevatten. Centrifugeer op 21.130 × g gedurende 6 minuten.
2. Verwijder de supernatanten (~1,1–1,15 mL) zonder de pellets te verstoren en breng ze over in een aparte conische buis.
3. Meng de geconcentreerde pellets en restvolumes in een schone microcentrifugebuis. Bepaal het nanodeeltjesvolume door te pipetteren en pas het volume aan op (aantal 1 mL buizen × 50 μL) of (aantal 5 mL buizen × 200 μL) met behulp van het gereserveerde supernatant. Bijvoorbeeld, na het centrifugeren van 10 aliquots van 1,2 mL in 1 mL buizen, past men het uiteindelijke volume van de geconcentreerde nanodeeltjes aan op 500 μL.

6. Assemblee van het nanodeeltje

1. Meng grondig 1,5 μL van de poly-L-lysine-werkoplossing met 48,5 μL van de buffer-uitgeruilde capture mAb (Figuur 2, stap 3).
2. Bereid een 1:1 mengsel voor van de geconcentreerde nanodeeltjesoplossing uit stap 5 en de poly-L-lysine/capture mAb-oplossing uit stap 6.1 (Figuur 2, stap 4).
3. Incubeer het mengsel een nacht op kamertemperatuur (23 °C) (Figuur 2, stap 5).

7. Opstelling van vloeistofbehandelaar-assayplaat

OPMERKING: Voer deze stappen uit op dag 2.

1. Verzamel de materialen die nodig zijn voor de assay, waaronder gedialyseerde antilichamen, het vloeistofbehandelaar invoerbestand met postdialyseconcentraties, geconjugeerde goudnanodeeltjes, robotische bedieningstips, platen en reservoirs (Figuur 3, Labautomatisering, stap 1). Laad de punten, monsters, platen en reservoirs vooraf op het dek volgens de indeling in Figuur 3 (Labautomatisering, stap 1).
2. Voeg de controles toe aan putten A12–D12 van de monsterplaat (twee positieve controles en twee negatieve controles). Laat put H12 leeg voor het buffermonster dat door de vloeistofbehandelaar is voorbereid.
3. Open de liquid-handler CS-SINS-methode en start het programma (Figuur 3, Labautomatisering, stappen 2–3). Laad het vloeistofhandler-invoerbestand wanneer daarom gevraagd wordt en voer het aantal samples in (Figuur 4A). Bekijk de twee daaropvolgende berekeningscontrolevensters (Figuur 4B, C), bevestig de waarden en ga verder met de uitvoering.
4. Normaliseer de monsters, inclusief de controles, tot 55,5 μg/mL in een 10 mM histidinebuffer, pH 6,0, door ze van de matrixmonsterbuizen naar de polymerasekettingreactieplaat te brengen in een eindvolume van 100 μL (Figuur 4D, stap 1). Houd de voortgang in de gaten, let op dat voltooide plaatgebieden grijs lijken en actieve stappen groen zijn gemarkeerd (Figuur 4E).
5. Bereid een grotere volume verdunning van elk monster voor bij 11,1 μg/mL in een 10 mM histidinebuffer, pH 6,0, door materiaal van de polymerasekettingreactieplaat over te brengen naar een diep putblok met een eindvolume van 200 μL (Figuur 4D, stap 2).
6. Laat het systeem pauzeren na stap 2. Wanneer daarom wordt gevraagd, meng je de geconcentreerde goudnanodeeltjes die in stap 6.3 zijn bereid door de buis om te keren en ongeveer 10 keer omhoog en omlaag te pipetteren.
   1. Verdeel de nanodeeltjes gelijkmatig over twee polypropyleen microcentrifugebuizen en plaats de buizen, met open doppen, op de aangewezen buis-rek op het dek (Figuur 4D, gemarkeerd "AuNP"). Hervat de run en laat de vloeistofbehandelaar 20 μL nanodeeltjes in elke put van het tweede diepe putblok doseren, twee putten tegelijk (Figuur 4D, stap 3).
7. Laat de vloeistofbehandelaar 192 μL monster overbrengen van het diepe-putblok met de 11,1 μg/mL monsters (Figuur 4D, stap 2) naar het tweede diepputblok en meng grondig. Genereer een 4× CS-SINS mastermix voor elk monster, wat resulteert in een eindmonsterconcentratie van 10 μg/mL na toevoeging van 48 μL goudnanodeeltjes aan een eindvolume van 240 μL (Figuur 4D, stap 3). Start op dit punt de 4-uur incubatietimer.
8. Laat de vloeistofbehandelaar 30 μL in de bronput doseren en vervolgens 60 μL in drie van de vier putten in elk kwadrant van een 384-put plaat om technische triplicaten voor elk monster te genereren (Figuur 4D, stap 4). Geef de resterende 30 μL terug naar de bronplaat.
9. Houd de lay-out van het liquid-handler-dek in de gaten terwijl de run vordert. Observeer de gebruikte tips en gevulde monsterputten die in realtime van licht naar donkergrijs veranderen, terwijl actieve bewegingen in groen worden aangegeven (Figuur 4E).
10. Verwijder de plaat na voltooiing van de run. Sluit de plaat af met een minimaal klevende transparante plaatafdichting en becubeer op kamertemperatuur gedurende in totaal 4 uur. Op het 3,5 uur tijdstip start je het dynamische lichtverstrooiingsprogramma om de kamer in evenwicht te brengen tot 20 °C met behulp van de instellingen weergegeven in aanvullende figuur 2.
11. Meet het absorptiespectrum van elke put van 510 tot 570 nm in stappen van 1 nm (30 nm aan elke kant van de piek) op het 4-uur tijdspunt.
12. Meet de plaat onmiddellijk met de dynamische lichtverstrooiingsplaatlezer op het 4,5 uur tijdstip met de instellingen die in aanvullende figuur 2 worden weergegeven.
    OPMERKING: Gebruik een high-performance plaatlezer voor spectrale metingen vanwege het beperkte dynamisch bereik. Gebruik de speed-read functie niet.

8. Data-analyse (Figuur 5, Gegevensverwerkingsschema)

1. Exporteer de raw-bestanden van het spectrofotometerplatform en sla ze op in een toegankelijke schijfmap.
2. Toegang tot het scripting-webportaal dat gekoppeld is aan de interne server. Voer de vereiste CS-SINS invoerparameters in, waaronder: (1) Startgolflengte; (2) Maplocatie van het ruwe resultatenbestand; (3) Kenteken- en kandidaatidentificaties; (4) Positieve- en negatieve controleputadressen voor normalisatie; (5) Methode-opstellingsaanduiding ("Handmatig" of "Vloeistofbehandelaar"); (6) Instrumenten gebruikt voor spectrale scanning en dynamische lichtverstrooiingsmetingen; (7) Elektronische laboratoriumnotitieboekenidentificatie (ELN); (8) Datum van verwerving.
3. Dien de parameters in bij het webportaal en controleer dat er drie Excel-bestanden zijn gegenereerd in een submap van de raw-results-map.
4. Bereken de λmax-waarden met behulp van het curve-fitting-script dat door het webportaal wordt uitgevoerd.
5. Bekijk de twee uitvoerbestanden met replicate-waarden, genormaliseerde resultaten en representatieve grafieken voor de spectrale scan- en dynamische lichtverstrooiingsmetingen.
6. Gebruik het derde uitvoerbestand, met assaymetadata en genormaliseerde resultaten, om bulkresultaten van laboratorium te creëren in de gebruikersinterface van de database. Definieer rapportageattributen volgens groepsspecifieke eisen en upload de resultaten naar de database om bedrijfsbrede toegang mogelijk te maken.

Resultaten

Figuur 6 toont de resultaten, Aanvullende Figuur 3A toont een voorbeeld van de CS-SINS-score van een representatief ruwe en gezuiverde monster, Aanvullende Figuur 3B toont de variabiliteit in het signaal van put tot put over verschillende dagen, Aanvullende Figuur 4 bevat de resultaten van het plaatvalidatieproces, en Aanvullende Figuur 5 beschrijft de normalisatieberekening voor beide CS-SINS-uitlezingen.

Belangrijk is dat monsters werden verzameld met gerapporteerde concentraties van minstens 55 μg/mL na dialyse in 10 mM Histidine, pH 6,0, voor assay-haalbaarheid, aangezien dit de minimale voorraadconcentratie is (minimaal 6 μg per monster) en nieuwe kindidentificaties werden gecreëerd. In totaal waren er 70 gezuiverde monsters en 20 ruwe expressiemonsters, elk die monstertypen vertegenwoordigden bij verschillende ontwikkelbaarheidscontrolepunten (gezuiverd in de loodoptimalisatiefase en 1- of 2-stap gezuiverd ruw materiaal vanaf de loodidentificatiefase, gemarkeerd in Figuur 1A). Ruwe materialen werden gegenereerd uit een volledig geautomatiseerd zoogdierexpressiesysteem, het Protein Expression and Purification Platform (PEPP; GNF, San Diego, CA, VS). De controles waren afgeleid van commercieel materiaal en waren eerder gevalideerd als maximale of minimale viscositeit, kD-DLS en CS-SINS-waarden. Verse aliquots worden opgeslagen bij -80°C, en voor elke assay wordt een nieuwe aliquot gebruikt.

Figuur 6A,B toont de gemiddelde spectrale en DLS-scores uitgezet per steekproeftype, en de staafdiagrammen tonen foutbalken (standaarddeviatie) met overeenkomende kleurcodes. De normalisatie wordt berekend door het script door het verschil tussen de monster- en de negatieve controlewaarden (berekend lambda max door spectrale verschuiving of Z-gemiddelde, hydrodynamische diameter in nm) te delen door het verschil tussen de controles (aanvullende figuur 5). Figuur 6C zet de spectrale scores uit tegen de DLS-scores, wat een duidelijke correlatie tussen de analytische benaderingen weergeeft. Tabel 1 geeft de identificaties, putadressen, steekproeftype, spectrale scores en DLS-scores samen met hun standaarddeviaties als referentie weer. De grens voor colloïdale stabiliteitsrisico (ongeacht spectrale of DLS-meting) voor een monospecifieke IgG is hoger dan een genormaliseerde waarde van 0,35 (aangeduid door een groene stippellijn in Figuur 6A,B, 6/70 (exclusief replicate controles)); gezuiverde monsters scoorden hoog-risico, terwijl 64/70 laag scoorden voor het gezuiverde materiaal. Belangrijk is dat we verwachten dat de grens hoger zal stijgen voor multispecifieke formaten. Voor de grove expressiemonsters scoorden 2 van de 20 monsters hoog, terwijl 18/20 laag scoorden. Van de hier geteste gezuiverde materialen werd ook de ruwe expressie van ouderbatches van een subset gescreend en leverde vergelijkbare resultaten op (afgebeeld in aanvullende figuur 3A), wat de representatieve aard van de test bij opschaling (zuivering) van kandidaat-eiwitten uit onafhankelijke batches aangeeft. Ondanks het beperken van monstergroottes wordt opgemerkt dat de standaardfout hoger kan zijn voor de ruwe PEPP-monsters dan voor de gezuiverde monsters. Het voordeel van het uitvoeren van CS-SINS in latere stadia zorgt ervoor dat orthogonale beoordelingen kunnen worden uitgevoerd met assays die meer eiwit vereisen voor analyse, zoals viscositeits- en kD-DLS-metingen, terwijl het voordeel van het uitvoeren van CS-SINS in vroege ontwikkelbaarheidsscreenings preventief colloïdale stabiliteitsrisico's aanpakt, wat mogelijk invloed heeft op de uiteindelijke leadkandidatenpool (Figuur 1B). Borderline-kandidaten met hoge fouten kunnen met assays stroomafwaarts als hoog of laag risico worden bevestigd.

Vanwege de kleine aard van de gedetecteerde plasmonische verschuivingen werd een alternatieve uitlezing beschreven om vertrouwen in de test te wekken, wat het dynamisch bereik verbreedt, wat bijzonder nuttig kan zijn bij afwezigheid van een hoogwaardige plaatlezer om kleine veranderingen te detecteren. De DLS-uitlezing maakt onderscheid tussen clustering van nanodeeltjes en het vertrouwen op de spectrale eigenschappen van de nanodeeltjes; beide descriptoren hebben echter vergelijkbare standaardfoutbereiken en zijn klein ten opzichte van hun metingen. Het lijkt erop dat monsters die gevoeliger zijn voor uitschieters hogere fouten hebben (of "multimodaal" zijn en geen resultaat rapporteren via DLS), maar CS-SINS-waarden binnen het werkbereik van de assay hebben lage foutverdelingen. Bij het vergelijken van DLS-waarden met spectrale scorewaarden is de foutverdeling strakker voor de DLS-resultaten uit ruwe monsters dan voor de spectrale scores; dit maakte echter slechts verschil voor één kandidaat die onder de grens van DLS viel, maar niet als spectrale score. Dit kan nuttig zijn als laboratoria andere instrumenten beschikbaar hebben.

Om specifiek de betrouwbaarheid van de gegevensverwerking en de methode zelf aan te pakken, werden de scantijden van end-to-end aangepast voor zowel uitlezingen van de positieve als negatieve controles in de bovenstaande dataset, naast meerdere medium- en lage controles om als tussenliggende referentiepunten te dienen aan het begin en einde van een 384-wellplaat. Aanvullende Figuur 4 toont de resultaten van de definitieve plaatvalidatie, waarbij meestal onbeduidende verschillen van waarden zijn ten opzichte van de monsters aan het begin versus het einde van de plaat (Aanvullende Figuur 4A, B) en een hoge correlatie tussen beide uitlezingen (Aanvullende Figuur 4C) worden getoond. Ten slotte werden de Z-factor en %CV berekend voor de controles uit de spectrale scanning en de DLS-dataset in Figuur 6. Uit de gegevens die voor de controles zijn gegenereerd en hier gepresenteerd, werd vastgesteld dat de spectrale scanuitslag een Z-factor van 0,648 heeft, met 0,019% CV voor de positieve controle en 0,012% voor de negatieve controle. Voor de DLS-uitlezing werd een Z-factor van 0,998 berekend, met 0,025% CV voor de positieve controle en 0,021% voor de negatieve controle. Over het geheel genomen werd de Spearman-correlatiecoëfficiënt tussen monsterwaarden in deze test (Figuur 6C) berekend als sterk positief op 0,829. Deze waarden vertegenwoordigen solide precisie en reproduceerbaarheid voor beide meettypes, en niet verrassend optimaliseert de nieuwe, voordelige DLS-detectiestrategie de Z-factor, maar de spectrale scan biedt een voldoende scheidingsband om betrouwbare resultaten vast te leggen (Z > 0,5). Het is belangrijk op te merken dat de DLS-score een orthogonale uitlezing is die gelijktijdig binnen de CS-SINS-workflow wordt verzameld, zonder extra steekproefvoorbereiding. Het grotere verschil in waarden voor ruwe DLS-scores zorgt voor een verbeterde Z-factor, maar de "scores" worden hetzelfde geïnterpreteerd omdat ze genormaliseerd zijn uit ruwe waarden. Bovendien vangen DLS-metingen driedimensionale groottes van nanodeeltjesclusters in tegenover indirecte aanwijzingen van nabijheid door plasmonische verschuiving en spectrale informatie, wat ons begrip van de CS-SINS-assaydynamiek kan versterken. Gezien het plaatgebaseerde en tijdkritische karakter van een HTP-assay, wilden we de betrouwbaarheid van de assay met deze methoden verhogen.

Figuur 1: Ontwikkelbaarheidsparadigma en CS-SINS gegevensverzameling. (A) De typische workflow van een ontdekkingscampagne tot kandidaatselectie wordt in dit diagram weergegeven voor multispecifieke antistoffen. Het ontdekkingsproces resulteert in monospecifieke kandidaten die worden gescreend, gevolgd door het screenen van verschillende datapakketten om monospecifieke van interesse te beperken voordat het wordt gecombineerd tot multispecifieke formaten. Datapakketten worden herhaald of uitgebreid om leadkandidaten te selecteren totdat de beste kandidaat voor ontwikkeling is gekozen. Lagere doorvoer-assays worden uitgevoerd in de huidige werkstroom wanneer een klein paneel van moleculen wordt geselecteerd (paarse vakjes). HTP CS-SINS kan in elke fase van het pad worden uitgevoerd, waarbij waardevolle gegevens worden toegevoegd en het selectieproces wordt verbeterd. (B) Het hypothetische resultaat van colloïdale eigenschappen voor de top 6 kandidaten wordt getoond voor 2 mogelijke paden: de selectie van de hoofdkandidaat met laag-doorvoer assays, en de selectie van de hoofdkandidaat met HTP CS-SINS. Kandidaten met ongunstig oplossingsgedrag worden met een gloed weergegeven. In het eerste scenario vertoont de helft van de leidende kandidaten, gebaseerd op optimale bindingskenmerken uit ontdekkingsschermen, slecht gedrag bij hoge concentratie. In het tweede scenario wordt slechts één kandidaat met matig slechte colloïdale stabiliteit opgenomen, omdat CS-SINS-gegevens parallel aan bindingsdata werden beschouwd in vroege ontdekkingsscreens. In het tweede scenario is de diversiteit aan potentiële geschikte kandidaten groter dan in het eerste scenario. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: SINS assay workflow. Goudnanodeeltjesvoorbereiding en conjugatie: (1) De capture mAb wordt buffer-uitgewisseld met 20 mM kaliumacetaat, pH 4,3, en verdund tot 0,8 mg/mL. (2) Goudnanodeeltjes worden geconcentreerd uit de voorraad. (3) Poly-l-lysine wordt gemengd met de buffer-uitgewisselde capture mAb. (4) Goudnanodeeltjes worden geïncubeerd met de poly-l-lysine en vangen mAb, en grondig gemengd. (5) Incubatie van het CS-SINS-complex 's nachts op kamertemperatuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Lab Automation workflow. Lab Automatiseringsworkflow: (1) Materialen en monsters worden samengesteld voor de vloeistofbehandelmethode. Gedialyseerde monsters in 10 mM histidine, pH 6, worden verzameld in matrixbuizen of 96-wellplaten. Monsterconcentraties worden opgemaakt in een vloeistofbehandelaar invoerbestand. CS-SINS-complex goudnanodeeltjes die geconjugeerd zijn om mAb, robotische vloeistofbedieningstips en plasticwaren te vangen, worden verzameld ter voorbereiding op de vloeistofbehandelaar-assay-opstelling. (2) De testplaat wordt voorbereid op de vloeistofbehandelaar en 4 uur op kamertemperatuur geïncubeerd. 3) Na 4 uur worden spectrale scans (uitlezing 1) verzameld uit monsterputten die 25 minuten beslaan; Na het 4,5-uursmerk verzamelt dynamische lichtverstrooiing (Readout 2) de grootte-informatie van elke meer uniforme putpopulatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Vloeistofbehandelprogramma en plaatopstelling. (A) Bij het starten van het programma en nadat het systeem is geïnitialiseerd, opent er een apart venster/prompt om het invoerbestand te selecteren met de aangewezen putadressen en monsterconcentraties. Het aantal monsters moet telkens worden gespecificeerd, maar het volume van 200 μL (het laatste volume van de gemengde reagentia vóór het stempelen van 384-wellenplaat) blijft hetzelfde. (B) Na het klikken op doorgaan vanuit het vorige venster in (A), verschijnt dit tweede venster om de interpretaties van het invoerbestand links en de waarden rechts te bevestigen. (C) Na bevestiging van de interpretaties uit (B) verschijnt dit derde venster met een dialoogvenster dat de wiskunde voor monsterconcentratie voor normalisatie (het 100 μL volume) tot de uiteindelijke diepe putplaat (het 200 μL volume) dubbelcontroleert. (D) Deze lay-out komt uit de Method Editor-weergave van de vloeistofbehandelersoftwaremodule. Links worden 300 μL standaardtips geladen, en in het midden van het podium worden 1 doos van 50 μL en 3 dozen van 300 μL dunne tips geladen, die compatibel zijn met vloeistofbehandelingsrobotica. Aan de voorkant is een bufferbak geladen met 10 mM histidine, pH 6 (de buffer waarin de monsters werden gedialyseerd). De goudnanodeeltjes worden gelijkmatig verdeeld in 2 microcentrifugebuizen en onafgedopt geladen achterin het buisrek aan de rechterkant. De matrixplaat met monsterbuizen wordt aan de achterkant van de drager in kolom 10 geladen. Na de monsters worden de normalisatieplaat (1), de diepe putplaat met 11,1 μg/mL monster (2), de 200 μL diepe putplaat van het gecombineerde monster en nanodeeltjes (3), en de 384-putvormige plaat (4) aangegeven. (E) De indeling van het liquid handler-dek toont het terughalen van tips en het doseren van monsters in realtime en markeert de putten naarmate elke stap vordert. Hier zijn alle monsters (96-well-afbeelding aan de achterkant van de drager in de^3e kolom) grijs gemaakt, evenals de daaropvolgende normalisatieplaat, wat aangeeft dat monsters aan de normalisatieplaat zijn toegevoegd vanuit de bronmatrixplaten. In groen tonen we de 8-kanaals kop nadat de buffer uit de trog is aspireerd en deze in de eerste kolom van de normalisatieplaat is gedoseerd tijdens het mengen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Gegevensverwerkingsschema. Het gegevensverwerkingsschema: (1) De ruwe databestanden worden naar een interne server gestuurd. (2) De databestanden worden gelezen en verwerkt door een script dat is aangepast om de curve-fitting van spectrale scans fijn af te stemmen, de lambda-max voor CS-SINS-replicaties te berekenen en multimodale populaties te screenen met DLS. (3) De data wordt gegroepeerd in replicaten, waarna ze vervolgens worden gemiddeld en genormaliseerd naar gespecificeerde controles; Vergelijkbare plaatkaarten in het databaseportaal worden gebruikt om de resultaten te koppelen. (4) Alle gegevens worden georganiseerd in een sjabloon dat klaar is om naar de database te worden geüpload, en grafieken worden automatisch aangemaakt voor ELN-rapportage. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Representatieve gegevens uit uitlezing 1 en uitlezing 2. (A) De genormaliseerde spectrale verschuivingsscores werden uitgezet met PPB ID voor gezuiverde, ruwe expressiemonsters, en controlemonsters waar aangegeven en gescheiden door een verticale stippellijn, in een staafgrafiek om de foutbalkverdeling tussen steekproeftypen te bepalen. De doorgetrokken rode lijn geeft de bovengrens van de assay aan, wat overeenkomt met de positieve controle, terwijl de groene stippellijn de cutoffwaarde aangeeft voor een laag-risico molecuulprofiel voor CS-SINS. (B) De genormaliseerde DLS-scores werden uitgezet met PPB ID voor gezuiverde, ruwe expressiemonsters en controlemonsters, waar aangegeven en gescheiden door een stippellijn, in een staafgrafiek om de foutbalkverdeling tussen steekproeftypen te bepalen. Sommige waarden ontbreken (zoals de^{tweede waarde in} lichtblauw met een bovengemiddelde score in (A) door multimodale scans van de DLS-uitvoer, die door het webportaal van scriptsoftware ongeldig werden beoordeeld. De doorgetrokken rode lijn geeft de bovengrens van de assay aan, wat overeenkomt met de positieve controle, terwijl de groene stippellijn de cutoffwaarde aangeeft voor een laag-risico molecuulprofiel voor CS-SINS. (C) De gemiddelde, genormaliseerde scores voor spectrale verschuiving en DLS-waarden werden vergeleken met een correlatiepuntplot, zoals getoond (spectrale verschuivingsscores komen overeen met de Y-as en DLS-scores met de X-as). De kleurcode is alleen afgestemd op DLS-scores. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1. Colloïdale stabiliteitsscores van antilichaammonsters bepaald door CS-SINS. De tabel vat voorbeeldidentificaties, putadressen, steekproefclassificaties, genormaliseerde spectrale scores en dynamische lichtverstrooiing (DLS)-scores samen die zijn verkregen uit de CS-SINS-assay. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende figuur 1: PLL verbeterde de stabiliteit van AuNP in 10 mM Zijn buffer, pH 6, voor CS-SINS. Deze figuur toont de nauwe overlay van de negatieve controle mAb gebonden aan het PLL-gecoate CS-SINS-complex en de buffer-only controle, in tegenstelling tot ongecoate goudnanodeeltjes met alleen de negatieve controle mAb of buffer, die pieken in totaal verschillende bereiken hebben. In blauw worden de incrementele spectrale scans getoond (genomen in stappen van 1 nm op het 4-uur tijdstip) voor geconjugeerde AuNP geïncubeerd met 10 mM. Zijn buffer overdekt met geconjugeerde kralen geïncubeerd met de negatieve controle (PPB-117487) bij afwezigheid van een pre-incubatie van poly-l-lysine. In rood worden de incrementele spectrale scans getoond (genomen in stappen van 1 nm op het 4-uur tijdstip) voor geconjugeerde AuNP geïncubeerd met 10 mM. Zijn buffer overheen met geconjugeerde kralen geïncubeerd met de negatieve controle (PPB-117487) na pre-incubatie van poly-l-lysine. De berekende lambda-max voor beide negatieve controles in aanwezigheid van PLL liggen dicht bij elkaar. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 2: Instellingen voor DLS en velplaatselectie voor de DLS-plaatlezer. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 3: CS-SINS-scores van Abs uitgedrukt in PEPP versus gezuiverd downstream. (A) De genormaliseerde spectrale verschuivingsscores werden uitgezet met put en plaat-ID voor PEPP-monsters (bijv. A1PL1 = put A1 van plaat 1) die Ab64 uitdrukken en door een verticale stippellijn gescheiden van de genormaliseerde spectrale verschuiving of DLS-scores van gezuiverde Ab64 stroomafwaarts, in een staafgrafiek om de foutbalkverdeling (standaarddeviatie) tussen steekproeftypen te bepalen. De groene stippellijn geeft de cutoffwaarde aan voor een laag-risico molecuulprofiel voor CS-SINS. (B) De totale AUC en de verdeling over de plaat voor alle monsters in de experimenten uitgevoerd in (A) worden hier uitgezet (kleurgecodeerd voor de bijbehorende experimenten). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 4: End-to-end 384-put plaatvalidatie van controles. (A) De gemiddelde, genormaliseerde spectrale scores voor monsters in de beginkolommen van de 384-put plaat worden uitgezet en in rood weergegeven, terwijl duplicaatwaarden die aan het einde van de 384-well plaat zijn gescand, in limoengroen worden weergegeven. Replicatewaarden staan naast elkaar, variërend van de positieve controle (aangeduid met een plusteken naast de PPB-ID) tot de negatieve controle (aangeduid met een minteken naast de PPB-ID). De waarde voor de buffercontrole die door het vloeistofbehandelprogramma is voorbereid (onafhankelijk van de invoerprompt van het monster) wordt weergegeven in een geblokt patroon. (B) De gemiddelde, genormaliseerde DLS-scores voor steekproeven in de beginkolommen van de 384-well-plaat worden uitgezet en in rood weergegeven, terwijl dubbele waarden die aan het einde van de 384-well-plaat zijn gescand, in limoengroen worden weergegeven. Replicatewaarden staan naast elkaar, variërend van de positieve controle (aangeduid met een plusteken naast de PPB-ID) tot de negatieve controle (aangeduid met een minteken naast de PPB-ID). Er is geen buffercontrolewaarde voor de DLS-uitlezing (vanwege multimodale metingen). (C) De gemiddelde, genormaliseerde spectrale scores worden uitgezet tegen DLS-scores in een correlatiepuntplot voor monsters variërend van metingen in de beginkolommen van de 384-wellplaat tot het einde van de 384-well-plaat. De kleurcodering voor de datapunten komt direct overeen met de gemiddelde, genormaliseerde spectrale scanscores. Omdat er geen buffercontrolewaarde is voor de DLS-uitlezing (vanwege multimodale metingen), worden alleen de 6 besturingselementen in duplicaat vergeleken van beide uitlezingen in dit plot. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 5: De berekeningen voor de normalisatie van spectrale scores of DLS-scores om universele rapportage en referentie tussen gebruikers en dagen mogelijk te maken. Positieve controlewaarden worden ingesteld op een waarde van 1, terwijl negatieve controles op 0 worden gezet, en hoge scores worden geassocieerd met slecht colloïdaal gedrag. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Dit protocol vertegenwoordigt verschillende belangrijke aanpassingen ten opzichte van de oorspronkelijke CS-SINS methode¹⁶. Belangrijk is dat de geoptimaliseerde PLL:IgG-verhouding en histidinebuffer uit de oorspronkelijke studie¹⁶ zijn behouden. Het meest opvallend is dat de assay werd aangepast voor het vloeistofbehandeler-robotplatform om HTP-verwerking mogelijk te maken (tot 352 monsters op 1 dag versus ~20), waardoor de hands-on tijd wordt verminderd en de reproduceerbaarheid verbeterd door geautomatiseerde vloeistofbehandeling. Het roboticasysteem is compatibel met plaatgebaseerde formaten, waaronder het stempelen in nieuwe formaten zoals de 384-well plaat en diverse soorten laboratoriumgerei. De programma's kunnen onafhankelijk draaien, en de end-to-end workflow biedt een hoogvolumeweergave met verbeterde reproduceerbaarheid in een sample-limiting setting. DLS-metingen werden ook als orthogonale uitlezing op de spectrale verschuiving opgenomen met een meer optimale Z-factor dan spectrale verschuivingsinterpretaties (0,998 versus 0,648), wat bijzonder waardevol is voor monsters met borderline spectrale scores of hoge standaardafwijkingen, en de interpretatie van de plasmonverschuiving beschrijft om het dynamisch bereik te vergroten dat alleen uit de plaatlezer-output zichtbaar is. Er wordt gesuggereerd dat laboratoria zonder high-end multimode plaatlezers DLS zouden kunnen gebruiken om CS-SINS betrouwbaar uit te voeren. Om mogelijke tijdsafhankelijke variabiliteit over een 384-wellplaat aan te pakken, werd uitgebreide plaatvalidatie uitgevoerd (Aanvullende Figuur 4) door controles zowel aan het begin als het einde van de plaat te plaatsen, waarmee minimale scantijdeffecten werden bevestigd. Daarnaast werd aangetoond dat ruwe PEPP-monsters vergelijkbare resultaten opleveren als gezuiverd materiaal (Figuur 6, Aanvullende Figuur 3A), waarmee de toepasbaarheid van de methode werd uitgebreid op eerdere ontdekkingsstadia waar gezuiverd eiwit niet beschikbaar was, wat eerder niet was gerapporteerd. De gegevens in Aanvullende Figuur 3 wijzen op de betrouwbaarheid tussen bronnen in de steekproef, maar geven ook minimale variabiliteit van de assay van dag tot dag aan, aangezien de gegevens zijn verzameld en genormaliseerd uit verschillende datasets. Meer specifiek toont Aanvullende Figuur 3B het totale oppervlak onder de kromme voor alle putten van de respectievelijke experimentplaten (kleurgecodeerd om overeen te komen met de plaat van hetzelfde experiment in Aanvullende Figuur 3A) om de verwachte, maar minimale variabiliteit binnen hetzelfde experiment en op verschillende dagen met verschillende parelvoorbereidingen aan te tonen. In de vroege ontdekkingsfase zijn methoden zoals kD-DLS en kolomgebaseerde benaderingen (SMAC, CIC) niet haalbaar vanwege hogere monsterconsumptievereisten en het onvermogen om ruwe materialen 12,13,24,25,26,27 te verwerken; CS-SINS maakt colloïdale stabiliteitsscreening uniek mogelijk in deze fase met slechts 6 μg per monster, wat in één stap gezuiverd kan worden. Ten slotte werd het curve-fitting script bijgewerkt om het fijn afstemmen van kleine lambda max-verschuivingen mogelijk te maken en om verbeterde bestandsverwerking en geautomatiseerde datarapportage aan interne databases mogelijk te maken.

Veelvoorkomende probleemoplossingsscenario's zijn: (1) hoge standaardafwijkingen in spectrale of DLS-scores, wat vaak wijst op onvolledige menging van nanodeeltjes (stap 7.6) of monsteraggregatie - in dergelijke gevallen wordt aanbevolen een kwaliteitscontrole uit te voeren met de gedialyseerde monsters door DLS om integriteit na dialyse te waarborgen en standaard spectrale scores als standaardweergave te gebruiken; (2) multimodale DLS-verdelingen of mislukte DLS-metingen, meestal veroorzaakt door bestaande monsteraggregatie of stofvervuiling - filtratie via 0,22 μm-filters vóór dialyse kan dit verhelpen; (3) afwijkingen tussen spectrale en DLS-scores, wat meestal te wijten is aan scheve DLS-metingen (waarschijnlijk door hoge polydispersiteit, die binnen het normaal-hoge bereik van spectrale score zou voorkomen); (4) inconsistente positieve controlewaarden, meestal als gevolg van onjuiste nanodeeltjesopslag of degradeerde capture mAb; verse aliquots die bij -80 °C worden opgeslagen, moeten voor elke assay worden gebruikt (niet langer dan enkele dagen bij 4 °C bewaard).

Enkele beperkingen van de assay zijn onder andere de noodzaak om monsters grondig te dialyseren en de conjugatie-nanodeeltjes semi-handmatig voor te bereiden de dag vóór de assay; Dialysetijd is echter gelijk ongeacht de grootte van de steekproefset. Wat betreft risico's op verstopping van de tip, monitoren de vloeistoftips drukveranderingen tijdens het aspireren, en relevante fouten kunnen tijdens het gebruik optreden. Tijdens de methodeontwikkelingsfase controleerden we logbestanden (en blijven dat na de service) om te controleren of verwachte volumes door het script worden berekend. De aliquoteringsfuncties zijn getest op de geconcentreerde kralenbereidingen en voorzien geen problemen. We erkennen het tijdsgevoelige karakter van de assay, het Fab-gedomineerde karakter van de beoordeling, en de rol ervan als surrogaatassay zonder colloïdaal gedrag zoals viscositeit en opalescentie direct te meten. Deze aanpassing maakt echter een efficiënte karakterisering van grotere datasets eerder in het geneesmiddelenontwikkelingsproces mogelijk, waardoor deze dient als een krachtig screeningsinstrument waar die eerder niet bestond.

Verschillende kritieke stappen in dit protocol vereisen zorgvuldige aandacht om reproduceerbare resultaten te garanderen. Ten eerste is een precieze pH-aanpassing tijdens de voorbereiding van de buffer (stappen 1.1.1 en 1.2.1) essentieel, omdat afwijkingen boven ±0,1 pH-eenheden de stabiliteit van nanodeeltjes en de efficiëntie van antistofvangst kunnen beïnvloeden. De lage pH-buffer die wordt gebruikt voor de voorbereiding van vangstantilichamen zorgt voor optimale conjugatie, en de gespecificeerde buffervoorwaarden zijn geoptimaliseerd voor ladingstabilisatie en brede antilichaamcompatibiliteit (meestal in een formuleringscontext). De 10 mM histidine pH 6.0 buffer biedt optimale elektrostatische interacties terwijl de eiwitstabiliteit behouden blijft. Ten tweede is grondige dialyse met volledige zoutverwijdering (stap 2.3) cruciaal; Onvolledige dialyse kan interfereren met elektrostatische interacties tijdens de assemblage van nanodeeltjes. Ten derde moet de stap voor de concentratie van gouddeeltjes (protocolstappen 5.1–5.3) zorgvuldig worden uitgevoerd om te voorkomen dat de pellet wordt verstoord, aangezien inconsistente nanodeeltjesconcentraties direct invloed hebben op de gevoeligheid van de assay. Ten vierde is de PLL:capture mAb-verhouding van 0,03 (stap 4.1) geoptimaliseerd voor maximale oppervlaktedekking, terwijl een voldoende plasmonisch verschuivingsvenster behouden blijft, zoals eerder vastgesteld¹⁶. Met betrekking tot vloeistofbehandelingsdynamiek werden vloeistofsensortips gebruikt om normalisaties en plaatmenging uit te voeren totdat goudnanodeeltjes werden geïntroduceerd, die niet betrouwbaar in oplossing worden gemeten (en daarom de doseringsvolumes op standaardhoeveelheden zetten). Vloeistofdetectie stroomopwaarts maakt het mogelijk dat de operator problemen met plaatuitlijning of ontbrekende monsters kan markeren, terwijl de 384-well stempelstap Z-uitlijningsproblemen zal identificeren. Ten slotte is strikte naleving van de 4-uur incubatietijd (protocolstappen 7.10–7.12) en het consequent lezen van de plaat van begin tot eind (ongeacht een onvolledige plaat) cruciaal, aangezien de plasmonische verschuiving en nanodeeltjesclustering tijdsafhankelijke fenomenen zijn; vertragingen of vroege lezingen kunnen leiden tot onnauwkeurige CS-SINS-scores, terwijl het lezen van het volledige plaatje zorgt voor consistentie van scores over dagen in het HTP-formaat.

Naarmate de colloïdale stabiliteit van multispecifieke antilichamen steeds meer wordt onderzocht, hebben de grote datasets die door HTP-biofysische assays zoals CS-SINS worden geleverd het potentieel om AI/ML-modellen te voeden om combinatorische effecten op molecuulstabiliteit beter te begrijpen. Uit studies blijkt dat naarmate de sequentiediversiteit toeneemt, de behoefte aan grotere datasets toeneemt om de nauwkeurigheid van AI/ML-resultaten te verbeteren 41,42,43. Eigenschappen en moleculaire beschrijvingen voor monospecifieken kunnen veranderen wanneer ze worden herformatterd naar bispecifieke of trispecifieken, rekening houdend met de volledige molecuulladingsverdeling en balans in tegenstelling tot sequentie- of motiefspecifieke overwegingen voor eigenschappen zoals chemische afbraakverplichtingen 17,18,19,20,21,22 . Opmerkelijk zijn structurele kenmerken zoals voorspelde elektrostatische patches, hydrofobiciteit en oplosmiddel-toegankelijk oppervlak die voorspellingen van aggregatie en stabiliteit kunnen verbeteren, onafhankelijk van sequentiespecifieke kenmerken, waardoor verschillende kleinere datasets compatibel zijn met voorspellingsvoorbereiding 17,18,19,20,21,22 . De eenvoud van de CS-SINS-score als referentie voor de representatieve culminatie van het biofysische profiel van een molecuul maakt de assay geschikt voor het trainen van AI/ML-modellen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
CLEARSEAL FILM 100PKCLEARSEAL	Fisher Scientific	500214
CO-RE II (50 μL Conductive Tips, 300 μL Conductive Tips, 300 µL Slim Conductive Tips)	Hamilton Company	235966, 235902, 235806
Eppendorf Tubes Snap Cap (5.0 mL, Microtube)	Eppendorf	30119401
Falcon Conical Centrifuge Tubes (15 mL)	Thermo Fisher Scientific	Falcon 352196
Goat antihuman Fcγ-specific antibody	Jackson ImmunoResearch Laboratories	109-005-008
Gold nanoparticles (20 nm)	Ted Pella Inc.	157051
Greiner Bio-One 384-well μClear Bottom Polystyrene Microplates – (SS & DLS assay plates)	Fisher Scientific	07-000-057
Greiner Bio-One MASTERBLOCK 96 Deep Well Conical Bottom 2 mL Storage Plate – (mastermix and reagent mixing plates)	Fisher Scientific	07-000-122
Hard-Shell PCR Plates normalization (96-Well, low profile, thin wall, skirted, white/clear HSP9601)	Bio-Rad	HSP9601	URL: https://www.bio-rad.com/en-us/sku/HSP9601-hard-shell-96-well-pcr-plates-low-profile-thin-wall-skirted-white-clear?ID=HSP9601
Histidine hydrochloride buffer sample (10 mM, pH = 6.0, sample and assay buffer)	Sigma	H8125; H6034	Prepare final concentration of 5 mM per reagent in ultra-pure water, adjust pH to 6.0, adjust final volume with ultra-pure water, and filter with 0.22 μm filter
Matrix ScrewTop Tubes sample (500 μL)	Thermo Fisher Scientific	3744
MD100 or MD300 Xpress Mini Dialyzer (Xpress Micro Dialyzer, Scienova, 6-8 kDa, 96 pcs. in deep well plate (12 cartridges), sealing sheet) and dialysis reservoir/box (low volume dialysis cassettes)	Vivaproducts, Inc.	40789, 40076
Microcentrifuge tubes pure polypropylene (1.5 mL)	USA Scientific	1615-5500
Nalgene Disposable Polypropylene Robotic Reservoirs – (buffer trough)	Thermo Fisher Scientific	1200-2300
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes	Thermo Fisher Scientific	567-0020
Poly-L-lysine, >70,000 MW	MP Biomedicals	219454405	Prepare a 5 mg/mL stock solution in ultra-pure water
Positive and negative Controls (1 mg/mL dialyzed into 10 mM Histidine, pH 6)	Internally-produced commercial antibodies	N/A	~2 nm spectral shift and DLS size of 250-300 nm for positive control; negligible spectral shift and DLS size comparable to buffer only control
Potassium acetate buffer capture (20 mM, pH = 4.3, mAb conjugation buffer)	Fisher Scientific	P171-500	Prepare final concentration of 10 mM reagent in ultra-pure water, adjust pH to 4.3 with acetic acid, adjust final volume with ultra-pure water, and filter with 0.22 μm filter
Zeba desalting columns (2 mL, 5 mL, or 10 mL)	Thermo Fisher Scientific	PI-89889; 89891; 89893