Vergelijkende RNA-structuuranalyse van ontluikende en rijpe transcripten in Saccharomyces cerevisiae

Summary

RNA secundaire structuur is voornamelijk waargenomen in rijp RNA met structuurprobingmethoden. Co-transcriptionele structuurvolgsequencing (CoSTseq) verenigt nucleaire run-on, die is gebruikt om de positie van polymerase op beginnend RNA te bestuderen, met structuuronderzoek. CoSTseq maakt hiermee observatie mogelijk van de secundaire structuur van RNA in RNA onder actieve transcriptie.

Abstract

Tijdens transcriptie begint beginnend RNA met basenparing wanneer het RNA-polymerasen (Pols) verlaat. Deze basenkoppeling maakt de vorming mogelijk van RNA-structuren die de genexpressie op het niveau van RNA-verwerking, translatie en stabiliteit kritisch beïnvloeden. Gevestigde methoden om de secundaire structuur van RNA te bestuderen zijn beperkt tot volwassen transcripten, terwijl er weinig bekend is over vouwtoestanden. Bovendien bemoeilijken de relatief lagere abundantie (< 1%) en het tijdelijke karakter van ontgroeiend RNA de isolatie en karakterisering ervan. Co-transcriptionele structuurtracking (CoSTseq) maakt gebruik van transcriptionele run-on met biotine-NTP en dimethylsulfaat (DMS) probing om gelijktijdig de Pol-positie en basenparingsstatus van beginnende transcripten te verkrijgen. In Saccharomyces cerevisiae levert CoSTseq de sequentie- en structurele informatie nabij het 3'-uiteinde van beginnende RNA's die door een van de drie RNA-polen worden getranscribeerd. Tijdens transcriptie-run-on zorgt de biotine-NTP die in het actieve centrum is opgenomen ervoor dat Pols effectief stagneert. Daarna behandeling met DMS-methylaten ongepaarde A-, C- en U-nucleotiden. Latere biotineverrijking en cDNA-synthese met een template-switching reverse transcriptase maken paired-end sequencing mogelijk en de berekening van DMS-reactiviteiten als functie van Pol-positie. CoSTseq wordt gemakkelijk naast DMS-probing (DMS-MaPseq) uitgevoerd, waardoor ook het gevouwen volwassen transcript kan worden vastgelegd. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor parallelle CoSTseq en DMS-MaPseq, inclusief transcriptionele run-on, bibliotheekvoorbereiding en data-analyse.

Introduction

RNA kan zich vouwen in secundaire en tertiaire structuren door basenparing binnen RNA-moleculen, en deze structuren kunnen verder worden beïnvloed door eiwitten die als chaperonnen fungeren om RNA-vouwing¹ te sturen. RNA-structuur kan zeer dynamisch zijn, waarbij cellulaire RNA's zich kunnen conformeren aan een reeks structuren die door het thermodynamische landschap worden gedefinieerd om ensembles van mogelijke RNA-conformaties^{te genereren 2}. Dynamische conformatieveranderingen kunnen de genregulatie en expressie beïnvloeden ^3,4. Omgekeerd kan RNA ook sterk bevoorrechte structuren aannemen die nauw verbonden zijn met zijn functie, zoals tRNA's, kleine nucleaire RNA's en rRNA. Hoewel deze voorbeelden rijpe RNA's met sterke regulerende rollen belichten, komen eukaryote RNA-verwerkingsstappen vaak samen met transcriptie, waaronder pre-mRNA splicing, 3'-uiteinden splijting en RNA-modificatie. Evenzo kan RNA-vouwing plaatsvinden vóór de rijping van het transcript, zoals elders besproken⁵.

Hoewel de RNA-sequentie secundaire structuur kan coderen, vereist nauwkeurige bepaling vaak experimentele validatie in vitro of in vivo. De komst van structuurspecifieke chemische modificatietechnieken zoals DMS-MaPseq (dimethylsulfaatmutatieprofiel met sequencing) heeft de weg vrijgemaakt voor het bepalen van secundaire structuur van cellulair RNA uit levende cellen⁶. DMS wordt geïntroduceerd in cellen en methyleert specifiek de Watson-Crick basenparingsvlakken van adenosine, cytosine en, in mindere mate, uridine, die alleen toegankelijk zijn wanneer ongepaard. Na aanpassing door DMS kan een high-fidelity en zeer processieve reverse transcriptase, zoals Thermostable Group II Intron Reverse Transcriptase (TGIRT)⁷, worden gebruikt om gemodificeerde basen als mutaties te hercoderen in de uiteindelijke voorbereide cDNA-bibliotheek. Deze mutaties kunnen vervolgens worden gebruikt om de toegankelijkheid van RNA op nucleotideniveau af te leiden. Hoewel het een krachtige techniek is, zijn DMS-MaPseq en aanverwante methoden voornamelijk gebruikt om rijp RNA te bestuderen dat al volledig gevouwen⁶ is.

Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om de regulatie en verwerking van beginnend RNA te bestuderen. Global run-on sequencing (GROseq) is ontwikkeld om de beperkingen van RNA-seq te overwinnen, wat steady-state meting van RNA-niveaus in cellen mogelijk maakt en zo informatie levert die gemiddeld is over transcriptie-, RNA-verwerkings- en degradatieprocessen die RNA-niveaus beïnvloeden. GROseq gebruikte bromouridine voor nucleaire run-on, waarbij een RNA-polymerase (Pol) nucleotiden aan beginnend RNA kon toevoegen bij de resolutie van tientallen basen⁸. Precisie run-on sequencing (PROseq) is gebaseerd op deze methodologie om RNA-polen op beginnend RNA met basenparresolutie in kaart te brengen door gebruik te maken van biotine-NTP's. Hier wordt een biotinyler-NTP toegevoegd waar Pol voor het laatst werd gedetecteerd aan het 3'-uiteinde van het nieuw gesynthetiseerde RNA⁹.

Onlangs ontwikkelden en gebruikten Schärfen et al. Co-transcriptionele structuurtracking (CoSTseq), waarbij biotine-run-on en DMS-probing worden benut en aangepast om RNA-structuurbepaling van beginnende transcripten in S. cerevisiae¹⁰ mogelijk te maken. CoSTseq maakt het mogelijk om de secundaire structuur van RNA te bepalen tijdens actieve transcriptie; dit protocol beschrijft hoe nucleaire run-on wordt gecombineerd met DMS-probing tijdens CoSTseq-experimenten. Aangezien CoSTseq zorgvuldige behandeling vereist tijdens de monstervoorbereiding, evenals nauwlettende aandacht voor datakwaliteit bij het uitvoeren van CoSTseq-analyse, beschrijft dit protocol best practices voor het genereren van geschikte bibliotheken voor paired-end sequencing op het Illumina-platform. Het CoSTseq-protocol levert gelijktijdig beginnend en rijp RNA op, waarvan het laatste kan worden geanalyseerd als een DMS-MaPseq dataset om een rigoureuze vergelijking tussen beginnend en rijp RNA mogelijk te maken (Figuur 1). Experimenteel is toegang tot reagentia die nodig zijn voor het onderhouden van gistculturen en het uitvoeren van nucleaire run-on en DMS-probing vereist, zoals beschreven in het onderstaande protocol. De opbrengst van ontluikende RNA's is cruciaal voor het succes van CoSTseq-bibliotheekvoorbereiding en data-analyse; Daarom zijn groeivoorwaarden die door geschikte incubators en groeimedia worden gecreëerd cruciaal om voldoende startmateriaal te verkrijgen. Ten slotte is toegang tot een High-Performance Computing (HPC) cluster ideaal om een computationele analyse van CoSTseq-gegevens uit te voeren.

Figuur 1: Overzicht van de gecombineerde CoSTseq- en DMS-MaPseq-bibliotheekvoorbereiding uit hetzelfde biologische monster. (A) Permeabilisatie van de gistcelwand en het nucleaire membraan met sarkosyl maakt biotine-NTP-opname mogelijk aan het 3'-uiteinde van ontgroeiend RNA tijdens een nucleaire run-on reactie. (B) DMS-methylaten zonder gepaarde A- en C-residuen (soms U) op beginnend en rijp RNA in de permeabiliseerde cel, en het totale RNA wordt verkregen door fenol/chloroform-extractie. Ontluikende RNA wordt vervolgens gezuiverd uit het totale RNA door streptavidine-geconjugeerde magnetische kralen; TRIzol-extractie maakt het onthullende RNA vrij uit de kralen. Parallel kan het kraalsupernatant met polyadenyleerde mRNA's EtOH-precipitatie krijgen; uit dit materiaal kan mRNA worden geïsoleerd door oligo(dT) bead pulldown. Poly A+ mRNA's worden gefragmenteerd voordat ze de bibliotheekvoorbereiding krijgen. (C) Een template-switching reverse transcriptase wordt gebruikt om cDNA afzonderlijk te genereren uit prille of rijpe RNA, gevolgd door ligatie van 5'- en 3'-adapters om een N₇ UMI en barcodes te introduceren (zie Figuur 2 voor details over CoSTseq). Let op dat DMS-MaPseq en CoSTseq reverse transcriptiestappen verschillende heteroduplexadapters zullen gebruiken met overhangen die complementair zijn aan biotine-NTP die in CoSTseq wordt gebruikt en N-overhangen die in DMS-MaPseq worden gebruikt. Minimale PCR-cycli worden gebruikt voor versterking om bias in de bibliotheek te beperken, en de groottekeuze wordt toegepast om adapterdimeren te verwijderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Zorg ervoor dat alle buffers uit Tabel 1 zijn voorbereid voordat je begint. Alle reagentia moeten worden bereid in nucleasevrij water. Filtersterilisatie van buffers wordt aanbevolen bij het gebruik van niet-moleculaire biologische chemicaliën/reagentia voor buffervoorbereiding. Voor secties 1 tot en met 4 bereidt u het volgende vooraf voor:

1. Bereiding van materialen en reagentia

1. Bereid minstens één dag van tevoren een 10% sarkosyl (v/v) oplossing voor om voldoende tijd te hebben voor volledige oplossing. Filtersteriliseer de homogene oplossing met een 0,22 μm filter. Op de dag van het experiment gebruik je 10% sarkosyl om een 0,5% sarkosyloplossing te maken, en laat je het ijs staan tot gebruik.
2. Koel ultracentrifuges vooraf af tot 4 °C. Zet in de dampkap de thermomixer op 30 °C en verwarm een aliquot van 2,5x Structure probing buffer voor. Deze thermomixer zal later worden gebruikt voor DMS-behandeling.
3. In de dampkap stel je een warmteblok in op 65 °C en verwarm 650 μL zuurfenol: chloroform per reactie voor RNA-extractie.
4. Meng DTT met een 2,5x transcriptiebuffer tot een uiteindelijke concentratie van 2 mM. Bereid de afkoelings- en wasoplossingen vers voor en koel ze voor direct gebruik na de DMS-behandeling (zie Tabel 1).
5. Aliquot 40 μL van 20% SDS in buisjes voor gistlyse vóór RNA-extractie. Bereid een 100 mM zinkchloride (ZnCl2) oplossing voor en filter voordat je het gebruikt.
6. Genereer deletie-, uitputtings- of knock-in-giststammen die nodig kunnen zijn om specifieke onderzoeksvragen over beginnende RNA-basenparing te beantwoorden in vergelijking met de wildtypestam van knopgist. Wek de stammen altijd vers tot leven door te strepen op een geschikte gistagarplaat (YPD, dropout of antibioticaplaten). Begin de dag voor het starten van het experiment met een vloeibare cultuur uit één kolonie. Voor meer instructies over groei en manipulatie van giststammen, zie Schärfen et al., 2025.

2. Bereiding van gistcellen voor CoSTseq

1. Een precultuur opzetten: Kweek S. cerevisiae-stam BY4741 in 50 mL YPAD-medium totdat de cellen de mid-log fase bereiken (optische dichtheid (OD) bij 600 nm = 0,6) bij 30 °C met schudden bij 200 rpm. Verdunn indien nodig de cultuur tot OD 0,2-0,3 en laat de gist 0,6 OD bereiken.
2. Gist oogsten: Verzamel en spin 1,8 OD (~3 mL) gistcultuur op 2.500 x g gedurende 3 minuten in een voorgekoelde centrifuge (4 °C). Gooi het supernatant weg in een afvalcontainer. Was de pellet door 10 mL koud fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) opnieuw te suspenderen. Draai opnieuw op 2.500 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en bewaar de gistpellet op ijs.
3. Permeabilisatie van gistcellen: Suspenseer de gistpellet voorzichtig opnieuw in 10 mL koude 0,5% sarkosyl. Gebruik een P1000-pipettor om de cellen opnieuw te suspenderen en voorkom dat er bubbels ontstaan. Incubeer 20 minuten op ijs om permeabilisatie te bevorderen. Pellet de permeabiliseerde gistcellen op 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Sussen de permeabiliseerde gistcellen opnieuw in 100 μL nucleasevrij water.

OPMERKING: Hoewel DMS-labeling geen celwandpermeabilisatie vereist, vereist nucleaire run-on reactie permeabilisatie zodat biotinyleerde nucleotiden de transcriptieplaats kunnen bereiken. Dit wordt bereikt door sarkosylbehandeling, die zowel de gistcelwand als het nucleaire membraan permeabiliseert. Bovendien faciliteert de sarkosylbehandeling de run-on assay door nieuwe transcriptie-initiatiegebeurtenissen te voorkomen en negatieve elongatiefactoren uit Pol II en chromatine^11,12 te verwijderen. Behandel de monsters voorzichtig en houd een lage centrifugale snelheid (400 x g) aan om celleurtuur te voorkomen en succesvolle biotine-opname in verlengende beginnende transcripten te bevorderen¹³.

3. Nucleaire run-on en DMS-sonde

OPMERKING: Nucleaire run-on met biotine-NTP introduceert sterische belemmering die RNA-polen stopt op hun actieve plaats en biedt een biotinehandvat voor de selectieve verrijking van ontluikend RNA. Afhankelijk van de gewenste resolutie kan een nucleaire run-on worden uitgevoerd met één, twee of alle vier de biotinyleerde ribonucleotiden⁹. Voor kostenefficiëntie gebruikt de hier beschreven workflow slechts één biotinylerend nucleotide (d.w.z. biotine-CTP).

1. Het opzetten van de nucleaire run-on reactie
   1. Bereid een werkoplossing voor voor de 2,5x transcriptiebuffer met vers toegevoegde 5 mM DTT en prewarm 2,5x structuurprobingbuffer tot 30 °C (zie Tabel 1).
   2. Voeg in een schone 2 mL buis 120 μL 2,5x transcriptiebuffer, 3,75 μL 10 mM ATP, 3,75 μL 10 mM GTP, 3,75 μL 10 mM UTP, 7,5 μL 1 mM Bio-CTP, 15 μL 10% sarkosyl toe en breng het volume tot 200 μL met 46,25 μL nucleasevrij water.
   3. Voeg 100 μL cellen toe aan de buis en incubeer in een thermomixer die op 30 °C staat gedurende 2 minuten met schudden op 500 rpm.
      OPMERKING: Deze stap is zeer tijdgevoelig. Probeer het aantal samples te beperken om betrouwbare data te genereren. Het is best practice om de timing tussen samples te spreiden voor consistentie.
2. DMS-behandeling: Zodra de incubatie is voltooid, voeg je snel 200 μL voorverwarmde 2,5x structuurprobing buffer en 25 μL DMS-reagens gelijktijdig toe aan de buis. Vortex zachtjes in twee pulsen en blijf 4 minuten op de thermomixer incuberen bij 30 °C terwijl je schudt op 500 rpm. Ruim 30 seconden tussen samples om consistent te zijn.
   OPMERKING: DMS-probing is een onmiddellijke reactie die een hoge temporele resolutie¹⁴ van RNA-basenparingsstatus mogelijk maakt. Om voortdurende DMS-modificatie te voorkomen, is het cruciaal om de DMS-etikettering snel te afkoelen met het sterke reducerende middel β-mercaptoethanol. Bovendien zal eventuele resterende DMS het RNA-herstel bij extractie belemmeren. De toevoeging van waterverzadigde isoamylalcohol vóór centrifugatie kan resterende onoplosbare DMS in de celpellet¹⁵ verwijderen. Deze stap is zeer tijdgevoelig. Het is essentieel om met een beperkt aantal monsters te werken om betrouwbare gegevens te genereren.
   VOORZICHTIG: DMS is een zeer giftige, kleurloze vloeistof met een lichte ui-achtige geur. Extreme voorzorgsmaatregelen zijn vereist bij het werken met DMS. Direct contact en/of inademing van dampen kan necrose in oog, mond en luchtwegen veroorzaken, inclusief ernstige schade aan organen. Gebruik beschermende bril, een labjas en de juiste handschoenen. Dubbele handschoen wanneer mogelijk en direct de handschoenen wisselen bij blootstelling of na DMS-gebruik. Voer stappen uit met DMS onder een dampkap. Gebruik speciale afvalcontainers voor DMS-verwijdering.
3. Afkoelen en wassen
   1. Bereid stop- en wasbuffers van tevoren voor zoals vermeld in Tabel 1 en leg ze op ijs tot gebruik. Stop de DMS-methylering door 1 mL stopbuffer toe te voegen.
   2. Draai de DMS-gelabelde monsters 5 minuten in op 3.500 x g in een voorgekoelde centrifuge. Gooi het afval weg in een geschikte afvalcontainer.
   3. Voeg 1 ml wasdemper toe aan de pellet en suspensieer opnieuw. Herhaal stap 3.3.2. Ga onmiddellijk door met RNA-extractie. Vries de gistpellet niet in.
4. Fenolchloroform-extractie
   1. Sussen de DMS-gelabelde gist opnieuw in 600 μL RNA-lysebuffer en breng de suspensie vervolgens over in buisjes met 40 μL 20% SDS. Incubeer bij 65 °C gedurende 30 seconden met schudden bij 950 rpm.
   2. Voeg 650 μL voorverwarmde zuurfenol:chloroform toe aan het gistlysaat en blijf 2 minuten op de thermomixer verwarmen bij 65 °C met schudden op 950 rpm. Laat de monsters 5 minuten op het ijs staan.
      OPMERKING: Zet ondertussen het warmteblok of de thermomixer over op kamertemperatuur (RT).
   3. Centrifugeer op 20.000 x g gedurende 3 minuten op RT.
   4. Verplaats de bovenste laag naar een nieuwe buis en voeg 650 μL chloroform toe. Kort vortex. Centrifugeer opnieuw en verzamel de bovenste laag in een nieuwe buis met 700 μL isopropanol.
   5. Keer om te mengen en te incuberen in de -20 °C vriezer gedurende 30 minuten, zodat het RNA kan neerslaan. Centrifugeer op 20.000 x g gedurende 45 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg. Was de pellet met 750 μL 75% ethanol (EtOH).
      OPMERKING: Dit is een stop-/pauzepunt in het protocol. De monsters kunnen 's nachts in 75% EtOH worden achtergelaten bij -80 °C.
   6. Draai 3 minuten op 20.000 x g en gooi het supernatant weg. Laat de RNA-pellet aan de lucht drogen en los deze op in 81 μL nucleasevrij water. Kwantificeer de RNA-opbrengst met een spectrofotometer ingesteld op een golflengte van 260 nm. Geef 1 μL van bovenstaande ophanging om te meten. Verdun het RNA-monster indien nodig. Er moet minstens 80 μg totaal RNA aanwezig zijn om naar de volgende stap te gaan.
      OPMERKING: Indien nodig kan DMS-gelabeld RNA tot 2 weken worden opgeslagen bij -80 °C.

4. Ontluikende RNA (CoSTseq)

OPMERKING: Het totale RNA dat uit het fenol wordt verkregen: chloroformextractie bevat DMS-gelabelde rijpe RNA's evenals DMS-gelabelde biotinyleerde nascente RNA's van alle drie de polymerasen. Om de onthullende RNA's te zuiveren van totaal RNA, zullen de volgende stappen streptavidinekorrels gebruiken om biotinylerend nascent RNA te verrijken. Vanwege de sterke affiniteit van biotine voor streptavidine (K_d = ^10-14 - ^10-15 M) worden twee opeenvolgende RNA-reagens (zie Materiaaltabel) extracties uitgevoerd om het RNA van de streptavidine-kralen te elueren. Let op dat minder dan 1% van het gist-RNA nascent RNA is, afhankelijk van de groeiconditie¹⁶.

1. Biotine pulldown
   1. Bereiding van Streptavidine magnetische kralen
      1. Bereid de voorwasbuffer A en voorwasbuffer B voor zoals weergegeven in Tabel 1 voor de samenstelling. Homogeniseer Streptavidine magnetische kralen door vortexen. Verkrijg 44 μL gehomogeniseerde magnetische kralen per monster van 80 μg totaal RNA.
         OPMERKING: Schaal op door het volume te vermenigvuldigen met het aantal samples.
      2. Plaats de magnetische kralen op het magnetische rek en verwijder de opslagoplossing. Suspendeer de magnetische kralen opnieuw in 1 mL voorwasbuffer A.
      3. Incubeer 2 minuten op kamertemperatuur. Magnetiseer en verwijder het supernatant. Herhaal de was. Was 1x met 1 ml voorwasbuffer B. Magnetiseer en verwijder het supernatant, en ga snel door met de binding en was.
   2. Binden en wassen
      1. Bereid de 2x bindingsbuffer, 1x bindingsbuffer, hoge zout- en lage zoutwasbuffers voor zoals weergegeven in Tabel 1.
      2. Suspendeer de voorgewassen kralen opnieuw door twee keer het oorspronkelijke volume (88 μL) van 2x bindingsbuffer toe te voegen. Breng 80 μL kralen over naar een steriele buis van 1,5 mL met 80 μL van het biotinyleerde RNA-monster.
      3. Draai het parel-monstermengsel 20 minuten op een rotator op kamertemperatuur. Verzamel de doorstroming met rijp RNA in een magnetisch stadium (ga door naar de neerslagstap).
      4. Spoel het kraal-nascent RNA-complex 2x met 500 μL hoge zoutbuffer. Voer één spoeling uit met 500 μL 1x binding, gevolgd door één spoeling met 500 μL lage zoutbuffer.
2. Elutie via extractie van RNA-reagens
   1. Verwarm een thermomixer voor tot 60 °C. Koel een centrifuge die een snelheid van 20.000 x g tot 4 °C kan bereiken.
   2. Voeg 300 μL RNA-reagens toe (zie Materiaaltabel) aan het kraal-nascent RNA-complex en hersuspendeer. Incubeer op een thermomixer gedurende 5 minuten, ingesteld op 60 °C.
   3. Voeg 60 μL chloroform, vortex toe, en incubeer 3 minuten bij RT. Draai op 14.000 x g gedurende 5 minuten in een voorgekoelde centrifuge.
   4. Verplaats de bovenste waterige fase naar een nieuwe verzamelbuis (~180 μL). Laat de organische fase achter en laat de kralen en de resterende waterige fase achter.
   5. Herhaal de extractie om een eindvolume van 360 μL waterige fase in de verzamelbuis te bereiken.
   6. Voeg 360 μL chloroform toe aan de verzamelbuis en vortex kort. Draai op 14.000 x g gedurende 5 minuten in een voorgekoelde centrifuge.
   7. Overbreng (ongeveer 350 μL) van de bovenste laag naar een verse buis. Precipiteer het RNA door 900 μL absolute EtOH en 1 μL co-precipitant toe te voegen.
   8. Vortex kortstondig en laat neerslag vallen bij -20 °C gedurende 20 minuten of -80 °C gedurende de nacht.
   9. In de voorgekoelde centrifuge centrifugeer je op 20.000 x g gedurende 20 minuten. Gooi het supernatant voorzichtig weg.
   10. Was de pellet met 750 μL van 75% EtOH, gevolgd door een andere koude centrifugatie op 20.000 x g gedurende 5 minuten.
   11. Droog de pellet 10 minuten om restanten van EtOH te verwijderen. Los de RNA-pellet op in 3,75 μL H2_O.
       OPMERKING: Dot blotting van het geëlueerde RNA gevolgd door probing met streptavidine-HRP conjugaat is de meest effectieve methode om de biotine pulldown te evalueren. Deze aanpak verbruikt echter een aanzienlijk deel van het monstermateriaal, waardoor er onvoldoende materiaal overblijft voor bibliotheekvoorbereiding.
3. Neerslag van supernatant
   1. Precipiteer het supernatant met volwassen RNA's door 2,5-3 volumes EtOH toe te voegen. Laat neerslag vallen bij -20 °C gedurende 1 uur.
   2. In een voorgekoelde centrifuge draai je 45 minuten op 20.000 x g. Aspireer voorzichtig het supernatant.
   3. Was de RNA-pellet met 0,5 mL 75% EtOH. Droog de pellet en los op in 50 μL nucleasevrij water. Plaats de buis op een warmteblok bij 65 °C om de oplossing van de RNA-pellet te verbeteren.
   4. Meet de RNA-concentratie met een spectrofotometer voor de volgende stappen.

5. Rijp RNA (DMS-MaPseq)

1. Poly A-selectie
   OPMERKING: De polyadenyleerde rijpe RNA's worden gezuiverd met behulp van oligo(dT) op affiniteitsvangst gebaseerde parel. Dit protocol is geoptimaliseerd om de Dynabeads mRNA DIRECT Purification Kit te gebruiken (zie Materiaaltabel). Als eerste voorbereiding verhit je 1 mL nucleasevrij water tot 80 °C voor elusie en zet je een warmteblok op 70 °C.
   1. Voorbereiding van RNA voor poly A pulldown: Overbrengen 50 μg neergeslagen RNA en brengen dit tot een eindvolume van 300 μL met nucleasevrij water. Verhit het RNA op 70 °C gedurende 2 minuten om secundaire structuren te verstoren en leg het onmiddellijk op ijs. Meng het RNA met 300 μL lysis/bindingsbuffer en vortex kort.
   2. Bereiding van magnetische kralen: Breng de magnetische kralen in suspensie door minstens 30 seconden te vortexen. Breng 100 μL suspente kralen per monster over in een steriele buis van 1,5 mL. Magnetiseer om de opslagbuffer weg te gooien. Spoel de magnetische kralen af in een gelijke hoeveelheid lysis-/bindingsbuffer, magnetiseer en verwijder het supernatant.
   3. Binden en wassen
      1. Voeg de 100 μL voorgewassen kralen toe aan de 600 μL voorbereide monster-RNA. Roteer continu op een rotator gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
      2. Verzamel de kralen door ze op een magnetisch rek te plaatsen en de doorstroom-door te gooien. Was de kralen met 600 μL wasbuffer A. Pipette om te mengen.
      3. Verzamel de kralen opnieuw om de was weg te gooien. Was de kralen met 300 μL wasbuffer B. Pipette om te mengen.
      4. Verzamel de kralen opnieuw om de was weg te gooien. Meng de kralen met 90 μL warm (80 °C) water en laat binding toe door 90 μL lysis/bindingsbuffer toe te voegen. Herhaal stap 5.1.3.1-5.1.3.3.
   4. Elutie: Suspendeer de kralen opnieuw in 30 μL warm (80 °C) nucleasevrij water. Incubeer bij 75 °C tot 80 °C gedurende 2 minuten. Bon de kralen snel bloot aan een magnetisch veld en verzamel het eluaat in een RNase-vrije buis. Herhaal de elusie en verzamel het geëlueerde RNA.
2. Fragmentatie
   OPMERKING: Fragmentatie van mRNA's kan worden bereikt via enzymatische of chemische methoden. Hier worden zinkchloride en warmte gebruikt voor fragmentatie. In tegenstelling tot enzymen die een specifieke sequentie of structurele elementen vereisen, werken zinkionen als een Lewiszuur om de 2'-zuurstof (een nucleofiel) te activeren en de phosphodieter-ruggengraat te splijten. Dit resulteert in de vorming van 5' OH en 2',3' cyclisch fosfaatester op de product-RNA-strengen¹⁷.
   1. Verwarm de thermocycler voor met bloktemperatuur ingesteld op 94 °C en dekseltemperatuur op 105 °C. Plaats 54 μL geëlueerd mRNA in een PCR-buis.
   2. Voeg 6 μL 100 mM zinkchlorideoplossing toe (eindconcentratie van 10 mM), vortex 2 s, en incubeer onmiddellijk bij 94 °C gedurende 55 seconden op de voorverwarmde thermocycler.
   3. Aan het einde van de incubatie blus je de fragmentatiereactie af met 6,6 μL van 0,5 M EDTA (eindconcentratie van 50 mM), pipetteer je op en neer om te mengen, en plaats je de buizen snel op ijs. Breng de inhoud over in steriele 1,5 mL buizen.
   4. Laat precipitatie van de gefragmenteerde mRNA's toe met toevoeging van 150 μL isopropanol, 15 μL 3 M natriumacetaat, pH 5,2 en 1 μL co-precipitant.
   5. Plaats het op -20 °C gedurende 30 minuten. Draai 45 minuten op 20.000 x g in een voorgekoelde centrifuge. Was de pellet met 75% EtOH en los deze op in 15 μL nucleasevrij water.
3. PNK-behandeling
   OPMERKING: Chemische fragmentatie met ZnCl₂ genereert 5'- en 3'-uiteinden die ongeschikt zijn voor ligatie¹⁷. Na de chemische fragmentatie worden de RNA's onderworpen aan polynucleotide Kinase (PNK)-behandeling, waarbij de 5' OH wordt gefosforyleerd en de 3' fosfaatuiteinden worden gedephosphoryleerd, die vervolgens kunnen worden geligeerd aan adaptors¹⁸.
   1. Voeg 1 μL ribonucleaseremmer, 2 μL 10x PNK buffer en 2 μL T4 PNK toe. Broed 60 minuten uit bij 37 °C. Stop de reactie door 30 μL nucleasevrij water, 50 μL RNA-bindingsbuffer en 50 μL EtOH toe te voegen.
   2. Gebruik een spinkolom-gebaseerde RNA-zuiveringsmethode om verontreinigingen te verwijderen en het RNA te concentreren. Dit kan worden gedaan met een commercieel verkrijgbare kit (RNA Clean and Concentrator kit, zie Materiaaltabel). Kort samengevat, meng twee volumes RNA-bindingsbuffer met 1 volume monster, meng een gelijk volume van dit mengsel met 100% EtOH, en laad op de spinkolom met een verse verzamelbuis. Draai dit monster en gooi de doorstroming weg. Was de spinkolom met 700 μL RNA wash buffer en één keer met 400 μL RNA wash buffer. Laat de flow erdoorheen vallen. Draai de lege kolom 1 minuut om de wasbuffer volledig te verwijderen.
   3. Eluteer het RNA in 10 μL warm nucleasevrij water.
      OPMERKING: Voer alle centrifugatiestappen uit op 10.000 - 16.000 x g bij RT gedurende 30 seconden.

6. Sjabloonwisseling van omgekeerde transcriptiereactie

OPMERKING: De ontluikende RNA's uit biotinepulldown (stap 4.2) en gefragmenteerd mRNA na PNK-behandeling (stap 5.3) worden onderworpen aan de volgende stappen voor bibliotheekvoorbereiding (zie Figuur 1 en Figuur 2). Kort gezegd zal er een synthetische RNA-template/DNA-primer starterduplex (R2 RNA/DNA heteroduplex adapter) worden voorbereid waarop template-switching kan plaatsvinden. Deze heteroduplex levert een korte complementaire sequentie die het mogelijk maakt template-switching door de reverse transcriptase (RT) om strengen te wisselen, waarbij de RT de strengen van RNA naar de DNA-primer wisselt, waardoor naadloze cDNA-synthese van het RNA naar de adaptersequentie mogelijk wordt. Hier wordt Induro reverse transcriptase gebruikt, die getest en geoptimaliseerd is voor dit protocol. Andere template-switching reverse transcriptases kunnen indien gewenst worden gebruikt voor de voorbereiding van CoSTseq-bibliotheken, maar vereisen optimalisatie door de gebruiker.

1. DNA/RNA heteroduplex adaptersequenties
   OPMERKING: De DNA/RNA heteroduplexadapters die worden gebruikt voor reverse transcriptie van het DMS-MaPseq monster zijn dezelfde als die vermeld in Xu et ^al.7 en gerefereerd door Schärfen et ^al.10.
   1. Voor de DNA/RNA heteroduplex-adapter die gebruikt zal worden voor reverse transcriptie van CoSTseq-monster, gebruik een adapter met een 'G' in het overhanggebied. Dit stelt G in staat om de biotine-C aan het 3'-uiteinde van het RNA te vangen. Als je een andere biotinyleerde NTP gebruikt, bewerk dan de heteroduplex DNA-primer zodat het juiste koppelingsnucleotide als overhang wordt (zie Tabel 2).
   2. Voor de DMS-MaPseq-adapter moet je ervoor zorgen dat er één N-overhang is, aangezien het 3'-uiteinde willekeurig zal zijn na fragmentatie. Voor een overzicht van de volgende stappen voor de voorbereiding van de bibliotheek, zie Figuur 2.
2. Bereiding van DNA/RNA-hybride voor sjabloonwisseling: bereid 1 μM R2 RNA- en R2R-DNA-primers voor in een buffer bestaande uit 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 en 1 mM EDTA. Incubeer het primermengsel bij 82 °C gedurende 2 minuten, koel dan af tot 25 °C met een snelheid van 0,1 °C/s. Aliquot het mengsel en invriezen voor later gebruik.
3. Sjabloonwisseling omgekeerde transcriptie
   1. Voeg de volgende reagentia toe en incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur: 2 μL 5x reactiebuffer, 1 μL 1 μM DNA/RNA heteroduplex (gebruik heteroduplex met één G-overhang voor CoSTseq-monster; gebruik heteroduplex met een willekeurige N-overhang voor het DMS-MaPseq-monster), 0,5 μL enzym, 0,5 μL RNase-remmer, 3,75 μL RNA-monster (of voeg water toe om 7,75 μL totaalvolume te bereiken).
   2. Incubeer dit mengsel (zonder dNTP's) 30 minuten bij RT. Voeg vervolgens 1,25 μL van 10 mM dNTP's toe aan de reactie en pas de volgende cyclische condities toe in een thermocycler: 25 °C voor 10 minuten, 42 °C voor 10 minuten, 50 °C voor 10 minuten, 55 °C voor 10 minuten, 60 °C voor 30 minuten, 65 °C voor 20 minuten, 75 °C voor 15 minuten.
   3. Voeg 1 μL RNase H toe en incubeer bij 37 °C gedurende 20 minuten. Zuiver de PCR-reactie met behulp van een kolomgebaseerde DNA-zuiveringsmethode om de resterende primers, nucleotiden en enzymen te verwijderen. Elut in een eindvolume van 20 μL.

Figuur 2: Gedetailleerde schematische weergave van de CoSTseq-bibliotheekvoorbereiding. Onthullend RNA met een biotinylerend 3'-uiteinde wordt geïncubeerd met een template switching adapter die een G-overhang bevat die complementair is aan biotine-CTP. Voor gefragmenteerd rijp RNA (DMS-MaPseq) wordt een adapter met N-overhang gebruikt (zie Figuur 1). cDNA-synthese wordt uitgevoerd met een zeer processieve reverse transcriptase, zoals thermostable group II intron reverse transcriptase (TGIRT), gevolgd door RNase H-behandeling om de RNA-streng af te breken. Vervolgens koppelt 5' App-DNA/RNA-ligase het ribose-adenyleerde 5'-uiteinde (rA^pp) van de N₇ UMI-linker aan de 3' OH van het enkelstrengige cDNA. De N₇ UMI-adapter heeft een geblokkeerd 3′-uiteinde, waardoor zelfligatie tussen adapters wordt voorkomen. Ten slotte wordt PCR-versterking uitgevoerd met primers die overlappende gebieden en 5′ overhangen bevatten met unieke Illumina i5- en i7-barcodes die aan elk monster zijn toegewezen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

7. 5' Adapterligatie voor de voorbereiding van definitieve cDNA-bibliotheken voor paired-end tagsequencing

1. Voorbereiding van 5'-uiteinde adapter
   1. Adnyleer de 5'-eindadapter met behulp van een RNA-ligase-gebaseerde reactie (bijv. Mth RNA-ligase, vermeld in Table of Materials) met de volgende reactiecomponenten: 8 μL 10x 5'-DNA adenylatie reactiebuffer, 8 μL 1 mM ATP, 100 μM R1R DNA (dit is de TruSeq primer met een unieke moleculaire identificatie of UMI), 8 μL Mth RNA-ligase, 52 μL nucleasevrij water.
      OPMERKING: Voor details met betrekking tot het ontwerp van de N₇ UMI-adapter, zie Tabel 2 en Figuur 2.
   2. Incubeer deze reactie bij 65 °C gedurende 1 uur, daarna bij 85 °C gedurende 5 minuten. Ga verder met het zuiveren van het product met EtOH-precipitatie of met een silica-membraan spinkolom-gebaseerde DNA-reinigingsmethode om cDNA te isoleren, volgens de instructies van de fabrikant.
   3. Voor EtOH-precipitatie kan DNA worden neergeslagen bij -20 °C (minimaal 20 minuten) met natriumacetat (pH 5,2) bij een uiteindelijke concentratie van 0,3 M en 2x-2,5x van 95%-100% koude EtOH. Centrifugeer de door EtOH neergeslagen reactie gedurende 15 minuten op maximale snelheid in een voorgekoelde (4 °C) centrifuge, was de pellet met 70% EtOH, centrifugeer opnieuw en droog de pellet aan de lucht. Susstrueer (of eluteer, als je een spinkolom gebruikt) de pellet in 40 μL nucleasevrij water. Bewaar het op -20 °C op lange termijn.
2. 5' adapterligatie
   1. Voor een enkel reactievolume van 20 μL voeg je de volgende componenten toe aan 10 μL cDNA: 2 μL van 10x NE Buffer 1, 2 μL van 50 mM MnCl_2, 2 μL van 5' AppDNA/RNA-ligase, 4 μL van 10 μM (100 ng/μL) van de adenyleerde adapter uit stap 7.1.
   2. Incubeer deze reactie bij 65 °C gedurende 1 uur, daarna 3 minuten bij 90 °C. Reinig de reactie met de minElute PCR-zuiveringskit en elueer in een eindvolume van 20 μL nucleasevrij water.
3. Minimale PCR-amplificatie van cDNA-bibliotheken met pilottest
   1. Bereid voordat je verder gaat een voorraad index primers van 10 μM voor met unieke barcodes. Elk uniek CoSTseq- of DMS-MaPseq-monster moet een unieke barcode hebben voor een soepele downstream-analyse. Zie primerreeksen in Tabel 2. De voor- en achteruit-individuele barcode-bevattende primers kunnen worden gecombineerd in een 1:1-mengsel en worden opgeslagen als een barcode-premix.
   2. Voeg met 2 μL van het PCR-product uit stap 7.2 2,5 μL high-fidelity PCR-buffer toe (bijv. een commerciële HiFi-buffer), 0,375 μL dNTP (10 mM), 0,75 μL barcoding premix (of 0,375 μL individuele i5- en i7-specifieke barcodingprimers), 0,25 μL high-fidelity hot-start DNA Polymerase (bijv. commercieel HiFi hot-start enzym), 6,625 μL nucleasevrij water.
   3. Incubeer deze reactie bij 95 °C en herhaal [15 s 98 °C, 30 s 62 °C, 30 s 72 °C] gedurende 23 cycli, eindig met 1 minuut incubatie bij 72 °C. Loop op een 1% agarosegel om het optimale aantal cyclies te bepalen.
      OPMERKING: Om lagere cyclische condities te testen, kan een monster worden voorbereid aan het einde van een lagere cyclus (bijvoorbeeld het einde van 15 of 16 cycli) en op een agarosegel worden uitgevoerd om de intensiteit van de cDNA-bibliotheekveer op een agarosegel over cyclilengtes te vergelijken.
4. Definitieve PCR voor bibliotheekversterking
   1. Met 18 μL van het PCR-product uit stap 7.2 voeg je het volgende toe uit de KAPA HiFi PCR Kit: 22,5 μL high-fidelity PCR Buffer, 3,375 μL dNTP (10 mM), 6,75 μL barcoding premix (of 3,375 μL individuele i5- en i7-barcodeprimers), 2,25 μL high-fidelity hot-start DNA-polymerase en 59,625 μL nucleasevrij water.
   2. Incubeer deze reactie bij 95 °C en herhaal [15 s 98 °C, 30 s 62 °C, 30 s 72 °C] voor het aantal cycli bepaald in stap 7.3. Eindig met 1 minuut incubatie bij 72 °C.
5. Groottekeuze
   1. Voer groottekeuze uit op het PCR-product met behulp van paramagnetische kraal-gebaseerde zuivering (bijv. AMPure XP of gelijkwaardig). Gebruik 1,3 keer het volume kralen (bijvoorbeeld voor een 50 μL PCR-reactie, gebruik 65 μL kraalslurry) en meng goed tot het homogeen is. Laat de kralen het monster 10 minuten binden bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: Deze 1:1,3x monster-tot-kraal-verhouding maakt het mogelijk om primeradapter-dimers te verwijderen en zorgt ervoor dat de opgeslagen DNA-fragmenten niet kleiner zijn dan 150 bp en niet groter dan 800 bp.
   2. Verwijder het supernatant zonder de kralen te verstoren en was de kralen vervolgens met 80% EtOH volgens het protocol van de fabrikant.
   3. Eluteer het eindproduct in 11 μL. Voer 1 μL uit op een agarosegel om bibliotheken te verifiëren. Dien het eindproduct in voor sequencing.

8. Data-analyse

OPMERKING: Het volledige CoSTseq-pakket en analysecode zijn beschikbaar op GitHub (https://github.com/NeugebauerLab/CoSTseq), en de workflow voor analyse wordt weergegeven in Figuur 3. Deze pijplijn is ontworpen om zowel CoSTseq- als DMS-MaPseq-sequencinggegevens te verwerken. CoSTseq gebruikt Snakemake, een bio-informatica workflow die analyse gemakkelijk paralleliseert door het aantal beschikbare CPU-cores^{te optimaliseren (19}). De workflow wordt gedefinieerd door een Snakefile, die bestaat uit een set regels die de analyses vaststellen die worden uitgevoerd. Er is geen noodzaak om het Snakefile dat beschikbaar is bij het installeren van het GitHub-pakket aan te passen.

1. Pas het configuratiebestand (.yaml-bestand) aan met de juiste bestandspaden naar de plek waar de ruwe data wordt opgeslagen. In deze instellingen moet een pad naar de adaptersequenties en de bijbehorende samplenamen zijn opgenomen. Pas het configuratiebestand aan om specifieke analyses uit te voeren die in de Snakefile zijn gedefinieerd.
2. Om de analyse te beginnen, download je ruwe gepaarde eindlezingen in fastq.gz formaat. Procesreads gebruiken fastp²⁰ om adaptersequenties te trimmen en kwaliteitsfilter voor reads met Phred-scores van minstens 20. Lijn deze reads af op het referentiegenoom met STAR²¹ om BAM-bestanden te genereren.
3. Als extra bevestiging visualiseer je de BAM-bestanden die zijn gegenereerd na het uitvoeren van de CoSTseq-analysepijplijn in de Integrated Genome Viewer (IGV) browser. Met IGV zouden de BAM-bestanden gemakkelijk interpreteerbaar moeten zijn om reads langs alle delen van relevante genen te tonen, wat aangeeft dat reads beginnend RNA vertegenwoordigen. Zoals verwacht zouden rijpe RNA-reads minimale dekking moeten vertonen in intronic gebieden, aangezien deze reads naar verwachting afkomstig zijn van rijpe en waarschijnlijk efficiënt gesplitste transcripten.
4. Gebruik de fastp-uitvoer (een .html bestand dat in een webbrowser geopend kan worden) voor een geschat percentage gedupliceerde lezingen. Let op dat CoSTseq-lezingen zeer sterk gedupliceerd kunnen zijn, wat de kritischheid van de volgende stap benadrukt.
5. Met UMICollapse²² worden reads gededupliceerd om reads met identieke UMI's en alignments te laten samenvallen, waardoor unieke reads behouden blijven en PCR-bias wordt geminimaliseerd. De resulterende bestanden moeten vrij zijn van gedupliceerde reads en in BAM-formaat, waarbij reads die uitlijnen met rRNA worden gescheiden van die geassocieerd met niet-rRNA-genen.
6. Voor het laatste grote onderdeel van de modulaire CoSTseq-pijplijn gebruik je een aangepaste Python-implementatie om de mutatietellingen en leesdekking over elk nucleotide te berekenen. De functies die deze implementatie beschrijven zijn te vinden in de broncode op GitHub, en de Snakefile beschrijft de invoer, uitvoer, parameters en functies om deze gegevens te genereren die in .pkl-formaat zijn opgeslagen.
   OPMERKING: Er zijn talloze andere analyses die kunnen worden uitgevoerd met de CoSTseq-analysepijplijn, hoewel parameters mogelijk optimalisatie vereisen voor gepersonaliseerde analyse-behoeften. Een waardevolle methode die is aangepast voor CoSTseq is HDProbe, een R-pakket dat genoom-brede vergelijkingen van mutatiesnelheden^{mogelijk maakt}. Kort gezegd vereist HDProbe gegevens van alle replicaten en kan het methodisch significante verschillen in mutatiesnelheden ten opzichte van de controle categoriseren. Aanvullende soorten analyses die men kan willen uitvoeren zijn onder andere structuurvoorspelling op basis van de experimentele DMS-reactiviteiten. Dit kan worden uitgevoerd met het RNAstructure-pakket²³.

Figuur 3: Analysestappen en verwachte output van de modulaire CoSTseq-analysepijplijn. Analysestappen, die het aanbevolen gebruik van bestaande tools aangeven naast de kant-en-klare CoSTseq-analysepijplijn met de verwachte outputbestanden en inhoud. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Results

Deze sectie presenteert de daadwerkelijke resultaten die worden gegenereerd door het implementeren van de CoSTseq-workflow en analyse, zoals beschreven in dit protocol. Ten eerste beschrijft deze sectie de verwachte resultaten na kwaliteitsbeoordeling van succesvolle bibliotheekvoorbereidingen vóór en na sequencing. Voorafgaand aan de sequencing kunnen onderzoekers een test-PCR- en TapeStation-analyse gebruiken om de aanwezigheid van RNA na biotineverrijking te bevestigen. Dit wijst op s...

Discussion

RNA begint co-transcriptieel te vouwen door een snellere kinetiek van basenparing vergeleken met de synthesesnelheid^van 24,25,26,27. Onze huidige kennis van het vouwen van beginnend RNA komt voort uit enkelmolecuulstudies van prokaryote RNA's, in vitro probing of in silico benaderingen. In dit protocol wordt een gedetailleerde workflow van CoS...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10mM ATP	Invitrogen	18330019
10mM Biotin-11-CTP	Jena biosciences	NU-831-BIOX
10mM GTP	Invitrogen	18332015
10mM UTP	Invitrogen	18333013
10X NEBuffer 1	New England Biolabs	B7001S	Gebruikt in stap 7.2.1
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	70011-044
20% SDS	RPI	L23100-500
Acid phenol:chloroform	Ambion	AM9722
AMPure XP beads voor maatselectie	Beckman Coulter	A63880	Gebruikt voor maatselectie in stap 7.5.1
Bacto Peptone	Gibco	211677
Bacto Yeast Extract	Gibco	212750
Bicine	Sigma Aldrich	B3876-100G
Chloroform	Sigma Aldrich	319988
D-(+)-GLUCOSE	Sigma Aldrich	G5767-500G
DIFCO AGAR	BD DIFCO	214010
Dimethyl Sulfate	Sigma Aldrich	D186309-5ML
Dynabeads™ MyOne Streptavidin C1 beads	Invitrogen	65001	Gebruikt voor Biotin Pulldown in Sectie 4.1
Dynabeads™ mRNA DIRECT™ Purification Kit	Invitrogen	61011	Gebruikt voor Poly A selectie in Sectie 5.1
EDTA, pH 8, 0.5M	Sigma Aldrich	03690-100ML
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023-500ML
GlycoBlue	Invitrogen	AM9516	Co-precipitant gebruikt in stap 4.2.7 en 5.2.4
Induro® Reverse Transcriptase	New England Biolabs	M0681S	RT-enzym gebruikt in stap 6.3.1
Isoamyl alcohol	Sigma Aldrich	W205710-1KG-K
Isopropanol	JT-BAKER	9084-05-01
KAPA HiFi HotStart PCR Kit	Roche	07958889001	High-fidelity DNA Pol gebruikt in 7.3.2 en 7.4.1 voor PCR-reacties
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	SLCM2154
MinElute PCR Purification Kit	Qiagen	28004	Gebruikt voor DNA-opruiming in stap 6.3.3 en 7.2.2
Mth RNA Ligase	New England Biolabs	M2611A
Oligo Clean & Concentrator	Zymo Research	D4060	Aanbevolen voor DNA Oligo-opruiming in stap 7.1.2
Potassium Acetate	Sigma Aldrich	236497-500G
Potassium Chloride	JT Baker	3040-01
Potassium Hydroxide	Avantor	6984-04-01
RNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	R1014	RNA-opruimingskit gebruikt in stap 5.3.2 na PNK-behandeling
RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	10777019	RNase-remmer gebruikt in stap 5.3.1 tijdens PNK-behandeling
Sarkosyl	IBI Scientific	IB07080
Sodium Acetate	Quality Biological	351-035-721
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S5150-1L
Sodium Hydroxide	Macron	7708-10
SUPERase·In™ RNase Inhibitor (20 U/μL)	Thermo Fisher Scientific	AM2696	RNase-remmer gebruikt in stap 6.3.1
T4 Polynucleotide Kinase	New England Biolabs	M0201S
Thermostable 5’ App DNA/RNA Ligase	New England Biolabs	M0319L
Tris-HCl, pH 7.4, 1M	Thermo Scientific	J60202.K2
Triton X-100	TEKNOVA	T1105
TRIzol™ Reagent	Invitrogen	15596-026	Voor nascent RNA-elutie in Sectie 4.2; ook vermeld als "RNA-reagens" in Sectie 4
β-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250-1L