Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Nieuw ratmodel van ernstige cerebrale veneuze sinustrombose, vastgesteld door combinatie van semi-ligatie, ferrichloride en trombine

331 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69961

⸱

13 februari 2026

 , 
1Department of Emergency, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, 2Department of Neurology, The People's Hospital of Qingxian

In dit artikel

Samenvatting

Het nieuwe rattenmodel van ernstige cerebrale veneuze sinus-trombose (CVST), dat wordt geconstrueerd door semi-ligatie gecombineerd met ferricchloride en trombine, kan het pathofysiologische mechanisme van ernstige CVST bij mensen effectiever nabootsen.

Samenvatting

Cerebrale veneuze sinustrombose (CVST) is een apart type beroerte dat vooral jonge mensen treft, met name zwangere vrouwen. Ongeveer 60% van de CVST-patiënten ontwikkelt een veneuze cerebrale infarct of bloeding, wat wordt gedefinieerd als ernstige CVST. Momenteel worden verschillende methoden zowel nationaal als internationaal toegepast om CVST in diermodellen op te wekken. Deze modellen slagen er echter niet in de pathofysiologische mechanismen achter ernstige CVST volledig te repliceren, waardoor fundamenteel onderzoek naar deze aandoening wordt beperkt. Een nieuw ratmodel van ernstige CVST kan worden ontwikkeld door semi-ligatie in combinatie met ferrichloride en trombine. Semi-ligatie werd bereikt door het meten van de cerebrale bloedstroom (CBF) in het interessegebied (ROI) vóór en na ligatie van de superior sagittale sinus (SSS) met behulp van een Perfusion Speckle Imager (PSI). Semi-ligatie van de SSS veroorzaakt bloedstasis in de veneuze sinus. De topische toepassing van ferrichloride op het oppervlak van de SSS leidt tot endotheelletader, terwijl directe injectie van trombine in de sinus een gelokaliseerde hypercoaguleerbare toestand creëert. Deze benadering bootst effectief de drie belangrijkste componenten van trombosevorming na: stase, endotheelschade en hypercoagulabeliteit. Het resulterende model vertoont een aanzienlijke trombotische belasting waarbij meerdere veneuze sinussen gelijktijdig betrokken zijn. De geïnduceerde trombus blijft minstens 1 week stabiel. De 2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride (TTC) kleuring toont aan dat dit model consequent een veneuze cerebrale infarct met groot gebied kan veroorzaken, die tot 7 dagen aanhoudt. Dit model kan zelfs epileptische aanvallen bij ratten opwekken, een vermogen dat eerdere modellen niet konden bereiken. De verstoring van de bloed-hersenbarrière werd waargenomen met behulp van Evans blue (EB) kleuring. Daarom repliceert het ernstige CVST-model, vastgesteld door semi-ligatie gecombineerd met toediening van ferricechloride en trombine, de pathofysiologische progressie van ernstige CVST bij mensen nauwkeuriger, wat stabiliteit en betrouwbaarheid aantoont.

Inleiding

Cerebrale veneuze sinustrombose (CVST) is een aparte vorm van cerebrovasculaire aandoening die verschilt van een arteriële beroerte. Het komt vaker voor bij jongere personen 1,2, vooral bij zwangere vrouwen3, en de incidentie is de afgelopen jaren gestaag gestegen. Een epidemiologisch onderzoek uitgevoerd in Australië geeft aan dat de jaarlijkse incidentie van CVST varieert van 13,0 tot 15,7 gevallen per miljoen individuen4. In de Verenigde Staten vertoont de incidentie van CVST een stijgende trend met de leeftijd. Toch is de piekleeftijd van aanvang bij vrouwen lager dan bij mannen5. Tussen 2021 en 2023 kregen 43 per miljoen patiënten die spoedeisende hulp in de Verenigde Staten bezochten de diagnose CVST6. In klinische omgevingen is multiple sinustrombose de meest waargenomen vorm, goed voor ongeveer 57,14% van alle gevallen. Hierop volgt betrokkenheid van de sinus sagittale superior (SSS; 16,19%), de transversale sinus (11,43%) en de sigmoïdale sinus (8,57%)4. De belangrijkste klinische manifestaties zijn hoofdpijn, die gepaard kan gaan met epilepsie, bewustzijnsstoornissen en focale neurologische symptomen 7,8,9. Deze manifestaties zijn echter niet specifiek. Ongeveer 60% van de patiënten met CVST ontwikkelt een cerebrale veneuze infarct of bloeding, wat wordt gecategoriseerd als ernstige CVST10,11. Hoewel de behandeling met CVST antistollingstherapie en chirurgische ingrepen omvat, blijft het sterftecijfer van ernstige CVST zo hoog als 34,2%. Deze hoge sterfte kan worden toegeschreven aan het feit dat de onderliggende pathofysiologische mechanismen van ernstige CVST nog niet volledig zijn begrepen. Een geschikt diermodel van ernstige CVST is daarom een essentieel experimenteel instrument om de pathogenese, pathofysiologische progressie en mogelijke therapeutische strategieën te onderzoeken12.

Momenteel kunnen de methoden voor het induceren van CVST-diermodellen over het algemeen worden ingedeeld in de volgende typen: permanente ligatie13,14, chemische inductie 15,16,17, interventionele benaderingen 18,19, implantatie van zelfgemaakte grafts 20,21,22, en bipolaire elektrostolling 23,24. De door eerdere diermodellen geïnduceerde trombus had een korte duur en kon niet tegelijkertijd meerdere veneuze sinus-trombi en een grote-area veneuze cerebrale infarct induceren. Daarom is de ontwikkeling van een ernstig CVST-model waarbij meerdere veneuze sinussen gelijktijdig betrokken zijn, een dringende prioriteit geworden. De methode van semi-ligatie gecombineerd met ferrichloride en trombine kan een nieuw ratmodel van ernstige CVST opzetten. Bovendien simuleert het nieuwe ernstige CVST-model het pathofysiologische proces van ernstige CVST bij mensen nauwkeuriger via drie belangrijke aspecten: veneuze sinus-trombusbelasting, veneuze cerebrale infarct en verstoring van de bloed-hersenbarrière. Dit model is toepasbaar op onderzoek naar pathofysiologische mechanismen en behandelstrategieën voor ernstige CVST. Dit nieuwe rattenmodel kan in de toekomst worden gebruikt om het pathofysiologische mechanisme van ernstige CVST te onderzoeken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het experimentele protocol werd goedgekeurd door het Animal Experiments and Experimental Animal Welfare Committee van de Capital Medical University (AEEI-2020-119) in Beijing, China, en werd uitgevoerd in overeenstemming met de voorschriften van de Animal Care and Use Committee van de instelling.

1. Diervoorbereiding

  1. Wijs gezonde volwassen mannelijke Sprague-Dawley (SD) ratten, met een gemiddeld lichaamsgewicht van 300 ± 10 g, willekeurig toe aan de experimentele groep of de schijnoperatiegroep. Alle dieren werden onderhouden op een afwisselende 12 uur licht/donker cyclus met toegang tot voedsel en water en libitum.

2. Toepassing van PSI

  1. Gebruik PSI om continu veranderingen in de cerebrale bloedstroom (CBF) binnen de SSS van ratten gedurende het modelleerproces te monitoren. Selecteer een vast cirkelvormig gebied binnen de SSS als het interessegebied (ROI). Door de veranderingen in de CBF van de ROI tijdens de operatie te monitoren, bepaal men de voltooiing van semi-ligatie en het succes van de trombusinductie.

3. Vestiging van het strenge CVST-rattenmodel

  1. Verdoof ratten met 5% enflurane, met een gasmengsel bestaande uit 70% lachgas en 30% zuurstof via een anesthesiemasker. Houd de concentratie enfluraan gedurende de hele operatie binnen het bereik van 1%-2%. Plaats de verdoofde ratten in de buikligging met hun hoofd vast op de middenlijn met behulp van een stereotaxisch frame. Houd de lichaamstemperatuur gedurende de operatie op 37 ± 0,5 °C met behulp van een thermostatisch verwarmingskussen.
  2. Maak een lengtesnede van 1,5 cm langs de middenlijn van het schedelgebied van de rat. Ontleed het subcutane weefsel om de onderliggende schedel bloot te leggen.
  3. Onder microscopische visualisatie maak je een longitudinaal schedelvenster (10 x 4 mm) tussen de bregma en de lambda met een hogesnelheidsboor. Blootstelling van de SSS en de bilaterale cerebrale cortex terwijl de integriteit van de dura mater behouden blijft. Tijdens het craniale boorproces koelt u de boorbit continu af met gewone zoutoplossing om thermische schade aan de dura mater en cortex te voorkomen.
  4. Na blootstelling aan SSS beoordeel je de CBF van de ROI in de SSS met behulp van de PSI en registreer je de bijbehorende gegevens. Semi-ligate de SSS rostraal en caudaal met een 8-0 polyamide hechtingen onder microscopische observatie.
    OPMERKING: Bij het ligateren van de SSS moet de kracht matig zijn en niet overdreven. Anders kan een semi-ligatie-effect niet worden bereikt. Ligatering moet idealiter in één enkele continue procedure worden uitgevoerd. Herhaalde ligatpogingen kunnen resulteren in perforatie van de SSS, waardoor het succes van modelfabricage in gevaar komt.
  5. Gebruik de PSI om de CBF van de ROI te beoordelen die zich bevindt in het geligeerde segment van de SSS, waarbij wordt bevestigd dat de CBF was afgenomen tot ongeveer 50% van dat niveau vóór semi-ligatie. Noteer de resultaten systematisch.
  6. Onder lichtbeschermde omstandigheden doop je een 3-0 zijden draad van 7 mm in 40% ferrichloride en gebruik je deze om het oppervlak van de SSS-ligatieplaats gedurende 5 minuten te bedekken. Was het veld met gewone zoutoplossing nadat de zijdedraad is verwijderd.
  7. Injecteer 0,1 mL trombineoplossing (500 U/mL) in de sinusholte van het geligeerde segment met een microinjector binnen 1 minuut. Herhaal de injectie nog twee keer achter elkaar, voor een totale trombinedosis van 150 U. Trombinereflux naar de epidurale ruimte leidde niet tot slechte trombose.
    1. Om de injectie van trombine in de SSS te vergemakkelijken, buig je de microinjectornaald voorzichtig vóór het inbrengen. Deze aanpassing zorgt voor een betere controle over de hoek van de naald tijdens het prikpunt en helpt onbedoelde penetratie door de SSS te voorkomen.
  8. Evalueer de CBF van de ROI opnieuw met behulp van de PSI na de trombine-injectie. Zorg ervoor dat de resultaten een significante daling van CBF bevestigen vergeleken met na semi-ligatie, wat wijst op succesvolle inductie van trombose. Registreer systematisch gegevens voor verdere analyse.
  9. Sluit het botraam af met botwas, gevolgd door het hechten van de incisie. Na de operatie dient u ketoprofen (5 mg/kg) subcutaan toe aan elke rat om de postoperatieve pijn te verlichten.
  10. In de schijnoperatiegroep wordt alleen de craniotomie uitgevoerd, zonder extra chirurgische ingrepen.

4. Last van veneuze sinustrombose en cerebrale infarct

  1. Evalueer de last van veneuze sinus-trombose op drie momenten: 1 dag, 2 dagen en 7 dagen na het aantreden van het model. Offert ratten en voert hartperfusie uit met normale zoutoplossing op verschillende tijdstippen.
  2. Voer een craniotomie uit om visueel de mate van veneuze sinus-trombose te beoordelen. Isoleer de trombus en onderwerp aan kwantitatieve analyse. Snijd het hersenweefsel uit en snijd het in 2 mm dikke coronale sneden.
  3. Dompel de plakjes onder in een 2% TTC-oplossing en incubeer ze 20 minuten in een 37 °C waterbad om het verkleuren te vergemakkelijken. Hierna beoordeel je visueel de cerebrale veneuze infarct en kwantificeer je het infarctvolume met behulp van de ImageJ-software voor de daaropvolgende statistische analyse.
    Infarctvolume = Oppervlakte van infarct in vierkante mm x dikte [2 mm]

5. Verstoring van de doorlaatbaarheid van de bloed-hersenbarrière (BBB)

  1. Op de tweede dag na de operatie selecteren ze willekeurig ratten uit zowel de modelgroep als de schijnoperatiegroep en geven ze een intraveneuze injectie van 2% Evans blue (EB) via de staartvene.
  2. Na 2 uur succesvolle toediening van de injectie, euthanasen de ratten en perfuseren met fosfaatgeborste zoutoplossing (PBS) via de linkerventrikel. Oogst het hersenweefsel en snijd ze in plakken van 2 mm dikke delen om de mate van EB-penetratie te beoordelen.

6. Statistische analyse

  1. Voer statistische analyses uit met SPSS 17.0-software. Presenteer meetgegevens als gemiddelde ± standaarddeviatie. Gebruik eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) of een onafhankelijke steekproef t-test voor groepsvergelijkingen.
  2. Voor de analyse van continue variabelen die op meerdere tijdstippen binnen dezelfde groep worden gemeten, gebruik herhaalde metingen (ANOVA) om intergroepverschillen over tijdstippen te beoordelen. Een p-waarde van minder dan 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Modelleerproces
Figuur 1A toont de SSS van de rat, zoals aangeduid met de pijl. De rostrale en caudale van de SSS werden semi-geligeerd (Figuur 1B), gevolgd door het aanbrengen van met ferricchloride doordrenkte draad op het oppervlak van geligeerde gebieden (Figuur 1C). Trombine werd vervolgens in de geligeerde segmenten geïnjecteerd om trombose te induceren. Het gebied dat doo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Een nieuw rattenmodel van ernstige CVST, geconstrueerd door semi-ligatie gecombineerd met ferrichloride en trombine, kan niet alleen bloedstasis en endotheelschade simuleren, maar ook de hypercoagulaleerbare toestand van bloed, dat wil zeggen, het simuleert de drie elementen van trombosevorming25. Wat nog spannender is, is dat het rattenmodel dat met deze methode is ontwikkeld, epileptische aanvallen kan vertonen. Epileptische aanvallen vormen een opvallende klini...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Wij danken het Institute of Critical Brain Diseases van de Capital Medical University voor hun technische ondersteuning. Deze studie werd ondersteund door de Beijing Natural Science Foundation (nr. 7182064).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2,3,5-trifenyltetrazoliumboorchlorideSigma-Aldrich
40% ijzerchloride Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., China
Evans blauw Sigma-Aldrich
Verwarmingskussen Harvard Apparatus Holliston, MA, USA50-7061-f, 
Hogesnelheids tandboormachine Saeshin, Busan, Zuid-KoreaStrong-207B
Laser speckle meter PeriCam PSI System, Zweden
MicroscoopCarl Zeiss, Inc., Berlijn, Duitsland
Polyamide hechtdraad Ningbo Chenghe Micro Apparatus Factory, China
Stereotactisch frameDavid Kopf Instruments, Tujunga, Californië, VS
TrombineChang Chun Lei Yunshang Pharmaceutical Co., Ltd., China

Referenties

  1. Silvis, S. M., de Sousa, D. A., Ferro, J. M., Coutinho, J. M. Cerebral venous thrombosis. Nat Rev Neurol. 13 (9), 555-565 (2017).
  2. Ferro, J. M., Aguiar de Sousa, D. Cerebral venous thrombosis: an update. Curr Neurol Neurosci Rep. 19 (10), 74(2019).
  3. Kashkoush, A. I., et al. Cerebral venous sinus thrombosis in pregnancy and puerperium: A pooled, systematic review. J Clin Neurosci. 39 (5), 9-15 (2017).
  4. Devasagayam, R., Wyatt, B., Leyden, J., Kleinig, T. Cerebral venous sinus thrombosis Incidence Is Higher Than Previously Thought: A Retrospective Population-Based Study. Stroke. 47 (9), 2180-2182 (2016).
  5. Payne, A. B., et al. Epidemiology of cerebral venous sinus thrombosis and cerebral venous sinus thrombosis with thrombocytopenia in the United States, 2018 and 2019. Res Pract Thromb Haemost. 6 (2), e12682(2022).
  6. Ruderman, A., Hogan, A., Epley, C., Courtney, D. M., Milman, B. Epidemiology of Cerebral Venous Sinus Thrombosis: 2021-2023. Cureus. 17 (10), e93654(2025).
  7. Singh, R. J., Saini, J., Varadharajan, S., Kulkarni, G. B., Veerendrakumar, M. Headache in cerebral venous sinus thrombosis revisited: exploring the role of vascular congestion and cortical vein thrombosis. Cephalalgia. 38 (3), 503-510 (2018).
  8. Mahale, R., et al. Acute seizures in cerebral venous sinus thrombosis: what predicts it. Epilepsy Res. 123 (7), 1-5 (2016).
  9. Luo, Y., Tian, X., Wang, X. Diagnosis and treatment of cerebral venous thrombosis: a review. Front Aging Neurosci. 30 (1), 102(2018).
  10. Kowoll, C. M., et al. Severe cerebral venous and sinus thrombosis: Clinical course, imaging correlates, and prognosis. Neurocritical care. 25 (3), 392-399 (2016).
  11. Stam, J., Majoie, C. B. L. M., van Delden, O. M., van Lienden, K. P., Reekers, J. A. Endovascular thrombectomy and thrombolysis for severe cerebral sinus thrombosis: A prospective study. Stroke. 39 (5), 1487-1490 (2008).
  12. Yenigün, M., Jünemann, M., Gerriets, T., Stolz, E. Sinus thrombosis: do animal models really cover the clinical syndrome. Ann Transl Med. 3 (10), 138(2015).
  13. Frerichs, K. U., et al. Cerebral sinus and venous thrombosis in rats induces long-term deficits in brain function and morphology--evidence for a cytotoxic genesis. J Cereb Blood Flow Metab. 14 (2), 289-300 (1994).
  14. Li, G., et al. A new thrombosis model of the superior sagittal sinus involving cortical veins. World Neurosurg. 82 (1/2), 169-174 (2014).
  15. Röttger, C., et al. A new model of reversible sinus sagittalis superior thrombosis in the rat: magnetic resonance imaging changes. Neurosurgery. 57 (3), 573-580 (2005).
  16. Chen, C., et al. Photothrombosis combined with thrombin injection establishes a rat model of cerebral venous sinus thrombosis. Neuroscience. 306 (10), 39-49 (2015).
  17. Wei, Y., Deng, X., Sheng, G., Guo, X. B. A rabbit model of cerebral venous sinus thrombosis established by ferric chloride and thrombin injection. Neurosci Lett. 662 (1), 205-212 (2018).
  18. Wang, J., et al. A new model of reversible superior sagittal sinus thrombosis in rats. Brain Res. 1181 (11), 118-124 (2007).
  19. Wang, J., et al. Development of a new model of transvenous thrombosis in the pig superior sagittal sinus using thrombin injection and balloon occlusion. J Neuroradiol. 37 (2), 109-115 (2010).
  20. Yang, H., Meng, Z., Zhang, C., Zhang, P., Wang, Q. Establishing a new rat model of central venous sinus thrombosis and analyzing its pathophysiological and apoptotic changes. J Neurosci Methods. 203 (1), 130-135 (2012).
  21. Bourrienne, M. C., et al. A Novel Mouse Model for Cerebral Venous Sinus Thrombosis. Transl Stroke Res. 12 (6), 1055-1066 (2021).
  22. Mu, S., et al. A novel rat model for cerebral venous sinus thrombosis: verification of similarity to human disease via clinical analysis and experimental validation. J Transl Med. 20 (1), 174(2022).
  23. Sakaki, T., Kakizaki, T., Takeshima, T., Miyamoto, K., Tsujimoto, S. Importance of prevention of intravenous thrombosis and preservation of the venous collateral flow in bridging vein injury during surgery: an experimental study. Surg Neurol. 44 (2), 158-162 (1995).
  24. Cokluk, C., Aydin, K., Yemisci, M., Colakoglu, S., Kaplan, S. Cortical anastomotic veins occlusion in the rat including the assessment of cerebral swelling. J Neurosci Methods. 156 (1-2), 203-210 (2006).
  25. Kyrle, P. A., Eichinger, S. Deep vein thrombosis. Lancet. 365, 1163-1174 (2005).
  26. Lindgren, E., et al. Acute symptomatic seizures in cerebral venous thrombosis. Neurology. 95 (12), e1706-e1715 (2020).
  27. Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric Chloride-induced Murine Thrombosis Models. J Vis Exp. (115), e54479(2016).
  28. Rahal, J. P., Malek, A. M., Heilman, C. B. Toward a better model of cerebral venous sinus thrombosis. World Neurosurg. 82 (1-2), 50-53 (2014).
  29. Duan, J., et al. Identifying Biomarkers Associated with Venous Infarction in Acute/Subacute Cerebral Venous Thrombosis. Aging Dis. 12 (1), 93-101 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Ernstige CVSTthrombine injectiesinus sagittalis superiorveneus cerebraal infarctbloed hersenbarri reTTC kleuring

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.