Driedimensionale visualisatie van lymfevaten in menselijke huid en hun structurele veranderingen tijdens lymfoedeem

Samenvatting

Hier werd een driedimensionale visualisatie van de lymfevatstructuur in de menselijke huid bereikt met behulp van confocale of lichte bladmicroscopie na toepassing van drie verschillende weefselreinigingstechnieken. Combinaties van deze methoden met immunohistochemische kleuring geven inzicht in functionele veranderingen in lymfevaten tijdens het verloop van lymfoedeem.

Samenvatting

De lymfevaten van de huid, bestaande uit haarvaten en verzamelvaten, spelen een sleutelrol bij het verwijderen van afvalstoffen en immuunresponsen, en zijn essentieel voor het behoud van de homeostase van het weefsel. De menselijke huid, met haar drie lagen – epidermis, dermis en subcutane vetten – bevat echter een dichte extracellulaire matrix rijk aan collageen, waardoor het visualiseren van lymfenetwerken in drie dimensies een uitdaging is. Om deze beperking aan te pakken, introduceert dit artikel drie verschillende methoden, elk afgestemd op specifieke moleculen van belang en experimentele doelstellingen, voor de driedimensionale visualisatie van menselijke huidlymfecellen met behulp van weefselverwijderingsreagentia in combinatie met confocale of lichtbladmicroscopie. Door adherens-junctionmoleculen in lymfatische endotheelcellen via immunohistochemie te targeten, werden structurele veranderingen met duidelijke functionele implicaties, met name de karakteristieke knop-tot-ritsachtige remodellering van capillaire junctions, geëvalueerd in huidweefsel afkomstig van patiënten met secundair lymfoedeem. Deze driedimensionale visualisatietechniek onthult vaatstructuren die niet te onderscheiden zijn via conventionele histologische weefselanalyse, waardoor het begrip van de structuur en functie van lymfevaten wordt vergroot.

Inleiding

Er is toenemende interesse in de functie van lymfevaten sinds de erkenning van hun rol bij het handhaven van de huidhomeostase, voorbij hun goed vastgestelde betrokkenheid bij kankermetastasen ^1,2. Lymfevaten zijn structureel verdeeld in haarvaten en verzamelvaten, elk met eigen kenmerken. Lymfatische haarvaten bestaan uit een enkelvoudige structuur gevormd door lymfatische endotheelcellen en dienen als eerste verzamelplaatsen voor interstitiële vloeistof, afvalproducten en immuuncellen. Daarentegen hebben verzamelende lymfevaten een dubbellaagse structuur met gladde spiercellen die de lymfe-endotheellaag omringen, waardoor het actief transport van lymfevloeistof die door het capillaire netwerk wordt verzameld naar de centrale circulatie^{mogelijk maakt}. Muizenmodellen zijn gebruikt om de structurele kenmerken, met name van bronchiale lymfevaten, te verduidelijken en hebben aangetoond hoe ontstekingsaandoeningen structurele herstructurering induceren⁴. Eerder onderzoek toonde aan dat door ultraviolet veroorzaakte ontsteking abnormale verwijding van lymfatische haarvaten veroorzaakt, wat hun vloeistofopvangfunctie aantast. De moleculaire mechanismen die aan deze disfunctie ten grondslag liggen, werden geïdentificeerd, waarbij specifiek werd aangetoond dat verhoogde VEGF-A-expressie in combinatie met een verminderde VEGF-C-expressie deze structurele veranderingen^{aandrijft 5,6,7}.

Hoewel driedimensionale visualisatietechnieken het begrip van het lymfenetwerk in muismodellen ^8,9 aanzienlijk hebben vergroot, is vergelijkbare structurele analyse van menselijke lymfevaten uitdagend gebleven. Deze analytische kloof ontstaat door de moeilijkheden bij het werken met menselijk weefsel, waaronder beperkte beschikbaarheid van monsters en de technische problemen die gepaard gaan met het realiseren van uitgebreide driedimensionale beeldvorming. In het bijzonder vormt de huid, gekenmerkt door een drielaagse structuur bestaande uit de epidermis, dermis en onderhuidig vet, en functioneert als barrière tegen de externe omgeving, grotere uitdagingen dan andere zachte organen. Bovendien brengt menselijke huid duidelijke analytische uitdagingen met zich mee ten opzichte van muismodellen, waaronder een grotere weefseldikte, wat diepe beeldvorming belemmert. Daarnaast creëren de overvloedige extracellulaire matrixcomponenten, met name collageen, samen met hun leeftijdsgebonden structurele veranderingen, optische barrières die de effectiviteit van opkomende weefselreinigingstechnieken verminderen, die lymfebeeldvorming bij muizen^{hebben gerevolutioneerd}.

Verschillende weefselverwijderingsmiddelen zijn eerder getest om menselijke huidhaarvaten te visualiseren, waarbij hun weefselcompatibiliteit^{werd aangetoond 11}. Na dat werk werden weefselreinigingsreagentia met succes gebruikt om lymfevaten van de menselijke huid in drie dimensies¹² te visualiseren. Door zich te richten op de adherens-verbindingen van lymfatische endotheelcellen, werden structurele veranderingen in lymfevaten die samenhangen met de progressie van lymfoedeem geïdentificeerd¹³. Het doel van dit artikel is om in detail de procedures te beschrijven voor driedimensionale visualisatie van menselijke huidlymfevaten met combinaties van drie huidreinigingstechnieken, samen met confocale microscopie en lichtbladmicroscopie, en immunohistochemische kleuring die is afgestemd op specifieke onderzoeksdoelstellingen. In deze studie richten we ons uitsluitend op verse menselijke huidweefsels die op de dag van excisie zijn vastgesteld en geen vries-dooicycli hebben ondergaan, maar bieden deze technieken inzicht in niet alleen de structurele veranderingen van lymfevaten tijdens ziekte en veroudering, maar ook in de bijbehorende functionele veranderingen.

Protocol

Huidmonsters van menselijke proefpersonen werden verkregen in het Chiba University Hospital (Chiba, Japan). Alle procedures met menselijke proefpersonen werden goedgekeurd door de Institutional Review Board van het Chiba University Hospital en het Shiseido Global Innovation Center, en alle proefpersonen gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Voorbehandeling van menselijke huidmonsters

1. Verwijder het subcutane weefsel van verwijderde exemplaren bij het verkrijgen.
   OPMERKING: Het interval tussen huidverwijdering en verwerving was ongeveer h. Tijdens het transport werd het weefsel ondergedompeld in DMEM en op ijspakken bewaard.
2. Plaats de monsters met de epidermale kant naar beneden op een 60 °C warme plaat gedurende 45 seconden om de epidermis en dermis te scheiden.
3. Dompel de exemplaren direct onder in ijskoude PBS.
4. Scheid de epidermis en dermis met een pincet.
5. Bevestig de dermale delen in 4% paraformaldehyde bij 4°C gedurende 16 uur en was daarna met PBS voordat je het gebruikt.
   OPMERKING: Na fixatie werden de monsters opgeslagen in PBS bij 4 °C en werden de immunokleuringsstappen binnen enkele maanden gestart.
   VOORZICHTIG: de PFA-oplossing is giftig. Alle voorbereiding en hantering moet plaatsvinden in een dampkap terwijl de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen worden gedragen.

2. Volledige immunokleuring gecombineerd met zuiveringsreagentia

1. iDISCO-techniek
   1. Snoei de exemplaren tot ongeveer 5 mm × 5 mm × 5 mm groot.
   2. Breng de monsters over in 5% Triton X-100 en 2,5% Tween 20 in PBS op een orbitale shaker ingesteld op 50 rpm bij 24 °C gedurende 16 uur voor permeabilisatie.
   3. Was de monsters met PBS op 24 °C gedurende 1 uur en herhaal het proces drie keer.
   4. Dompel de monsters onder in vers bereide blokkeringsbuffer A (1% BSA, 0,1% Tween 20, 0,03% natriumazide in PBS) op een orbitale shaker ingesteld op 50 rpm bij 24 °C gedurende 72 uur.
   5. Incubeer de monsters met primair antilichaam tegen podoplanine (1:100) in een blokkerende buffer A op een orbitale shaker ingesteld op 50 rpm bij 37 °C gedurende 72 uur.
   6. Was de monsters met wasfilter A (0,1% Tween-20 in PBS) op 24 °C gedurende 1 uur, en herhaal het proces drie keer. Houd vervolgens de monsters in wasdemper A op een orbitale shaker ingesteld op 50 rpm bij 4 °C gedurende 72 uur.
   7. Incubeer de monsters met secundair antilichaam tegen muis IgG geconjugeerd aan Alexa Fluor 647 (1:1000) in een blokkeringsbuffer A op een orbitale shaker ingesteld op 50 rpm bij 37 °C gedurende 72 uur.
   8. Herhaal stap 1.6.
   9. Incubeer de exemplaren met 50% MeOH bij 24 °C gedurende 3 uur.
   10. Incubeer de exemplaren met 70% MeOH bij 24 °C gedurende 3 uur.
   11. Incubeer de exemplaren met 100% MeOH bij 24 °C gedurende 16 uur.
   12. Incubeer de monsters met dichloormethan bij 24 °C gedurende 15 minuten, en herhaal het proces twee keer.
   13. Maak de monsters 16 uur schoon met dibenzylether bij 24 °C.
       OPMERKING: Als het weefsel op dit punt nog niet transparant is geworden, zal verder wachten leiden tot geen significante verbetering.
   14. Maak beelden van de monsters met een lichtbladmicroscoop.
       OPMERKING: Gebruik een lichtblad met een EC Plan-Neofluar 5×/0,16 doel; stel verlichting (excitatie) in op 63 nm en detectie op 648 nm; een Z-stack met een stapgrootte van 5,8 μm verkrijgen.
       VOORZICHTIG: Methanol, dichloormethan en dibenzylether zijn gevaarlijk. Alle voorbereiding en hantering moet plaatsvinden in een dampkap terwijl de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen worden gedragen.
2. Rapiclear 1.52 reagens
   1. Knip de exemplaren tot ongeveer 5 mm × 5 mm × 2 mm groot.
   2. Breng de monsters over in 2% Triton-X 100 in PBS op een orbitale shaker ingesteld op 50 rpm bij 24 °C gedurende 16 uur voor permeabilisatie.
   3. Dompel de monsters onder in vers voorbereide blokkeerbuffer B (5% donkey serum en 1% Triton-X 100 in PBS) op een orbitale shaker ingesteld op 50 rpm bij 4 °C gedurende 16 uur.
   4. Incubeer de monsters met primaire antilichamen tegen podoplanine en VE-cadherine (beide op 1:100) in een blokkerende buffer B op een orbitale shaker ingesteld op 50 rpm bij 4 °C gedurende 72 uur.
   5. Was de monsters met wasbuffer B (3% NaCl en 0,2% Triton-X 100 in PBS) op 24 °C gedurende 1 uur, en herhaal het proces drie keer. Houd vervolgens de monsters in wasbuffer B op een orbitale shaker ingesteld op 50 rpm bij 4 °C gedurende 16 uur.
   6. Was de monsters 1 uur met PBS op 24 °C.
   7. Incubeer de exemplaren met secundaire antilichamen tegen muis IgG en konijn IgG, geconjugeerd met Alexa Fluor 647 en 568 respectievelijk (beide op 1:1000), in blokkerende buffer B op een orbitale shaker ingesteld op 50 rpm bij 4 °C gedurende 16 uur.
   8. Herhaal stappen 1.5. en 1,6.
   9. Maak de monsters schoon met minstens 5 keer het monstervolume Rapiclear 1,52 bij 24 °C gedurende 16 uur.
      OPMERKING: Het opruimen van de perifere delen van het weefsel werd waargenomen in minder dan 1 uur.
   10. Plaats de vrijgemaakte monsters in een polydimethylsiloxaan-gelkamer geplaatst op een dekmantel met vers Rapiclear 1.52-reagens.
   11. Beeld de monsters in beeld met een confocale microscoop.
       OPMERKING: Gebruik een confocale microscoop met een Plan-Apochromat 10×/0,45 M27 objectief; stel excitatie in op 633 nm en 561 nm, en detectiebereik 641-754 nm en 566-628 nm, met een GaAsP-detector; verkrijg een Z-stack met een stapgrootte van 3,15 μm.
3. CUBIC-techniek
   1. Snoei de exemplaren tot ongeveer 5 mm × 5 mm × 3 mm groot.
   2. Dompel de monsters in 50% CUBIC-L bij 24 °C gedurende 24 uur als voorbehandeling voor delipidatie.
   3. Breng de monsters over in 100% CUBIC-L op een orbitale shaker die staat op 50 toeren per minuut bij 37 °C gedurende 7 dagen voor delipidatie.
   4. Was de monsters 24 uur met PBS op kamertemperatuur.
   5. Dompel de monsters onder in vers voorbereide blokkeerbuffer A op een orbitale shaker ingesteld op 50 rpm bij 24 °C gedurende 72 uur.
   6. Incubeer de monsters met primaire antistoffen tegen VE-cadherine, podoplanine en CD31 (respectievelijk 1:100, 1:100 en 1:200) in blokkeringsbuffer A op een orbitale shaker ingesteld op 50 rpm bij 37 °C gedurende 72 uur.
   7. Was de monsters met wasdemper A op 24 °C gedurende 1 uur. Herhaal het proces drie keer en houd de monsters vervolgens in wasbuffer A op een orbitale shaker ingesteld op 50 rpm bij 4 °C gedurende 72 uur.
   8. Incubeer de exemplaren met secundaire antilichamen tegen muis-IgG, konijnen-IgG en schapen-IgG, geconjugeerd aan Alexa Fluor 647, 568 en 488 respectievelijk (allemaal op 1:1000), in blokkeringsbuffer A op een orbitale shaker ingesteld op 50 rpm bij 37 °C gedurende 72 uur.
   9. Herhaal stap 3.7.
   10. Verwijder de exemplaren vooraf met 50% CUBIC-R+(M) bij 24 °C gedurende 16 uur.
   11. Maak de exemplaren schoon met 100% CUBIC-R+(M) bij 24 °C gedurende 16 uur.
       OPMERKING: Als het weefsel op dit punt nog niet transparant is geworden, zal verder wachten leiden tot geen significante verbetering.
   12. Beeld de monsters in beeld met een confocale microscoop.
       OPMERKING: Gebruik een confocale microscoop met een Plan-Apochromat 20×/0,8 M27 objectief; stel excitatie in op 633 nm, 561 nm en 488 nm, en detectiebereik 641-754 nm, 566-628 nm en 479-550 nm, met een GaAsP-detector; verkrijg een Z-stack met een stapgrootte van 0,78 μm.

Resultaten

Verschil in lichttransmissie van schoongemaakt menselijk huidweefsel met en zonder epidermis
Figuur 1 toont representatieve foto's van menselijke huidmonsters met en zonder epidermis, na permeabilisatie en het verwijderen met Rapiclear 1.52-reagens. Epidermale verwijdering verbetert de weefseltransparantie door melanine, een krachtige lichtabsorber, te elimineren, zoals bevestigd door de verbeterde zichtbaarheid van de zwarte lijn onder ...

Discussie

Driedimensionale visualisatie van lymfenetwerken in biologische weefsels is van cruciaal belang voor het begrijpen van hun structurele kenmerken en fysiologische functies, evenals pathologische veranderingen. Dit protocol presenteert drie verschillende methoden voor het verwijderen van weefsels die geoptimaliseerd zijn voor menselijk huidweefsel, elk afgestemd op specifieke observatiedoelen.

Epidermale verwijdering wordt beschouwd als een cruciale stap om mela...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Anti-CD31 antilichaam	R&D Systems	AF806	verdunning bij 1:200
Anti-Podoplanin antilichaam	Dako	M3619	verdunning bij 1:100
Anti-VE-cadherin antilichaam	Cell Signaling Technology	#2500	verdunning bij 1:100
CUBIC-L	Tokyo Chemical Industry	T3740
CUBIC-R+(M)	Tokyo Chemical Industry	T3741
DMEM, lage glucose, pyruvaat	Thermo Fisher SCIENTIFIC	11885084
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 647	Thermo Fisher SCIENTIFIC	A-31571	verdunning bij 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher SCIENTIFIC	A10042	verdunning bij 1:1000
Donkey anti-Sheep IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher SCIENTIFIC	A-11015	verdunning bij 1:1000
Rapiclear 1.52	Sunjin Lab	RC152001
ZEISS Lightsheet Z.1 Microscoop	Carl Zeiss
ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscoop	Carl Zeiss