Een enkelmolecuul FRET assay maakt kwantitatieve analyse van Hfq-gemedieerde annealing tussen bacteriële sRNA's en mRNA's mogelijk, waardoor de interactiekinetiek en stabiliteit gemeten kunnen worden. Representatieve resultaten tonen aan hoe zaadlengte, Hfq-bindingsmotieven en motiefafstand de vorming van RNA-duplex beïnvloeden.
Onderzoeksartikel
Effect van zaadlengte en bindingsmotieven op Hfq-gemedieerde sRNA-mRNA-gloeiing geanalyseerd met behulp van enkelmolecuul FRET
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het definiëren van de regels die annealing tussen bacteriële kleine RNA's (sRNA's) en hun mRNA-doelen regelen, is uitdagend omdat deze RNA's zeer heterogeen zijn qua volgorde en structuur. Om de bijdrage van individuele kenmerken te onderscheiden, varieerden we systematisch belangrijke determinanten, waaronder zaadsterkte, Hfq-bindende motieven en de afstand daartussen. De effecten van deze kenmerken op de stabiliteit van sRNA-mRNA duplex werden getest met behulp van enkelmolecuul Förster-resonantie energieoverdracht (smFRET), waarmee individuele RNA-moleculen op millisecondetijdschaal worden gemonitord en toegang worden gelaten tot dynamische gebeurtenissen die vaak in ensemble-assays worden verborgen.
We tonen aan dat korte zaadgebieden (4-5 bp) onstabiele, kortlevende complexen vormen, terwijl langere zaden (8-10 bp) stabiele duplexen produceren. Het verlengen van Hfq-bindingsmotieven of het introduceren van een spacer tussen de bindingsplaatsen op mRNA verlengde de interactielevensduur verder, wat het belang van motiefsterkte en ruimtelijke ordening in Hfq-gemedieerde annealingefficiëntie benadrukte. Bovendien biedt deze benadering een robuust en reproduceerbaar kader voor het analyseren van RNA-interactiedynamiek op enkelmolecuulresolutie en voor het onderzoeken van RNA-chaperonmechanismen.
Inleiding
Bacteriële genexpressie wordt op post-transcriptieniveau uitgebreid gereguleerd door kleine RNA's. Deze korte (meestal 50-300 nt) RNA's werken door basenparing met doel-mRNA's1. In veel gevallen neien sRNA's naar ribosoombindende plaatsen om translatie te onderdrukken of mRNA-verval te triggeren door RNases 2,3 te rekruteren. Hoewel deze interacties uitgebreid zijn bestudeerd met genetische en biochemische assays, leiden de meeste beschikbare benaderingen regulatie indirect af van stationaire effecten op RNA-niveaus of eiwitoutput, waardoor het moeilijk wordt om de onderliggende bindingsdynamiek te onderscheiden.
Efficiënte doelregulering vereist vaak de RNA-chaperon Hfq, een klein hexamerisch Sm-achtig eiwit 4,5. Hfq verlengt de halfwaardetijd van sRNA's door ze te beschermen tegen nucleasen6 en bevordert het annealen met doel-mRNA's 7,8. Hfq bereikt deze functies via drie verschillende RNA-bindende oppervlakken met verschillende voorkeuren: het distale vlak herkent AAN-motieven die gewoonlijk in mRNA's voorkomen, het proximale vlak bindt U-rijke sequenties die typisch zijn voor sRNA-terminatoren, en de rand interageert elektrostatisch met RNA-ruggengraat9. Hfq komt echter in veel lagere abundantie voor dan de totale pool van interacterende RNA's 10,11. Ondanks deze schijnbare beperking vinden nieuw gesynthetiseerde sRNA's hun doelwitten en triggeren ze regulatie binnen enkele minuten na transcriptie12. Deze paradox suggereert dat RNA-Hfq-interacties zeer dynamisch zijn, waarbij RNA's continu associëren en dissociëren in plaats van gebonden blijven in stabiele complexen13,14. Begrijpen hoe zulke tijdelijke interacties betrouwbare regulatie produceren, vereist experimentele toegang tot individuele bindingsgebeurtenissen in plaats van populatiegemiddelden.
Interacties tussen sRNA's en mRNA's worden gemedieerd door onvolmaakt complementaire zaadsequenties, die hun matchingsplaatsen binnen mRNA's moeten lokaliseren die vaak lang en sterk gestructureerd zijn. Daarnaast kan de afstand tussen het sRNA-zaadgebied en de Hfq-bindingsplaats op het mRNA aanzienlijk variëren met15, wat het annealingproces verder bemoeilijkt. Hfq helpt deze uitdagingen te overwinnen door sRNA's flexibel over te dragen tussen potentiële bindingsplaatsen op het doelwit, waardoor de kans op het vinden van de juiste paringsregio16 toeneemt. Hfq-gemedieerde paring kan ook lokale mRNA-structuren hermodelleren, waarbij basengepaarde gebieden tijdelijk worden ontwikkeld en anders ontoegankelijke sequenties blootgelegd worden. Dergelijke remodeling kan echter ook leiden tot niet-productieve of abortieve annealing-gebeurtenissen. Deze tijdelijke interacties kunnen soms worden gestabiliseerd door sterke Hfq-bindende motieven nabij de koppelingsplaats17. Ondanks deze flexibiliteit resulteren niet alle sRNA-mRNA-ontmoetingen in stabiele duplexvorming, en de factoren die de annealing-efficiëntie bepalen blijven slecht begrepen. In het bijzonder blijft het onduidelijk hoe individuele sequentiedeterminanten kwantitatief bijdragen aan bindingslevens en complexe stabiliteit.
Hier hebben we een minimaal gereconstitueerd enkelmolecuulsysteem vastgesteld dat stapsgewijze manipulatie van sequentiedeterminanten en directe meting van annealingkinetiek met smFRET mogelijk maakt. In dit systeem ontwierpen we RNA-paren met aanvankelijk inefficiënte annealing en veranderden systematisch belangrijke kenmerken, waaronder zaadsterkte, Hfq-bindingsmotiefsterkte en de afstand tussen deze sites, om te analyseren hoe individuele parameters duplexstabiliteit beïnvloeden. Door gedefinieerde sequentiekenmerken te isoleren in een gecontroleerd in vitro systeem, maakt deze aanpak de mechanistische ontleding van sRNA-targetingregels mogelijk, die moeilijk in vivo te ontwarren zijn vanwege netwerkcomplexiteit en indirecte regulerende effecten.
Protocol
Dit protocol beschrijft de single-molecule FRET assay om sRNA-mRNA annealing te monitoren. Het omvat procedures voor model-RNA-ontwerp, synthese, slidepassivatie en functionalisatie, single-molecule imaging en kwantitatieve data-analyse.
RNA-voorbereiding
Ontwerp de sRNA- en mRNA-sequenties in silico. Elk sRNA moet eindigen met een transcriptieterminator en een U-rijk Hfq-bindend motief bevatten, evenals een zaadsequentie die complementair is aan het doel-mRNA. Het bijbehorende mRNA moet AAN-herhalingen bevatten die dienen als een Hfq-bindend motief en een sequentie die complementair is aan het sRNA-zaadgebied. Sequenties buiten de Hfq-binding worden gerandomiseerd, waarbij AAN-motieven en U-rijke tracties worden vermeden om onbedoelde Hfq-interacties te voorkomen. Voeg een tether-complementaire sequentie toe aan het 3'-uiteinde van het mRNA om immobilisatie op het oppervlak tijdens beeldvorming mogelijk te maken. Voorspel RNA-secundaire structuren exclusief tether-complementaire sequentie met behulp van RNA-structuur via de webserver of lokaal18. Voor webgebaseerde analyse upload je FASTA-sequenties naar de RNAstructure Web Server (https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb) en selecteer je Predict a Secondary Structure. Gebruik standaardparameters (temperatuur 37 °C, geen vouwbeperkingen). Na berekening inspecteer je het structuurdiagram en de kans op vouwen. Regio's werden als geblokkeerd geclassificeerd als nucleotiden binnen het zaad- of Hfq-bindende motief een basenparingskans >60% hadden voorspeld. Sequenties die deze drempel overschreden, werden opnieuw ontworpen.
Bereid DNA-sjablonen voor in vitro transcriptie door overlappende oligonucleotiden uit te breiden met behulp van DNA-polymerase, volgens het protocol van de fabrikant. De primerconcentratie was elk 3 μM. Het thermocyclerprogramma werd gebruikt zoals aanbevolen door de fabrikant, behalve dat het aantal versterkingscycli werd teruggebracht tot 8, wat voldoende was om de primers te verlengen.
Transcribeer RNA bij 37 °C gedurende 3 uur tot nacht met T7 RNA-polymerase in een 1× transcriptiebuffer (80 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM spermidine, 10 mM NaCl), aangevuld met 1 mM NTP, 40 mM DTT en 30 mM MgCl2. Stop de reactie door EDTA toe te voegen aan een uiteindelijke concentratie van 30 mM. Voor RNA-precipitatie voeg je 1/10 volume 3 M NaOAc (pH 5,4) toe, gevolgd door 2,5-3 volumes ≥99% ethanol. Meng goed en laat het 1 uur incuberen bij -80 °C. Pellet-RNA door centrifugatie bij ≥20.000 × g gedurende 35 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant, was de pellet met 70% ethanol en laat het kort aan de lucht drogen. Los de RNA-pellet op in 20 μL van 8 M ureum en verhit het bij 90 °C gedurende 2 minuten. Zuiver het RNA op 8% polyacrylamide gels met 8 M ureum. Exciseer de banden van belang en elueer het RNA 's nachts in de elutiebuffer (0,3 M natriumacetaat, pH 5,4, 1 mM EDTA). Haal het RNA terug door ethanolprecipitatie (volg de instructies voor DNA-precipitatie) en los de pellet op in nucleasevrij water.
Om RNA's voor fluorescerende labeling voor te bereiden, voer je in vitro-transcriptie uit zoals beschreven, waarbij de reactie wordt aangevuld met 32 mM GMP om transcripten te genereren met een monofosfaat van 5'. Behandel het RNA met 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiamide hydrochloride19 (EDC) en imidazol om een aminegroep aan de 5'-kant te introduceren. Incubeer het sRNA in een carbonaat-bicarbonaatbuffer (pH 8,5) met ofwel Alexa Fluor 555 of Cy3 NHS-ester, volgens de instructies van de fabrikant. Zuiver het gemodificeerde RNA met behulp van chromatografiespinkolommen, precipiteer met ethanol en los de pellet op in nucleasevrij water. Bepaal de labelingsefficiëntie spectrofotometrisch door de absorptie te meten bij 260 nm en bij het kleurstofspecifieke absorptiemaximum met een Nanodrop of een equivalente spectrofotometer. Bereken RNA- en kleurstofconcentraties met behulp van de Beer-Lambertwet en de bijbehorende extinctiecoëfficiënten die door de fluorofoorfabrikant worden verstrekt. Labelingsefficiëntie wordt gedefinieerd als de molaire verhouding van kleurstof tot RNA en naderde routinematig 100%. Gelabelde RNA's kunnen worden opgeslagen bij -20 °C.
Bestel DNA-oligonucleotiden met een 3′-biotine-moiety en een 5′-amino C6-linker. Precipiteer DNA met ethanol en natriumacetaat zoals hierboven beschreven. Label de aminegroep met Cy5 NHS-ester in een carbonaat-bicarbonaatbuffer (pH 8,5) volgens de instructies van de fabrikant. Bepaal de concentratie van gelabeld DNA spectrofotometrisch zoals hierboven beschreven. Gelabelde DNA's kunnen worden opgeslagen bij -20 °C.
Hfq-zuivering
Kweek Escherichia coli BL21 (DE3) Δhfq::cat-sacB-cellen met het Hfq-expressieplasmide pET21b-EcHfq, waarin het E. coli hfq-gen wordt tot expressie gebracht vanuit een IPTG-induceerbare promotor. Hfq wordt uitgedrukt zonder affiniteitstag; het native eiwit bevat voldoende aan het oppervlak blootgestelde histidineresiduen om zuivering mogelijk te maken met Ni2+ affiniteitschromatografie. Kweek cellen in 1 L LB-Miller medium, aangevuld met 100 μg/mL ampicilline bij 37 °C tot een OD600 van 0,6. Induceer Hfq-expressie door IPTG toe te voegen aan een uiteindelijke concentratie van 1 mM en incubeer 4 uur bij 37 °C. Oogst de cellen door centrifugatie bij 5.000 × g gedurende 10 minuten, en suspendeer de pellet vervolgens opnieuw in 50 mL lysisbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 500 mM NH4Cl, 250 mM MgCl2, 1 mM 2-mercaptoethanol, Let op: 2-mercaptoethanol is giftig, grip in een dampkap). Lys de cellen door sonicatie op ijs met een pulsinstelling van 50% duty cycle. Pas drie 40-s pulsen toe met 1 minuut koelintervallen op ijs tussen pulsen. Centrifugeer het lysaat op 27.000 × g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Verhit het supernatant 45 minuten op 85 °C en centrifugeer daarna opnieuw onder dezelfde omstandigheden. Behandel het resulterende supernatant met RNase A (30 μg/mL) en DNase I (5 U/mL) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met zacht schudden, gevolgd door filtratie door een 0,45 μm filter. Breng het geklaarde lysaat toe op een affiniteitschromatografiekolom die vooraf is opgeladen met NiSO4. Was de kolom met een buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 500 mM NH4Cl, 0,5 mM 2-mercaptoethanol). Eluteer het eiwit met dezelfde buffer en een lineaire imidazolgradiëntconcentratie van 10 mM tot 1 M. Verzamel de fracties die Hfq bevatten en laad ze op een HiLoad 16/600 Superdex 200 grootte-uitsluitingschromatografiekolom in evenwicht met HB-buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 250 mM NH4Cl, 1 mM EDTA, 10% glycerol). Bedien de kolom volgens de instructies van de fabrikant. Een representatieve SDS-PAGE-analyse van Hfq-zuivering is weergegeven in aanvullende figuur 1. Concentreer het gezuiverde eiwit indien nodig met centrifugaalfilters (3 kDa MWCO). Gezuiverde Hfq aliquots kunnen worden opgeslagen bij -80 °C.
Experimenten met één molecuul
Passivatie van kwartsgeleidingen20
Bereid kwartsgeleiders voor met vijf parallelle gaten (0,8 mm diameter) die bij elke lange rand zijn geboord. Plaats kwartsglaasjes en dekfolies in een Hellendahl kleurpot (glaashouder) en sonicateer 20 minuten in aceton (Let op: aceton is brandbaar en vluchtig; werk in een dampkap). Herhaal de reinigingsstap met methanol (Let op: methanol is giftig en brandbaar; het handvat in een dampkap). Spoel de slides grondig af met water en sonicate in 1 M KOH gedurende 1 uur (Let op: KOH is bijtend, draag handschoenen en oogbescherming). Spoel de glaasjes af met water en sonicatéer daarna sequentieel in aceton en methanol gedurende elk 20 minuten. Herhaal de KOH-reiniging met 5 M KOH gedurende 1 uur, gevolgd door grondig waterspoelen (Let op: Hanteer geconcentreerde KOH met de juiste beschermingsuitrusting). Laat de dia's aan de lucht drogen. Maak een schone set Hellendahl-kleurpotjes klaar en spoel ze af met hexaan (Let op: hexaan is zeer brandbaar; gebruik ze in een afzuigkap), en laat ze dan aan de lucht drogen. Plaats de slides in de slidehouder en spoel ze twee keer af met hexaan. Voeg 75 mL hexaan toe aan de schuifhouder en injecteer voorzichtig 50 μL dichloordimethylsilaan (DMDCS) onder het hexaanoppervlak (OPMERKING: vermijd blootstelling van DMDCS aan lucht). Incubeer de glijbanen met zacht wiegen gedurende 1,5 uur. Spoel en sonicaer de glaasjes 1 minuut in hexaan en herhaal deze stap drie keer om resterende DMDCS te verwijderen. Laat de glaasjes aan de lucht drogen en vacuümverzegeling in 50 mL buizen (bijvoorbeeld Falcon of conische buizen). Voorbereide glaasjes kunnen worden bewaard bij −20 °C tot verder gebruik.
Assemblage en functionalisering van stromingskanalen
Een eenvoudig stromingskanaal kan worden samengesteld met een kwartsschuif, glazen dekmantel, dubbelzijdige tape, pipetpunten en epoxy. Breng dunne stroken dubbelzijdig tape tussen de gaten van de kwartsgeleider en plaats de dekmantel erop. Sluit de langere randen af met epoxy. Snijd ongeveer 5 mm segmenten uit een pipettip (zowel de smalle punt als de bredere kraag) en steek er één in een gat als uitgang en de andere in een parallel gat om een inlaatreservoir te vormen. Zet beide vast met epoxy. Het inlaatreservoir moet vloeistof vasthouden zonder lekkage vóór de injectie. Om oplossingen door het kanaal te trekken, verbind je de buis van een 1-mL spuit naar de uitlaat.
Behandel de kanalen sequentieel met de volgende reagentia om het oppervlak te functionaliseren: biotinyleerde BSA (0,2 mg/mL) voor 5 minuten, Tween-20 (0,2%) voor 10 minuten, en NeutrAvidin (0,1 mg/mL) voor 1 minuut. Ongeveer 100 μL van elke oplossing is voldoende per kanaal. Vermijd het aantrekken van meer vloeistof dan in het inlaatreservoir, omdat dit lucht in het kanaal brengt en bellen veroorzaakt. Laat tussen de stappen een klein volume oplossing in het reservoir om te voorkomen dat het kanaal uitdroogt. Spoel grondig af met 1× TNK-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 50 mM KCl) tussen elke stap. Deze behandeling creëert een biotine-NeutrAvidin-oppervlak voor RNA-immobilisatie.
Bereid mRNA-tether-duplexen voor direct voor immobilisatie door 40 nM mRNA te mengen met 20 nM biotinyleerde Cy5-gelabelde DNA-tether. Denatureer het mengsel bij 75 °C gedurende 5 minuten in 1× TNK-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 50 mM KCl), daarna hervernieuwd bij 37 °C voor 15 minuten en equilibratie bij 20 °C.
Verdun het monster 50 keer in de beeldvormingsbuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 50 mM KCl, 4 mM 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromaan-2-carboxylzuur, 0,01% octaethyleenglycol monododecylether, 0,8% glucose, 2 U/mL RNase-remmer) en injecteer het in het stroomkanaal om de mRNA's te immobiliseren. Incubeer 1 minuut, daarna spoel je met een beeldvormingsbuffer aangevuld met een zuurstofopvangsysteem (165 U/mL glucoseoxidase en 2170 U/mL catalase) om fotobleaching te verminderen.
Bereid sRNA-Hfq-complexen voor door de componenten in een verhouding van 1:1 te mengen tot een uiteindelijke concentratie van 250 nM in een 1× TNK-buffer en incubeer 5-15 minuten bij kamertemperatuur. Verdun de complexen 50 keer in de beeldvormingsbuffer met het zuurstofopvangsysteem en injecteer ze direct vóór de beeldvorming in het stroomkanaal.
Single-molecule data-acquisitie
Stel de prisma-gebaseerde totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) microscoop in door de EMCCD-camera en lasers aan te zetten. Bevestig de voorbereide slede met geassembleerde stromingskanalen op het microscooppodium en plaats het prisma bovenop. Gebruik Single software (https://github.com/Ha-SingleMoleculeLab) om data te verzamelen. Bepaal in de software het achtergrondniveau door AutoScale te selecteren en kopieer de verkregen waarde naar het Achtergrondveld. Stel de opnameframerate in op 100 ms. Excite Alexa Fluor 555 of Cy3 met een 532 nm laser en Cy5 met een 633 nm laser. Verzamel emissies van beide kanalen gelijktijdig via een 60× wateronderdompelingsdoel. Begin voor elke film met tien frames 633 nm excitatie om Cy5-gelabelde mRNA's in het gezichtsveld te lokaliseren. Blijf 5 minuten opnemen met 532 nm excitatie. Beëindig de vergiftiging met 1 s van 633 nm excitatie om Cy5-fotobleaching te verifiëren. Dit produceert het .pma-filmbestand, dat gebruikt kan worden voor analyse.
Analyse van enkelmolecuulgegevens
Analyseer ruwe .pma-bestanden met behulp van aangepaste IDL-scripts om donor-acceptorkanaalmapping uit te voeren en fluorescentieintensiteitstrajecten te extraheren. Neem eerst een kalibratiefilm op met meerkleurige fluorescerende kralen die detecteerbaar zijn in zowel donor- als acceptorkanalen bij excitatie met de 532 nm of 633 nm laser. Gebruik deze kalibratiefilm om een mappingbestand te genereren dat donor- en acceptorkanalen uitlijnt. Pas het resulterende mappingbestand toe op alle experimentele opnames om overeenkomstige donor-acceptorparen te identificeren, fluorescerende vlekken te detecteren en intensiteitstijdsporen te exporteren voor downstream FRET-analyse. Gedetailleerde stapsgewijze instructies worden samen met het script (https://github.com/Ha-SingleMoleculeLab) verstrekt.
Procesintensiteitstraces in MATLAB met het script s_tr_E.m. Start het script en voer de map in met de .traces- en .pks-bestanden, gevolgd door de bestandsindex en de tijdresolutie. Selecteer het raam dat wordt gebruikt voor vlekidentificatie wanneer daarom wordt gevraagd. Het script toont vervolgens donor- en acceptorintensiteiten per enkele plek. Navigeer door moleculen met toetsenbordcommando's (b om terug te gaan, g om naar een gespecificeerd molecuul te springen). Definieer donor- en acceptorbaselines (k) en corrigeer lekkage (l) door indien nodig op de grafieken te klikken. Sla geaccepteerde sporen afzonderlijk op als .dat bestanden met tijd-, donor- en acceptorintensiteiten door op s te drukken. Gebruik de geëxporteerde bestanden voor downstream kwantitatieve analyse.
Gebruik het peak-finder programma om individuele smFRET-sporen te analyseren en bindingsgebeurtenissen te extraheren voor kwantificatie, inclusief dwell-time analyse en FRET-toestandsverdelingen. Start het programma en open de map met de geëxporteerde .dat trace-bestanden via het Bestandsmenu. Stel de basislijnwaarden en donor-naar-acceptor lekwaarden in die eerder met het MATLAB-script zijn bepaald. Stel vervolgens de intensiteitsdrempels in om automatische piekdetectie te sturen, zodat alle visueel geverifieerde bindingsgebeurtenissen boven de geselecteerde waarden liggen. Als ruis ervoor zorgt dat een enkel evenement in meerdere pieken wordt opgesplitst, voeg deze dan handmatig samen met de ingebouwde samenvoegfunctie. Klik op Pieken opslaan om gedetecteerde gebeurtenissen te exporteren als .csv bestanden met starttijd, eindtijd en gemiddelde RET-efficiëntie voor elk evenement. Uitvoerbestanden worden opgeslagen in de peaks-map, terwijl frame-resolved FRET-waarden voor elk event naar de peak-fretmap worden geschreven. De FRET-efficiëntie wordt berekend door de fluorescentieintensiteit van de acceptor te delen door de som van de donor- en acceptorintensiteiten, waarbij waarden worden gecorrigeerd voor achtergrond- en donorlekkage in het acceptorkanaal. Inspecteer sporen handmatig op Cy5-fotobleaching, geïdentificeerd door een abrupte daling van de RET-efficiëntie gepaard met een toename van de Cy3-intensiteit. Wanneer fotobleaching optreedt, ga ervan uit dat binding aanhoudt zolang Cy3-fluorescentie detecteerbaar blijft, en corrigeer piekduur door de bijbehorende .csv bestanden te bewerken.
Importeer frame-resolved FRET efficiëntiewaarden uit de peak-fretbestanden in GraphPad Prism. Genereer FRET-histogrammen met behulp van de frequentieverdelingsfunctie en pas de verdelingen af met Gaussische modellen om de dominante FRET-populatie te identificeren.
Bepaal verblijftijden voor individuele bindingsgebeurtenissen door associatie af te trekken van dissociatietijden met behulp van een spreadsheet. Bereken het aandeel van de transiënte gebeurtenissen (<10 s) voor elke experimentele herhaling. Statistische analyses werden uitgevoerd in GraphPad Prism. Vergelijkingen tussen twee aandoeningen werden geëvalueerd met ongepaarde t-tests, en vergelijkingen tussen drie of meer condities werden geanalyseerd met eenrichtings-ANOVA en Tukey's post-hoc test.
Resultaten
Zaadlengte bepaalt het dynamische regime van sRNA-mRNA-koppeling
We hebben een minimale enkelmolecuul-assay opgezet om te testen hoe sequentiekenmerken Hfq-gemedieerde annealing sturen. Model-RNA's werden ontworpen volgens eerder beschreven architecturen van Hfq-afhankelijke sRNA-mRNA-paren16,17 en droegen een adenosine-rijke Hfq-bindende motief op het mRNA en een uridine-rijke randbindingsplaats op het sRNA (Figuur 1A). Het sRNA werd gelabeld met Alexa Fluor 555 (donor) aan het 5ʹ-uiteinde en de mRNA-DNA-verbinding met Cy5 (acceptor), waardoor detectie van basenparings-geïnduceerde nabijheid via FRET mogelijk werd.
Het variëren van de zaadcomplementariteit van 4, 5, 8 tot 10 bp leverde duidelijk dynamisch gedrag op. Met een zaad van 4 bp waren de interacties overwegend tijdelijk en vertoonden ze heterogene SET-efficiënties, wat wijst op onvolledige basenparing (Figuur 1B-D). Daarentegen leverden 8-bp en 10-bp zaden stabiele duplexen op die vaak gedurende het observatievenster bleven bestaan (Figuur 1C). De interacties leverden de verwachte hoge RET-toestand op (EFRET ≈ 0,79-0,80, Figuur 1D), wat consistent is met volledige basenparing tussen RNA's. Een zaad van 5 bp produceerde kortstondige maar goed gedefinieerde bindingsgebeurtenissen (EFRET ≈ 0,66), wat een werkbaar dynamisch bereik biedt voor latere modificaties in RNA-sequentie (Figuur 1B-D). Daarom gebruikten we 5-bp complementariteit voor alle downstream tests.
Sterkere Hfq-bindende motieven verhogen de stabiliteit van het sRNA-mRNA-complex
Vervolgens vroegen we hoe de bindingssterkte van Hfq de bindingslevensduur moduleert bij vaste 5-bp complementariteit. Het uitbreiden van het mRNA-motief van AAN4 naar AAN6 verhoogde de kans op het vormen van stabiele complexen aanzienlijk (p < 0,001). De gemiddelde levensduur steeg van 7,5 seconden naar 18 seconden, en het aandeel onstabiele gebeurtenissen < 10 seconden daalde van 80 ± 2% naar 68,3 ± 2,9% (Figuur 2A-C).
Vervolgens testten we het effect van het Hfq-bindende motief op het sRNA. Het verkorten van de randbindingsplaats van UUAUUUUUUUU naar CUUC (sRNA-SR, "korte rand") veroorzaakte zeer onstabiele interacties (gemiddelde levensduur 1,9 s met AAN4), en het versterken van het mRNA-motief in die context had slechts een bescheiden effect (gemiddelde 3,0 s met AAN6, niet significant, Figuur 2B,C). Beide partners dragen dus bij aan de stabiliteit van het geproduceerde complex, maar zwakke sRNA-Hfq-contacten beperken de winst van een sterker mRNA-motief.
Een afstandhouder tussen Hfq- en zaadplaatsen op het mRNA bevordert langlevende complexen
Hfq kan gebonden blijven aan de AAN-regio terwijl het het randoppervlak gebruikt om de zoektocht naar optimale sRNA-paringsplaats16 te vergemakkelijken. Deze eigenschap suggereerde dat extra afstand tussen de twee bindingsgebieden op het mRNA de interactiestabiliteit kan beïnvloeden.
Om dit te testen, introduceerden we een 15-nt enkelstrengs spacer tussen de Hfq- en sRNA-bindingsplaatsen (N15). Deze aanpassing verhoogde de levensduur van stabiele annealing-gebeurtenissen aanzienlijk van 7,5 s (AAN4) naar 47 s (AAN4-N15) (p < 0,01) (Figuur 3A,B). Het percentage bindingsgebeurtenissen dat minder dan 10 seconden duurde daalde ook van 80 ± 2% naar 44 ± 6% (Figuur 3C). Deze gegevens geven aan dat extra flexibiliteit tussen bindingsmodules annealing-intermediairen kan stabiliseren en langdurige duplexen kan bevorderen.
BESCHIKBAARHEID GEGEVENS:
Alle gegevens die de bevindingen van deze studie ondersteunen, inclusief single-molecule FRET trajecten, verwerkte datasets en analysescripts, zijn openbaar beschikbaar in de Mendeley Data repository op: doi:10.17632/3z8fng2c8g.1
Figuur 1: Effect van sRNA-mRNA-complementariteit op bindingsefficiëntie. (A) smFRET-assay voor sRNA-mRNA-annealing. Basenparing tussen het Alexa Fluor 555-gelabelde sRNA en het geïmmobiliseerde mRNA-Cy5-DNA tethercomplex produceert een hoog RET-signaal. Model-mRNA's bevatten een Hfq-bindingsplaats (AAC)4 (blauw) en een sRNA-bindingsplaats (S5, rood), gevolgd door vijf nucleotiden en de RNA-DNA-hybride regio. sRNA's bevatten een randbindingsplaats (oranje). Panelen in (B-D) worden gegroepeerd op experimentele conditie (zaadlengte). (B) Representatieve sRNA-bindingsgebeurtenis op een enkel mRNA-molecuul. Fluorescentieintensiteitssporen van Alexa Fluor 555-gelabeld sRNA (donor, groen) en Cy5-DNA-lijn (acceptor, rood) worden getoond. Cy5 was direct opgewonden tijdens de eerste en laatste tien frames van de opname. (C) Rastergrammen die 50 representatieve mRNA-moleculen weergeven, gebonden door sRNA-Hfq. Elke horizontale streep vertegenwoordigt een enkele sRNA-mRNA-interactie. (D) Histogrammen van FRET-efficiënties voor interacties tussen mRNA's en sRNA's die 4 bp (N = 416 mRNA's), 5 bp (N = 513 mRNA's), 8 bp (N = 191 mRNA's) of 10 bp (N = 105 mRNA's) complementaire regio's bevatten. FET-efficiënties werden berekend uit baseline- en lekgecorrigeerde donor- en acceptorintensiteiten voor individuele bindingsgebeurtenissen binnen intervallen van 0,1 s. Gaussische fits (blauw) worden getoond als een aanduiding van de dominante FRET-populatie en werden niet gebruikt om E_FRET waarden te berekenen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Effect van de lengte van Hfq-bindingsmotief op sRNA-mRNA-interacties. De basisparingsregio in alle varianten is 5 bp lang. (A) Rastergrammen die 50 representatieve mRNA's tonen die gebonden zijn door sRNA-Hfq-complexen. Elke horizontale streep vertegenwoordigt één enkele interactie. Bovenstaande cartoondiagrammen illustreren de bijbehorende RNA-ontwerpen met veranderingen in het aantal (AAC) herhalingen in het mRNA en de lengte van het randbindende gebied in het sRNA (SR = "korte rand"). Inkleuring zoals in Figuur 1A. (B) Scatterplots van sRNA-mRNA-bindingslevensduur. Elke stip vertegenwoordigt één bindingsgebeurtenis. Gemiddelde levensduur (rode horizontale lijn): 7,5 s voor mRNA-AAN4 + sRNA (N = 188 mRNA's), 18 s voor mRNA-AAN6 + sRNA (N = 142 mRNA's), 1,9 s voor mRNA-AAN4 + sRNA-SR (N = 85 mRNA's), en 3 s voor mRNA-AAN6 + sRNA-SR (N = 149 mRNA's). (C) Staafdiagram dat het percentage bindingsgebeurtenissen korter dan 10 s. toont. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardafwijking van twee onafhankelijke datasets. Statistische analyse door eenrichtings-ANOVA met Tukey's post-hoc test voor meervoudige vergelijkingen. p < 0,001, ****p < 0,0001; NS, niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Effect van spacerlengte tussen Hfq- en sRNA-bindingsplaatsen op sRNA-mRNA-interacties. De basisparingsregio in alle varianten is 5 bp lang. (A) Rastergrammen die 50 representatieve mRNA's weergeven, gebonden door een sRNA-Hfq-complex. Elke horizontale balk vertegenwoordigt één bindend evenement. De bovenstaande cartoondiagrammen illustreren het bijbehorende RNA-ontwerp. N15 = 15 nt spacer van willekeurige sequentie. Inkleuring zoals in Figuur 1A. (B) Scatterplots van sRNA-mRNA-bindingslevensduur. Elke stip vertegenwoordigt één bindingsgebeurtenis. Gemiddelde levensduurzaamheden (rode horizontale lijn): 7,5 s voor mRNA-AAN4 + sRNA (N = 188 mRNA's) en 47 s voor mRNA-AAN4-N15 + sRNA (N = 289 mRNA's). (C) Staafdiagram dat het percentage bindingsgebeurtenissen korter dan 10 s. toont. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardafwijking van twee onafhankelijke datasets. Statistische analyse met behulp van ongepaarde t-test. **p < 0,01. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende Figuur 1: Zuivering van E. coli Hfq. SDS-PAGE-analyse van Hfq-expressie en zuivering. (Boven) Monsters verzameld tijdens zuivering op een Ni2+ affiniteit (HiTrap) kolom, inclusief vóór inductie, na inductie, pellet, lysaat, lading, doorstroom, washfracties en geëlueerde piekfracties. (Onderaan) SDS-PAGE van piekfracties na grootte-uitsluitingschromatografie op een HiLoad 16/600 Superdex 200-kolom. Monomere (~11 kDa) en hexamere (~66 kDa) vormen van Hfq zijn geïndigeerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussie
Deze studie stelt een minimale enkelmolecuul-assay vast om te analyseren hoe specifieke RNA-sequentiekenmerken de efficiëntie van Hfq-gemedieerde sRNA-mRNA-annealing bepalen. Door de zaadlengte, de sterkte van het Hfq-bindingsmotief en de afstand tussen bindingsmodules te variëren, hebben we direct gekwantificeerd hoe elke parameter bijdraagt aan duplexstabiliteit bij enkelmolecuulresolutie. In tegenstelling tot ensemblemetingen, die populatiegemiddelde effecten rapporteren, lost deze benadering individuele bindings- en dissociatiegebeurtenissen direct op, waardoor het mogelijk is om kinetische heterogeniteit en tijdelijke interacties te meten. Onze resultaten tonen aan dat zelfs korte zaadgebieden tijdelijk kunnen ingrijpen, terwijl langere zaden stabiele duplexen met een verlengde levensduur produceren. Deze bevindingen zijn consistent met eerdere in vivo- en ensemblegegevens waaruit blijkt dat natuurlijke zaadregio's in bacteriële sRNA's doorgaans 6-12 nucleotiden beslaan en zelden volledig complementaire duplexenvormen 21,22,23.
We ontdekten ook dat zowel de mRNA- als sRNA Hfq-bindende motieven een sterke invloed hebben op duplexstabiliteit. Het verlengen van het AAN-motief op het mRNA verlengde de bindingslevensduur, terwijl het verkorten van de sRNA-randbindplaats deze aanzienlijk destabiliseerde. Dit ondersteunt een coöperatief model waarbij het distale gezicht van Hfq adenosinrijke mRNA-motieven verankert, en de rand uridine-rijke sRNA's rekruteert om efficiënte uitlijning van complementaire regio'ste bevorderen 9,17. In tegenstelling tot genetische of op verslaggevers gebaseerde assays, die doorgaans alleen productieve regulatorische uitkomsten detecteren, scheidt dit systeem kwantitatief bindingsstabiliteit van downstream-effecten, waardoor directe vergelijking mogelijk is van hoe individuele sequentiekenmerken fysieke interactielevens moduleren. Een sterk randbindend motief is vooral belangrijk wanneer structurele herschikkingen nodig zijn voor sRNA-mRNA-paring, omdat het RNA-retentie op Hfq17 versterkt. Men denkt ook dat de rand het laterale scannen van mRNA's door sRNA-Hfq-complexen16 bevordert, een eigenschap die bijzonder belangrijk kan zijn wanneer doellocaties ver van het Hfq-bindende gebied liggen. Onze resultaten met een 15-nt afstander tussen de bindingsplaatsen ondersteunen dit standpunt, en laten zien dat extra flexibiliteit tussen het zaad- en Hfq-motief de paarstabiliteit verbetert, mogelijk door sterische beperkingen tijdens strengwisseling te verminderen.
Naast natuurlijke systemen zijn de resultaten relevant voor het ontwerp van synthetische of gemodificeerde sRNA's. De meeste bestaande ontwerpstrategieën richten zich op het optimaliseren van een zaadregio of een algemene steiger 23,24,25, maar onze gegevens benadrukken aanvullende bepalende factoren zoals de afstand tussen het Hfq-bindingsmotief en het doelgebied. Omdat sequentiekenmerken op een gecontroleerde en modulaire manier worden geïntroduceerd, biedt de assay een systematisch experimenteel kader voor het testen van ontwerpregels. Dit principe kan toekomstige constructie van kunstmatige sRNA's met verbeterde regulatoire efficiëntie sturen.
Hoewel de aanpak kwantitatieve en reproduceerbare analyse van RNA-RNA-interacties mogelijk maakt, kent deze ook beperkingen. De assay onderzoekt volledig complementaire gebieden, terwijl de meeste fysiologische sRNA-mRNA-interacties mismatches en uitpuilingen bevatten die herkenning en regulatie kunnen beïnvloeden. De methode meet de bindingslevensduur van sRNA-mRNA, maar richt zich niet direct op downstream regulatieve uitkomsten, zoals translatieremming of mRNA-verval. Toekomstige aanpassingen van deze assay zouden mismatched zaadregio's, gevarieerd GC-gehalte of ribosomen en degradosomen kunnen omvatten om systematisch te onderzoeken hoe deze factoren de bindingskinetiek beïnvloeden.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten.
Dankbetuigingen
Wij danken prof. Sarah Woodson voor het faciliteren van de toegang tot instrumentatie met één molecuul. Deze studie werd gefinancierd door het National Science Centre in Polen (2022/46/E/NZ1/00462 aan EMM) en een EMBO Installation Grant (IG 5730-2024 aan EMM).
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.45 μm filter | Millipore | HABG04700 | |
| 5 mL Hi-Trap column | Cytiva | GE17-0408-01 | |
| Aceton | Merck | 270725 | HPLC grade |
| Acrylamide:Bis-acrylamide oplossing | Merck | A2792-100ML | |
| ALEXA555 NHS succinimidyl ester | Thermo Fischer | A20009 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters (NMWL, 3 kDa) | Merck | UFC900308 | |
| Ammoniumchloride | Merck | 1330-500G | |
| Ampicilline | Merck | A9518-5G | |
| ATP | Linegal Chemicals | K054.1 | |
| Beta-mercaptoethanol | Merck | M3148-500ML | |
| BIO-BSA | Merck | A8549-10MG | |
| Bio-Spin Columns met Bio-Gel P-30 | Bio Rad | 7326231 | Voor het zuiveren van gelabeld RNA |
| Catalase | Merck | C9322 | |
| CTP | Linegal Chemicals | K057.4 | |
| Cy3 HNS ester | Cytiva | PA13105 | |
| Cy5 NHS succinimidyl ester | Cytiva | PA15101 | |
| DDT | Thermo Fischer | R0861 | |
| Dichlorodimethylsilaan | Merck | 440272 | |
| DNA oligomeren (tether) a 5′-amino linker C6 | Thermo scientific | n/a | |
| Dnase I | Thermo Scientific | 18047019 | |
| EDC | Thermo scientific | PG82079 | |
| EDTA | Merck | ED2SS-1KG | |
| EMCCD camera | Andor | ||
| Ethanol | Merck | 1085430250 | |
| Glucose | Merck | D9434-1KG | |
| Glucose oxidase | Merck | G2133-50KU | |
| Glycerol | Merck | G5516-1L | |
| GMP | Merck | G8377 | |
| GTP | Linegal Chemicals | K056.4 | |
| HCl | Merck | 1.00318 | |
| Hexaan | Thermo Fischer | 045652.M1 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 200 size exclusion column | Cytiva | GE28-9893-35 | |
| IPTG | Merck | 420322-1GM | |
| KCl | Merck | P9541-1KG | |
| KOH | Merck | 484016-1KG | |
| Magnesiumchloride | Merck | M8266-1KG | |
| Methanol | Merck | 34885-M | HPLC grade |
| Neutravidin | Thermo Fischer | 31000 | |
| Nikkelsulfaat | Merck | 1067261000 | |
| Nikkol | Merck | P8925-1G | |
| Q5 Polymerase | NEB | M0491S | Gebruikt voor de productie van in vitro transcriptie sjabloon |
| RNase A | Thermo scientific | EN0531 | |
| RNasin Plus | Promega | N2611 | |
| Natriumacetaat | Merck | S7545-100G | |
| Natriumchloride | Sigma-Aldrich | S3014-1KG | |
| Spermidine | Merck Life Science | S2626 | |
| Tris Base | Thermo Scientific | 17926 | |
| Trolox | Merck | 238813-1G | |
| Urea | Merck | U1250-5KG | |
| UTP | Linegal Chemicals | K055.3 |
Referenties
- Alquethamy, S., Lalaouna, D., Tree, J. J. What makes a small RNA work. Nucleic Acids Res. 53 (12), 563(2025).
- Prévost, K., Desnoyers, G., Jacques, J. F., Lavoie, F., Massé, E. Small RNA-induced mRNA degradation achieved through both translation block and activated cleavage. Genes Dev. 25 (4), 385-394 (2011).
- Massé, E., Escorcia, F. E., Gottesman, S. Coupled degradation of a small regulatory RNA and its mRNA targets in Escherichia coli. Genes Dev. 17 (19), 2374-2383 (2003).
- Panja, S., Woodson, S. A. Hexamer to monomer equilibrium of E. coli Hfq in solution and its impact on RNA annealing. J Mol Biol. 417 (5), 406-412 (2012).
- Sauter, C., Basquin, J., Suck, D. Sm-like proteins in eubacteria:the crystal structure of the Hfq protein from Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 31 (14), 4091-4098 (2003).
- Andrade, J. M., Pobre, V., Matos, A. M., Arraiano, C. M. The crucial role of PNPase in the degradation of small RNAs that are not associated with Hfq. RNA. 18 (4), 844-856 (2012).
- Panja, S., Schu, D. J., Woodson, S. A. Conserved arginines on the rim of Hfq catalyze base pair formation and exchange. Nucleic Acids Res. 41 (15), 7536-7546 (2013).
- Soper, T. J., Woodson, S. A. The rpoS mRNA leader recruits Hfq to facilitate annealing with DsrA sRNA. RNA. 14 (9), 1907-1917 (2008).
- Updegrove, T. B., Zhang, A., Storz, G. Hfq:the flexible RNA matchmaker. Curr Opin Microbiol. 30, 133-138 (2016).
- Moon, K., Gottesman, S. Competition among Hfq-binding small RNAs in Escherichia coli. Mol Microbiol. 82 (6), 1545-1562 (2011).
- Hussein, R., Lim, H. N. Disruption of small RNA signaling caused by competition for Hfq. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (3), 1110-1115 (2011).
- Papenfort, K., et al. SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay. Mol Microbiol. 62 (6), 1674-1688 (2006).
- Wagner, E. G. H. Cycling of RNAs on Hfq. RNA Biol. 10 (4), 619-626 (2013).
- Roca, J., Santiago-Frangos, A., Woodson, S. A. Diversity of bacterial small RNAs drives competitive strategies for a mutual chaperone. Nat Commun. 13, 2449(2022).
- Tree, J. J., et al. Identification of bacteriophage-encoded anti-sRNAs in pathogenic Escherichia coli. Mol Cell. 55 (2), 199-213 (2014).
- Małecka, E. M., Woodson, S. A. RNA compaction and iterative scanning for small RNA targets by the Hfq chaperone. Nat Commun. 15, 2069(2024).
- Małecka, E. M., Woodson, S. A. Stepwise sRNA targeting of structured bacterial mRNAs leads to abortive annealing. Mol Cell. 81 (9), 1988-1999.e4 (2021).
- Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129(2010).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nat Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nat Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
- Kawamoto, H., Koide, Y., Morita, T., Aiba, H. Base-pairing requirement for RNA silencing by a bacterial small RNA and acceleration of duplex formation by Hfq. Mol Microbiol. 61 (4), 1013-1022 (2006).
- Bandyra, K. J., et al. The seed region of a small RNA drives the controlled destruction of the target mRNA by the endoribonuclease RNase E. Mol Cell. 47 (6), 943-953 (2012).
- Brück, M., et al. A library-based approach allows systematic and rapid evaluation of seed region length and reveals design rules for synthetic bacterial small RNAs. iScience. 27 (9), (2024).
- Han, K., Kim, K. S., Bak, G., Park, H., Lee, Y. Recognition and discrimination of target mRNAs by Sib RNAs, a cis-encoded sRNA family. Nucleic Acids Res. 38 (17), 5851-5866 (2010).
- Sharma, V., Yamamura, A., Yokobayashi, Y. Engineering artificial small RNAs for conditional gene silencing in Escherichia coli. ACS Synth Biol. 1 (1), 6-13 (2012).