Een workflow voor live beeldvorming en kwantitatieve analyse van acentrosomale microtubulinetwerken in Drosophila-oocyten

Summary

Hier presenteren we een protocol dat live imaging combineert met geautomatiseerde analysetools om microtubuli-dynamiek in de Drosophila-oocyt te analyseren. Deze workflow maakt efficiënte en reproduceerbare metingen van microtubuli-gedrag mogelijk, inclusief groei, oriëntatie, snelheid en ruimtelijke organisatie, en kan worden aangepast aan andere celtypen na optimalisatie.

Abstract

Het cytoskelet van de microtubuli (MT) is essentieel voor veel cellulaire functies, waaronder celvorm, polariteit, migratie en deling. Hoewel centrosomen functioneren als het belangrijkste MT-organiserend centrum (MTOC) in de delende dierlijke cellen, vertrouwen veel gedifferentieerde cellen, waaronder Drosophila-oocyten , op acentrosomale routes om MT-netwerken samen te stellen. In tegenstelling tot de uitgebreide kennis van MT-organisatie in proliferaterende cellen, is er weinig bekend over hoe MT-netwerken zich assembleren zonder centrosomen. Drosophila-oocyten bieden een krachtig model om de organisatie en dynamiek van acentrosomale MT te bestuderen. Hun dichte MT-netwerk daagt echter conventionele beeldvorming uit. Live imaging maakt realtime visualisatie van MT-groei en oriëntatie mogelijk, maar gestandaardiseerde analysemethoden blijven beperkt. Hier presenteren we een live-imaging-gebaseerd protocol om MT-groeidynamiek in Drosophila-oocyten te analyseren met behulp van End-Binding Protein 1 (EB1)-Green Fluorescent Protein (GFP), een plus-end tracking-eiwit dat plaatsen van actieve MT-polymerisatie labelt. Hoogresolutie Airyscan-confocale microscopie maakt de detectie van EB1-kometen mogelijk, terwijl aangepaste Fiji-macro's en Python-scripts gestroomlijnde, reproduceerbare kwantificering van komeetdichtheid, snelheid, lengte en oriëntatie bieden. We valideerden deze methode door controle-oocyten te vergelijken met die welke waren onderworpen aan een koud-geïnduceerde MT-depolymerisatie, evenals met Patronine-mutanten (CAMSAP bij mensen), een geconserveerde MT minus-eindstabilisator en een kerncomponent van niet-centrosomale microtubuli organiserende centra (ncMTOC), als positieve controle voor verstoorde MT-dynamiek. Onze analyses toonden regio-specifieke MT-dynamiek, waaronder anterieure verrijking van EB1-kometen en karakteristieke oriëntatiebiases, en bevestigden de gevoeligheid van de workflow voor het detecteren van subtiele verstoringen in MT-groei. Deze aanpak biedt een betrouwbaar, gebruiksvriendelijk kader voor het bestuderen van MT-gedrag in oocyten. Het stapsgewijze protocol maakt het mogelijk om MT-regulatoren in deze context te onderzoeken en kan met passende optimalisatie aangepast worden aan andere gedifferentieerde celtypen, zoals neuronen en epitheelcellen. In bredere zin ondersteunt het mechanistische studies en genetische screenings die onderzoeken hoe diverse MT-architecturen ten grondslag liggen aan gespecialiseerde cellulaire functies.

Introduction

Het cytoskelet van de microtubuli (MT) is een essentieel onderdeel van de eukaryote cel en speelt een essentiële rol bij het vaststellen en behouden van celvorm, polariteit en deling. Het dynamische gedrag van MT-polymeren, gekenmerkt door groei en krimp, is cruciaal voor veel MT-gebaseerde processen ^1,2. De assemblage van verschillende MT-arrays is afhankelijk van de gecombineerde werking van microtubuli-organiserende centra (MTOC's), waaruit MT's worden genucleeerd, en de activiteit van diverse MT-regulerende eiwitten die de stabiliteit, oriëntatie en dynamiek van MT reguleren ^1,2,3. De best bestudeerde MTOC is het centrosoom, dat radiale arrays van MT's genereert die belangrijk zijn voor het reguleren van celvorm en polariteit in interfase en voor mitotische spilassemblage bij mitose ^4,5. Bij mitotische exit of differentiatie, zoals bij neuronen en epitheelcellen, wordt de centrosomale MTOC-activiteit echter vaak verminderd, en in extreme gevallen, zoals bij oocyten, kan deze worden geëlimineerd ^6,7. Dit wordt vaak geassocieerd met celtype-specifieke remodellering van het MT-cytoskelet, waarbij de MTOC-functie wordt toegewezen aan andere cellulaire locaties ^2,3,8, meestal aangeduid als niet-centrosomale MTOC's (ncMTOC's). Hoewel er aanzienlijke vooruitgang is geboekt in het ophelderen van MT-organisatie in mitotische cellen, is er relatief weinig bekend over hoe MT's genucleeerd, gestabiliseerd en ruimtelijk gerangschikt zijn in dierlijke cellen die de mitose verlaten of differentiatie^{ondergaan 2}. Opmerkelijk is dat bij levende organismen de meeste cellen zich niet delen; ze zijn uit de celcyclus verdwenen en/of gedifferentieerd. Daarom is het cruciaal om te begrijpen hoe het MT-cytoskelet in deze contexten wordt samengesteld en gereguleerd. Deze kennis is essentieel om te ontdekken hoe verschillende MT-architecturen worden opgezet om gespecialiseerde cellulaire functies te ondersteunen.

De Drosophila melanogaster-oocyt biedt een krachtig systeem om de organisatie en functie van acentrosomale MT te bestuderen. In middenstadia van oogenese is de centrosoomactiviteit met⁹ verminderd, en MT's worden gegenereerd uit ncMTOC's die gelokaliseerd zijn in de antero-laterale cortex van de oocyt (Figuur 1B). Dit MT-netwerk is essentieel voor de lokalisatie van maternale mRNA's, eiwitten en organellen, die op hun beurt cruciaal zijn voor de vestiging van toekomstige embryo-assen en ontwikkeling^10,11. Eerder onderzoek toonde aan dat de ncMTOC's van de oocyt bestaan uit het MT-minus-eindeiwit Patronine, dat een complex vormt met het spectraplakine-eiwit Shot, verankerd aan het corticale actine-cytoskelet. Er werd voorgesteld dat MT's groeien uit korte MT-fragmenten die worden gegenereerd door afsnijdende enzymen zoals katanine te gebruiken, die kunnen fungeren als zaden voor verdere MT-polymerisatie¹². Vergelijkbare mechanismen zijn voorgesteld in andere gedifferentieerde cellen, zoals neuron¹³, waar centrosomale activiteit is verminderd. De mechanismen waarmee severing complexe MT-netwerken genereert, zoals in de eicel, zijn echter nog slecht begrepen. Het is nog steeds onduidelijk of MT's in deze contexten voornamelijk worden gevormd door severing-gebaseerde herschikking of een combinatie van severing en de novo MT-nucleatie. De complexiteit van het oocyten-MT-netwerk maakt het een ideaal systeem om te bestuderen hoe MT's worden gegenereerd en georganiseerd buiten de bekende centrosomale context. Dit vormt ook een uitdaging voor beeldvorming en analyse: het dichte MT-netwerk binnen de oocyt maakt het moeilijk om individuele MT's te onderscheiden met conventionele immunokleuring of statische beeldvorming ^2,14.

Live imaging heeft de mogelijkheid om MT-netwerken te bestuderen aanzienlijk verbeterd, omdat het visualisatie van MT-polymerisatiegebeurtenissen in realtime mogelijk maakt, wat belangrijke inzichten biedt in de dynamiek en oriëntatie van MT-groei. Eerdere studies hebben met succes de groeidynamiek van MT in oocyten geanalyseerd met behulp van live beeldvorming van plus-end markers 14,15,16. In veel gevallen worden de beeldanalyseprocedures die worden gebruikt om MT-dynamiek te kwantificeren echter slechts kort beschreven, vertrouwen ze op maatwerk of laboratoriumspecifieke implementaties, of worden ze niet openbaar beschikbaar gesteld, waardoor reproduceerbaarheid en bredere adoptie beperkt worden. Onze methode bouwt voort op deze eerdere benaderingen door een volledig gedocumenteerde, open beschikbare en gebruiksvriendelijke analysepijplijn te bieden die gestandaardiseerde kwantificering van MT-groeiparameters over datasets en experimentele omstandigheden mogelijk maakt. In dit protocol worden MT-dynamiek afgebeeld tijdens het midden van de oögenese, wanneer het MT-cytoskelet is georganiseerd door acentrosomale MT-netwerken. Groeiende MT's worden gevisualiseerd met EB1-GFP, een MT plus-end tracking-eiwit^17,18, en worden verkregen met laserscanning confocale microscopie met een arraydetector in hogesnelheidsmodus. De nieuwigheid van onze aanpak ligt in de beeldanalyse: een volledig gedocumenteerde, gebruiksvriendelijke, stapsgewijze pijplijn die gebruikers alleen interessegebieden moet kiezen. Beeldverwerking en kwantificatie worden gefaciliteerd door aangepaste Fiji-macro's en Python-scripts, waardoor een efficiënte, reproduceerbare detectie van EB1-kometen en het extraheren van parameters mogelijk is, waaronder groeioriëntatie, snelheid en ruimtelijke organisatie. Dit kader biedt een gestandaardiseerd en toegankelijk hulpmiddel om MT-dynamiek te vergelijken over experimentele omstandigheden.

In dit manuscript passen we deze methode toe om de groei van MT te vergelijken in controle-oocyten en in oocyten die door koude behandeling zijn gedepolymeriseerd. Dit dient zowel om het protocol te valideren als om toekomstige studies te ondersteunen die gericht zijn op het ontleden van de rol van kandidaat-eiwitten in MT-regulatie.

Protocol

1. Vlieggenetica

OPMERKING: Om MT's in de oocyt te visualiseren, gebruikt dit protocol een openbaar beschikbaar transgeen (Table of Materials) dat het MT plus-end trackingeiwit EB1 expressief, getagd met een GFP (Green Fluorescent Protein) tag¹⁹. EB1-GFP bindt specifiek aan groeiende MT's plus uiteinden, en verschijnt als fluorescerende "kometen" die zich bewegen in de richting van polymerisatie^17,18. Dit maakt visualisatie en kwantificering van de groeidynamiek van MT mogelijk, inclusief groeioriëntatie, snelheid en ruimtelijke verdeling binnen de oocyt^14,20.

1. Houd alle vliegstammen op standaard maïsmeel-agar medium op 25 °C met behulp van standaard Drosophila-verzorgingstechnieken .
2. Kruis 8–12 maagdelijke vrouwelijke vliegen met een UAS-RNAi-transgen dat gericht is op de expressie van een eiwit van interesse, naar 5 mannetjes van het genotype matα4-Gal4-VP16; EB1-GFP.
   OPMERKING: Om de genetische kruisingen te vereenvoudigen, genereer je een vliegenstam door de V32-Gal4-lijn (insertie op het tweede chromosoom) te kruisen met de EB1-GFP-lijn (insertie op het derde chromosoom). Omdat EB1-GFP onder controle staat van een UASp-promotor, induceert de V32-Gal4-driver expressie van EB1-GFP evenals elk UAS-RNAi-transgen dat bij latere kruisingen wordt geïntroduceerd indien gewenst.
3. Na het uitkomen van de F1-nakomelingen selecteert men 10–15 vrouwelijke vliegen van het gewenste genotype (minder dan een week oud).
4. Breng de vrouwtjes samen met 2–3 mannetjes over in een vers flesje met een kleine hoeveelheid gistpasta op het oppervlak van het voedsel. Gistpasta stimuleert oogenese en bevordert de ontwikkeling van de eierkamer. De aanwezigheid van mannetjes zorgt voor paring, wat ook de rijping van de eieren en het leggen van eieren bevordert. Houd de vliegen 2 dagen op 25 °C.
   OPMERKING: Om de rol van specifieke genen in MT-dynamiek te onderzoeken, kan eiwitknockdown worden bereikt door gebruik te maken van het UAS/GAL4-systeem²¹, met de publiek beschikbare maternale driver matα4-Gal4-VP16 (ook bekend als V32-Gal4; Materiaaltabel), die Gal4-expressie in de kiemlijn initieert vanuit de toestand 3–4 van oogenese. Zoals hierboven beschreven, induceert deze driver expressie van EB1-GFP en UAS-RNAi-constructies, waardoor eiwitten van belang pas na het germariumstadium worden uitgeput. Deze strategie omzeilt potentiële vroege functies van de doelwitte eiwitten tijdens de initiële mitotische delingen en oocytspecificatie. Bij het uitvoeren van dergelijke experimenten moeten vliegen worden voorbereid zoals eerder beschreven.

2. Ovariumdissectie

1. Doof de F1-vrouwtjes met CO₂ op een standaard vliegmatte en selecteer één vrouwtje voor dissectie.
2. Breng het geselecteerde vrouwtje direct over op een schaal met glazen bodem van 35 mm (met een glasdikte van 0,13–0,15 mm) en plaats een druppel beeldende olie bovenop de vlieg.
3. Plaats de vlieg met de buikzijde naar boven (vleugels naar beneden). Met één pincet houdt je voorzichtig de onderste borstzak vast met een pincet, en knijp je met een tweede pincet een stukje buiknagelriem aan het achterste uiteinde van de buik.
4. Haal voorzichtig het voortplantingskanaal eruit door het voorzichtig door de opening eruit te trekken.
5. Isoleer de eierstokken en vervolgens de individuele ovariolen door ze voorzichtig door de olie te schuiven met een pincet. Houd bij het manipuleren van de eierstokken altijd bij de oudere eikamers (stadia 13–14) om schade aan de kwetsbaardere middenstadia (stadia 6–9), die van belang zijn voor beeldvorming (Figuur 1A,B).
6. Pak de voorste punt van de eierstok, waar de germarium en de vroege eicelkamers zich bevinden (Figuur 1A,B). Breng langzame, gelijkmatige spanning toe op de afzonderlijke eierstokken. Terwijl je trekt, komen er eierkamers uit verschillende ontwikkelingsstadia. Dit proces kan meerdere keren per eierstok worden herhaald om extra ovarillen²² te isoleren (zie video voor demonstratie).
   OPMERKING: Voor oocyten die koud werden behandeld om MT te depolymeriseren, werden dissecties uitgevoerd zoals eerder beschreven, maar met BRB-80 buffer in plaats van beeldvormende olie. De gedissecte eierstokken werden vervolgens overgebracht naar microbuisjes met BRB-80 en 15 minuten²³ minuten op ijs geïncubeerd. Na de incubatie werden de eierstokken overgebracht naar een schaaltje met glazen bodem en beeldende olie, en het protocol werd hervat vanaf stap 3.1.

3. Live beeldvorming

1. Plaats de glazen bodemschaal op het microscooppodium met de juiste diahouder.
2. Selecteer eikamers van stadium 7 of 8 voor beeldvorming.
   OPMERKING: Eikamers in deze stadia kunnen worden geïdentificeerd op basis van de grootte van de eicellen en de nucleaire positie. De eicel is duidelijk groter dan individuele verpleegcellen en beslaat ongeveer een derde (stadium 7) tot de helft (stadium 8) van de eicel. De eicelkern bevindt zich in de voorste cortex van de eicel, naast de verpleegcellen²⁴.
3. Vermijd beeldvorming van eicelkamers die discontinuïteit in de buitenste follikelcellaag of andere tekenen van schade vertonen, wat kan wijzen op mechanische verstoring veroorzaakt door de pincet. Voor optimale beeldkwaliteit gebruik je een snel confocaal beeldsysteem met een hoge signaal-ruisverhouding (SNR) en een 63x objectief (1,40 NA, olie-onderdompeling). Zorg ervoor dat je voldoet aan de Nyquist-Shannon steekproefcriteria.
4. Pas de scherpstelling aan en bepaal de juiste belichting, want deze kan variëren afhankelijk van het gebruikte EB1-construct (bijv. verschillende promotoren of fluorescerende tags) en het microscoopsysteem. Het signaal moet helder genoeg zijn om de dynamiek van de kometen te volgen, maar niet verzadigd of verduisterd door achtergrondfluorescentie.
5. Stel de 488 nm laser in om de GFP-fluorofoor te exciteren (10% laservermogen; detectorversterking = 750 V). Kies een geschikt emissievenster van 500–550 nm of een equivalent filterset voor de GFP-fluorofoor.
6. Verzamel time-lapse films van minstens 4 minuten duur, met een frame-interval van 500 ms (2 frames/s) om voldoende data te verkrijgen voor het volgen van individuele MT-plus eindes. (Aanvullende video 1 illustreert een representatieve time-lapse acquisitie die geschikt is voor latere MT-trackinganalyse).
7. Verwerk de verkregen beelden met behulp van de arraydetector die in de microscoop-acquisitiesoftware werkt met de standaard sterkte van het verwerkingsfilter.
   OPMERKING: Zodra ze in beeldvormende olie zijn ondergedompeld, blijven de gedissectiede eierstokken tot 90 minuten levensvatbaar. Tijdens deze periode kunnen eikamers worden gefotografeerd zonder significante tekenen van degeneratie. Na deze periode moet een nieuw vrouwtje worden ontleed en verse eikamers worden voorbereid voor beeldvorming²⁰.

4. Beeldverwerking

Voer de volgende workflow uit om grafieken en statistieken te genereren die verschillende parameters die samenhangen met MT-dynamiek kwantificeren. Voer elke stap automatisch uit via een macro/script of handmatig door het protocol te volgen (Figuur 2). Alle Fiji-macro's, trackingscripts en Python-analysecode die in deze workflow worden gebruikt, worden geleverd als Aanvullende Codeerbestanden 1–7.

1. Beeldvoorbewerking - STAP 1
   De volgende stappen bereiden ruwe timelapse-beelden voor door te corrigeren voor fotobleaching en achtergrondruis te verminderen, zodat signaalstabiliteit voor tracking wordt gegarandeerd. Ten eerste wordt de zichtbaarheid van EB1 verbeterd met een Difference of Gaussians (DoG)-filter, dat functioneert als een ruimtelijk banddoorlaatfilter. Door een sterk wazig beeld af te trekken van een licht wazig beeld, onderdrukt dit proces laagfrequente cytoplasmatische nevel en hoogfrequente pixelruis terwijl het diffractie-beperkte signaal van EB1-kometen wordt geïsoleerd. Ten tweede wordt een temporele gradiëntfilter toegepast om specifiek de groeiende MT-tips te versterken. De beeldstack wordt hersliced om de temporele dimensie af te leggen op de ruimtelijke Y-as. Een 1D-convolutie met een [-1 0 1] kernel wordt vervolgens toegepast om de temporele afgeleide voor elke pixel te berekenen, waarbij de voorrand van de bewegende kometen wordt gemarkeerd waar de intensiteit het snelst toeneemt. De stapel wordt vervolgens teruggesneden naar zijn oorspronkelijke afmetingen, samengevoegd tot een composietafbeelding en geëxporteerd voor analyse.
   OPMERKING: Deze stap kan in batch worden uitgevoerd voor alle bestanden in een map door het macrobestand File1.Step1_MTs_macro.ijm (Aanvullende codering Bestand 1) Fiji binnen en de macro uitvoeren.
   1. Vereiste plugin-installatie (Eenmalige setup)
      1. Lanceer Fiji. Navigeer naar Plugins > Installeren in de menubalk.
      2. Selecteer in de bestandsbrowser het File_7_Kalman_Stack_Filter_Compiled.jar (Supplementary Coding File 7) bestand dat bij dit protocol wordt geleverd.
      3. Wanneer je wordt gevraagd de plugin op te slaan, zorg dan dat de bestemming de standaard plugins-map in je Fiji-installatiemap is en klik op Opslaan.
      4. Herstart Fiji om de installatie te voltooien.
         OPMERKING: Deze gecompileerde versie van de plugin is identiek aan de ingebouwde versie van Fiji, maar verwijdert de vereiste voor een aparte Java Development Kit (JDK)-installatie, waardoor het installatieproces wordt vereenvoudigd.
   2. Correctie en deoising van bleekmiddel:
      1. Open Fiji en open vervolgens elk bestand met de Bio-Formats importer-plugin
      2. Compenseer fluorescentieverval in de loop van de tijd door de Bleach Correction-plugin te gebruiken, met behulp van de Simple-Ratio bleekcorrectie (achtergrond = 0).
      3. Voer de Kalman Stack Filter Compiled uit (acquisition_noise = 0,1; bias = 0,7) om willekeurige fotonenruis te onderdrukken terwijl de werkelijke signaaldynamiek over tijd behouden blijft
      4. Snijd de resulterende beeldtijddimensie bij om de verwerkingstijd te verkorten, indien gewenst.
         OPMERKING: Deze stappen genereren een gedenoised beeld, dat later als kanaal 1 verschijnt aan het einde van stap 1 (4.1.5) (Figuur 3A). Het wordt aanbevolen om de eerste 5 tot 10 frames (tijdsaanduidingen) uit te sluiten, aangezien het rolling window van het Kalman-filter deze beginframes slechts gedeeltelijk filtert.
   3. Verschil in feature-verbetering van Gaussians (DoG):
      1. Dupliceer de afbeelding uit 4.1.2.4 twee keer (klik met de rechtermuisknop en klik op Dupliceren).
      2. Pas de Gaussian Blur Plugin toe op één kopie met een low sigma (σ = 1).
      3. Pas de Gaussian Blur Plugin toe op de andere kopie met een high sigma (σ = 8).
      4. Open de plugin Image Calculator en trek het high sigma-beeld af van het low sigma-beeld (= Low – High) om fijne details te isoleren.
      5. Verwijder de achtergrond door Fiji's Math > Subtract te gebruiken en selecteer een waarde (DoG-drempel = 100) om indien nodig alleen het ware signaal te behouden.
         OPMERKING: Deze stappen genereren een Gaussisch verschilbeeld, dat later verschijnt als kanaal 2 aan het einde van stap 1 (4.1.5) (Figuur 3B).
   4. EB1-GFP signaalverbetering:
      1. Selecteer de afbeelding uit 4.1.2.4 en gebruik de Reslice-plugin met instellingen: boven, Geen interpolatie.
      2. Gebruik de Convolve 2D-plugin met kernel [–1 0 1] om MT-tips te verbeteren.
      3. Gebruik de Reslice-plugin opnieuw met dezelfde instellingen om de oorspronkelijke afbeeldingsafmetingen te herstellen.
      4. OPMERKING: Deze stappen genereren een afbeelding met een verbeterd EB1-GFP-signaal. Deze afbeelding zal later verschijnen als kanaal 3 aan het einde van stap 1 (4.1.5) (Figuur 3C).
      5. Kanalen samenvoegen en afbeelding exporteren:
         1. Meng de MT EB1-GFP image (4.1.2.4) met de Difference of Gaussians image (4.1.3.5) en de EB1-GFP signaalverbeteringsimage (4.1.4.3) met behulp van de Merge Channels-plugin. Zorg ervoor dat de afbeelding die voor verdere analyse gebruikt moet worden op kanaal 3 wordt geplaatst tijdens het samenvoegingsproces.
         2. Sla het resulterende bestand op als een .tif bestand, met het naamformaat: "filename"_processed.tif. Zorg ervoor dat de afbeelding die voor downstream-analyse wordt gebruikt eindigt met _processed.tif
2. Regio's van Belang (ROI) - STAP 2
   In deze stap worden drie ROI's gedefinieerd langs de anteroposterieure as van de oocyt: anterior (ROI1), midden (ROI2) en posterior (ROI3). Voer deze ruimtelijke segmentatie uit om analyse van MT-dynamiek over verschillende regio's van de oocyt mogelijk te maken.
   OPMERKING: Deze stap 2 kan voor elke "bestandsnaam" worden uitgevoerd_processed.tif door het macrobestand File_2_Step2_MTs_macro.ijm (Supplementary Coding File 2) naar Fiji te slepen en op Run te drukken. De macro zal de gebruiker vragen om handmatig een rechthoek in de oocyt te tekenen. Het gebied dat het dichtst bij het begin van de polygoon ligt (eerste klik) komt overeen met de eerste ROI. Het geselecteerde rechthoekige gebied wordt automatisch verdeeld in gelijke rechthoekige ROI's. Als er geen ROIs worden opgeslagen, worden de volgende stappen in het volledige beeld uitgevoerd.
   1. ROI's definiëren:
      1. Open het doelbestand via Plugins → Bio-Formats → Bio-Formats Importer.
      2. Gebruik het Polygon-gereedschap om een interessegebied te tekenen dat het gewenste gebied overspant.
      3. Voeg de geselecteerde regio toe aan de ROI Manager (druk op de T-toets).
      4. Herhaal stap 4.2.1 voor hoeveel ROI's je nodig hebt.
   2. Meet- en exportgebied:
      1. Selecteer de eerste ROI
      2. Voer Analyze → Measure uit en sla de Area-waarde op als een bestand genaamd: "filename"_processed_RoiArea.csv
         OPMERKING: De bestandsnaam moet overeenkomen met de oorspronkelijke afbeeldingsnaam en eindigen met: _processed_RoiArea.csv
      3. Gebruik de ROI Manager om de ROIs op te slaan. Gebruik dezelfde bestandsnaam met de. ROI-extensie voor één ROI, of de .zip-extensie voor meerdere ROI's.
3. Detecteer en volg EB1-GFP kometen - STAP 3
   Gebruik de TrackMate-plugin²⁵ om EB1-GFP-kometen te detecteren en hun beweging in de tijd te volgen.
   OPMERKING: STEP 3 kan op elke "bestandsnaam" worden toegepast_processed.tif door het macrobestand File_3_Step3_MTs_macro_tracking.py (Supplementary Coding File 3) naar Fiji te slepen en op RUN te drukken. Selecteer vervolgens een map die verwerkt moet worden. De ROI's worden automatisch geladen en de analyse wordt uitgevoerd voor elk bestand, waarbij de bijbehorende spot- en track-uitkomsten worden gegenereerd. Voor batchverwerking wordt aanbevolen om 2–3 representatieve beelden te analyseren om visueel te verifiëren dat de standaardinstellingen van de detector en tracker geschikt zijn voor de grootte en dynamiek van de kometen. Als de instellingen geschikt zijn, kan de gebruiker de relevante parameters aanpassen om EB1-tips nauwkeurig te volgen, waardoor vals-negatieve en vals-positieven worden geminimaliseerd.
   1. Open het doelbestand via Plugins → Bio-Formats → Bio-Formats Importer
   2. Open de TrackMate-plugin. Kies JA als je gevraagd wordt T en Z te wisselen.
   3. Selecteer Logdetector. Stel de deeltjesdiameter in op 0,5 μm (pas aan indien nodig)
   4. Stel de kwaliteitsdrempel in op 30 (pas aan indien nodig). Activeer zowel subpixel-lokalisatie als Pre-process met een mediaanfilter.
   5. Verwijder alle extra spotfiltering. Selecteer de Kalman Tracking-methode
   6. Stel een initiële zoekstraal in op 0,5, zoekradius 0,7 en maximale frameafstand van 2 (pas aan indien nodig - De initiële zoekradius zet de tracker in, de zoekradius bepaalt hoe ver een spot tussen frames kan bewegen, en de maximale framegap maakt korte verdwijningen in de baan mogelijk).
   7. Sla de track-filtering over die dan verschijnt. Zodra het spoor voltooid is, ga je naar Spots → Export naar CSV en geef je het bestand een naam: "bestandsnaam"_ROI01_spots.csv
   8. OPMERKING: De bestandsnamen moeten het aantal geanalyseerde ROI's weerspiegelen. Als er meerdere ROI's worden gebruikt, sla dan elk uitvoerbestand op met een bijbehorende identificatie, zoals _ROI01, _ROI02, enzovoort.
4. Datavisualisatie en kwantitatieve analyse - STAP 4
   Gebruik de Python-scripts om de trackinggegevens te verwerken en belangrijke parameters te berekenen, waaronder het aantal komeeten, snelheid, levensduur, hoekconsistentie en oriëntatie. Deze scripts genereren samenvattende tabellen (CSV-bestanden), plots en statistische analyses ter ondersteuning van kwantitatieve analyse van MT-dynamiek (Figuur 4).
   1. Softwareomgeving:
      1. Installeer de distributie van Python (3.12). Zorg ervoor dat de volgende externe Python-bibliotheken zijn geïnstalleerd (via pip install pandas numpy scipy matplotlib seaborn ipython statsmodels notebook): Pandas en NumPy (voor datastructuurverwerking en numerieke berekeningen), SciPy en Statsmodels (specifiek scipy.stats, voor circulaire statistiek en hypothesetoetsing), Matplotlib en Seaborn (voor het genereren van roosplots en statistische staafdiagrammen), IPython (voor displaytools binnen het notitieboek), Jupyter Notebook (voor het gebruik van het notitieboek).
      2. Plaats de aangepaste analysemodules (File_5_MTModule1.py en File_6_MTModule2.py – Aanvullende Codeerbestanden 5 en 6) in de hoofdmap naast het analysenotitieboek (Bestand 4_Step4_MTs_results.ipynb – Aanvullende Codering Bestand 4).
      3. Open het Jupyter-notebook door het commando "jupyter notebook" in de Python-terminal uit te voeren en laad het bestand 4_Step4_MTs_results.ipynb – Supplementary Coding File 4 notebook.
   2. Invoergegevens en parameterdefinitie:
      1. Vul de database in om biologische replicaties te koppelen aan hun experimentele metadata.
      2. Geef het volgende voor elk experiment: Basisnaam: De unieke identificatiestring die in de bestandsnamen wordt gevonden, Voorwaarde: De experimentele groep (bijv. "Controle", "Behandeld"), Correctiehoek: De hoek die nodig is om de ROI uit te lijnen met de biologische as (bijv. Voorste = 0°).
      3. Pas de parameters aan: exporteer afbeeldingsformaat en dpi, plotkleuren en de standaard bin-grootte voor hoekberekeningen
      4. Stel de datafilterparameters zo in dat ze korte tracks uitsluiten: Minimale spoorlengte: tracks korter dan deze duur worden weggegooid
   3. Uitvoering van de analysepijplijn:
      1. Lees en voer alle codecellen uit om de ruwe trackinggegevens te verwerken. Het script doorloopt de databaselijst om de volgende procedurele stappen uit te voeren:
         1. Identificeer alle ROI-specifieke CSV-bestanden die aan elke basisnaam zijn gekoppeld.
         2. Filter sporen op basis van de minimale lengte (alleen trajecten die langer dan 3 frames blijven behouden), bereken de instantane snelheden, bereken de totale verplaatsing en pas de referentiehoekcorrectie toe op alle trajecten.
         3. Normaliseer het aantal kometen op basis van het ROI-gebied (geladen vanuit metadata) om de komeetdichtheid te berekenen.
      2. Verzamel verwerkte gegevens in een masterdataset (df_all) en bereken algemene samenvattende statistieken (gemiddelde snelheid, spoorduur en hoekconsistentievectorlengte) voor elke ROI.
      3. Voer de make_combined_rose_panel-functie uit om gegroepeerde rozenplots te genereren. Dit creëert een zij-aan-zij panelvergelijking van hoekverdelingen voor alle ROI's binnen elke experimentele conditie. Voer create_comprehensive_analysis_plots_enhanced uit om staafdiagrammen te maken voor scalaire metrics.
      4. Voer de run_angle_analysis_pipeline functie uit om specifieke oriëntatieanalyse uit te voeren:
         1. Classificeer sporen in oriëntatiebakken met twee strategieën: Cardinal Binning (4 bins van 90° breedte: Noord/Voor, Oost/Rechts, Zuid/Posterior, West/Links) en Anterieur/Posterior Binning (2 bins van 180° Anterior versus Posterior).
         2. Bereken het percentage sporen dat per oocyt in elke gedefinieerde oriëntatie bewegen.
   4. Statistische analyse en outputgeneratie:
      1. Itereer door gedefinieerde scalaire metriek: Gemiddeld aantal kometen per frame per gebied, gemiddelde duur van het kometspoor en gemiddelde komeetsnelheid. Voor elke metriek voert het volgende uit:
         1. Voer Kruskal-Wallis- of Mann-Whitney U-tests uit voor onafhankelijke vergelijkingen over experimentele omstandigheden.
         2. Voer Friedman- of Wilcoxon-tests uit om consistentie over de ROI's heen te beoordelen.
         3. Voer Friedman- en Wilcoxon Signed-Rank-tests uit (met de Pratt-methode) om oriëntatievoorkeuren (bijv. Noord versus Zuid) binnen elke ROI te beoordelen.
         4. Exporteer de volgende resultaten naar de Results-map : Samenvattende CSV's (metrics_table.csv, track_table.csv, roi_metrics.csv), Statistische Rapporten (bijv. Gemiddelde komeet velocity_mwu.csv) en Plots (PNG-bestanden met hoge resolutie).
            OPMERKING: Stap 4 kan alleen in Python worden uitgevoerd. Open de File_4_Step4_MTs_results.ipynb en lees en voer alle cellen uit. Elke cel bevat instructies voor uitvoering en het bijbehorende verwachte resultaat.

5. Statistische analyse:

OPMERKING: Vanwege de niet-Gaussische verdeling van trackinggegevens werden voor alle vergelijkingen niet-parametrische statistische tests gebruikt.

1. Beoordeel onafhankelijke verschillen tussen experimentele omstandigheden (bijv. Controle versus Behandeld) met behulp van de Mann-Whitney U-test (voor twee groepen) of de Kruskal-Wallis-test, gevolgd door post-hoc paarwijze Mann-Whitney vergelijkingen (voor >2 groepen)).
2. Beoordeel oriëntatievoorkeuren binnen dezelfde ROI met behulp van de Friedman-test (globaal verschil), gevolgd door de Wilcoxon Signed-Rank test (paargewijs).
3. Behandel nul-verschil gelijkstanden met behulp van de Pratt-methode.
4. Rapporteer paargewijze vergelijkingen als ongecorrigeerde p-waarden om statistische kracht te behouden. Gebruik de meegeleverde scripts om zowel ruwe als aangepaste p-waarden te rapporteren, met betekenis ingesteld op 0,05. Rapporteer alle samenvattende statistieken als Gemiddelde ± Standaardfout van het Gemiddelde (SEM), tenzij anders vermeld).

Results

Dit protocol werd met succes gebruikt om de groeidynamiek en polariteit van MT te analyseren in Drosophila melanogaster-oocyten in middenstadia van oogenese, met behulp van EB1-GFP, een plus-end-tracking eiwit dat plaatsen van actieve MT-polymerisatie^{markeert 17,18}. Wanneer het wordt afgebeeld met laserscanning confocale microscopie, verschijnt EB1-GFP als heldere, puntvormige "kometen" die bewegen in de oriëntatie van MT-groei^17,18 (Figuur 3A; Aanvullende video 1). Het volgen en kwantificeren van deze kometen maakt een nauwkeurige beoordeling mogelijk van MT-nucleatie, verlenging en organisatie binnen de oocyt. Met dit workflowprotocol werden MT-dynamiek beoordeeld in controle-oöcyten en in oözyten die experimenteel werden verstoord in het MT-netwerk. Specifiek werd het gedrag van EB1-kometen vergeleken over drie aandoeningen: onbehandelde controle-oocyten, koud behandelde controle-oocyten en koud behandelde heterozygote patronine-mutante eicellen ^12,26. Koude behandeling induceert MT-depolymerisatie, waardoor MT-hergroei tijdens het herstel kan worden beoordeeld. Heterozygote patronine mutant (+/patr⁰⁵²⁵²⁾ oocyten werden geïncludeerd als positieve controle voor verstoorde MT-dynamiek. Patronine is een geconserveerde MT minus-end stabilisator²⁷ en een kerncomponent van ncMTOCs in oöcyten¹² en andere weefsels². Eerder onderzoek toonde aan dat patroninemutanten die aan MT-depolymerisatie worden onderworpen, een significante afname van het aantal EB1-kometen vertonen na regrowth¹². Zo maakte het opnemen van heterozygote patroninemutanten validatie van de methode mogelijk tegen een bekende MT-regrowth-defecte achtergrond. Stadium 7-8 oocyten werden gefotografeerd wanneer centrosomen worden verzwakt en MT's worden gegenereerd via acentrosomale routes.

In overeenstemming met eerdere waarnemingen werd de hoogste dichtheid van EB1-kometen gedetecteerd in het voorste gebied van de eicel, met een geleidelijke afname richting de achterste^14,15 (Figuur 5B; Tabel 1; Aanvullende tabellen 1 en 2). Om onderscheid te maken tussen bona fide MT-polymerisatiegebeurtenissen en stationaire of uit-vlak signalen, maakt dit protocol onderscheid tussen het totale aantal gedetecteerde EB1-GFP-brandpunten en de subset van bewegende brandpunten. De onbeweeglijke fractie vertegenwoordigt waarschijnlijk stationaire kometen of kometen die voornamelijk in het axiale vlak bewegen (Figuur 5A,B). Analyses van MT-spoorlengte en groeisnelheid werden uitsluitend uitgevoerd op de mobiele EB1-GFP-kometen om opname van stationaire signalen of axiale bewegingen te vermijden die de schatting van spoorlengte en -snelheid konden verstoren. Totale EB1-GFP-brandpunten en de motiele fractie worden in aparte grafieken weergegeven om directe vergelijking tussen de algehele detectie en het dynamische gedrag mogelijk te maken (Figuur 5A, B). In controle-oocyten mat het protocol 0,189 ± 0,02 SEM EB1 beweeglijke kometen/μm² (18,9 EB1 kometen/100 μm²) in het voorste gebied, gevolgd door 0,064 ± 0,02 SEM en 0,043 ± 0,01 SEM EB1 beweeglijke kometen/μm² in respectievelijk het midden en achterste gebied (respectievelijk 6,4 en 4,3 EB1 kometen/100 μm²) (Figuur 5B; Tabel 1; Aanvullende tabellen 1 en 2). Een eerdere studie²⁸ waarin EB1-kometen in dezelfde ontwikkelingsfase werden gemeten, detecteerde 48,54 EB1-kometen/100μm², wat hoger is dan de waarden die hier zijn gedetecteerd voor beweeglijke EB1-GFP-kometen. De gemeten waarden zijn echter consistent wanneer men rekening houdt met het totale aantal gedetecteerde EB1-GFP-kometen (Figuur 5A; Tabel 1; Aanvullende tabellen 1 en 2). De sectie Materialen en Methoden van die studie specificeert niet hoeveel z-stacks zijn gebruikt om de oocyten te fotograferen. Het is daarom mogelijk dat meer dan één z-stack in de analyse is opgenomen, wat kan hebben bijgedragen aan het hogere aantal gedetecteerde EB1-GFP-kometen. Een andere factor die de gerapporteerde waarden kan beïnvloeden, is het gebied van de oocyt dat wordt geselecteerd voor de kwantificatie van de komeet. Als regio's van belang dichter bij de meest voorste pool waren gekozen, waar de EB1-komeetdichtheid het hoogst is, zou dit de gemiddelde komeetdichtheid kunnen verhogen ten opzichte van de hier gepresenteerde metingen. Desalniettemin zijn de hier verkregen resultaten van dezelfde orde van grootte en geven ze consequent een afname van de EB1-komeetdichtheid richting het achterste gebied weer, zoals eerder gerapporteerd^14,15.

Na kou-geïnduceerde MT-hergroei vertoonden controle-oocyten EB1-komeetwaarden vergelijkbaar met onbehandelde controles, wat wijst op een robuust MT-herstel. Daarentegen vertoonden, in overeenstemming met eerdere rapporten¹², patroninemutanten een significante vermindering van het aantal beweeglijke EB1-kometen in het voorste gebied (ROI1) vergeleken met beide controlegroepen (Figuur 5B; Tabel 1; Aanvullende tabellen 1 en 2). Hoewel het aantal kometen in de midden- en achterregio's (ROI's 2 en 3) ook lager liep, waren deze verschillen niet statistisch significant (Figuur 5B). De hier waargenomen vermindering was minder uitgesproken dan die gerapporteerd in nocodazol-gebaseerde assays¹². Dit weerspiegelt waarschijnlijk het gebruik van heterozygote patroninemutanten waarbij slechts één allel gemuteerd is. Daarnaast zal het koud-geïnduceerde depolymerisatieprotocol mogelijk niet alle MT's volledig depolymeriseren, en het interval van 5–15 minuten tussen verwijdering uit het ijs en beeldvorming maakt waarschijnlijk enige MT-nucleatie en hergroei mogelijk voordat de gegevens worden verzameld. Daarentegen worden nocodazol-gebaseerde assays direct na colcemide-inactivatie uitgevoerd met behulp van een microscoop UV-laser¹². Desalniettemin tonen deze resultaten aan dat dit protocol biologisch relevante, regio-specifieke veranderingen in MT-organisatie kan detecteren. Ze sluiten ook aan bij de verrijking van ncMTOC's en van Patronine, een kerncomponent van ncMTOC, aan de voorkant van de oocyt. De zwakkere vermindering van het aantal kometen in de midden- en achterste regio's kan ook het ontwikkelingsgedoe zijn dat ncMTOCs en Patronine uit de achterste cortex in deze stadia¹² worden uitgesloten.

Analyse van de EB1-spoorlengte in controle-oocyten toonde langere komeetsporen in het anterieure gebied van de oocyt (0,613 μm ± 0,04 SEM) en kortere kometen in de midden- en achterregio's (respectievelijk 0,463 μm ± 0,04 SEM en 0,488 μm ± 0,05 SEM) (Figuur 5C; Tabel 1; Aanvullende tabellen 1 en 2). Deze bevinding komt overeen met eerdere gegevens waaruit blijkt dat MT's korter aanblijven bij de achterpool dan bij de voorste pool, wat suggereert dat MT's bij de achterpool korter zijn^{als 14}. Bij koud behandelde heterozygote patronine-mutante oocyten was de lengte van de EB1-komeet significant verkort vergeleken met koudbehandelde controles in de voorste en achterste regio's. Een vergelijkbare niet-statistisch significante trend werd waargenomen in het middengebied (Figuur 5C; Tabel 1; Aanvullende tabellen 1 en 2), wat een gedeeltelijke vermindering van de MT-stabiliteit suggereert. Gezamenlijk ondersteunen deze resultaten de bekende rol van Patronine als minus-eind MT-stabilisator en zijn consistent met eerdere waarnemingen in Drosophila-gekweekte cellen, waar verlies van Patronine resulteert in kortere MT-spoelen^12,27. Deze bevindingen benadrukken ook de gevoeligheid van dit protocol bij het detecteren van subtiele maar biologisch betekenisvolle verstoringen in MT-dynamiek.

Bij het meten van de snelheid van EB1-komeeten in controle-oözyten detecteerde de analyse gemiddelde snelheden van 0,208 ± 0,01 μm/sec, 0,207 ± 0,01 μm/sec en 0,202 ± 0,01 μm/sec in respectievelijk de voorste, midden- en achterregio's (Figuur 5D; Tabel 1; Aanvullende Tabellen 1 en 2), wat consistent is met eerder werk^14,15. Controle-oocyten vertoonden een lichte afname in de groeisnelheid van de MT van het voorste naar het achterste gebied. Dit kan de verrijking van ncMTOC's weerspiegelen, samen met mogelijk andere niet-geïdentificeerde microtubuli-geassocieerde eiwitten (MAPs), in de antero-laterale regio's, die de groei en extensie van MT bevorderen en zo bijdragen aan de waargenomen posterieure afname. Bij koudbehandelde eicellen vertoonden patronine-heterozygote mutanten een niet-statistisch significante trend naar een lichte vermindering van de MT-groeisnelheid vergeleken met controles, hoewel dit verschil geen statistische significantie bereikte (Figuur 5D; Tabel 1; Aanvullende tabellen 1 en 2). Deze bevinding komt overeen met eerdere waarnemingen in Drosophila-neurale stamcellen die patroninemutanten tot expressie ^{brengen 29}.

Lokalisatie van ncMTOC's in het antero-laterale gebied van de oocyt, samen met hun uitsluiting van de posterior, zorgt ervoor dat de meeste MT's worden gekweekt met hun minusuiteinden verankerd in de antero-laterale cortex. Daardoor wordt een antero-posterior gradiënt van MT's vastgesteld binnen de oocyt, met een bescheiden oriëntatiebias: 60% van de MT's groeit naar de posterior en 40% naar de anterieure¹⁴. Ons protocol detecteerde deze bias succesvol in controle-oöcyten in alle regio's van de oocyt (Figuur 5E). De vertekening in MT-oriëntatie was sterker in het achterste gebied, zoals eerder gerapporteerd¹⁴. Opmerkelijk is dat deze posterior verrijking in oriëntatiebias verloren ging na koude behandeling bij controle- en heterozygote patronine-mutante oocyten (Figuur 5E,F). Bij koudbehandelde controle-oocyten verschuift de oriëntatie van MT naar voorwaarts gerichte groei in alle regio's. Deze verschuiving verscheen als een trend in de voorste en middelste regio's en werd statistisch significant in de achterste regio (Figuur 5F). Een mogelijke verklaring voor dit verlies van bias naar de achterzijde is dat nieuw gepolymeriseerde MT's onder koudbehandelde omstandigheden tijd nodig hebben om te associëren met MAPs, zoals motoreiwitten, die MT-stabilisatie en/of crossbinding bevorderen. Vertraagde rekrutering van deze factoren kan de versterking van posterior georiënteerde MT's belemmeren. Samenvattend maakt dit protocol een gevoelige, kwantitatieve analyse mogelijk van MT-groei, lengte, snelheid en oriëntatie binnen de eicellen. Het detecteert betrouwbaar regio-specifieke, biologisch betekenisvolle veranderingen in MT-dynamiek, in lijn met eerdere studies, en toont gevoeligheid aan om subtiele verschillen in MT-gedrag op te lossen, zoals geïllustreerd door de waarnemingen bij heterozygotep-atroninemutanten.

Figuur 1: Oogenese van Drosophila melanogaster (A) Overzicht van oogenese in de eierstok van Drosophila . Elke eierstok bevat 12–16 ovariolen, die fungeren als een eiproductielijn. Oogenese begint in het germarium, waar 2–3 kiemlijnstamcellen asymmetrisch delen, waardoor een stamcel en een dochtercel ontstaan die beginnen te differentiëren. Deze cellen ondergaan 4 mitotische delingen om een cyste van 16 cellen te vormen die verbonden is door ringkanalen. Van deze cellen wordt er één de oocyt, terwijl de andere als verpleegcellen dienen en de groei en ontwikkeling van de eicel ondersteunen tot een stadium 14 oocyt aan het achterste uiteinde. (B) Plan van fase 9 Drosophila eierkamer. MT's worden gegenereerd uit ncMTOC's die gelokaliseerd zijn in de antero-laterale cortex, die worden uitgesloten van de achterzijde van de oocyt¹². Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Protocol workflowdiagram. Overzicht van de belangrijkste stappen van eierstokdissectie en live imaging tot komeettracking en kwantitatieve analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Representatieve beelden gegenereerd door de verwerking van oocyten in stadium 7–8. (A-E) Representatieve beelden die de beeldverwerkingsworkflow in stap 1 illustreren, toegepast op stadium 7–8 oocyten van controle-, controle-koudbehandelde en heterozygote patronin⁰⁵²⁵² koudbehandelde oocyten. Kanalen zijn een representatief beeld van een maximale projectie van 2 frames van een 150-frame time-lapse film, opgenomen met 0,5 s per frame. (A) Kanaal 1, dat overeenkomt met het genereren van een ontruisd beeld uit de bijbehorende afgebeelde oocyt. (B) Kanaal 2, dat overeenkomt met het genereren van een verschil in Gaussisch beeld. (C) Kanaal 3, dat overeenkomt met het genereren van een beeld waarbij het signaal van EB1-GFP-kometen werd versterkt om de toppen van de kometen te tonen. (D) Samensmelting van kanalen 2 en 3, wat helpt om de resulterende komeetpunten uit de verwerking van kanaal 2 te visualiseren. (E) EB1-GFP komeettrajecten gegenereerd uit time-lapse C in FIJI met behulp van de Temporal Color code-plugin om MT-dynamiek te illustreren. De kleurcode geeft de tijdsprojectie aan voor 20 frames (0,50 s tussen de frames). Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Screenshot van een sectie in STEP 4 Jupyter Notebook. Het notitieboekje is opgebouwd met Markdown-cellen die vanzelfsprekende instructies geven, gevolgd door codecellen die realtime resultaten en logs weergeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Analyse van EB1-GFP komeetdynamiek in controle- en koudbehandelde oocyten van stadium 7-8. Gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde ± SEM per ROI (ROI1–ROI3) voor controle-, controle-koudbehandelde en patronine⁰⁵²⁵² koudbehandelde oocyten. EB1-GFP komeetmetingen werden verkregen uit time-lapse beelden die in FIJI werden verwerkt; tenzij anders aangegeven, werden analyses uitgevoerd op beelden die in Channel 3 waren verwerkt. Het totale aantal EB1-GFP kometen werd geanalyseerd uit Kanaal 2-beelden (DoG-beeld). De statistische significantie werd beoordeeld met behulp van de Kruskal–Wallis-test, gevolgd door Mann–Whitney post-hoc vergelijkingen, of de Friedman-test gevolgd door Wilcoxon matched-pairs-tests, afhankelijk van toepassing (p < 0,05; p < 0,001; p < 0,0001). (A) Scatter dot plot dat het gemiddelde aantal totale EB1-GFP komeetnummers toont. (B) Scatter dot plot dat het gemiddelde aantal beweeglijke EB1-GFP-kometen toont. (C) Scatter dot plot die de gemiddelde lengte van het EB1-GFP komeetspoor toont. (D) Scatter dot plot die de gemiddelde EB1-GFP komeetsnelheid toont. (E) Rose-grafieken tonen de oriëntatie van EB1-GFP-sporen binnen ROI1–ROI3 in controle- (n = 14), controle-koudbehandelde (n = 12) en patronine⁰⁵²⁵² koudbehandelde (n = 11) oocyten. Het gemiddelde percentage van elke spoor per oocyt, gericht op de voorste (A) of posterieure (P), is aangegeven voor elke aandoening en ROI. (F) Staafgrafiek die het gemiddelde percentage EB1-GFP komeetspoorhoeken toont gericht op de voorste en achterzijde van de eicel. Percentages per oocyt werden berekend en geven de relatieve verdeling van de komeetoriëntatie binnen elke ROI weer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Metriek	ROI	Controle (n=14)	Gecontroleerd koud behandeld (n=12)	Patronin05252 koudbehandeld (n=11)
Totaal EB1-GFP komeetnummer (#/μm2)	ROI 1 (vooraan)	0,667 ± 0,18	0,691 ± 0,20	0,570 ± 0,17
	ROI 2 (midden)	0,394 ± 0,11	0,532 ± 0,15	0,400 ± 0,12
	ROI 3 (posterior)	0,353 ± 0,09	0,561 ± 0,16	0,378 ± 0,11
Motiele EB1-GFP komeetnummer (#/μm2)	ROI 1 (vooraan)	0,189 ± 0,02	0,175 ± 0,03	0,099 ± 0,03
	ROI 2 (midden)	0,064 ± 0,02	0,091 ± 0,02	0,056 ± 0,02
	ROI 3 (posterior)	0,043 ± 0,01	0,104 ± 0,03	0,047 ± 0,02
EB1-GFP komeet spoorlengte (μm)	ROI 1 (vooraan)	0,613 ± 0,04	0,621 ± 0,03	0,478 ± 0,07
	ROI 2 (midden)	0,463 ± 0,04	0,535 ± 0,03	0,410 ± 0,05
	ROI 3 (posterior)	0,488± 0,05	0,543 ± 0,04	0,393 ± 0,05
EB1-GFP komeetsnelheid (μm/sec)	ROI 1 (vooraan)	0,208 ± 0,01	0,198 ± 0,01	0,188 ± 0,01
	ROI 2 (midden)	0,207 ± 0,01	0,199 ± 0,01	0,186 ± 0,01
	ROI 3 (posterior)	0,202 ± 0,01	0,194 ± 0,01	0,177 ± 0,01

Tabel 1. Samenvatting van EB1-GFP komeetmetingen over de voorste en posterieure regio's in geanalyseerde oocyten. Metingen werden verkregen van controle-, controle-koudbehandelde en heterozygote patronin⁰⁵²⁵² koudbehandelde oocyten. Interessegebieden werden gedefinieerd als ROI1 (anterior), ROI2 (midden) en ROI3 (posterior).

Aanvullende Tabel 1. Statistische analyse van EB1-GFP komeetmetingen tussen experimentele omstandigheden. P-waarden geven verschillen aan tussen controle, controle, koud behandelde en heterozygote ^{patronine 05252} koud behandelde oocyten voor elke ROI (ROI1-ROI3). Globale vergelijkingen tussen de drie aandoeningen werden uitgevoerd met behulp van de Kruskal–Wallis-test, gevolgd door paarwijze Mann–Whitney post hoc-vergelijkingen.  Klik hier om dit bestand te downloaden

Aanvullende Tabel 2. Statistische vergelijking van EB1-GFP komeetmetingen tussen ROI's binnen elke experimentele conditie. P-waarden geven verschillen aan tussen ROI1 (anterior), ROI2 (midden) en ROI3 (posterior) binnen controle, controle, koud behandelde en heterozygote patronine⁰⁵²⁵² koudbehandelde oocyten. De totale verschillen tussen ROI's binnen elke aandoening werden beoordeeld met behulp van de Friedman-test. Vervolgens werden paargewijze vergelijkingen tussen ROI's uitgevoerd met behulp van Wilcoxon matched-pairs signed-rank tests. Klik hier om dit bestand te downloaden

Aanvullende video 1. Time-lapse beeldvorming van het plus-end–tracking eiwit EB1-GFP in een controlefase 7–8 oocyt, die een representatieve acquisitie aantoont die geschikt is voor latere MT-tracking analyse (gerelateerd aan Figuur 3). Klik hier om dit bestand te downloaden

Aanvullende codering Bestand 1: File_1_Step1_MTs_macro.ijm. Een Fiji/ImageJ-macro voor beeldvoorbewerking. Het automatiseert correctie van fotobleaching, Kalman-filtering en achtergrondaftrekking met behulp van een Difference of Gaussians (DoG)-filter. Het past ook een temporele gradiëntverbetering toe (reslicing en 1D-convolutie) om de voorranden van MT-tips te verscherpen voor een betere volgnauwkeurigheid. Klik hier om dit bestand te downloaden

Aanvullende codering Bestand 2: File_2_Step2_MTs_macro.ijm. Een Fiji/ImageJ-macro voor semi-geautomatiseerde Region of Interest (ROI)-definitie. Het vraagt de gebruiker om de oocytgrens te definiëren en segmenteert de selectie automatisch in gelijk ver verwijderde zones (in ons voorbeeld 3 zones: Voor, Centraal en Posterior) om regionale stratificatie van de analyse mogelijk te maken. Klik hier om dit bestand te downloaden

Aanvullende coderingsbestand 3: File_3_Step3_MTs_macro_tracking.py. Een Python-script (uitgevoerd binnen Fiji/ImageJ) dat de automatische tracking van EB1-kometen uitvoert met behulp van Trackmate. Het verwerkt voorbewerkte afbeeldingen in batch, detecteert kometen met gedefinieerde kwaliteitsparameters, koppelt deze aan trajecten en exporteert de ruwe coördinatengegevens als CSV-bestanden. Klik hier om dit bestand te downloaden

Aanvullende codering Bestand 4: File_4_Step4_MTs_results.ipynb. Een Jupyter Notebook dat dient als de primaire interface voor kwantitatieve analyse. Het laadt de ruwe trackinggegevens, voert de analysepijplijn uit en genereert alle eindresultaten, inclusief roosplots, statistische samenvattingstabellen en vergelijkingsgrafieken voor komeetdichtheid, snelheid en levensduur. Klik hier om dit bestand te downloaden

Aanvullende codering Bestand 5: File_5_MTModule1.py. Een aangepaste Python-module met fundamentele nutsfuncties die worden gebruikt voor data-extractie en basis geometrische berekeningen. Het bevat functies voor het vinden van ROI-bestanden, het berekenen van momentane snelheden en het berekenen van basishoekverplaatsingen. Klik hier om dit bestand te downloaden

Aanvullende codering 6: File_6_MTModule2.py. Een aangepaste Python-module met geavanceerde analyse- en visualisatiefuncties. Het bevat de algoritmen voor de oriëntatieanalysepijplijn (Cardinal vs. Axial binning), robuuste statistische tests (Friedman/Wilcoxon met Pratt-methode) en het genereren van publicatiekwaliteit polaire (roos) plots. Klik hier om dit bestand te downloaden

Aanvullende codering 7: File_7_KalmanStackFilterCompiled.jar. Een gecompileerde Java Kalman Filter-plugin voor Fiji/ImageJ is vereist voor de ruisonderdrukkingsstappen in de pre-processing macro. Deze standalone versie elimineert de noodzaak van een aparte Java Development Kit (JDK), waardoor de software-setup van de gebruiker wordt vereenvoudigd. Klik hier om dit bestand te downloaden

Discussion

Live beeldvorming van MT-dynamiek in oocyten brengt unieke uitdagingen met zich mee, omdat hoogwaardige datasets en kwantitatieve analyses nodig zijn om betekenisvolle informatie te extraheren. Hoewel eerdere studies live beeldvormingsbenaderingen 14,15,16 rapporteerden, zijn de beeldanalysestappen vaak sterk aangepast en bieden protocollen niet voldoende details voor reproduceerbaarheid. Daardoor kunnen onderzoekers zonder uitgebreide expertise in beeldvorming of computationele techniek barrières ondervinden bij het reproduceren van deze analyses. Om deze uitdagingen aan te pakken, werd een gestroomlijnde workflow ontwikkeld, waarbij Airyscan live imaging met hoge resolutie wordt gecombineerd met gebruiksvriendelijke, geautomatiseerde macro's en scripts. Deze pijplijn maakt efficiënte detectie en tracking van EB1-kometen mogelijk, gevolgd door kwantitatieve analyse van MT-oriëntatie, snelheid en ruimtelijke organisatie. Door handmatige interventie te minimaliseren en duidelijke, stapsgewijze instructies te geven, bevordert de workflow de toegankelijkheid en reproduceerbaarheid van MT-dynamica-analyse in oocyten.

Eierstokdissectie en monstervoorbereiding zijn cruciale eerste stappen. Oocyten moeten zorgvuldig worden ontleed om mechanische schade te voorkomen, en de beeldvormingsduur moet worden beperkt tot 90 minuten om levensvatbaarheid^{te behouden}. Stadiumselectie is belangrijk: na halverwege oogenese neemt de oocyt toe in omvang en hoopt zich dooier op in het cytoplasma, waardoor het steeds moeilijker wordt om het EB1-signaal te visualiseren na stadium 9. Daarom wordt beeldvorming na stadium 9 niet aanbevolen om²⁰ te nemen. Ook zijn, voor reproduceerbare kwantificeringen, waar mogelijk, oöcyten van vergelijkbare grootte te verkiezen, omdat dit ervoor zorgt dat gedefinieerde interessegebieden overeenkomen met equivalente voor-posterior posities over monsters.

Temperatuurregeling is essentieel voor reproduceerbaarheid. Vliegbestanden moeten worden gehandhaafd bij standaard kweekcondities (25 °C) om normale ontwikkeling en consistente EB1-GFP-expressie te ondersteunen, vooral bij gebruik van het GAL4/UAS-systeem, dat gevoelig is voor temperatuurschommelingen. Temperatuurstabiliteit tijdens beeldvorming is even belangrijk, omdat variaties de MT-dynamiek kunnen beïnvloeden. Hoewel een temperatuurgecontroleerde kamer niet vereist is, wordt aanbevolen temperatuurschommelingen tijdens de verwerving te vermijden.

Voor beeldverwerving werd confocale beeldvorming van de arraydetector gekozen vanwege de hoge gevoeligheid en verbeterde SNR, waardoor de noodzaak van post-acquisitie-denoising werd geminimaliseerd. Objectieven met een hoge numerieke apertuur (zo hoog mogelijk) in combinatie met passende brekingsindexmatching moeten worden gebruikt om laterale en axiale resolutie te maximaliseren, wat cruciaal is voor het oplossen van individuele kometen in dichte netwerken. Bovendien moeten de Nyquist-Shannon³⁰ bemonsteringscriteria in XYZ en tijd worden gevolgd om verlies van nauwkeurigheid bij het volgen van de komeet te voorkomen. Even belangrijk is de zorgvuldige selectie van het beeldvlak langs de z-as. Te diepe beeldvorming resulteert in fluorescentieverlies door lichtverstrooiing, terwijl het beperken van de acquisitie tot het corticale oppervlak niet de volledige dynamiek van EB1-kometen vastlegt. De meest informatieve gegevens worden verkregen op een tussenliggende z-positie. Oocyten waarin de kern binnen het geselecteerde vlak valt, moeten worden vermeden, omdat het nucleaire compartiment een groot deel van het cytoplasma verplaatst en geen EB1-sporen heeft, waardoor het aantal detecteerbare kometen afneemt.

Hoewel geoptimaliseerd voor confocale beeldvorming gebaseerd op arraydetectoren, is deze analysepijplijn hardware-agnostisch en compatibel met andere modaliteiten, zoals spinning-disk confocale microscopie. Gebruikers moeten zich er echter van bewust zijn dat systemen met een lagere NA of SNR mogelijk aanpassingen vereisen aan de voorverwerkingsparameters van de macro (bijv. ruistolerantie/DoG-sigma's) en dat dit kan resulteren in een lagere dichtheid van komeetdetectie ten opzichte van de waarden die in deze studie zijn gepresenteerd. Desalniettemin zullen de relatieve trends tussen experimentele omstandigheden en ROI's robuust blijven, hoewel absolute waarden tussen systemen kunnen verschillen.

Gezien de grote 3D-structuur van de oocyt, legt 2D-beeldvorming slechts een optisch deel van het MT-netwerk vast. Daardoor kunnen kometen die steil bewegen langs de z-as het brandpuntsvlak verlaten, wat mogelijk leidt tot een onderschatting van de levensduur van het spoor en de absolute snelheid (aangezien alleen de xy-component van de snelheidsvector wordt gemeten). Echter, hogesnelheids 3D-volumetrische beeldvorming van de gehele oocyt zou kleinere gezichtsvelden (FOV), kortere belichtingstijden en snellere responstijden van de detector vereisen, waardoor SNR wordt verminderd en de verwervingstijd over meerdere z-sneden wordt verdeeld, wat de temporele resolutie die nodig is voor het volgen van snelle EB1-kometen in gevaar brengt. Om niet-bewegende kometen en onscherpe artefacten te beperken, werden convolutionele en minimale-spoorduur filters toegepast (exclusief sporen < 3 frames) om transiënte vlekken die door het brandpuntsvlak lopen te verwijderen. Bovendien blijven de waargenomen relatieve verschillen in komeetdichtheid, snelheid en oriëntatie robuust, aangezien deze geometrische beperking uniform geldt voor experimentele omstandigheden. Hoewel opkomende technieken zoals lichtveldmicroscopie idealiter de volledige 3D-structuur gelijktijdig zouden vastleggen, zijn ze nog niet breed beschikbaar. Desalniettemin zijn de gemeten waarden voor alle MT-dynamicaparameters consistent met eerdere rapporten, wat aangeeft dat dit protocol geschikt is voor het onderzoeken van MT-dynamiek in verschillende experimentele opstellingen.

Voordat de macro's in dit protocol worden gebruikt, wordt aanbevolen om de eerste paar afbeeldingen handmatig te verwerken om te zorgen dat de softwareparameters correct zijn geoptimaliseerd. Factoren zoals beeldresolutie, vergroting, signaal-ruisverhouding, framerate en of de data single-plane of z-stack zijn, kunnen allemaal invloed hebben op de nauwkeurigheid van tracking. Iteratief parameters aanpassen terwijl je de resulterende tracks visueel inspecteert om valse positieven en vals-negatieven te minimaliseren. Zodra de parameters geoptimaliseerd zijn, passen de parameters consequent toe over datasets om reproduceerbaarheid te garanderen.

Tot slot moeten enkele beperkingen met betrekking tot biologische interpretatie worden opgemerkt. EB1-GFP labelt selectief groeiende MT plus uiteinden en rapporteert daarom op plaatsen van actieve MT-polymerisatie in plaats van op de gehele MT-populatie. Stabiele, niet-polymeriserende MT's die tijdens de beeldvormingsperiode aanwezig zijn, worden met deze methode niet gedetecteerd. Hoewel deze beperking minder beperkend is bij oocyten met midden-oogenese, waar de meerderheid van de MT's zeer dynamisch is, moet deze worden meegenomen bij het toepassen van het protocol op andere celtypen met substantiële stabiele MT-populaties, zoals neuronen³¹.

Samenvattend maakt deze workflow een hoogresolutie, kwantitatieve analyse van MT-dynamiek in Drosophila-oocyten mogelijk. Door geoptimaliseerde dissectie, arraydetector confocale live imaging en geautomatiseerde analysetools te integreren, biedt het een rigoureuze maar toegankelijke methode om MT-regulatoren in een acentrosomale context te onderzoeken. Hoewel het voornamelijk in oocyten wordt gevalideerd, zijn de principes van deze benadering bij optimalisatie aanpasbaar aan andere celtypen, waaronder niet-delende cellen zoals neuronen en epitheel, en bieden ze een schaalbaar platform voor genetische screenings en mechanistische studies van MT-organisatie.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
EB1::GFP	Van Dr. Antoine Guichet, CNRS, Institut Jacques Monod, Frankrijk		Genotype: w; +/CyO; UASp-EB1::GFP/TM3
Petrischalen met glazen bodem	MatTek	P35G-1.0-14-C
Matα4-Gal4-VP16	Bloomington Drosophila Stock Center	7062	Genotype: w[*]; P{w[+mC]=matα4-GAL-VP16}V2H
Olie 10S, VOLTALEF	VWR Chemicals	24627.188
Patronin mutant	Bloomington Drosophila Stock Center	16647	Genotype: y[1] w[67c23]; P{y[+mDint2] w[+mC]=EPgy2}Patronin[EY05252]/CyO
w1118	Bloomington Drosophila Stock Center	3605
Zeiss LSM 980 met Airyscan 2	Zeiss