Methodenartikel

Immunokleuring en kleurstofpenetratie-experimenten om kerngeplooide septaat-junction-eiwitten te definiëren in het embryonale epitheel van Drosophila

DOI:

10.3791/69986

⸱

27 februari 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Case Western Reserve University, 2Admissions Counselor, Case Western Reserve University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze protocollen beschrijven hoe de organisatie en occluderende functie van geplooide septaatverbindingen in controle- en mutante Drosophila-embryonale epitheel karakteriseerd kunnen worden.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van deze protocollen is het evalueren van de organisatie en barrièrefunctie van geplooide Septaatverbindingen (pSJ's) in de ectodermaal afgeleide epitheelweefsels van Drosophila-embryo's. pSJ vormen een afsluitende barrière op het laterale membraan van ectodermale weefsels, waaronder de epidermis, speekselklieren, luchtpijp en achterdarm, die functioneel vergelijkbaar is met de strakke verbinding in het weefsel van gewervelden. Bij Drosophila zijn 30 eiwitten geïdentificeerd die nodig zijn voor de vorming van pSJ's. Kerneiwitten van pSJ zijn aanvankelijk gelokaliseerd langs de lengte van het laterale membraan, maar worden sterk verrijkt in het apicale laterale gebied van de overgang, net basaal van de adherens-verbinding, tegen stadium 16 van de embryogenese. Tegen het late stadium 15 van de embryogenese beschikken deze weefsels over een volledig functionele occluerende overgang. Dit artikel zal immunokleurings- en kleurstofpermeabiliteitsprotocollen beschrijven die kunnen worden gebruikt om de organisatie en functie van pSJ's in controle- en mutante embryo's te onderzoeken. Succesvol gebruik van deze protocollen kan worden gebruikt om de occluerende functie van pSJ's aan te tonen en te testen of een onbekend gen codeert voor een kerncomponent van de verbinding.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een cruciale functie van epitheelweefsels is het compartimentaliseren van afzonderlijke gebieden binnen een organisme. Het creëren van deze onderscheidende omgevingen is essentieel voor de orgaanfunctie en om het organisme te beschermen tegen externe bedreigingen. De occluerende verbinding die tussen de cellen van een epitheel wordt gevormd, is verantwoordelijk voor het vestigen en behouden van deze omgevingen door de paracellulaire stroom van opgeloste stoffen tussen de apicale en basale zijde van dat epitheelte voorkomen. Bij gewervelde organismen wordt de occluding junction de tight junction genoemd, terwijl deze bij ongewervelden zoals Drosophila melanogaster 1,3 de septate junction (SJ) wordt genoemd. Er zijn twee typen SJ bij geleedpotigen, onderscheiden door hun weefselverdeling en ultrastructuur4. Geplooide septaatverbindingen (pSJ's) worden gevonden in ectodermaal afgeleide weefsels zoals de epidermis, speekselklieren, luchtpijp en achterdarm. Ze worden ultrastructureel gekenmerkt door een ladderachtige array van elektronendicht materiaal in de extracellulaire ruimte tussen cellen, die net basaal ligt op de adherens-verbinding 3,5. Daarentegen worden gladde septaatverbindingen (sSJ) gevonden in endodermaal afgeleide weefsels zoals middendarm- en Malpighiaanse buisjes en vertonen ze geen elektronendichte septae tussen cellen6.

Genetische studies in Drosophila hebben 30 eiwitten geïdentificeerd die nodig zijn voor de structuur en functie van pSJ en hebben extra eiwitten geïdentificeerd die zich in de overgang bevinden, maar geen functie lijken te hebben in hun vestiging of onderhoud (besproken in7). Uit deze analyses hebben wetenschappers SJ-eiwitten in drie klassen ingedeeld. Kern-SJ-eiwitten bevinden zich in de overgang en zijn nodig voor het opzetten en onderhouden van de overgang. Zeventien eiwitten zijn geïdentificeerd als kern pSJ-eiwitten, waaronder Coracle (Cora), Neurexin IV, Macroglobuline complement-related (Mcr), Kune-kune en ATPase alfa 8,9,10,11,12. Negen eiwitten zijn geïdentificeerd als aanvullende pSJ-eiwitten die nodig zijn voor het opzetten en/of onderhouden van de verbinding, maar die niet noodzakelijkerwijs in de verbinding aanwezig zijn. Deze klasse omvat eiwitten zoals Rab5, Rab11 en Coiled13,14. Ten slotte lokaliseren pSJ-residente eiwitten zich op de pSJ, maar zijn ze overbodig voor het vestigen en onderhouden van de verbinding. Voorbeelden van de vier leden van deze groep zijn Discs Large en Fasciclin III15,16.

Het vestigen van een functioneel intact pSJ is een meerstapsproces dat halverwege de embryogenese begint wanneer alle kern pSJ-eiwitten volledig tot expressie zijn gebracht. Sommige kerngenen van pSJ worden maternaal tot expressie gebracht, maar alle tonen sterke zygotische expressie in stadium 12 tot17. In stadium 12 lokaliseren de kern pSJ-eiwitten zich over de hele lengte van het laterale membraan. Tijdens stadia 13-16 worden kerneiwitten van pSJ endocytoseerd en vervolgens teruggerecycled naar het laterale membraan in het gebied van de pSJ. Dit proces vereist pSJ-accessoire-eiwitten, waaronder Rab5 en Rab1114. In stadium 16 zijn de kern pSJ-eiwitten nauw gelokaliseerd in het gebied van de pSJ langs het laterale membraan. In overeenstemming met deze observaties vindt de volledige occluderende functie van de junction plaats in het late stadium 15 van embryogenese12. Dit wordt het beste aangetoond met een kleurstofpermeabiliteitstestsay. Voorafgaand aan de vorming van de overgang kan een 10 kDa dextran-kraal, gelabeld met een fluorescerende marker zoals rhodamine, door de paracellulaire ruimte tussen cellen gaan. Als de gelabelde dextran in de hemocoel wordt geïnjecteerd, zal deze zich snel ophopen in het lumen van buisepitel zoals de luchtpijp, speekselklier en achterdarm. Nadat de pSJ fysiologisch strak is aan het einde van stadium 15, wordt de geïnjecteerde dextran beperkt tot de basale zijde van het epitheel en kan zich niet ophopen in het lumen (apikale domein) van deze organen.

Kern pSJ-eiwitten delen een karakteristiek kenmerk waarbij elk kern pSJ-eiwit de aanwezigheid van alle andere kern pSJ-eiwitten vereist voor correcte subcellulaire lokalisatie18,19. Deze onderlinge afhankelijkheid in de vorming van pSJ is een bepalend kenmerk van kerneiwitten van pSJ en ligt ten grondslag aan de protocollen die in dit artikel worden gepresenteerd. Mutaties in kern- of accessoire-pSJ-genen leiden tot embryonale lethaliteit en worden gekenmerkt door de verkeerde lokalisatie van andere kern-pSJ-eiwitten langs het laterale membraan in stadium 16-embryo's, in plaats van dat ze nauw gelokaliseerd zijn in hun normale apicale laterale regio. Daarentegen leiden mutaties in pSJ-residente genen niet tot verkeerde lokalisatie van kern pSJ-eiwitten15. De functionele verstoring van de pSJ bij kern- en accessoire-pSJ-genmutaties wordt aangetoond door de ophoping van gelabelde 10 kDa dextran in het lumen van de luchtpijp, speekselklieren of achterdarmen in stadium 16 of 17 mutante embryo's. Ten slotte is het onderscheidende kenmerk tussen een kern- en accessoire-pSJ-eiwit hun subcellulaire lokalisatie. Kerneiwitten van pSJ zijn nauw geassocieerd met de pSJ zodra ze gevormd zijn, terwijl aanvullende pSJ-eiwitten cruciaal zijn voor de assemblage van de junction maar niet noodzakelijkerwijs in de junction aanwezig zijn. De beste voorbeelden van aanvullende pSJ-eiwitten zijn Rab5 en Rab11. Beide zijn cytoplasmatische eiwitten die helpen bij het vervoeren van lading van het plasmamembraan naar vroeg en het recyclen van endosomen en vervolgens terug naar het plasmamembraan14. Om te onderscheiden of een nieuw potentieel pSJ-eiwit een kerncomponent of een accessoire-eiwit is, is het over het algemeen nuttig om een specifiek antilichaam te creëren of een fluorescentie-gelabeld recombinant eiwit tot expressie te brengen om te bepalen waar deze eiwitten zich op verschillende punten in het pSJ-rijpingsproces bevinden.

Het doel van deze protocollen is om potentiële kern- en accessoire-pSJ-eiwitten ondubbelzinnig te onderscheiden van pSJ-residente eiwitten. Verschillende studies hebben extra, niet-occluderende rollen voor pSJ-eiwitten tijdens de ontwikkeling aan het licht gebracht, waaronder rollen in morfogenese en apical-basale polariteit 17,20,21,22. Naarmate de interesse in pSJ-biologie toeneemt en er meer potentiële pSJ-eiwitten worden geïdentificeerd, zullen de eenvoudige, gemakkelijk interpreteerbare protocollen die hier worden gepresenteerd onderzoekers helpen de pSJ-organisatie en occluderende functies van deze eiwitten correct te karakteriseren. In de literatuur zijn veel aanvullende experimentele benaderingen voor het karakteriseren van pSJ-eiwitten beschreven, waaronder Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) en transmissie-elektronenmicroscopie 6,23. Hoewel deze benaderingen vaak zeer nuttig zijn, biedt de hier gepresenteerde immunokleuringstest een snelle visualisatie van pSJ-eiwitlokalisatie zonder dure en tijdrovende ultrastructurele methoden, terwijl de kleurstofpermeabiliteitstest een functionele meting van pSJ-integriteit biedt die niet alleen met beeldvorming kan worden bereikt. Daarnaast kunnen deze assays worden uitgevoerd met standaard laboratoriumapparatuur zoals een hoogwaardige fluorescentiemicroscoop en een rudimentaire micro-injectieopstelling. Het moet worden opgemerkt dat deze assays geoptimaliseerd zijn voor de analyse van Drosophila stadium 16 embryo's en niet geschikt zijn voor het evalueren van de organisatie of functie van sSJ's.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Stadiëring van embryo's

  1. Kruis gezonde mannelijke en vrouwelijke vliegen met de juiste genotypen (zie Materiaaltabel voor voorbeelden) en plaats ze in embryo-verzamelkooien met verse appelsapplaten die met gistpasta zijn besmeerd. Laat de vliegen een dag of twee wennen aan de eierverzamelkooien voordat ze beginnen met het verzamelen van embryo's.
  2. Verzamel embryo's op appelsapbordjes en laat ze zich ontwikkelen tot stadium 16 (~13 uur na het leggen van het eier (AEL) tot 16 uur AEL bij 25 °C). Laat de volwassen dieren bevruchte eieren 1-2 uur leggen op appelsapbordjes, haal het bord uit de eicelkooi en laat ze daarna rijpen tot 13-16 AEL bij 25 °C. Alternatief kunt u embryo's 's nachts verzamelen bij 25 °C en vervolgens stadium 16 embryo's selecteren vóór fixatie of tijdens de beeldvorming na fixatie en immunokleuring.
    OPMERKING: Embryonale stadiering kan worden beoordeeld aan de hand van darmmorfologie, die het gemakkelijkst zichtbaar is door autofluorescentie in het UV-spectrum (d.w.z. het DAPI-kanaal). In stadium 16 embryo's verschijnt de darm als drie parallelle, lange ovalen loodrecht op de lengteas van het lichaam (Figuur 1H).

2. Fixatie en immunokleuring van embryo's

  1. Stel een embryo-verzamelmand samen met een nylon mesh (120 mm mesh). Bedek de opening en de schroefdraad van het mandje met nylon gaas en schroef dan de dop erop.
  2. Haal de embryo's voorzichtig van het appelsapbord met een penseel en een embryowash-oplossing. Giet het embryomengsel in het embryoverzamelmandje en spoel de embryo's af met gedestilleerd water.
    OPMERKING: Wees voorzichtig om het water langs de binnenkant van het embryoverzamelmandje te leiden en voorkom dat de embryo's op de zijkanten van de mandje worden gespetterd, wat kan leiden tot verlies van het embryo door adhesie.
  3. Dechorioneer de embryo's door het verzamelmandje en de embryo's in een tray te dompelen met 50% commerciële bleekmiddel (eindconcentratie van 3,75% natriumhypochloriet). Draai de embryo's door het bleekmiddel en laat ze 3-5 minuten op kamertemperatuur onderdompelen. Haal het mandje uit het bleekmiddel en spoel de embryo's af met gedestilleerd water, waarbij je opnieuw de waterstroom langs de binnenkant van het mandje leidt.
  4. Bereid een fixatieflesje voor door gelijke volumes verse 4% paraformaldehydeoplossing en heptaan toe te voegen aan een 20 mL scintillatiebuis. Maak paraformaldehydeoplossing door de juiste hoeveelheid paraformaldehyde op te lossen in een hete (~90 °C) 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een chemische dampkap. Om het oplosproces te versnellen, voeg je 10 μL 14 N natriumhydroxide (per 10 mL PBS) toe aan de fix totdat de formaldehyde in oplossing is gegaan, en voeg je vervolgens 10 μL 14 N zoutzuur toe om de pH weer neutraal te maken.
    VOORZICHTIG: Draag altijd een labjas, veiligheidsbril en handschoenen bij het hanteren van paraformaldehyde en heptaan, en gebruik het alleen onder een chemische dampafzuigkap. Paraformaldehyde is een kankerverwekkend en corrosief, terwijl heptaan zeer brandbaar is en een huid- en oogirritant.
  5. Demonteer het embryoverzamelmandje en dompel het nylon gaas met gedechoreerde embryo's onder in het heptaan. De embryo's zullen loskomen van het nylon en zich vestigen op de grens tussen de heptaan (bovenste laag) en de fixatie (onderste laag). Herstel de embryo's door het fixatieflesje op een platformshaker te schudden op 240 omwentelingen per minuut (RPM) gedurende 20 minuten.
  6. Verwijder het fixatiebuisje uit het fixatiebuisje met een Pasteur-pipet in een chemische dampafzuigkap. Gooi de oplossing weg in een goedgekeurde container voor gevaarlijk chemisch afval. Voeg een gelijke hoeveelheid methanol toe, sluit de fixatiekamer en schud de kamer krachtig gedurende 5-10 seconden. De gefixeerde embryo's scheuren los uit de vitelline-omhulsel en zakken naar de bodem van de methanol (onderste laag). Vitelline-enveloppen en embryo's die er niet in slaagden los te rukken uit de vitelline-envelop blijven op de interface en worden verwijderd in stap 2.7.
    VOORZICHTIG: Draag altijd een labjas, een bril en handschoenen bij het hanteren van methanol, omdat het giftig en brandbaar is.
  7. Verwijder de heptaan met een Pasteur-pipet en gooi deze weg in een goedgekeurde container voor gevaarlijk chemisch afval. Verwijder vervolgens het grootste deel van de methanol, waarbij de embryo's in een kleine plas methanol worden achtergelaten, en gooi de methanol weg in gevaarlijk chemisch afval. Voeg 5 ml methanol toe, draai de embryo's rond en laat ze zakken. Verwijder het grootste deel van de methanol opnieuw en herhaal dit proces nog twee keer.
  8. Breng de embryo's in methanol over in een 0,8 mL glazen kweekbuis. Verwijder het methanol en voeg 750 mL blokoplossing toe (PBS plus 1% normaal donkey serum en 0,1% Triton X-100). Was de embryo's 3 keer in PBS en breng ze vervolgens 30 minuten in blokoplossing op kamertemperatuur met voorzichtig mengen op een platformwiebel.
  9. Spoel de embryo's nog één keer uit met PBS en voeg dan blok- plus primaire antilichamen toe. Gebruik antilichamen tegen een kern pSJ-eiwit (bijv. Coracle) en een adherens-junction-eiwit (bijv. E. cadherine). Incubeer de embryo's een nacht in het primaire antilichaam bij 4 °C of 3-4 uur op kamertemperatuur met voorzichtig mengen op een platform-schommel.
  10. Verwijder het blok met primaire antilichamen en spoel de embryo's drie keer af met PBS. Voeg Block toe en was de embryo's 30 minuten op kamertemperatuur op een platform.
  11. Spoel de embryo's nog één keer uit in PBS, voeg dan de blokkerende oplossing en fluorescerend gelabelde secundaire antilichamen toe die specifiek zijn voor de primaire antilichamen die in stap 2.9 worden gebruikt. Bred embryo's uit op kamertemperatuur gedurende 3-4 uur of 's nachts op 4 °C.
  12. Verwijder het blok met secundaire antistoffen en spoel de embryo's drie keer af met PBS. Voeg Block toe en was de embryo's 30 minuten op kamertemperatuur op een platform.
  13. Spoel de embryo's nogmaals af met PBS en plaats ze daarna op een microscoopglaasje met een Pasteur-pipet. Voer overtollige PBS af met kleine stroken Whatman-papier, waarbij je de embryo's niet aanraakt. Bedek de embryo's met montagemedium (commercieel verkrijgbaar of gemaakt van 90% glycerol, 10% 1 M Tris, pH 8,0, met 0,5% n-propylgallaat als antifadingmiddel). Bedek met een passend formaat 1,5 afdekglas en sluit de randen af met nagellak.

3. Beeldvorming en data-analyse van immunogekleurde embryo's

  1. Voor het beste resultaat beeld je embryo's met een confocale microscoop met een 40x olie-onderdompelingsobjectief. Gebruik controle-embryo's om de laserintensiteit en versterking op de confocale in te stellen, zodat een sterk fluorescerend signaal wordt bereikt zonder pixels te oversatureren. Identificeer stadium 16 embryo's naar keuze (d.w.z. die geen balancer-gecodeerde GFP uitdrukken om mutante embryo's te identificeren) met behulp van middarmmorfologie. Richt de scan op de speekselklier of achterdarm, aangezien deze organen gepolariseerd zijn en lange laterale membranen hebben die ideaal zijn om de adherens-overgang, pSJ en het resterende laterale oppervlak te onderscheiden. Beeld in een z-positie die de grootste mogelijke diameter van het lumen van de speekselklier of achterdarm omvat om het volledige laterale membraan van de epitheelcel te zien.
    OPMERKING: Het voorbeeld dat in Figuur 1C wordt getoond, is genomen met een confocale microscoop met een HC PL APO 40x/1,3 CS2 olie-immersielens met een laserintensiteit van 1,59 en een versterking van 3,3 voor de 561 nm laser en een laserintensiteit van 2,0 en een versterking van 21,7 voor de 638 nm laser (zie Materiaaltabel).
  2. Beeld een gepolariseerd weefsel in minstens 20 controle- en mutant-stadium 16 embryo's in. Alleen gegevens registreren van embryo's waarbij de adherens-junctionmarker nauw is gelokaliseerd in het apicale laterale gebied van het membraan om te waarborgen dat het embryo correct is gefixeerd en gekleurd. Vervolgens registreer je de verdeling van de pSJ-marker langs het laterale membraan. In wildtype stadium 16 embryo's moet je zoeken naar sterke verrijking van pSJ-eiwitten langs de ~10-15% van het laterale membraan net basaal van de adherens-verbinding.
    OPMERKING: Verkeerde lokalisatie van zelfs 10-20% van het pSJ-eiwit langs de lengte van het laterale membraan is diagnostisch voor een pSJ-organisatiedefect. pSJ-organisatiedefecten zijn sterk penetrant in alle kern- en accessoire-pSJ-mutante embryo's, dus je zou moeten verwachten dat 75-100% van de gemuteerde embryo's duidelijk verkeerd gelokaliseerd pSJ-eiwit vertonen.

4. Voorbereiding op kleurstofinjectie

  1. Maak een verse kleurstofoplossing door rhodamine-gelabelde 10 kDa Dextran op te lossen tot 1 mg/mL in 0,5 M natriumfosfaat, pH 7,5, en 5 mM kaliumchloride.
  2. Trek een capillairbuis (1,0 mm OD x 0,5 mm ID met vezel) met een naaldtrekker in een glazen naald.
    OPMERKING: Naaldtrekkers zijn eigenaardig en de instellingen voor ideale naalden verschillen vaak van dag tot dag. Goede naalden hebben een geleidelijke taps toelopende punt en zouden tussen de vormen in Figuur 2A moeten vallen. De naald aan de linkerkant is langer en kan buigen wanneer deze in het embryo wordt geduwd. Dat kan worden gecorrigeerd door de naald verder van de punt af te breken. De naald rechts is goed, maar zal een grotere boring hebben als deze in het begin breekt en kan te veel vloeistof in het embryo duwen. Als dat gebeurt, wissel dan over op een nieuwe naald met een fijnere punt. Het is het beste om meerdere naalden tegelijk te trekken wanneer de omstandigheden op de naaldtreker naalden van de juiste vorm creëren. Overtollige naalden kunnen in een gesloten container worden bewaard met een stuk schuim of tape om de naalden onafhankelijk vast te zetten.
  3. Laad de naald in de naaldhouder op een micromanipulator. Plaats de micromanipulator naast een omgekeerde microscoop (Figuur 2F). Oriënteer de naald zo dicht mogelijk parallel aan de glaasglaasje en laat deze zakken zodat deze in hetzelfde z-vlak ligt als de zijkant van de glaas.
  4. Breek de punt van de naald door tegen de zijkant van de microscoopglaasglaasje te slaan. Hef de naald boven het niveau van de slede en haal hem eruit voor het laden.
  5. Vul de capillaire buis met kleurstof met de kleinste beschikbare pipettip (P2- of P10-tip) of door capillaire werking door het achterste uiteinde van de naald in een 1,5 mL microcentrifugebuis met de kleurstof te plaatsen.
  6. Laad de gevulde naald opnieuw in de naaldhouder en test de stroming van de dextran door een beetje in een druppel halocarbonolie op het oppervlak van een microscoopglaasje te injecteren.
    OPMERKING: Een goed gebroken naald lekt niet zonder extra druk, en de doorstromingssnelheid kan worden aangepast door hoeveel druk er op de zuiger van de spuit wordt uitgeoefend.

5. Embryo's monteren en kleurstofinjectie

  1. Selecteer stadium 16 of 17 embryo's (controle- en mutanten) met middarmmorfologie als stadieringsmarker.
  2. Maak een ingedrukte lijn op een appelsapplaat met een deklaag van 22 x 22 # 2 dikte. Zet ongeveer 25 gefaseerde embryo's op de appelsapplaat met hun achterste uiteinden die de lijn raken en het buikoppervlak naar boven gericht.
  3. Breng een stuk dubbelzijdig tape aan op een deklaag van 22 x 22 #2. Raak de tape aan de embryolijn en wrijf lichtjes over de deklaag om de embryo's van de plaat naar de dubbelzijdige tape op de deklaag te verplaatsen (Figuur 2B).
  4. Bevestig de deklaag aan een microscoopglaasje door een druppel halocarbonolie aan de glaasje toe te voegen en met capillaire werking een binding te creëren. Oriënteer de coverslip dichter bij de zijkant van de glijbaan tegenover het bematte gedeelte. Droog de embryo's 3-5 minuten uit in een container met droogmiddel of in de lucht op een laboratorium gedurende 10-15 minuten (Figuur 2C-E). Bedek de embryo's volledig met halocarbonolie.
    OPMERKING: Embryo's zullen na het uitdrogen iets minder zwaar zijn, maar niet sterk slap. De embryo's die in Figuur 2E worden getoond, werden 15 minuten aan de lucht gedroogd in een kamer met 42% relatieve luchtvochtigheid bij 21,2 °C.
  5. Bevestig de glaasglaas met embryo's op de omgekeerde microscoop met de embryo's naar boven gericht (weg van het objectief). Lijn de micromanipulator zo uit dat de naald naar het achterste uiteinde van de embryo's gericht is onder een hoek zo dicht mogelijk parallel aan de embryo's (Figuur 2G). Stel de z-as van de micromanipulator zo aan dat de punt van de naald is uitgelijnd met het midden van het embryo (langs de dorsale-ventrale as).
  6. Injecteer de embryo's door de fase snel in de naald te bewegen zodat de naaldpunt in de hemocoel van het embryo terechtkomt. Injecteer een kleine hoeveelheid kleurstof (~0,2-0,5 nL) met een spuit van 10, 25 of 50 mL. Trek de naald snel terug, verplaats het stadium naar het volgende embryo en herhaal het proces. Injecteer zoveel mogelijk embryo's in 10 minuten.
    OPMERKING: Het is belangrijk dat de naald ongeveer 25% van het pad in het embryo wordt ingebracht, zodat de kleurstof niet direct in de perivitelline ruimte wordt geïnjecteerd die continu is met het lumen van de voor- en achterdarm. De geïnjecteerde kleurstof zou het embryo moeten lijken te "opblazen", waardoor het er zwaarder uitziet. Overinjectie zorgt ervoor dat er een bel van kleurstof plus hemolymfe uit de injectieplaats komt en moet worden vermeden.
  7. Voeg extra halocarbonolie toe en bedek de embryo's met een deklaag van 22 x 22 #2. De extra halocarbonolie vormt een meer uniforme laag tussen de twee dekfolies, waardoor de embryo's niet worden verpletterd.

6. Beeldvorming en data-analyse

  1. Voer beeldvorming uit met een fluorescerende verbindingsmicroscoop of een confocale microscoop (10x of 20x luchtobjectieven zijn voldoende om ondubbelzinnige resultaten te verkrijgen). Op de confocale zal z-stack imaging door ongeveer een kwart van de diepte (langs de dorsale ventrale as) van het embryo aantonen of de gelabelde dextran de lumen van de luchtpijp en achterbuik is binnengedrongen (diepere secties of het heroriënteren van de embryo's met het ventrale oppervlak bovenaan is noodzakelijk om de speekselklieren te zien).
    OPMERKING: De voorbeelden in Figuur 3 zijn genomen met een confocale microscoop met een HC PL APO 10x/0.4 CS2 droge lens met een laserintensiteit van 2.0 en een gain van 13.6 voor de 561 nm laser. 24 z-slices werden verkregen met een z-stapgrootte van 2,4 nm (zie de Materiaaltabel).
  2. Laat het geïnjecteerde embryo 10 minuten verouderen en onderzoek vervolgens het lumen van de luchtpijp, speekselklier of achterdarm op ophoping van het gelabelde dextran. Noteer het genotype en stadium van elk embryo en of er een ophoping van gelabelde dextran in een buisorgaan is. Let op embryo's waarin de perivitelline ruimte ook sterk is gekleurd met kleurstof, omdat dit embryo's kunnen zijn die per ongeluk in die ruimte zijn geïnjecteerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hier gepresenteerde protocollen worden gebruikt om de organisatie en functie van pSJ's in ectodermale weefsels in stadium 16 Drosophila-embryo's te onderzoeken. Deze protocollen zijn alleen van toepassing op pSJ's en kunnen niet worden gebruikt om sSJ's te ondervragen. Een mutatie in een gen die ertoe leidt dat andere pSJ-eiwitten niet worden gelokaliseerd naar de pSJ-regio in stadium 16-embryo's en het creëren van een occluding junction in stadium 16 bevindt zich in een kern-pSJ-gen ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om kern- en accessoire-pSJ-eiwitten te identificeren met behulp van twee relatief eenvoudige assays die kunnen worden uitgevoerd in bescheiden laboratoria met fluorescentiemicroscopiemogelijkheden. De eerste test onderzoekt de moleculaire organisatie van de pSJ in volwassen gepolariseerd epitheel met behulp van confocale beeldvorming van gefixeerde mutante embryo's. De tweede test test de integriteit van de occluderende functie van de pSJ door met kleurst...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten om te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken het Bloomington Drosophila Stock Center voor de vliegbestanden die in deze studie zijn gebruikt. Wij danken de Developmental Studies Hybridoma Bank voor de antistoffen die in de studie zijn gebruikt. We danken ook de afdeling Biologie van Case Western Reserve University voor het gebruik van hun Leica MZ10F fluorescentie-stereomicroscoop voor genotypering en stadiëring van embryo's voor dissectie en hun DMi8 omgekeerde fluorescentiemicroscoop voor de experimenten met kleurstofinjectie. Wij danken Helen Salz, hoogleraar Genetica en Genoomwetenschap aan de CWRU School of Medicine, voor het leveren van de micromanipulator en het trekken van verschillende naalden die werden gebruikt in het kleurstofinjectie-experiment dat in deze studie werd gepresenteerd. Dit project werd ondersteund door een subsidie van de National Science Foundation (IOS 2111069) aan REW.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Capillary tube for needles (Boro 1 X 0.5/Fiber )FHC30-30-1
Confocal microscopeLeicaStellaris 5 
Cover glass 22 x 22 2 thickness for injectionsFisher Scientific12-540-B
Cover glass 22 x 30 1.5 thickness for imagingCorning2980-233
Culture tube for immunostaining (6 x 50 mm) Fisher Scientific14-958-A
Embryo collection cageGenesee Scientific59-100
Fluorescence stereomicroscopeLeicaMZ10 F
Halocarbon oil (700)Genesee Scientific59-131
HeptaneFisher ScientificH350-4
Inverted fluorescence microscopeLeicaDMi8
Mesh baskets for dechorionating embryosGenesee Scientific46-101
MethanolFisher ScientificA412-4
MicromanipulatorNarishigeMN151
Microscope slidesFisher Scientific12-544-2
Needle pullerDavid Kopf instrumentsmodel 720
Normal Donkey SerumJackson ImmunoReseaerch017-000-121
Nylon mesh (120 um)Genesee Scientific57-102
Objective lens HC PL FLUOTR 10X/0.32 PH 1Leica11506537
Objective lens HC PL APO 10x/0.40 CS2Leica15506407
Objective lens HC PL APO 40x/1.30 CS2Leica15506358
Petri plates 60 x 15 mmCorning351007
Platform rockerGlobe ScientificGTR-FS
Primary antibody (Coracle)DSHBC566.9
Primary antibody (Coracle)DSHBC615.16
Primary antibody (E cadherin)DSHBDCAD2
Primary antibody (Mcr)Ward lab, CWRUguinea pig polyclonal
Rhodamine labeled 10 kDa dextranMolecular ProbesD1824
Secondary antibody (donkey anti-guinea pig Cy3)Jackson ImmunoReseaerch706-165-148
Secondary antibody (donkey anti-mouse Cy2)Jackson ImmunoReseaerch715-225-151
Secondary antibody (donkey anti-rat Cy5)Jackson ImmunoReseaerch712-175-150
Table top shakerNew Brunswick ScientificC2 platform shaker
Tegosept (methyl 4-hydroxybenzoate)TCIH0216
Triton X-100Fisher ScientificBP151500
Vials for fixation (20 ml WHEATON liquid scintillation vials)Fisher Scientific03-341-73C
Whatman 3MM  Chromatography PaperFisher Scientific05-716-6H
Fly stocksFull genotypestock numberSource
cor4w*; P{neoFRT}43D cora4/CyO52232BDSC
w1118w[1118]5905BDSC
SolutionRecipe
10x PBSMix 90 g of NaCl, 20 g of Na2HPO4, and 8.3 g of NaH2PO4.H2O and dH2O to 1L. Filter sterilize. Dilute to 1X with dH2O for washing steps in immunostaining.
10% Triton X-100 solutionMix 1 ml of Triton X-100 to 9 ml of dH2O on a platform rocker until dissolved. Store at room temperature.
50% bleachMix 10 ml of commercial bleach (7.5% sodium hypochlorite) to 10 ml of water prior to dechorionating embryos.
Apple juice platesBoil 15 g Drosophila agar in 725 ml dH2O. Add 25 g sugar and 250 ml apple juice and mix until blended. Let the solution cool to 55 C and then add 1.3 g tegosept and gently mix. Pour into 60 x 15 petri plates and let cool. Store at 4 C.
Blocking solutionMix 9.8 ml of 1X PBS with 100 ul of 10% Triton X-100 and 100 ul of Normal Donkey Serum in a 15 conical tube.
Embryo wash solutionMake 10X embryo wash solution by mixing 70 g NaCl and 2 ml Triton X-100 to 1L of dH2O. Dilute to 1X with dH2O for working solution.
FixPreheat 10 ml of 1X PBS in the microwave. Add 0.4 g  of paraformaldehyde and pipet to mix. Add 10 ul of 14N NaOH to speed dissolving. Place on a 90 C heatblock until dissolved. Once no solid paraformaldehyde remains add 10 ul of 14N HCL to adjust pH to neutral. Always wear a lab coat, gloves and googles when using paraformaldehyde.
Mounting mediaMix 9 ml of glycerol and 1 ml of 1M Tris base pH 8.0. Add 0.05 g n-propyl-gallate,  mix and heat to dissolve. Aliquot 0.5 ml into eppendorf tubes. 
Rhodamine dextran solutionMake fresh dye solution by dissolving Rhodamine-labeled 10 kDa Dextran to 1 mg/ml in 0.5M Sodium Phosphate, pH 7.5 and 5 mM Potassium Chloride.
Yeast pasteMix 50 g of commercial yeast (Red Star) with a pinch of sucrose and enough water to make a thick paste. Store at 4 C.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Farquhar, M. G., Palade, G. E. Junctional complexes in various epithelia. J. Cell Biol. 17, 375-412 (1963).
  2. Lord, B. A., DiBona, D. R. Role of the septate junction in the regulation of paracellular transepithelial flow. J. Cell Biol. 71 (3), 967-972 (1976).
  3. Noirot-Timothée, C., Smith, D. S., Cayer, M. L., Noirot, C. Septate junctions in insects: comparison between intercellular and intramembranous structures. Tissue Cell. 10 (1), 125-136 (1978).
  4. Rouka, E., et al. The Drosophila septate junction beyond barrier function: review of the literature, prediction of human orthologs of SJ-related proteins and identification of protein domain families. Acta Physiol. 231 (1), e13527(2021).
  5. Poodry, C., Schneiderman, H. The ultrastructure of the developing leg of Drosophila melanogaster. Roux Arch. Dev. Biol. 166, 1-44 (1970).
  6. Tepass, U., Hartenstein, V. The development of cellular junctions in the Drosophila embryo. Dev. Biol. 161 (2), 563-596 (1994).
  7. Rice, C., De, O., Alhadyian, H., Hall, S., Ward, R. E. Expanding the junction: new insights into non-occluding roles for septate junction proteins during development. J. Dev. Biol. 9 (1), 11(2021).
  8. Baumgartner, S., et al. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87 (6), 1059-1068 (1996).
  9. Fehon, R. G., Dawson, I. A., Artavanis-Tsakonas, S. A Drosophila homologue of membrane-skeleton protein 4.1 is associated with septate junctions and is encoded by the coracle gene. Development. 120 (3), 545-557 (1994).
  10. Hall, S., et al. Macroglobulin complement-related (Mcr) encodes a protein required for septate junction organization and paracellular barrier function in Drosophila. Development. 141, 889-898 (2014).
  11. Nelson, K. S., Furuse, M., Beitel, G. J. The Drosophila claudin Kune-kune is required for septate junction organization and tracheal tube size control. Genetics. 185 (3), 831-839 (2010).
  12. Paul, S. M., Ternet, M., Salvaterra, P. M., Beitel, G. J. The Na⁺/K⁺-ATPase is required for septate junction function and epithelial tube-size control in the Drosophila tracheal system. Development. 130 (20), 4963-4974 (2003).
  13. Nilton, A., et al. coiled and crimpled are three Ly6-like proteins required for proper localization of septate junction components. Development. 137 (14), 2427-2437 (2010).
  14. Tiklova, K., Senti, K. A., Wang, S., Gräslund, A., Samakovlis, C. Epithelial septate junction assembly relies on melanotransferrin iron binding and endocytosis in Drosophila. Nat. Cell Biol. 12 (11), 1071-1077 (2010).
  15. Bilder, D., Schober, M., Perrimon, N. Integrated activity of PDZ protein complexes regulates epithelial polarity. Nat. Cell Biol. 5 (1), 53-58 (2003).
  16. Woods, D. F., Bryant, P. J. The discs-large tumor suppressor gene of Drosophila encodes a guanylate kinase homolog localized at septate junctions. Cell. 66 (3), 451-464 (1991).
  17. Hall, S., Ward, R. E. Septate junction proteins play essential roles in morphogenesis throughout embryonic development in Drosophila. G3 (Bethesda). 6 (8), 2375-2384 (2016).
  18. Genova, J. L., Fehon, R. G. Neuroglian, Gliotactin, and the Na⁺/K⁺-ATPase are essential for septate junction function in Drosophila. J. Cell Biol. 161 (5), 979-989 (2003).
  19. Ward, R. E., Lamb, R. S., Fehon, R. G. A conserved functional domain of Drosophila coracle is required for localization at the septate junction and has membrane-organizing activity. J. Cell Biol. 140 (6), 1463-1473 (1998).
  20. De, O., et al. Septate junction proteins are required for cell shape changes, actomyosin reorganization and cell adhesion during dorsal closure in Drosophila. Front. Cell Dev. Biol. 10, 947444(2022).
  21. Laprise, P., et al. The FERM protein Yurt is a negative regulatory component of the Crumbs complex that controls epithelial polarity and apical membrane size. Dev. Cell. 11 (3), 363-374 (2006).
  22. Laprise, P., et al. Neurexin IV and the Na⁺/K⁺-ATPase form a novel group of epithelial polarity proteins. Nature. 459 (7250), 1141-1145 (2009).
  23. Oshima, K., Fehon, R. G. Analysis of protein dynamics within the septate junction reveals a highly stable core protein complex that does not include the basolateral polarity protein Discs large. J. Cell Sci. 124 (Pt 16), 2861-2871 (2011).
  24. Hartenstein, V. Atlas of Drosophila Development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1993).
  25. Lamb, R. S., Ward, R. E., Schweizer, L., Fehon, R. G. Drosophila coracle, a member of the protein 4.1 superfamily, has essential structural functions in septate junctions and developmental roles in epithelial cells. Mol. Biol. Cell. 9 (12), 3505-3519 (1998).
  26. Davis, M. J., Talbot, D., Jemc, J. Assay for blood-brain barrier integrity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (151), e60233(2019).
  27. Laprise, P., et al. Epithelial polarity proteins regulate Drosophila tracheal tube size in parallel to the luminal matrix pathway. Curr. Biol. 20 (1), 55-61 (2010).
  28. Batz, T., Förster, D., Luschnig, S. The transmembrane protein macroglobulin complement-related is essential for septate junction formation and epithelial barrier function in Drosophila. Development. 141 (4), 899-908 (2014).
  29. Behr, M., Riedel, D., Schuh, R. The claudin-like Megatrachea is essential in septate junctions for epithelial barrier function in Drosophila. Dev. Cell. 5 (4), 611-620 (2003).
  30. Wu, V. M., et al. Sinuous is a Drosophila claudin required for septate junction organization and epithelial tube size control. J. Cell Biol. 164 (2), 313-323 (2004).
  31. Wu, V. M., et al. Drosophila Varicose, a member of a new subgroup of basolateral MAGUKs, is required for septate junctions and tracheal morphogenesis. Development. 134 (5), 999-1009 (2007).
  32. Jaspers, M. H., et al. The claudin Megatrachea protein complex. J. Biol. Chem. 287 (44), 36756-36765 (2012).
  33. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
  34. Zirin, J., et al. Large-scale transgenic Drosophila resource collections for loss- and gain-of-function studies. Genetics. 214 (4), 755-767 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Gepleatte septale verbindingenDrosophila embryo simmunokleuringprotocolepitheliale barri refunctiekern SJ eiwittenlateraal membraanectodermale weefselsoccluderende verbindingadherens verbinding

Gerelateerde artikelen