Methodenartikel

Real-time visualisatie van de impact van nutriëntenmedia op de ontwikkeling van Pseudomonas aeruginosa biofilm met behulp van een microfluïdisch systeem

DOI:

10.3791/69997

⸱

15 mei 2026

 ,  , 
1School of Mechanical, Aerospace and Civil Engineering, University of Sheffield, 2School of Chemical, Materials and Biological Engineering, University of Sheffield

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol evalueert de invloed van rijke (TSB) en minimale (FAB) nutriëntenmediasamenstellingen op de ontwikkeling van Pseudomonas aeruginosa PAO1 en PA14 biofilm in een steady state flow omgeving in een microkanaal.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De pathogene bacterie Pseudomonas aeruginosa is een belangrijke oorzaak van talrijke nosocomiale infecties, en de groeiende antimicrobiële resistentie heeft ertoe geleid dat het een aanzienlijke bedreiging voor de volksgezondheid vormt. Dit artikel presenteert een uitgebreid protocol dat het gebruik van een microfluïdisch systeem beschrijft voor realtime visualisatie en kwantificatie van biofilmontwikkeling in twee belangrijke P. aeruginosa-stammen , PAO1 en PA14. De methode maakt gebruik van optisch transparante, multikanaal microkanaalplaten om bacteriële culturen te onderwerpen aan een continue, constante stroom van media, waaronder tryptische sojabouillon (TSB) of gemodificeerde minimale nauwkeurige anaerobe bouillon (FAB) met wisselende concentraties koolstofbronnen, waarmee de omstandigheden in klinische omgevingen worden nagebootst. Over een periode van 24 uur legt geautomatiseerde realtime beeldvorming de groei en rijping van biofilms vast in de vorm van de oppervlaktebedekking, dikte en oppervlakteruwheid van de biofilm op een zeer reproduceerbare manier. Het experimentele doel is om de resultaten te gebruiken om aan te tonen dat biofilmvorming voor beide stammen significant wordt beïnvloed door veranderingen in de samenstelling van voedingsmedia. Het doel van dit gevisualiseerde protocol is om onderzoekers een methode te bieden om biofilmdynamiek te bestuderen onder stabiele laminaire stromingsomstandigheden, en de verkregen inzichten kunnen worden benut om alternatieve, niet-antimicrobiële strategieën te ontwikkelen voor het uitroeien van vroege P . aeruginosa-biofilms in nosocomiale omgevingen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van deze methode is om de impact te observeren van twee verschillende kweekmedia, namelijk tryptische sojabouillon (TSB) en gemodificeerde minimale nauwgezette anaerobe bouillon (FAB), op de biofilmgroei van twee Pseudomonas aeruginosa-stammen , namelijk PAO1 en PA14. Hoewel P. aeruginosa PAO1 en PA14 beide veelvoorkomende referentiestammen in het laboratorium zijn, infecteert de PA14-stam een groter aandeel gastheren, van planten tot ongewervelden1. De TSB-voedingsbouillon is een algemeen kweekmedium met 2,5 g/L glucose als koolstofbron en kan een breed scala aan bacteriën kweken dankzij de samenstelling van caseïne- en sojapeptonen voor organisch stikstof en een natuurlijke suikervoorziening, evenals natriumchloride om osmotisch evenwicht2 te behouden. Het minimale FAB-medium daarentegen is geformuleerd met minimale concentraties (50-voudige reductie) van één enkele koolstofbron, bij niveaus van 0,05 g/L om de groeibehoefte van anaerobe bacteriën te onderzoeken. Zowel de PAO1- als PA14-vervormingen werden blootgesteld aan eenrichtings, laminaire stroming, wat resulteerde in een lage wandschuifspanning van 0,01 Pa. Deze afschuifstresswaarde komt vaak voor op door P. aeruginosa gekoloniseerde locaties, waaronder de bronchiën van cystische fibrosepatiënten en het maag-darmkanaal. De biofilmgroei werd gemeten over een periode van 24 uur door realtime het percentage biofilmoppervlakte, de oppervlaktedekking, dikte en het rekenkundige gemiddelde van de oppervlakteruwheid te beoordelen.

P. aeruginosa-biofilms zijn verantwoordelijk voor een aanzienlijk percentage van de nosocomiale infecties en zijn een belangrijke doodsoorzaak bij mensen met taaislijmziekte 3,4,5. Eerdere onderzoeken naar de impact van koolstofbronniveaus op de ontwikkeling van bacteriële biofilms hebben de cruciale rol van hydrodynamische stroming tijdens de ontwikkeling van biofilm verwaarloosd, scherspanningswaarden gebruikt die niet representatief zijn voor infectieplaatsen van P. aeruginosa, of alleen biofilmkinetische en morfologische analyses uitgevoerd na experiment 6,7. Deze beperkingen worden met deze methode aangepakt door gebruik te maken van realtime beeldvorming van biofilmontwikkeling, onder stationaire stroming binnen een microfluïdisch kanaal dat fysiologische omgevingen bij cystische fibrosepatiënten nauw nabootst.

Deze methode biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van alternatieve technieken die worden gebruikt om biofilmontwikkeling te bestuderen. De toepassing van realtime beeldvorming tijdens de 24-uur biofilmgroeiperiode zorgt ervoor dat de ontwikkelende biofilm onaangetast blijft, omdat er geen droging of chemische aanpassingen nodig zijn, waardoor veranderingen in de samenstelling worden voorkomen en representatievere resultaten opleveren dan methoden die monstermanipulatie vereisen8. Daarnaast repliceert deze procedure door het toepassen van stabiele hydrodynamische stromingscondities en het variëren van de concentraties van koolstofbronnen over een grote omvang de fysiologische omgevingen op locaties van P. aeruginosa nosocomiale infecties nauwkeuriger. Dit maakt het een representatievere methode vergeleken met statische assays, zoals 96-well microtiterplaten of coupons, die het kritieke effect van vloeistofstroom op biofilmontwikkelingniet vastleggen.

Het gebruikte microfluidische apparaat is specifiek gekozen omdat de afmetingen vergelijkbaar zijn met delen van de long, zoals bronchiolen en bronchiën12. Bovendien zijn P. aeruginosa-infecties een groot probleem voor patiënten met ernstige brandwonden, waarbij het glucosegehalte aanzienlijk kan afwijken van het normale bereik van de patiëntvan 13,14.

Hoewel dit protocol specifiek twee stammen van P. aeruginosa gebruikt, is de methode ook toepasbaar op onderzoeken naar de vroege ontwikkeling van andere bacteriën die infecties veroorzaken of gebieden onder vergelijkbare omstandigheden koloniseren. Daarnaast kunnen ook andere samenstellingen van voedingsstoffen en stromingscondities (bijvoorbeeld pulserende en oscillerende stromingen, of hogere wandschuifwaarden) met dezelfde methodologie worden onderzocht.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Glaswerkreiniging

  1. Dompel twee glazen flessen van 200 ml om te gebruiken voor media en agar, en drie glazen flessen van 1 L in een 10% zoutzuurbad (HCl) voor ongeveer 5 minuten bij kamertemperatuur.
    VOORZICHTIG: zoutzuur is corrosief. Voer alle zuurbehandeling uit in een chemische dampkap terwijl je de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen draagt (labjas, handschoenen en oogbescherming).
  2. Verwijder vervolgens het glas uit het HCl-bad en spoel twee keer met kraanwater en één keer met gedestilleerd water (dH2O).

2. Tryptische sojabouillon-mediabereiding

  1. Bereid de TSB-oplossing voor, weeg 6 g/200 mL TSB-poeder met een schone weegboot en een precisiebalans.
    OPMERKING: De samenstelling van het gebruikte TSB-poeder is als volgt: Dextrose (2,5 g∙L-1), Dikaliumfosfaat (2,5 g∙L-1), Pancreasdigestie van caseïne (17 g∙L-1), Papaïsche digest van sojameel (3,0 g∙L-1) en natriumchloride (5,0 g∙L-1).
  2. Meet 200 mL dH2O op met een meetcilinder en giet dit in een van de eerder gereinigde glazen flessen.
  3. Voeg de 6 g TSB toe aan de schone glazen fles met 200 ml dH2O, sluit de fles stevig af en meng ongeveer 2 minuten om het poeder op te lossen, waardoor het TSB-oplossingsmedium ontstaat.
  4. Autoclaaf TSB-mediaoplossing gedurende 15–20 minuten bij een temperatuur van 121 °C en een druk van 1,5 atm om de oplossing te steriliseren.
    OPMERKING: (PAUZEPUNT) TSB-oplossing kan tussen gebruik door bij kamertemperatuur (ongeveer 20 °C) worden bewaard en voor toekomstige experimenten worden gebruikt.

3. Nauwgezette anaerobe bereiding van bouillon

  1. Bereid een FAB-media-tracemetaloplossing voor.
    1. Gebruik aparte, schone weegboten en een spatel, en een precisiebalans bij het wegen van massa's tussen 0,5–210 g, en een analytische balans bij het wegen van massa's tussen 0,001–0,5 g. Meet de volgende componenten en hun hoeveelheden af: CaSO4,2H 2O (200 mg∙L-1), FeSO 4,7H2O (200 mg∙L-1), MnSO4. H2O (20 mg∙L-1), CuSO 4,5H2O (20 mg∙L-1), ZnSO4,7H 2O (20 mg∙L-1), CoSO4,7H 2O (10 mg∙L-1), NaMoO4. H2O (10 mg∙L-1), en H3BO3 (5 mg∙L-1)7,9.
    2. Voeg elk van de componenten toe aan een 1 L schoongemaakte glazen fles met 1 L dH2O en meng grondig met de dH2O.
    3. Voeg 1 ml van het mengsel toe aan elk van de twee resterende 1 L gesteriliseerde glazen flesjes met 1 L dH2O en meng grondig.
  2. Bereid 20 mM natriumcitraat-aangevuld FAB voor nachtkweken
    1. Meet de volgende componenten en hun hoeveelheden af met aparte, schone weegboten en een spatel, een precisiebalans bij het wegen van massa's tussen 0,5-200 g en een analytische balans bij het wegen van massa's tussen 0,001-0,5 g,: Natriumcitraat (20 mM), (NH4)2SO4 (2 g∙L-1), Na2HPO4,2H 2O (6 g∙L-1), KH2PO4 (3 g∙L-1), NaCl (3 g∙L-1), MgCl2 (93 mg∙L-1) en CaCl2 (11 mg∙L-1)7,9.
    2. Voeg alle componenten toe aan een van de resterende 1 L gesteriliseerde glazen flessen met 1 L dH2O en 1 ml spoormetaaloplossing.
    3. Meng grondig.
  3. Bereid 0,3 mM met glucose aangevuld FAB voor biofilmgroei.
    1. Vervang de 20 mM natriumcitraat door 0,3 mM glucose. Gebruik dezelfde componenten en massa's als vermeld in stap 3.2.1.
    2. Voeg in de resterende schoongemaakte 1 L glazen fles de 0,3 mM glucose FAB-componenten toe aan 1 mL dH2Omet 1 mL spoormetaaloplossing en meng goed.
  4. Autoclaaf 15-20 minuten bij een stoomtemperatuur van 121 °C en een druk van 1,5 atm, om het medium te steriliseren.
    OPMERKING: (PAUZEPUNT) Fab Mediumoplossing kan tussen gebruik door op kamertemperatuur (ongeveer 20 °C) worden opgeslagen en voor toekomstige experimenten worden gebruikt.

4. TSB-agarbereiding

  1. Meet 8 g/200 mL TS-agar af met behulp van de precisiebalans en het wassen van de weegboten en spatel.
  2. Meet 1 g/200 mL van bacteriologische agar, op een aparte weegboot, met dezelfde precisiebalans.
  3. Meet met een meetcilinder 200 mL dH2O en giet dit in de uiteindelijke, eerder gereinigde glazen fles.
  4. Giet beide agarcomponenten in de 200 mL dH2O en meng goed.
  5. Autoclaaf gedurende 15–20 minuten bij een temperatuur van 121 °C en een druk van 1,5 atm, om het medium te steriliseren.
    OPMERKING: (PAUZEPUNT) TSB-agar kan tussen gebruik door op kamertemperatuur (ongeveer 20 °C) worden opgeslagen en moet opnieuw worden verwarmd voor gebruik in toekomstige experimenten.

5. Petrischaal Pseudomonas Aeruginosa kweek

  1. Smelt agar ongeveer 5 minuten in de magnetron, of totdat de oplossing vloeibaar is.
  2. Open en desinfecteer een klasse II veiligheidskastoppervlak met 70% ethanoloplossing, klaar voor gebruik. Volg alle onderstaande stappen in deze sectie binnen deze klasse II veiligheidskast.
  3. Meet 25 mL agaroplossing af in een flesje van 50 mL en giet dit in een 90 mm petrischaal, en wacht tot de agar is uitgehard.
  4. Haal de diepvriesbouillon van P. aeruginosa PAO1 en PA14 op uit de vriezer -80 °C. Plaats de bouillons ongeveer 5 minuten in de broedmachine op 37 °C, of totdat de inhoud volledig ontdooid is.
  5. Doop de inoculatielus in een van de ontdooide P. aeruginosa-stokken en verspreid het monster over de agar.
  6. Herhaal stap 5.5 voor de andere P. aeruginosa-stam , waarbij twee aparte P. aeruginosa-petrischaalculturen ontstaan, één met de PAO1-stam en de andere met de PA14-stam.
  7. Label elke petrischaal met de stam P . aeruginosa erin, datum van heropleving en initialen, en plaats ze vervolgens in de broedmachine voor 16–18 uur bij 37 °C.
    OPMERKING: (PAUZEPUNT) P. aeruginosa PAO1 en PA14 Petrischalen kunnen tot 4 weken worden bewaard op 4 °C en worden gebruikt voor toekomstige experimenten.

6. Pseudomonas aeruginosa PAO1 en PA14 glycerolvoorraden

  1. Open en desinfecteer een klasse II veiligheidskast voor gebruik, selecteer acht 50 mL flesjes om de nachtelijke kweek te bevatten.
  2. Met behulp van het eerder vervaardigde TSB en natriumcitraat FAB-medium (sectie 3) giet je 5 ml TSB-medium in vier van de acht flesjes en het natriumcitraat minimale FAB-medium in de overige vier.
  3. Met behulp van de eerder geïncubeerde Petrischalen en een inoculatielus, raak je vijf afzonderlijke kolonies in de P. aeruginosa PAO1 Petrischaal aan en doe je het over in een van de TSB-flesjes. Herhaal dit voor het natriumcitraat FAB-medium en voor de P. aeruginosa PA14 stevenpetrischaal.
  4. Dompel een schone inoculatielus direct onder in de resterende vier TSB- en natriumcitraat-FAB-media-flesjes, zodat controles ontstaan.
  5. Bred alle acht flesjes uit in een schudbare broedmachine gedurende 16–18 uur bij 200 toeren per minuut en 37 °C en merk het duidelijk.
  6. Haal de kweekflesjes op, zorg ervoor dat de met P. aeruginosa ingeënte flesjes troebel zijn en dat de gebruikte stoffen schoon blijven.
  7. Centrifugeer de vier met P. aeruginosa geïnëntificeerde buisjes op 4000 × g gedurende 5 minuten bij 20 °C om de P. aeruginosa van het kweekmedium te scheiden. Zorg ervoor dat de centrifuge in balans is.
  8. Negeer het supernatant en suspendeer de P. aeruginosa-pellet na centrifugatie opnieuw met 1 mL oplossing die 15% glycerol bevat, met 150 μL glycerol en 850 μL verse TSB of natriumcitraat FAB-media.
  9. Doe de gesuspendeerde culturen over in 1 mL buisjes en plaats ze in de -80 °C vriezer.
    OPMERKING: (PAUZEPUNT) Glycerolvoorraden kunnen worden opgeslagen bij -80 °C voor langdurige opslag en gebruikt voor toekomstige experimenten.

7. Het meten van de optische dichtheid van nachtelijke culturen

  1. Herhaal stappen 6.1–6.5, voor slechts twee TSB medium flesjes, waarvan één als controle dient en de andere voor de PAO1 P. aeruginosa-stam .
  2. Pipetteer 1 ml TSB-medium in een 1 mL spectrofotometerflesje binnen een veiligheidskast van klasse II, en breng 0,9 ml TSB-medium over in het tweede buisje, aanvullend met 0,1 ml van de nachtkweek.
  3. Stel de spectrofotometer in op een lichtgolflengte van 600 nm en met, met het 1 mL TSB spectrofotometer flesje om de machine te kalibreren, de optische dichtheid van het 0,1 mL suspensieflesje15.
    1. Als de gemeten absorptie niet 0,1 is, bereken dan opnieuw het benodigde ophangingsvolume.
      OPMERKING: Het volume suspensie dat nodig is om een absorptiewaarde van 0,1 (V1) te bereiken, kan worden berekend met de initiële 0,1 mL ophangingsbuisabsorptiemeting, C1, de gewenste absorptie waaraan de ophanging wordt aangepast, C2, en het gewenste volume geconcentreerde nachtelijke ophanging, V2:
      C1V1 = C2V2
      In het bovenstaande voorbeeld, als C1 = 3,59, C2 = 0,1 en V2 = 10 mL, zou het benodigde volume van nachtelijke suspensie 0,279 mL zijn in een oplossing van 10 mL.
  4. Meet 10 mL TSB-medium af in een 50 mL flesje en verwijder hetzelfde volume TSB-medium als het volume suspensie dat nodig is om een 10 mL 0,1 OD 600 nm ophanging te maken. Voeg met de nachtkweek het berekende suspensievolume en vortex ongeveer 5 seconden toe om te mengen.
  5. Plaats 1 mL van de 10 mL aangepaste suspensie in een spectrofotometerbuis en meet de absorptie opnieuw om te garanderen dat deze 0,1 is.
  6. Herhaal bovenstaande 7,1–7,5 voor PA14 en TSB-medium en voor zowel P. aeruginosa-stammen als het natriumcitraat FAB-medium.

8. Aantal levensvatbare cellen

  1. Breng dH2O over in een vierkante petrischaal binnen een veiligheidskast van klasse II en gebruik een multikanaals pipet om 180 μL over te brengen in kolommen 2–9 van een heldere 96-put polystyreen plaat16.
  2. Breng de 10 mL 0,1 OD 600 suspensie over in een aparte vierkante petrischaal en breng met behulp van de multikanaals pipet 200 μL van de suspensie over in kolom 1 van de 96-well, polystyreen plaat.
  3. Breng meer dan 20 μL suspensie over met behulp van de multikanaalpipette van kolom 1 van de 96-well, polystyreenplaat, naar kanaal 2, gevolgd door het overbrengen van 20 μL verdunde suspensatie in kanaal 2 naar kanaal 3, herhaling naar kanaal negen, waardoor ophangingsverdunningen ontstaan van 10-1 naar 10-8.
  4. Doe 50 ml TS-agar (sectie 4 en stap 5.1) in een veiligheidskast van klasse II met een flesje over in een vierkante petrischaal en laat het liggen tot agar troebel wordt.
  5. Breng 10 μL over van elk van de putten langs kolommen 2–9 op de TS agar Petrischaal in een kolomvorming, met behulp van een multikanaals pipet, zodat de kolommen elkaar niet raken.
  6. Incubeer TS agar 24 uur bij 37 °C, nadat je hebt gewacht tot de overgedragen verdunningen zijn ingedrongen.
  7. Bereken kolonievormende eenheden (CFU) per milliliter (mL) door te bepalen of de Petrischaal telbaar is (tussen 30 en 300 kolonies).
  8. Bepaal de verdunningsfactor van de gebruikte 10 mL ophanging; in dit geval werd de ophanging verdund tot 1/10 (0,1 OD 600).
  9. Bereken de individuele verdunningsfactoren van elke geplateerde kolom. Dit is de hoeveelheid verdund suspensie die aan elke kolom wordt toegevoegd, gedeeld door het totale volume van de kolom nadat de suspensie is toegevoegd. In het geval van kolom 2 van de 96-wellplaat (kolom 1 van de petrischaal) geldt 20 μL/200 μL = 1/10.
  10. Bereken de totale reeksverdunningsfactor door de individuele verdunningsfactoren van de kolommen met elkaar te vermenigvuldigen.
    OPMERKING: In dit geval, aangezien 20 μL van elke kolom naar de volgende werd overgedragen, waardoor het totale volume van elke kolomput 200 μL werd, was elke individuele serieverdunning 1/10. Waardoor de totale serieverdunning 1 × 10-8 is.
  11. Bepaal de verdunningsfactor van de plating terwijl de verdunning wordt overgebracht van de 96-wellplaat naar de Petrischaal. Om CFU/mL te bepalen, deel je het volume van elke kolom die (10 μL) is geplateerd, door 1 mL. In dit geval: figure-protocol-1.
  12. Bepaal de uiteindelijke verdunningsfactor door de oorspronkelijke suspensieverdunningsfactor (0,1) te vermenigvuldigen met de totale serieverdunningsfactor (1 × 10-8) en de verdunningsfactor van de plaat (figure-protocol-2).
  13. Bereken de CFU∙mL-1 in het oorspronkelijke monster, vermenigvuldig de CFU op de plaat met de inverse van de uiteindelijke verdunningsfactor.
    OPMERKING: In dit geval, als 200 CFU wordt geteld, betekent dit dat 200 × 1/1 × 10-8 worden uitgevoerd, wat resulteert in het uitvoeren van 2 × 1010 CFU∙mL-1 17.

9. Microfluidische systeemopstelling en experimentele run

  1. Inoculeer 5 ml bouillon van kweekmedium met elke stam van P. aeruginosa om een nachtkweek te vormen en broeden 16–18 uur bij 37 °C.
  2. Stel het microfluïdische systeem en bijbehorende software in.
    1. Activeer de componenten van het microfluïdische systeem in de volgende volgorde: voeding, microfluïdische systeemcontroller, CMOS-camera, behuizingsverwarmers, microscoop, computer en bijbehorende monitoren.
    2. Activeer de microfluidische software en start de bijbehorende besturingsmodule-interface door de 48-put 0–2 Pa multikanaalplaat-gerelateerde barcode in te voeren wanneer daarom wordt gevraagd, gevonden aan de zijkant van de multikanaalplaat.
  3. Stel de inentingsprocedure voor de P. aeruginosa multikanaals plaatput in.
    1. Pas de optische dichtheid van de nachtcultuur aan op 0,1 OD600.
    2. Breng 50 μL 0,1 OD 600 vering parallel in de uitlaatput van elk van de zes kanalen in een klasse II veiligheidskast.
      OPMERKING: Zes kanalen werden op elk moment parallel uitgevoerd om de kans op identificatie van afwijkende resultaten te maximaliseren.
    3. Vervang de 48-put multikanaals plaatdeksel en breng deze over naar het beweegbare podium in de systeemincubator en zet het vast.
  4. Stel de inentingsprocedure voor P. Aeruginosa multikanaalplaatkanaal in.
    1. Zet de microfluïdische kanalen in met behulp van de microfluïdische systeembesturingsmodule door te kiezen: Handmatig > Kolommen 1–4 > Vloeistof: TSB bij 37 °C > Maximale Afschuiving (Pa): 0,1 (1 dyne∙cm-2 = 0,1 Pa) en selecteer een uitlaatput van het 48-put 0–2 Pa multikanaals plaatdiagram.
    2. Selecteer de afbreekknop om de stroom na 2–4 seconden te stoppen en laat de plaat 30 minuten staan, zodat de cellen zich aan het kanaalsubstraat hechten voordat de continue stroming begint.
      OPMERKING: Een duur van 30 minuten zorgt ervoor dat de zwaartekracht helpt om de planktonische P. aeruginosa-bacteriën aan de bodemwand van het kanaal te hechten. Deze keer varieert het afhankelijk van de bacterie en het type voedingsstof.
    3. Verwijder de multikanaalplaat van de beweegbare broedmachine en breng 1 mL verse TSB over in de inlaatput van elk van de zes kanalen in een veiligheidskast van klasse II.
    4. Breng de multikanaalplaat over naar het beweegbare podium in de incubator en zet deze op zijn plaats.
  5. Stel AutoRun in.
    1. Zorg ervoor dat de gebruikte stroming tijdens de 24-uursexperimenten relevant is voor de plek waar P. aeruginosa in de natuur voorkomt, door te navigeren naar handmatig > schuifspanning: 0,01 Pa, en de weergegeven volumedebiet (μL⋅h-1) te registreren. Zorg ervoor dat deze waarde voor de 48-put microkanaalplaat 8,2 μL⋅h-1 is.
    2. Zet de volumedebiet om in m3∙s-1, bereken de kanaaldoorsnedeoppervlakte (m2) en bepaal de stroomsnelheid bij een hydrodynamische schuifspanning van 0,01 Pa.
      OPMERKING: Door gebruik te maken van en de vloeistofvolume-debietvergelijking te herschikken, kan de vloeistofsnelheid door het kanaal worden berekend:
      figure-protocol-3
      Waarbij U de vloeistofsnelheid (m∙s-1) is en A de microkanaaldoorsnede (m2) van de kanalen in de multikanaalplaat.
    3. Bereken het Reynolds-stromingsgetal met behulp van de dichtheid, ρ, en de dynamische viscositeit, μ, van het TSB-medium, en zorg ervoor dat P . aeruginosa-biofilms binnen een stromingsbereik van de vloeistof worden gevonden. Voor een hydrodynamische schuifspanning van 0,01 Pa moet het Reynold-getal respectievelijk 0,0117 en 0,0165 zijn voor TSB en FAB media. Als het buiten dit bereik valt, controleer dan of de vloeistofcondities op TSB zijn ingesteld.
      figure-protocol-4
      Waarbij Dh de hydraulische diameter is van het gebruikte microkanaal, verkregen met behulp van:
      figure-protocol-5
      Waarbij w en h de breedte (m) en hoogte (m) van het gebruikte microkanaal weergeven.
    4. Bereken de vloeistofontwikkelingsduur om ervoor te zorgen dat de vloeistofstroom binnen het beeldverwervingsgebied volledig ontwikkeld is.
      OPMERKING: De ontwikkelingslengte van laminaire vloeistof door een kanaal kan worden berekend met het Reynoldsgetal, Re, en de hydraulische diameter van de kanalen, Dh:
      Ldev = 0,06ReDh
    5. Stel de autorun in: Edit AutoRun > Protocol Setup > tijdsduur: 24 uur, met een herhaling van 1 en een schuifspanning van 0,01 Pa. Sla het protocol op.
    6. Maak een nieuwe sequentie aan in het tabblad Sequence Setup door het nieuw aangemaakte protocol met één herhaling toe te passen op kanalen 1–6 en selecteer vloeistof: TSB op 37 °C. Sla deze sequentie op.
  6. Stel beeldopname in via het Multidimensionale Acquisitievenster .
    1. Selecteer Multidimensionale Acquisitie met de systeemsoftware, vervolgens de live-knop (linksonder in het Multidimensionale Acquisitievenster ). Navigeer door het microscooppodium om kanalen 1–6 te bekijken met de live view-knop en cameravergrotingen van 5× tot 40× op het microscooptouchscreen, waarbij je telkens één kanaal in het cameraveld toont.
    2. Bereid de camera voor op beeldverwerving: Multidimensionale acquisitie > Opslaan: selecteer een map om de beelden op te slaan > Timelapse: Duur: 24 uur, dezelfde duur als de hydrodynamische stroming > Tijdinterval: Tijd tussen elke verkregen afbeelding, ingesteld op 10 minuten.
    3. Voer de camera-instellingen in door Golflengte > Verlichting te selecteren: helderveld 50% camera 50%: zwart-wit > automatische belichting: elke acquisitie > verkrijgen: elk tijdstip > autofocus: nooit.
    4. Bepaal de cameraposities om de biofilmbeelden vast te leggen door de vergroting op 20× te zetten, wat een gezichtsveld produceert met afmetingen 665,6 μm × 665,6 μm, en navigeer naar het midden van het kanaalkijkgebied, waar het kanaalnummer in het midden wordt gegraveerd.
    5. Voeg de podiumpositie toe zodat deze door de camera wordt vastgelegd, ga naar het podiumlabel en selecteer de optelknop om het aan de map toe te voegen.
      1. Herhaal dit voor upstream-punten 0,9984 mm en downstream-punten 3,0016 mm van de inlaat van het kanaalkijkgebied, waar de positie het middenpunt van het cameraveld vertegenwoordigt.
        OPMERKING: Deze beeldposities zijn geselecteerd om representaties te geven van de biofilmgroei langs het kijkgebied, terwijl de stroming binnen volledig ontwikkeld is. Dit resulteert in drie beelden per microkanaal, in dit geval 18 beelden die elke 10 minuten worden gemaakt.
  7. Voer experimentele runs uit
    1. Selecteer in het systeemcontrolemodule-venster AutoRun > Run Setup > Sequence: selecteer de 0,01 Pa-sequentie die is aangemaakt en selecteer dan start.
    2. Navigeer direct daarna naar het Multidimensionale Acquisitievenster > Verwerven. Dit markeert het verkrijgen van de 18 beelden elke 10 minuten van de 24 uur durende experimentele procedure, wat resulteert in 2610 beelden wanneer het experiment eindigt.
      OPMERKING: Het bovenstaande gedeelte werd gereproduceerd over nog eens zes microkanalen, ongeveer 48 uur na het eerste experiment, met identieke omstandigheden.

10. Z-stack accumulatie

  1. Aan het einde van elke experimentele run selecteer je drie kanalen en verkrijg je z-stacks van drie secties langs deze kanalen met 40× vergroting door de Multi Dimensional Acquisition > Main te openen: selecteer alle opties behalve 'Z Series' uit.
  2. Navigeer naar Z-serie nadat een sectie langs een kanaal is geselecteerd binnen Multidimensionale Acquisitie en verander > Interactieve instellingen: Increment: 0,5 en vink beide vakjes uit.
  3. Gebruik de focusknop van de microscoop en draai hem net totdat de biofilm onscherp raakt, en voer de z-afstand in door Set Top To Current te selecteren. Herhaal deze procedure, maar draai de focusknop in de tegenovergestelde richting en selecteer Zet Bodem op stroom. Dit geeft de microscoop het bereik om de z-stack vast te leggen.
  4. Selecteer een map binnen het opslaan-venster om de z-stack op te slaan en kies rechtsonder in het venster op 'Aankopen' om de acquisitie te starten.

11. Afbeelding na het experiment en data-analyse

  1. Verkrijg gegevens over het biofilmpercentage oppervlaktedekking.
    1. Laad de verkregen afbeeldingen in de systeemsoftware door te kiezen: Analysetools > Meerdimensionale gegevens bekijken > Basisbestand selecteren > Map selecteren: ga naar en selecteer de map met de opgeslagen afbeeldingen > Bekijk > Golflengte 1, en klik horizontaal op het aantal verkregen afbeeldingen met de rechtermuisknop op het kleine, grijze vakje bovenaan, linker hoek.
    2. Laad de afbeeldingen van elk kanaalgedeelte, kies één voor één, kies Stagepositie: selecteer de positie om te bekijken > Laad afbeelding(en). Sla de afbeeldingsserie op als een TIFF-bestand.
    3. Drempel de afbeelding door te kiezen voor Drempelbeeld > Auto Drempel voor Donkere Objecten die de biofilm markeren, en raam vervolgens de afbeelding met de Rechthoekige Regio-tool .
      OPMERKING: De schuifregelaar aan de linkerkant van het drempelbeeld kan omhoog en omlaag worden verplaatst om de drempelintensiteit aan te passen en zo beter te onderscheiden tussen biofilm en achtergrond. Als de afbeelding schaduwen heeft, begrens dan het gedeelte zonder dat de schaduwen standaard zijn gemarkeerd, de meetwaarden veranderen.
    4. Verkrijg gegevens over het percentage oppervlaktedekking van de biofilm in het beeld gedurende het 24-uursexperiment door MM Standard > Measure > Region Measurements te selecteren in het systeemsoftwarevenster om een tabel te genereren met gegevens over de gemarkeerde biofilm binnen de rechthoekige rand, inclusief Threshold Area %. Selecteer Open Log om een logbestand te openen en op te slaan en F9: Log Data om de gegevens in het logbestand in te voeren.
    5. Open een spreadsheet en maak met behulp van de 24 uur biofilmgegevens voor elk kanaalgedeelte een grafiek die de dekking van het biofilmpercentage over 24 uur toont.
  2. Bepaal de dikte van de biofilm en de rekenkundige gemiddelde oppervlakteruwheid.
    1. De z-stack werd opgeslagen in Fiji (ImageJ) door het opgeslagen bestand in de Fiji-controlebalk te slepen en om te zetten naar een 8-bits afbeelding: Image > Type > 8-bit.
    2. Verhoog het contrast tussen de biofilm en het kanaaloppervlak om ongewenste ruis te elimineren: Beeld > Stel > helderheid/contrast aan.
    3. Drempel het beeld, stel de biofilmpixelwaarde 255 (wit) en de achtergrondpixelwaarde 0 (zwart) in: Beeld > Pas > drempel aan.
    4. Stel de schaal van de afbeelding in, analyseer > stel schaal > afstand in pixels: 2048 > Bekende afstand: 332,8 > Pixel beeldverhouding: 1,0 > Lengte-eenheid: μm.
      OPMERKING: De bekende afstand is 332,8 μm, aangezien de gebruikte Hamamatsu-camera een gezichtsveld van 2048 × 2048 pixels heeft, waarbij elke pixel een grootte van 6,5 μm heeft en de beelden zijn genomen met 40 × vergroting.
    5. Analyseer de Z-stack met behulp van een aangepaste macro18 (Supplementair Bestand 1) die het oppervlak van biofilm op elke z-stack schijf berekent en optelt en de invoerwaarden van de schaal gebruikt om de dikte van de serie te berekenen, waardoor het volume kan worden bepaald. Alternatief kun je de biofilmdikte bepalen door het berekende volume te delen door het oppervlak.
    6. Verkrijg de rekenkundige gemiddelde oppervlakteruwheidswaarden van de biofilm uit elke z-serie door de ImageJ (niet Fiji) plugin SurfCharJ te downloaden en deze op te slaan in de plugins-map .
    7. Upload de z-stack naar ImageJ door de opgeslagen stack naar de controlebalk te slepen en deze om te zetten naar een 32-bits afbeelding: Image > Type: 32-bit.
    8. Maak een oppervlaktegrafiek die de variatie in grijswaarden over het oppervlak van de stapel toont: Analyseer > grafiekprofiel > meer: Hoogresolutie grafiek. Zet de hoge resolutie plot om naar 32-bit.
    9. Verkrijg de rekenkundige gemiddelde oppervlakteruwheidswaarde door de SurfCharJ-plugin te starten: Plugins > SurfCharJ > Ruwheidsberekening: Gemiddelde steekproeflengte (): 10.
      OPMERKING: De SurfCharJ-plugin gebruikt de verschillende grijze waarden langs het oppervlak van de z-stack om de rekenkundige gemiddelde oppervlakteruwheid te berekenen. Er wordt een tabel met oppervlakteruwheidsparameters geproduceerd, waarbij de enige parameter van belang de rekenkundige gemiddelde oppervlakteruwheid Ra is. De tabelwaarden moeten vanaf pixels worden omgezet naar micrometer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze sectie beschrijft de representatieve uitkomsten bij het toepassen van bovenstaande protocolprocedure. Alle experimenten werden uitgevoerd met ten minste drie onafhankelijke biologische replicaten, elk bestaande uit zes parallelle kanalen, en de gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie. Foutbalken in alle grafieken geven standaarddeviatie aan, zoals gedefinieerd in de figuurlegendes.

De groei van de PAO1- en PA14-vervormingen

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De verschillende cruciale stappen die samen dit protocol vormen, maken een meer uitgebreide en nauwkeurige analyse van biofilmvorming mogelijk dan alternatieve, meer traditionele methoden. Een belangrijk onderdeel is het gebruik van een 48-wells microkanaalplaat, met microschaalkanalen van afmetingen 350 μm × 70 μm × 4 mm (W × H × L). Deze afmetingen weerspiegelen specifiek de stromingscondities en microomgevingen die voorkomen in ziekenhuisomgevingen, zoals urinekatheters of de longbron...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen de School of Mechanical, Aerospace and Civil Engineering (MAC) van de Universiteit van Sheffield bedanken voor de financiering.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
(NH4)2SO4Acros Organics7783-20-2Voor gemodificeerd FAB medium
48-well 0-2 Pa microchannel plate - glass coverslipCell Microsystems910-0047-5PackMicrokanalen voor mediastroom en biofilm
groei met real-time beeldvorming
-80 °C FreezerThermo Fisher Scientific1.16057E+15Om glycerolstocks op te slaan tot verder gebruik
Agar, Bacteriological GradeAcros Organics443570010Voor Agar platen - bacteriecultuur
Analytical BalanceVWRVWRI611-2297Om componenten van gebruikte media te meten
AutoclavePriorclave4304Om glaswerk te steriliseren
BioFlux 1000HTI&L Biosystemshttps://il-biosystems.com/cell- microsystems/device/bioflux-1000ht-
shear-flow-system/ 		Voor microchannel stroming en biofilmgroei experimenten
BioFlux Control ModuleI&L Biosystemshttps://il-biosystems.com/cell-
microsystems/device/bioflux-1000ht- shear-flow-system/ 		Om mediastroming en biofilmgroei binnen de microkanalen in te stellen en te monitoren
BioFlux Montage SoftwareI&L Biosystemshttps://il-
biosystems.com/app/uploads/2025/01/Bi oFlux_Overview_.pdf		Om mediastroming en biofilmgroei binnen de microkanalen in te stellen en te monitoren
CaCl2Fisher Scientific10043-52-4Voor gemodificeerd FAB medium
CaSO4.2H2OChemCruzA1719Voor 1 L minimale metaaloplossing
Clear Polystyrene 96-well PlateCorning, CostarCLS7007Voor het tellen van levensvatbare cellen
CoSO4.7H2OSigma-Aldrich10026-24-1Voor 1 L minimale metaaloplossing
CuSO4.5H2OHoneywell209198-100GVoor 1 L minimale metaaloplossing
Eppendorf Tubes 3810XEppendorf30125150Voor P. aeruginosa glycerolstocks
FeSO4.7H2OVWR International Ltd.284005EVoor 1 L minimale metaaloplossing
Fiji (ImageJ)National Institutes of Healthhttps://imagej.net/software/fiji/downloa
ds		Z-stack beeldverwerking
GlucoseSigma-Aldrich50-99-7Voor glucose gemodificeerd FAB Medium
GlycerolSigma-Aldrich56-81-5Voor P. aeruginosa glycerolstocks
H3BO3Fisher Scientific10043-35-3Voor 1 L minimale metaaloplossing
Hamamatsu Orca-Flash 4.0 Camera Model C11440-
42U		HamamatsuC11440-42UVoor microchannel stroming en biofilmgroei
experiment real-time beeldvorming
KH2PO4Fisher BioReagents7778-77-04Voor gemodificeerd FAB medium
Methylated-SpiritSigma-Aldrich2857Om microbiologiekast te reinigen voor en na
gebruik
MgCl2Sigma-AldrichM8266-100GVoor gemodificeerd FAB medium
Microbiology Cabinet Class IIThermo Fisher Scientific42111226Om protocolstappen uit te voeren zonder
bacteriën, bouillon of agar te besmetten
Mini IncubatorLabnet Internationalsn03171014Om PAO1 en PA14 te ontdooien na -80 °C vrieskast en
voor de eerste 24 uur bacteriële agarplaatgroei
MnSO4.H2OSigma-Aldrich10034-96-5Voor 1 L minimale metaaloplossing
Na2HPO4.2H2OSigma-Aldrich10102-40-6Voor gemodificeerd FAB medium
NaClSigma-AldrichS5886-500GVoor gemodificeerd FAB medium
NaMoO4.H2OSigma-Aldrich10102-40-6Voor 1 L minimale metaaloplossing
Precision BalanceVWRVWRI611-2299Om componenten van gebruikte media te meten
Refrigerated CentrifugeHeraeus40289841P. aeruginosa cultuur scheiden van
supernatant voor glycerolstocks
Semi-Micro CuvettesAlpha LaboratoriesX72053Voor optische dichtheidsmetingen
Shaking IncubatorINFORS HThttps://infors- ht.com/en/products/incubator- shakers/multitron-standardVoor overnachtsculturen
Sodium citrateSigma-Aldrich71498-250GVoor Natriumcitraat gemodificeerd FAB medium
Sterile Plastic Inoculation LoopsMicrospec15782105Voor P. aeruginosa PAO1 en PA14 inoculatie in agar platen en falcon buizen
Tryptic Soy Agar, vegitoneMillipore14432-500G-FVoor Agar platen - bacteriecultuur
Tryptic Soy BrothSigma-AldrichT8907Gedehydrateerde cultuurmedia - 6 g/200 mL
Type 1 Water DispenserThermo Fisher Scientificsn42103311Voor gedistilleerd water
ZnSO4.7H2OFisher Scientific7446-20-0Voor 1 L minimale metaaloplossing

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grace, A., Sahu, R., Owen, D. R., Dennis, V. A. Pseudomonas aeruginosa reference strains PAO1 and PA14: A genomic, phenotypic, and therapeutic review. Front Microbiol. 13, 1023523(2022).
  2. T8907 Tryptic Soy Broth. , Sigma-Aldrich. Available from: https://www.merckmillipore.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/275/615/t8907dat.pdf (2018).
  3. Donlan, R. M. Biofilms and device-associated infections. Emerg Infect Dis. 7 (2), 277-281 (2001).
  4. Pseudomonas Aeruginosa - Biofilm Formation, Infections and Treatments. , IntechOpen. (2021).
  5. Tuon, F. F., Dantas, L. R., Suss, P. H., Tasca Ribeiro, V. S. Pathogenesis of the Pseudomonas aeruginosa biofilm: A Review. Pathogens. 11 (3), 300(2022).
  6. She, P., et al. Effects of exogenous glucose on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation and antibiotic resistance. MicrobiologyOpen. 8 (12), e933(2019).
  7. Klausen, M., et al. Biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa wild type, flagella and type IV pili mutants. Mol Microbiol. 48 (6), 1511-1524 (2003).
  8. Preda, V. G., Săndulescu, O. Communication is the key: biofilms, quorum sensing, formation and prevention. Discoveries (Craiova). 7 (3), e100(2019).
  9. Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology (Reading). 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
  10. Seneviratne, C. J., Yip, J. W. Y., Chang, J. W. W., Zhang, C. F., Samaranayake, L. P. Effect of culture media and nutrients on biofilm growth kinetics of laboratory and clinical strains of Enterococcus faecalis. Arch Oral Biol. 58 (10), 1327-1334 (2013).
  11. Rajewska, M., Maciąg, T., Narajczyk, M., Jafra, S. Carbon source and substrate surface affect biofilm formation by the plant-associated bacterium Pseudomonas donghuensis P482. Int J Mol Sci. 25 (15), 8351(2024).
  12. Goswami, S., Dey, C. COVID-19 and SARS-CoV-2: The Science and Clinical Application of Conventional and Complementary Treatments. , CRC Press. Boca Raton. (2022).
  13. Jeschke, M. G. Clinical review: Glucose control in severely burned patients - current best practice. Crit Care. 17 (4), 232(2013).
  14. Badoiu, S. C., et al. Glucose metabolism in burns—What happens. Int J Mol Sci. 22 (10), 5159(2021).
  15. Wacogne, B., et al. Concentration vs. optical density of ESKAPEE bacteria: A method to determine the optimum measurement wavelength. Sensors. 24 (24), 8160(2024).
  16. Meyer, C. T., et al. A high-throughput and low-waste viability assay for microbes. Nat Microbiol. 8 (12), 2304-2314 (2023).
  17. Allen, T. Serial Dilution Problem Help. , The University of Vermont. Available from: https://www.uvm.edu/~btessman/calc/serhelp.html (2012).
  18. Blog Post: Loading and Measurement of Volumes in 3D Confocal Image Stacks with ImageJ. , VISIKOL. Available from: https://visikol.com/blog/2018/11/29/blog-post-loading-and-measurement-of-volumes-in-3d-confocal-image-stacks-with-imagej/ (2024).
  19. Kasetty, S., Katharios-Lanwermeyer, S., O'Toole, G. A., Nadell, C. D. Differential surface competition and biofilm invasion strategies of Pseudomonas aeruginosa PA14 and PAO1. J Bacteriol. 203 (22), e0026521(2021).
  20. Shen, Y. Role of biofilm roughness and hydrodynamic conditions in Legionella pneumophila adhesion to and detachment from simulated drinking water biofilms. Environ Sci Technol. 49 (7), 4274-4282 (2015).
  21. Sankari, A., Sharma, S. Cystic Fibrosis. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2025).
  22. Cameron, K., Jarvis, K. Urinary Catheterisation for Adults Clinical Guideline. , Available from: https://www.rightdecisions.scot.nhs.uk/media/2210/urinary-catheterisation-adultsfinal.pdf (2022).
  23. IV access improvement project guidelines: choosing catheter sizes. , Children's Hospital of Philadelphia. Available from: https://www.chop.edu/clinical-pathway/iv-access-improvement-project-guidelines-choosing-catheter-sizes (2017).
  24. Casadevall, A., Fang, F. C. Reproducible science. Infect Immun. 78 (12), 4972-4975 (2010).
  25. Sutlief, A. L., et al. Live cell analysis of shear stress on Pseudomonas aeruginosa using an automated higher-throughput microfluidic system. J Vis Exp. (143), e58926(2019).
  26. Shear Flow BioFlux Plates. , Cell Microsystems. Available from: https://cellmicrosystems.com/wp-content/uploads/2024/09/BioFlux-Brochure_v6-Single-page.pdf (2024).
  27. Wijesinghe, G., et al. Influence of laboratory culture media on in vitro growth, adhesion, and biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Med Princ Pract. 28, 28-35 (2019).
  28. Jahid, I. K., Lee, N. -Y., Kim, A., Ha, S. -D. Influence of glucose concentrations on biofilm formation, motility, exoprotease production, and quorum sensing in Aeromonas hydrophila. J Food Prot. 76 (2), 239-247 (2013).
  29. De Plano, L. M., Caratozzolo, M., Conoci, S., Guglielmino, S. P. P., Franco, D. Impact of nutrient starvation on biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa: An analysis of growth, adhesion, and spatial distribution. Antibiotics. 13 (10), 987(2024).
  30. Tan, X., et al. Alkaline phosphatase LapA regulates quorum sensing-mediated virulence and biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa PAO1 under phosphate depletion stress. Microbiol Spectr. 11 (6), e0206023(2023).
  31. Quan, K., et al. Water in bacterial biofilms: pores and channels, storage and transport functions. Crit Rev Microbiol. 48 (3), 283-302 (2022).
  32. Green, A. S. Modelling of peak-flow wall shear stress in major airways of the lung. J Biomech. 37 (5), 661-667 (2004).
  33. Lee, K., Han, J. Analysis of the urine flow characteristics inside catheters for intermittent catheter selection. Sci Rep. 14, 13273(2024).
  34. Wang, C., et al. Carbon starvation induces the expression of PprB-regulated genes in Pseudomonas aeruginosa. Appl Environ Microbiol. 85 (22), e01705-e01719 (2019).
  35. Sarinas, P. S. A., et al. Inspiratory flow rate and dynamic lung function in cystic fibrosis and chronic obstructive lung diseases. Chest. 114 (4), 988-992 (1998).
  36. Franca, M. J., Valero, D., Liu, X. Turbulence and Rivers. Treatise on Geomorphology. , Elsevier, Academic Press. (2022).
  37. Shroder, J. F. Treatise on Geomorphology. , Elsevier Science & Technology. San Diego. (2022).
  38. Narciso, D. A. C., Pereira, A., Dias, N. O., Melo, L. F., Martins, F. G. Characterization of biofilm structure and properties via processing of 2D optical coherence tomography images in BISCAP. Bioinformatics. 38 (6), 1708-1715 (2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Laminaire luchtstroombiofilmkwantificeringoppervlaktebedekkingantimicrobi le resistentienosocomiale infecties
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen