Dit protocol beschrijft de methode voor het opzetten van de mammosfeervormingstest om Apoptosis Inhibitor 5 (Api5)-geïnduceerde kankerstam in niet-tumorogene borstepitheelcellen te bestuderen. Lysaten die uit mammosferen van de primaire generatie worden verzameld, worden geanalyseerd op verschillende stammarkeringen om de inductie van stamcelachtige eigenschappen te beoordelen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Mammosfeertest onthult Api5-geïnduceerde stamheid in niet-tumorogene borstepitheelcellijnen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Borstkanker blijft wereldwijd de meest voorkomende kanker onder vrouwen, met de hoogste leeftijdsgestandaardiseerde incidentie en sterftecijfers. Ondanks de vooruitgang in therapieën gericht op borstkanker, vertoont 20% van de patiënten een terugval van de ziekte, wat mogelijk wordt toegeschreven aan een populatie therapieresistente kankerstamcellen (CSC's). Deze CSC's kunnen conventionele behandelingen overleven door in een rustfase te blijven of blijven bestaan door een onvolledige resectie van de tumormassa, wat leidt tot terugkeer in een later stadium. Daarom richt recent onderzoek zich op het identificeren, isoleren en richten op deze resistente celpopulatie. In vitro dient de mammosfeervormingsassay als een robuust driedimensionaal suspensiekweeksysteem voor het verrijken en voortplanten van stamachtige cellen binnen de populaties van borstepitheel. Hier presenteren we een benadering waarbij de mammosfeertest wordt gebruikt om het stamcelachtige fenotype van kanker te evalueren dat in niet-tumorigene borstepitheelcellen wordt mogelijk gemaakt door de overexpressie van Apoptosis Inhibitor 5 (Api5). Het protocol omvat het voortplanten van mammosferen via seriële passages om de formatie-efficiëntie en zelfvernieuwingscapaciteit van de mammosfeer te beoordelen. Daarnaast worden eiwitlysaten die uit mammospheres zijn verzameld, onderzocht op gevestigde stammarkers via immunoblotting. Deze test maakt het mogelijk om nieuwe regulatoren, zoals Api5, te onderzoeken naar kankerstamcelachtige eigenschappen in populaties van borstepitheelcellen. De beschreven aanpak kan worden aangepast voor vergelijkende studies van moleculaire interventies of voor het screenen van therapeutische middelen gericht op CSC's in vitro.
Inleiding
De toename van chemotherapieresistente borstkankers heeft geleid tot een toenemende nadruk op het identificeren en richten van de onderliggende oorzaak van therapieresistentie en terugval, een populatie kankercellen die bekendstaan als stamkanker. Deze cellen worden gekenmerkt door hun vermogen om differentiatie te ontwijken en stil te blijven, waardoor ze weerstand bieden aan verschillende modaliteiten van kankerbehandeling 1,2. Verschillende methoden kunnen worden gebruikt om borstkankerstamcellen te identificeren, waaronder de mammosfeervormingsassay 3,4,5, celsortering op basis van celoppervlaktemarkers 6,7, isolatie op basis van efflux-eigenschappen, in vivo tumorigeniciteitsassays7, en de beoordeling van stamcelnucleaire modulatoren zoals Okt48, Nanog9, Sox210 en BMI11. Typisch omvat het identificeren en isoleren van kankerstamcellen een combinatie van een of meer van deze benaderingen.
Apoptose-remmer 5 (Api5) is een anti-apoptotisch eiwit dat is vastgesteld in verschillende vormen van kanker, waaronder borstkanker 12,13,14, baarmoederhalskanker 15,16,17, B-cel chronische lymfoïde leukemie 18 en niet-kleincellige longkanker19. Hoge niveaus van Api5 zijn geassocieerd met chemotherapieresistentie bij cervicale16 en drievoudig negatieve borstkanker12. Er is steeds meer bewijs dat therapieresistentie en terugval vaak worden veroorzaakt door stamcellenvan kanker 20,21. Een interessante studie van Song et al.22 toonde aan dat de overexpressie van Api5 in baarmoederhalskankercellen leidt tot verhoogde Nanog-niveaus, wat bijdraagt aan een verhoogde stamvorm van kanker. Eerdere studies van ons laboratorium hebben aangetoond dat overexpressie van Api5 leidt tot de transformatie van niet-tumorigene borstepitheelcellen die in matrigel-ondersteunde 3D-culturen worden gekweekt. Deze getransformeerde cellen vertonen verstoorde polariteit, verhoogde proliferatie, ankeronafhankelijke groei en een gedeeltelijk epitheel-naar-mesenchymale overgangsfenotype (EMT). De fenotypische veranderingen die werden waargenomen bij overexpressie van Api5 in 3D-culturen bleven behouden na het dissocieren van de sferoïden in monolaagculturen14. Aangezien Api5 is opgereguleerd bij chemotherapieresistente drievoudig-negatieve borstkankers, speculeren we dat Api5 ook de stameigenschappen van kanker in de epitheelcellen van borst kan reguleren.
In deze context beschrijven we de mammosfeervormingstest om kankerstamcellen te identificeren uit 3D-gedissocieerde niet-tumorogene borstepitheelcellen die zijn getransformeerd door overexpressie van Api5, gevolgd door western blotting voor stamcelmarkers om de identiteit van deze cellen te bevestigen. De mammosfeertest houdt in dat borstepitheelcellen worden gekweekt onder niet-adherente, niet-differentiërende omstandigheden, wat de verrijking van stamachtige/voorlopercellen in driedimensionale structuren die mammosferen worden genoemd mogelijk maakt. Borstepitheelcellen die geen stamachtige eigenschappen hebben, ondergaan doorgaans anoikis; Echter, cellen met stamachtige kenmerken geven aanleiding tot mammospheres 4,5. Deze methode werd oorspronkelijk ontwikkeld door Dontu et al.3 en is geïnspireerd op de neurosphere assay, die wordt gebruikt om neurale stamcellen en voorlopers te bestuderen en te identificeren23. De hier beschreven mammosfeertest maakt het mogelijk om stamcelactiviteit en zelfvernieuwingsvermogen te beoordelen in minimale media, aangevuld met B27 zonder vitamine A en recombinante menselijke epidermale groeifactor (EGF). Api5-overexpressieve 3D-gedissocieerde cellen worden spaarzaam gezaaid op platen met Poly(2-hydroxyethylmethacrylaat) (pHEMA) bedekt. Dit stelt de cellen in staat te groeien onder niet-hechtende omstandigheden, zodat elke volgende mammosfeer van klonale oorsprong is. De mammospheres mogen groeien tot dag zeven, waarna de formatie-efficiëntie van de mammosfeer wordt berekend. Om echte stamcellen te onderscheiden van niet-stamcellen die hun proliferatieve vermogen na verloop van tijd verliezen, worden volgende generaties van mammosfeervorming uitgevoerd. Seriële overdracht van mammosferen houdt in dat de sferen die uit de primaire generatie zijn verzameld worden gedissocieerd en de afzonderlijke cellen worden herplaterd om secundaire (en latere) generatie-mammosferen te vormen. Dit bepaalt of de cellen herhaaldelijk bolvorming kunnen initiëren en wordt gekwantificeerd als het zelfvernieuwingsvermogen van cellen5.
Deze methode kan worden gebruikt om borstkankerstamcellen te identificeren in tumorigene of getransformeerde borstepitheelcellen. De methode kan ook worden aangepast om borstkankerstamcellen uit patiëntmonsters te isoleren. Het systeem kan helpen nieuwe doelwitten tegen borstkankerstamcellen te identificeren die mogelijk verband houden met chemotherapieresistentie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Coating van weefselkweekplaten met Poly(2 -hydroxyethylmethacrylaat), pHEMA
- Los 1,2 g pHEMA (molecuulgewicht ̴ 300.000) op in 100 mL 95% ethanol door constant te roeren op 65 °C om een 1,2% pHEMA-oplossing te bereiden (zie Materiaaltabel).
- Bedek standaard weefselkweekplaten met pHEMA door 1 mL per put van een 6-put plaat toe te passen. Het volume van de pHEMA-oplossing kan worden aangepast op basis van de grootte van het weefselkweekvat.
- Laat de borden onder steriele omstandigheden in een oven drogen op 40 °C.
- Blootstel de platen 15 minuten aan UV-licht, gevolgd door drie washes met Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS), voordat je ze gebruikt om de mammosfeervormingsassay op te zetten.
2. Het zaaien van mammosferen van de primaire generatie
- Cultuur 3D-gedissocieerde MCF10A-cellen (controle- en Api5-overexpressie) verkregen door de 16e 3D-culturen van dag 16 in het groeimediumte dissocieren.
OPMERKING: Samenstelling van groeimedium: Hoge glucose DMEM zonder natriumpyruvaat aangevuld met 5% paardenserum, 10 μg/mL insuline, 0,5 μg/mL hydrocortison, 20 ng/mL recombinant humaan epidermale groeifactor (EGF), 100 ng/mL choleratoxine en 200 eenheden/mL penicilline-streptomycine (zie Materiaaltabel). - Verwijder het gebruikte medium, was de cellen met 1 ml DPBS, voeg dan 500 μL 0,05% trypsine-EDTA toe en incubeer bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO2-incubator gedurende 12-15 minuten totdat alle cellen trypsiniseerd zijn.
- Nadat alle cellen zijn losgeraakt, voeg je 2 mL resuspendiemedium toe om de trypsineactiviteit te neutraliseren en draai je de celsuspensie op 112 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Samenstelling van het re-suspension medium: DMEM met een hoog glucosegehalte zonder natriumpyruvaat aangevuld met 20% paardenserum en 200 eenheden/mL penicilline-streptomycine. - Aspireer het supernatant en suspendeer de celpellet opnieuw in 1 ml mammosfeermedium. Haal de celsuspensie door een 25 G-naald om een single-cell suspension te krijgen.
OPMERKING: Samenstelling van mammosfeermedium: DMEM/F12 aangevuld met 20 ng/mL epidermale groeifactor (EGF), 1 × B27-supplement zonder vitamine A, en 200 eenheden/mL penicilline-streptomycine (zie Materiaaltabel). - Met een hemocytometer telt je het aantal cellen en bereken je het volume celsuspensie dat nodig is om 0,2 × 10cellen per put te zaaien.
OPMERKING: Houd een lage zaaidichtheid om de efficiëntie van de vorming van de mammosfeer nauwkeurig te bepalen, zodat de impact van celaggregering wordt geminimaliseerd. Bij het verzamelen van eiwitlysaten voor immunoblotting kan de celdichtheid worden verhoogd tot wel 2,5 × 105 cellen per put. - Verdun het benodigde celsuspensievolume in 2 mL mammosfeermedium en zaad in elke put van een 6-put plaat. Zaadcellen in drievoud voor elke aandoening.
- Incubeer 7 dagen bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO2-broedmachine.
- Na zeven dagen in kweek tel je handmatig het aantal mammosferen met een diameter groter dan 50 μm in elke put door een microscoop met een graticule te gebruiken of een kwadrantrooster onder een lichtmicroscoop.
- Maak beeld van de mammosferen met een digitale camera die is gemonteerd op een lichtmicroscoop met 20x vergroting.
- Bereken de formatie-efficiëntie van de mammosfeer (MFE) met de volgende formule5
3. Het zaaien van mammosferen van de secundaire generatie
- Verzamel de mammosferen die in de eerste generatie zijn gevormd in een buis van 15 mL en centrifugeer op 300 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Aspireer het supernatant en laat de mammosfeerpellet achter.
- Was de pellet met DPBS.
- Voeg 200 μL 0,05% trypsine-EDTA toe aan de mammosphere-pellet en incubeer bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO2-incubator gedurende 2-3 minuten. Haal de mammosferen in de trypsine-oplossing drie keer door een naald van 25 G om een single-cell suspension te verkrijgen.
- Voeg 0,5 mL resuspensionmedium toe om de trypsineactiviteit te neutraliseren en laat de celsuspensie 10 minuten bij kamertemperatuur draaien op 112 × g .
- Aspireer het supernatant en suspendeer de celpellet opnieuw in 0,5 mL mammosfeermedium.
- Met een hemocytometer telt u het aantal cellen en berekent het volume celsuspensie dat nodig is om 0,2 × 104 cellen per put te zaaien.
OPMERKING: Houd een lage celdichtheid om het zelfvernieuwingsvermogen te beoordelen, waardoor het effect van celaggregatie wordt geminimaliseerd. - Verdun het benodigde celsuspensievolume in 2 mL mammosfeermedium en zaad in elke put van een 6-put plaat. Zaadcellen in drievoud voor elke aandoening.
- Incubeer 7 dagen bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO2-broedmachine.
- Na 7 dagen in kweek telt je het aantal mammosferen met een diameter groter dan 50 μm in elke plaat met een microscoop uitgerust met een graticule of een kwadrantrooster.
- Maak beeld van de mammosferen met een digitale camera die is gemonteerd op een lichtmicroscoop met 20x vergroting.
- Bereken de zelfvernieuwingscapaciteit met de volgende formule5
4. Western blotting om veranderingen in pluripotentiemarkers bij Api5-overexpressie te detecteren
- Verzamel de mammosferen die in de eerste generatie zijn gevormd in een buis van 15 mL en centrifugeer op 300 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Aspireer het supernatant en laat de mammosfeerpellet achter.
- Was de pellet met DPBS.
- Verzamel de pellet in een ijskoude RIPA-buffer om het eiwitlysaat te verkrijgen en voer immunoblotting uit volgens standaardprotocol24.
OPMERKING: Samenstelling van de RIPA-buffer: 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoxycholaat, 0,1% natriumdodecylsulfaat (SDS), 1 mM ethyleendiaminetetraasynzuur (EDTA), 1 mM fenylmethysulfonylfluoride (PMSF), 10 mM natriumfluoride, 1 mM natriumorthovanadat. - Probe op stamheidsmarkers - Okt3/4, Nanog, Sox2 en Bmi1, en belastingcontrole GAPDH (zie Materiaaltabel voor antilichaamverdunningen).
- Kwantificeer eiwitniveaus met behulp van densitometrische analyse op ImageJ. Selecteer het regio van interesse op Western blot-afbeeldingen en genereer een dichtheidsprofiel voor elke baan.
- Normaliseer de relatieve dichtheden van het eiwit van belang ten opzichte van die van GAPDH voor elke baan. Bereken de vouwverandering voor elk eiwit.
- Plot de vouwverandering in eiwitniveaus met een willekeurige plotsoftware.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om de efficiëntie van mammosfeervorming onder niet-hechtende omstandigheden te beoordelen, werden controle- en Api5-overexpressieve 3D-gedissocieerde MCF10A-cellen op polyHEMA-gecoate platen volgens het protocol geplaatst. Api5-overexpressieve cellen toonden een 1,58-voudige toename in de gemiddelde efficiëntie van de vorming van de mammosfeer ten opzichte van de controles (Figuur 1B,C). Deze toename toont aan dat een hogere expressie van Api5 het aandeel stamcelachtige voor...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hoewel monolaagculturen van gevestigde kankercellijnen of tumorafgeleide cellen inzicht geven in de verschillende moleculaire routes die de kankerfenotypen reguleren, kan onderzoek gericht op kankerstamcellen niet in tweedimensionale culturen worden uitgevoerd. Aangezien men denkt dat kankerstamcellen een belangrijke bijdragende factor zijn voor terugval na de huidige behandelmethoden, is het noodzakelijk robuuste assays op te stellen om deze cellente bestuderen <...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs geven geen mogelijke belangenconflicten op.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door een subsidie van de SERB-POWER (SPG/2021/002661-G) en deels door financiering van IISER, Pune Core. S.B. werd gefinancierd door een UGC-SRF fellowship. We willen prof. Raymond C. Stevens (Scripps Research Institute, VS) bedanken voor het genereus leveren van de MCF10A-cellen en Dr. Abhijith K (Ahammune Biosciences Pvt. Ltd.) voor zijn waardevolle bijdragen aan het manuscript.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| 37 °C bevochtigde incubator | New Brunswick | Galaxy 170 R | |
| Anti-Bmi1 Konijn pAb | ABclonal | A13472 | 1:1000 verdunning, overnachtelijke incubatie bij 4 °C |
| Anti-GAPDH-antilichaam | Sigma | G9545-200UL | 1:10000 verdunning, 1 uur incubatie bij kamertemperatuur |
| Anti-Nanog Konijn mAb | ABclonal | A22625 | 1:5000 verdunning, overnachtelijke incubatie bij 4 °C |
| Anti-Oct3/4-antilichaam (C-10) | Santa Cruz | sc-5279 | 1:300 verdunning, overnachtelijke incubatie bij 4 °C |
| Anti-Sox2-antilichaam (E-4) | Santa Cruz | sc-365823 | 1:300 verdunning, overnachtelijke incubatie bij 4 °C |
| B-27 Supplement (50x), minus vitamine A | Invitrogen | 12587010 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R | |
| Cholera toxine | Sigma | C8052-1MG | 1 mg/mL stock in dH2O |
| DMEM/F12 | Thermo | 11330032 | |
| Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) | Invitrogen | 14190-144 | |
| Epidermale groeifactor (EGF) | Sigma | E9644-0.2MG | 100 mg/mL stock in dH2O |
| Ethyleendiaminetetraazijnzuur dinatriumzout dihydraat (EDTA) | SRL | 43272 | |
| Hoge glucose DMEM zonder natriumpyrovaat | Invitrogen | 11965126 | |
| Paardenserum | Invitrogen | 16050122 | |
| Zoutzuur (HCl) | Qualigens | Q29145 | Wordt gebruikt om pH van Tris-HCl (pH 8,0) aan te passen |
| Hydrocortison | Sigma | H0888 | 1 mg/mL stock in ethanol |
| ImageJ | Beeldverwerkingssoftware | ||
| ImageQuant LAS 4000 | Cytiva | ||
| Immobilon Western chemiluminiscent HRP substraat | Merck | WBKLS0500 | |
| Insulin | Sigma | I1882 | 10 mg/mL stock in 1% ijzersterk azijnzuur |
| Nikon Eclipse TS-100 microscoop | Nikon | BM-1919 | |
| MCF10A-cellen | Cadeau van Prof. Raymond C. Stevens (Scripps Research Institute, VS) | ||
| Penicilline-Streptomycine | Lonza | 17-602E | |
| Fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Sigma | 78830-5G | |
| Plottingsoftware | GraphPad Prism 10 | ||
| Poly(2-hydroxyethyl methacrylaat) (pHEMA) | Santacruz | sc-253284 | 1,2% pHEMA in 95% ethanol |
| Natriumchloride (NaCl) | SRL | 41721 | |
| Natriumdeoxycholaat | Amresco | 0613-100G | |
| Natriumdodecylsulfaat (SDS) | SRL | 54468 | |
| Natriumfluoride (NaF) | HiMedia | RM1081-500G | |
| Natriumorthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508-10G | |
| Tris-buffer | SRL | 71033 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML |
Referenties
- Li, X., et al. Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy. J Natl Cancer Inst. 100 (9), 672-679 (2008).
- Creighton, C. J., et al. Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (33), 13820-13825 (2009).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Grimshaw, M. J., et al. Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells. Breast Cancer Res. 10 (3), R52(2008).
- Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Res. 65 (13), 5506-5511 (2005).
- Kim, R. J., Nam, J. S. OCT4 expression enhances features of cancer stem cells in a mouse model of breast cancer. Lab Anim Res. 27 (2), 147-152 (2011).
- Lu, X., Mazur, S. J., Lin, T., Appella, E., Xu, Y. The pluripotency factor nanog promotes breast cancer tumorigenesis and metastasis. Oncogene. 33 (20), 2655-2664 (2014).
- Leis, O., et al. Sox2 expression in breast tumours and activation in breast cancer stem cells. Oncogene. 31 (11), 1354-1365 (2012).
- Paranjape, A. N., et al. Bmi1 regulates self-renewal and epithelial to mesenchymal transition in breast cancer cells through Nanog. BMC Cancer. 14 (1), 785(2014).
- Bousquet, G., et al. High expression of apoptosis protein (Api-5) in chemoresistant triple-negative breast cancers: an innovative target. Oncotarget. 10 (61), 6577-6588 (2019).
- Basset, C., et al. Api5 a new cofactor of estrogen receptor alpha involved in breast cancer outcome. Oncotarget. 8 (32), 52511-52526 (2017).
- Kuttanamkuzhi, A., Panda, D., Malaviya, R., Gaidhani, G., Lahiri, M. Altered expression of anti-apoptotic protein Api5 affects breast tumorigenesis. BMC Cancer. 23 (1), 374(2023).
- Cho, H., et al. Apoptosis inhibitor-5 overexpression is associated with tumor progression and poor prognosis in patients with cervical cancer. BMC Cancer. 14 (1), 545(2014).
- Jang, H. S., et al. API5 induces cisplatin resistance through FGFR signaling in human cancer cells. Exp Mol Med. 49 (9), e374(2017).
- Song, K. H., et al. Apoptosis inhibitor 5 increases metastasis via Erk-mediated MMP expression. BMB Rep. 48 (6), 330-335 (2015).
- Krejci, P., et al. The antiapoptotic protein Api5 and its partner, high molecular weight FGF2, are up-regulated in B cell chronic lymphoid leukemia. J Leukoc Biol. 82 (6), 1363-1364 (2007).
- Koci, L., et al. Apoptosis inhibitor 5 (API-5; AAC-11; FIF) is upregulated in human carcinomas in vivo. Oncol Lett. 3 (4), 913-916 (2012).
- Phi, L. T. H., et al. Cancer stem cells (CSCs) in drug resistance and their therapeutic implications in cancer treatment. Stem Cells Int. 2018 (1), 5416923(2018).
- Zhou, H. M., Zhang, J. G., Zhang, X., Li, Q. Targeting cancer stem cells for reversing therapy resistance: mechanism, signaling, and prospective agents. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 62(2021).
- Song, K. H., et al. API5 confers cancer stem cell-like properties through the FGF2-NANOG axis. Oncogenesis. 6 (1), e285(2017).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Bodakuntla, S., Libi, A. V., Sural, S., Trivedi, P., Lahiri, M. N-nitroso-N-ethylurea activates DNA damage surveillance pathways and induces transformation in mammalian cells. BMC Cancer. 14 (1), 287(2014).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open:a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).
- Eyre, R., et al. Patient-derived mammosphere and xenograft tumour initiation correlates with progression to metastasis. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 21 (3-4), 99-109 (2016).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
