Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Intranasale afgifte van mRNA-polyplexen via Rayleigh-opbraakaerosolen: een in vitro methode voor neusafzetting en functioneel testen

751 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70000

⸱

20 januari 2026

 ,  , 
1GKT School of Medical Education, Faculty of Life Sciences and Medicine, King's College London, 2Genetics, Faculty of Life Sciences and Medicine, King's College London, 3Institute of Pharmaceutical Science, King's College London

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol presenteert Rayleigh-opsplitsing als een mild proces voor het aerosoliseren van niet-virale mRNA-vectoren. Regionale afzetting voor aerosoliseerde mRNA-vectoren wordt geëvalueerd met het Alberta Idealized Nasal Inlet (AINI) model. Groene fluorescentieproteïne (GFP)-expressie in menselijke longcellen vertegenwoordigt het behoud van fysisch-chemische en biologische functies van post-aerosoliseerde mRNA-vectoren.

Samenvatting

Intranasale toediening van mRNA-therapieën is een veelbelovende strategie voor vaccinatie en behandeling van luchtwegaandoeningen, met directe immuunactivatie op de plaats van de binnenkomst van het pathogeen. Conventionele aerosolisatiemethoden (zoals ultrasone of hogedrukvernevelaars) degraderen echter niet-virale mRNA-vectoren door overmatige schuifkrachten, waardoor mRNA's hun structurele integriteit en biologische activiteiten verliezen. Een Rayleigh breakup nasale atomizer werd gebruikt om polyethyleeneimine (PEI)-mRNA-vectoren voorzichtig te vernevelen tot uniforme druppels. Groen fluorescent eiwit (GFP)-coderend mRNA werd geformuleerd in kationische polyplexen en karakteriseerde pre- en post-aerosolisatie. Het Rayleigh-breekproces vormt een continue microstraal van druppels met minimale schuif, waardoor de fysisch-chemische eigenschappen van de nanodeeltjes behouden blijven. Consistente deeltjesgrootte, lage polydispersie-index en stabiel zetapotentiaal voor en na aerosolisatie werden waargenomen, wat bevestigde dat de fysisch-chemische eigenschappen van mRNA-polyplexen goed bewaard bleven via Rayleigh-opsplitsing voor aerosolisatie. Met behulp van een Alberta Idealized Nasal Inlet (AINI) model van de neusluchtweg werden de PEI-mRNA-aerosolen toegediend. De geaerosoliseerde mRNA's werden voornamelijk afgezet in de turbinate gebieden. Verwaarloosbare fracties werden gevonden in de nasofarynx of long-equivalente secties. Daarnaast werden de post-aerosoliseerde mRNA-polyplexen met succes toegediend aan A549 menselijke longepitheelcellen en produceerden ze detecteerbare GFP-expressie. Dit protocol demonstreert een niet-destructieve intranasale mRNA-afgiftemethode met behulp van Rayleigh-breakup-aerosolisatie. Het onderhoudt effectief de fysisch-chemische eigenschappen en biologische functies van niet-virale mRNA-vectoren, waarbij de waterige fase wordt verneveld tot druppels van geschikte grootte voor gerichte neusafzetting. Dit protocol onthult een nieuwe benadering om mRNA's effectief te aerosoliseren en hun regionale afzetting in de neusholte te evalueren.

Inleiding

Het toedienen van vaccins aan het neusslijmvlies (de toegangspoort voor veel luchtwegpathogenen) kan sterke lokale immuniteit opwekken en infecties bij de bron blokkeren. Het succes van intranasale griepvaccins en de recente goedkeuring van intranasale COVID-19-vaccins onderstrepen de effectiviteit van de neusroute bij het opwekken van zowel mucosale als systemische immuunresponsen1. De intranasale afgifte van mRNA-vaccins trekt daarom grote belangstelling als strategie om respiratorische virale infecties te voorkomen. Een grote technische uitdaging is echter het omzetten van fragiele mRNA-polyplexen in een inadembare aerosol zonder hun stabiliteit in gevaar te brengen.

Rayleigh-breakup-aerosolisatie biedt een mild alternatief door te werken volgens een ander fysisch principe. In een Rayleigh-breakup-apparaat wordt een onder druk staande vloeistofstroom door een microschaalopening geduwd om een continue microstraal te vormen. De straal breekt op natuurlijke wijze op in gelijkmatig grote druppels door de Plateau-Rayleigh instabiliteit2. Oppervlaktespanning zorgt ervoor dat de vloeistofkolom fragmenteert bij een karakteristieke golflengte van ongeveer twee keer de diameter van de nozzle. In tegenstelling tot ultrasone nebulisatie introduceert dit proces vrijwel geen turbulente schuif; Druppels worden van nature gevormd door de zelfinstabiliteit van de straal, niet door externe brekende krachten. Daardoor ondervinden nanodeeltjesformuleringen minimale stress. Er is aangetoond dat het gebruik van Rayleigh-afbreking lipidennanodeeltjes (LNP) mRNA's kan aerosoliseren zonder significante verandering in hun grootte, oppervlaktelading of encapsulatie-efficiëntie vóór vóór na spray 3,4,5. In deze methode blijft het PEI-mRNA intact en functioneel na aerosolisatie, in tegenstelling tot de achteruitgang die wordt gezien bij hardere vernevelingstechnieken.

Een ander voordeel van Rayleigh-breuk is de controle over de druppelgrootte. De gegenereerde druppels zijn relatief groot (ongeveer 20-30 μm). Deze druppelgrootte is ideaal voor nasale toediening: deeltjes >10 μm in aerodynamische diameter neigen zich af te zetten in de neus en bovenste luchtwegen in plaats van in de longente drijven. Door druppels te produceren die meestal boven deze drempel liggen, richt de Rayleigh-atomizer zich op natuurlijke wijze op afzetting in de neusholte. Targeting wordt verder verbeterd door gebruik te maken van het Alberta Idealized Nasal Inlet (AINI) model om toedieningstechnieken te optimaliseren. De AINI is een 3D-geprinte replica van de neusluchtweg die nauwkeurig in vivo sprayafzettingspatronen voorspelt6. Met dit model is vastgesteld dat spuiten onder een hoek van 45° in het neusgat de afzetting naar de turbinatenaanzienlijk verhoogt. De afnamehoek beïnvloedt het depositiepatroonaanzienlijk 7. Afzetting in niet-doelgebieden zoals de nasofarynx of longen is ongewenst, omdat dit keelirritatie, slechte smaak of systemische bijwerkingen kan veroorzaken8. In dit protocol werden deze omstandigheden gerepliceerd (een straalhoek van 45° en gecontroleerde inademingsluchtstroom) om de turbinaatafzetting van het mRNA-aerosol3 te maximaliseren. Eerdere gegevens tonen aan dat meer dan de helft van de afgeleverde mRNA-massa onder optimale omstandigheden in het neusschelpgebied kan worden geconcentreerd, terwijl <10% de nasofarynx of verder3 bereikt. Deze gerichte toediening zal naar verwachting de effectiviteit van het vaccin verbeteren door de dosis te concentreren op de inductieve plaatsen van immuniteit (die goed vasculariseerd zijn en rijk aan immuuncellen), en tegelijkertijd een minimalisatie van off-target afzetting die tot afval of bijwerkingen kan leiden.

In dit methode-artikel wordt de experimentele procedure voor het aerosoliseren van mRNA via Rayleigh-opsplitsing uitvoerig beschreven, waarbij regionale afzettingen in het AINI-model worden beoordeeld en de biologische activiteit van het afgezet mRNA in vitro geëvalueerd worden. Een rapporterend mRNA dat codeert voor GFP wordt gebruikt om transfectie-uitkomsten in menselijke cellen te visualiseren. HEK293T cellen worden gekozen om de functionaliteit van de geaerosoliseerde complexen te testen. Om de cellulaire opname van het geaerosoliseerde mRNA in vitro te verbeteren, wordt het mRNA vertakt met PEI om PEI-mRNA-polyplexen te vormen voordat deze aan cellen worden toegevoegd. PEI is een cationisch polymeertransfectiemiddel dat de mRNA-afgifteefficiëntie kan verbeteren, en hier werd een N:P (stikstof: fosfaat) molaire verhouding van 24:1 gebruikt, gebaseerd op eerdere optimalisatie voor genlevering. PEI wordt in deze studie alleen gebruikt voor de valideringsstap van celkweek en maakt geen deel uit van de aerosolafgifte naar een daadwerkelijke neus (in vivo zou men alleen op LNP-mRNA vertrouwen, maar in celkweek helpt dit om genexpressie voor detectie te maximaliseren).

Dit protocol benadrukt een nieuwe benadering voor intranasale mRNA-vaccintoediening die het stabiliteitsprobleem van aerosoliseren van mRNA aanpakt. Rayleigh-opsplitsing is pas recentelijk toegepast op nucleïnezuurafgifte in enkele studies 3,4,5,9, en dit werk biedt een gedetailleerde methodologische gids om deze techniek toe te passen. Door deze stapsgewijze procedure te volgen, kunnen onderzoekers de zachte aerosolisatie van mRNA-nanodragers reproduceren en hun afzettings- en transfectiekenmerken beoordelen. De onderstaande protocolsectie is georganiseerd in sequentiële onderdelen: (1) PEI-mRNA-formulering; (2) Nanopartikelkarakterisering (grootte en zetapotentiaal) vóór en na aerosolisatie; (3) Werking van de Rayleigh breakup atomizer en AINI nasale afzettingsprocedure. Belangrijke overwegingen voor succes, zoals het behouden van RNase-vrije omstandigheden en een juiste uitlijning van apparaten, worden genoteerd. De resultaten en discussie bevatten representatieve uitkomsten, voordelen van de methode ten opzichte van conventionele benaderingen, mogelijke toepassingen (bijv. neusvaccins tegen influenza of COVID-19 10,11,12), evenals beperkingen en tips voor probleemoplossing. Deze uitgebreide methodologie is bedoeld om reproduceerbare intranasale mRNA-afgifte-experimenten mogelijk te maken en de ontwikkeling van naaldvrije mucosale RNA-vaccins te versnellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Kweek HEK293T en A549-cellijnen in een volledig medium bestaande uit Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal rundserum (FBS) en 2% penicilline-streptomycine vóór PEI-mRNA-transfectie. Ga ongeveer elke 48 uur door beide cellijnen na het bereiken van confluentie. Zaadcellen met een dichtheid van 40.000 cellen per cm² en kweek gedurende ~48 uur. Verwijder het kweekmedium en was de cellen direct voor transfectie met fosfaatgeborduurde zoutoplossing (PBS) om restserum te verwijderen en transfectiecondities te standaardiseren. Autoclaaf alle celkweekflessen, 24-wellplaten, PBS, pipetten en pipettips vóór gebruik.

1. PEI-mRNA-formulering

  1. Het vormen van PEI-mRNA-complexen (voor in vitro transfectie)
    OPMERKING: Deze stap is alleen vereist als PEI wordt gebruikt om transfectie in celkweek te stimuleren.
    1. Bereken de vereiste PEI-hoeveelheid voor de gewenste N:P-molarverhouding.
      OPMERKING: N:P = 24 (wat betekent 24 mol positief geladen amines per mol negatief geladen fosfaten op mRNA) wordt gebruikt; en een hoeveelheid van 10 μg mRNA zou ~31 μg PEI vereisen om PEI-mRNA's te vormen bij deze N/P-verhouding.
    2. Maak een verdunde PEI-oplossing (bijv. 1 mg/mL bouillon in water) en autoclaveer.
    3. Verdun het mRNA tot een geschikte concentratie (bijv. 0,2 μg/μL).
    4. Voeg de PEI-oplossing toe aan de mRNA-oplossing terwijl je zachtjes mengt (niet vortexen).
      OPMERKING: Het mengsel kan in een klein buisje zitten; Pipetteer voorzichtig op en neer of tik met de buis om te mengen.
    5. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende ~20 minuten om elektrostatische binding van PEI aan mRNA mogelijk te maken.
      OPMERKING: Als je geen PEI gebruikt, kan het naakte mRNA direct worden geaerosoliseerd. De extra PEI verbeterde de genexpressie in A549-cellen aanzienlijk, maar is optioneel en kan vanwege toxiciteitsoverwegingen mogelijk niet worden gebruikt voor daadwerkelijke in vivo levering.

2. Karakterisering van het nanodeeltje (grootte en zetapotentiaal)

OPMERKING: Stel de meetparameters in de software in en sla op als methode voordat je de analyzer gebruikt om de grootte of zetapotentiaal te meten. De methode-opstelling is vereist om het instrument te laten draaien, en de parameters zijn afhankelijk van de meetomgeving, de gebruikte cuvette en de eigenschappen van het monster.

  1. Dynamische lichtverstrooiing (DLS) vóór aerosolisatie
    1. Met een deeltjesgrootte-analyzer laadt u een verdund monster van de formulering in een wegwerp-maatcuvette (bijvoorbeeld 500 μL bij 0,2 μg/μL).
    2. Zet de analyzer aan en open software13 op de aangesloten computer.
    3. Klik op de knop Meten bovenaan het venster.
    4. Klik op het blauwe Bestandsicoon bovenaan het venster om de methode voor de vooraf ingestelde grootte te selecteren.
    5. Hernoem het protocol zodat het overeenkomt met de naam van het voorbeeld.
    6. Druk op de dekselknop van de analyzer om de kamer te openen.
    7. Steek de cuvette in de kamer.
    8. Klik op de groene knop 'Run' bovenaan het softwarevenster. Wacht tot de meting13 voltooid is.
    9. Klik op de knop Analyseren bovenaan het softwarevenster en klik vervolgens op de Grootte-knop op resultaatpagina13.
    10. Verkrijg de gemiddelde hydrodynamische diameter (Z-gemiddelde) en de polydispersie-index (PDI) uit de Statistiektabel.
    11. Druk op de dekselknop van de analyzer om de kamer te openen, verwijder de cuvette en sluit het deksel.
    12. Gooi de cuvette weg en spoel de atomizer met RNAase-vrij water en 70% v/v ethanol om te desinfecteren en het drogen tussen de metingen van de grootte te vergemakkelijken.
      OPMERKING: Zorg er voor de Rayleigh-atomizer voor dat er geen zoutafzettingen of residuen in de nozzle achterblijven, omdat deze de sproeiwerking kunnen beïnvloeden.
  2. Zetapotentiaal vóór aerosolisatie
    1. Gebruik hetzelfde instrument (of een Zeta-potentiaalanalyzer) en laad een verdund monster van de formulering in een gevouwen capillaire cel (bijv. 700 μL bij 0,2 μg/μL).
    2. Zet de analyzer aan en open software13 op de aangesloten computer.
    3. Klik op de knop Meten bovenaan het venster.
    4. Klik op het blauwe Bestandsicoon bovenaan het venster om de vooraf ingestelde zeta-methode te selecteren.
    5. Hernoem het protocol zodat het overeenkomt met de naam van het voorbeeld.
    6. Druk op de dekselknop van de analyzer om de kamer te openen.
    7. Steek de cuvette in de kamer.
    8. Klik op de groene knop 'Run' bovenaan het softwarevenster. Wacht tot de machine13 draait.
    9. Klik op de knop Analyseren bovenaan het softwarevenster en vervolgens op de Zeta-knop op resultaatpagina13.
    10. Verkrijg het zetapotentiaal (oppervlaktelading) door naar de Statistiektabel te kijken.
    11. Druk op de dekselknop van de analyzer om de kamer te openen, haal het monster eruit en sluit het deksel.
    12. Spoel de cuvette en de atomizer met RNAase-vrij water en met 70% v/v ethanol om te desinfecteren en het drogen te vergemakkelijken tussen metingen van het Zeta-potentieel.
      OPMERKING: Zorg er voor de Rayleigh-atomizer voor dat er geen zoutafzettingen of residuen in de nozzle achterblijven, omdat deze de sproeiwerking kunnen beïnvloeden.

3. Rayleigh-opbreking van aerosolisatie en neusdepositie

  1. Atomizer en AINI-opstelling
    1. Stel het Rayleigh breakup nasale atomizerapparaat en het Alberta Idealized Nasal Inlet (AINI) model samen.
      OPMERKING: Het AINI-model bestaat uit anatomisch representatieve holle secties die overeenkomen met verschillende regio's van de menselijke neusholte (bijv. neusgatvestibule, neusschelp, olfactorische regio, nasofarynx).
    2. Zorg ervoor dat alle AINI-componenten schoon en droog zijn voor gebruik (residuen kunnen de afzettingsresultaten beïnvloeden). Maak schoon door te wassen met gedeïoniseerd water9 en daarna met ethanol of een organisch oplosmiddel.
    3. Bevestig de AINI aan een Next Generation Impactor (NGI) die is aangesloten op een vacuümpomp bij de uitlaat om luchtstroom door de neusgangen te trekken.
    4. Stel de debiet in op 7,5 L/min - een debiet die een langzame, diepe neusinademing bij een volwassen6 vertegenwoordigt. Gebruik een gekalibreerde debietmeter (of een rotameter) die aan de inductiepoort van NGI is bevestigd. Stel de pomp af totdat de debietmeter 7,5 L/min aangeeft.
      OPMERKING: Gebruik een debietmeter om de luchtstroom te meten bij de vereiste debiet voor de test.
    5. Houd deze luchtstroom vast gedurende de duur van de spray. Gebruik Parafilm om het apparaat goed aan de AINI te sluiten.
  2. Positioneren van de atomizer
    1. Steek de nozzle van de Rayleigh breakup atomizer in de ingang van het AINI-neusgat (vestibulesectie) onder een hoek van 45°.
    2. Zet de atomizer vast zodat deze niet verschuift tijdens gebruik (alle verbindingen, modelsecties, slangen naar de pomp) zijn luchtdicht.
  3. Het monster laden
    1. Meng voorzichtig de bereide PEI-mRNA-suspensie om homogeniteit te waarborgen (het ontstaan van bellen).
    2. Haal het monster in het atomizerreservoir.
      OPMERKING: Afhankelijk van het ontwerp van het apparaat kan dit inhouden dat een spuit of pipettip wordt gevuld die aan de atomizer wordt bevestigd.
    3. Laad het monster in het apparaat.
      OPMERKING: Verwijder bijvoorbeeld een centrale kap of kamer in de atomizer, pipetteer het monster erin en zet het apparaat dan stevig weer in elkaar. Zorg ervoor dat er geen lekkages zijn en dat het apparaat indien nodig goed is geprimed.
  4. Het genereren van de aerosol
    1. Zet de luchtstroom (7,5 L/min via de AINI) van de luchtpomp aan vóór of tegelijkertijd met het starten van de spray, volgens de instructies van het apparaat.
    2. Activeer de Rayleigh-breakup-atomizer om te beginnen met aerosolisatie.
      OPMERKING: Voor een handmatige spuit-aangedreven atomizer, druk de spuitzuiger gestaag in om de vloeistof door de opening te persen. Spuit het hele monstervolume in één keer als dat mogelijk is. De plunjer moet soepel worden ingedrukt om een stabiele werkdruk te genereren, omdat de formulering pas wordt geaerosoliseerd nadat deze tot verhoogde druk is geperst en is blootgesteld aan een wandafschuifsnelheid binnen micro-orifice14. Snelle bewegingen van de zuiger veranderen de druk en veranderen daarmee zowel de afschuifsnelheid als de afschuiftijd14.
    3. Zorg ervoor dat de debiet gedurende de hele periode op 7,5 L/min blijft. De aerosoldruppels moeten door het neuskanaalmodel reizen en op verschillende gebieden worden afgezet afhankelijk van hun aerodynamische grootte.
    4. Zet de luchtpomp snel uit om te voorkomen dat reeds afgezet druppels verder naar beneden worden gezogen of ongelijkmatig uitdrogen.
  5. Monsterverzameling van AINI
    1. Ontleed het AINI-model zorgvuldig in afzonderlijke anatomische segmenten om afgezet nanodeeltjes uit elk gebied te verzamelen.
      OPMERKING: Noteer of markeer vóór het demonteren de oriëntatie om de secties bij te houden.
    2. Verzamel afzettingen uit zes compartimenten: (i) het atomizerapparaat, (ii) de neusvestibulesectie, (iii) de turbinaatsectie, (iv) het reukgebied, (v) de nasofaryxsectie, en (vi) elke downstream capture (bijv. stadia van een aangehechte NGI of een eindfilter dat longpenetrerende fractie vertegenwoordigt)
    3. Voor elk compartiment gebruik je een gemeten volume celkweekmedium om het afgezet materiaal eruit te wassen.
      OPMERKING: Om bijvoorbeeld de turbinaatafzetting op te vangen, verwijder je het turbinaatgedeelte en spoel je de binnenkant grondig af met 5 mL Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), met behulp van een wegwerppipet. Was voorzichtig alle oppervlakken en giet de spoeling vervolgens in een gelabelde 15 mL centrifugebuis (gebruik een trechter om de overdracht te vergemakkelijken). Tijdens het spoelen werd het segment horizontaal of licht gekanteld gehouden om volledig contact met het interne oppervlak te garanderen en vochtontsnapping te voorkomen. Herhaal hetzelfde voor het vestibule, de olfactorie, de nasofarynx en andere secties, waarbij je 5 mL verse DMEM voor elk gebruikt en deze verzamelt in aparte gelabelde buizen.
    4. Haal eventueel residueel monster terug van het atomizerapparaat.
      OPMERKING: Voor een spuittype spoel je de spuit en nozzle in een buis.
    5. Haal de vloeistof uit de NGI (cascade impactor) trappen als de AINI was aangesloten op een NGI om fijne deeltjes op te vangen (bijvoorbeeld door de trappen met DMEM te spoelen).
    6. Sluit de buis af met de verzamelde vloeistof.
      OPMERKING: Voorkom het verliezen van druppels op de bankoppervlak of door verdamping.
  6. Afhandeling na de verzameling
    1. Direct na het verzamelen werden de PEI-mRNA-monsters apart op cellen geplaatst voor transfectie.
      OPMERKING: Kan de PEI-mRNA-monsters in de koelkast laten staan voor ~1-2 uur (maximaal 6 uur) voordat ze worden gebruikt voor transfectie. Een bepaald volume (maximaal 1 mL) wordt uit elk verzameld PEI-mRNA-monster genomen om de post-aerosoliseerde vectoren te karakteriseren (d.w.z. DLS- en zeta-metingen).
  7. Het apparaat schoonmaken
    1. Maak de atomizer en het AINI-model grondig schoon na elke run om kruisbesmetting van latere experimenten te voorkomen.
    2. Spoel alle AINI-secties en de atomizerdelen af met gedeïoniseerd water om het medium en de nanodeeltjes te verwijderen, en daarna met 70% ethanol om te desinfecteren en het drogen te vergemakkelijken.
      OPMERKING: Als het apparaat of model kleine openingen heeft, spoel ze dan door met een spuit.
    3. Laat alle onderdelen volledig luchten (of plaats ze in een droogkast op lage temperatuur) voordat je ze weer in elkaar zet. Voor de Rayleigh-atomizer moet je ervoor zorgen dat er geen zoutafzettingen of residuen in de nozzle achterblijven, omdat deze de sproeiwerking kunnen beïnvloeden.

4. Celbeeldvorming

OPMERKING: Na de transfectie verwijder je het transfectiemedium en vervang je het door een nieuw volledig medium om de belichting te beëindigen. Kweek cellen gedurende 48 uur om expressie en celherstel door de reporter mogelijk te maken. Bij ~80% confluentie fixeer je cellen met 4% formaldehyde gedurende 8 minuten, kleur je vervolgens de kernen met 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI; 300 nM) gedurende 5 minuten, gevolgd door een 2-voudige PBS-wash voorafgaand aan de beeldvorming.

  1. Fluorescentiebeeldvorming
    1. Gebruik een fluorescentiemicroscoop met filtersets voor DAPI en GFP.
    2. Begin met het Blauwe kanaal (excitatiegolflengte = 385 nm, emissiegolflengte = 477,5 nm) om DAPI-gekleurde kernen te visualiseren.
    3. Schakel over naar het groene kanaal (excitatiegolflengte = 488 nm, emissiegolflengte = 525 nm) om GFP-positieve cellen te visualiseren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Als een op methoden gericht manuscript zijn gedetailleerde resultaten niet het primaire doel; Echter, representatieve bevindingen worden gepresenteerd om de verwachte uitkomsten van elk onderdeel van het protocol te illustreren. De onderstaande figuren tonen voorbeeldgegevens (bijv. grafieken of afbeeldingen) die de validiteit van de methode ondersteunen, maar er zijn geen nieuwe kwantitatieve analyses opgenomen buiten demonstratie.

Druppelgrootte en a...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit protocol wordt, voordat de formulering wordt verneveld, het mRNA vertakt met PEI om de cellulaire opname te verbeteren. Dit dient als surrogaat voor de levering van LNP-mRNA tijdens in vitro validatie10,15. PEI-mRNA behoudt de meeste functies van LNP-formuleringen, waaronder belangrijke biologische en functionele kenmerken10. De positief geladen aminegroepen in PEI binden negatief geladen m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs erkenden de financiële steun van de King's Undergraduate Research Fellowship (KURF) en het Student Opportunity Fund verstrekt door King's College London.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
50 mL centrifuge tubesSigma-Aldrich Company LimitedCLS430829-500EA
50–1000 μL pipette tipsSigma-Aldrich Company LimitedZ740031-1000EA
A549 Cell LineAmerican Type Culture CollectionATCC CRM-CCL-185
Air Flow MeterN/AN/AGenerieke luchtstroommeter kan worden gebruikt.
Alberta Idealized Nasal Inlet (AINI) modelTSI Incorporated (via Copley Scientific, UK)0001-01-8540
Autoclave indicator tapeSigma-Aldrich Company LimitedZ744090
DAPISigma-Aldrich Company LimitedD1306
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Gibco, Thermo Fisher Scientific11966025
Ethyl alcohol, pureSigma-Aldrich Company Limited32221-MGekocht via Merck
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco, Thermo Fisher ScientificA5256701
FormaldehydeSigma-Aldrich Company LimitedF8775
HEK293T Cell LineAmerican Type Culture CollectionATCC CRL-3216
Heraeus HERAsafe HS 12 Biosafety CabinetHeraeusN/A
Next Generation ImpactorMSP's, a Division of TSI0170-01-1000Dit product staat ook in de Copley Catalogus, artikelnummer 5201.
Nikon DS-Qi2 Monochrome Microscope CameraNikonN/A
Nunc Cell-Culture Treated MultidishesThermo Fisher Scientific142475
Nunc EasYFlask cell culture treated flasksThermo Fisher Scientific156340
ParafilmSigma-Aldrich Company LimitedP7793-1EA
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco, Thermo Fisher Scientific15140148
Phosphate-buffered saline (PBS) TabletsThermo Fisher Scientific18912014
Polyethylenimine hydrochlorideSigma-Aldrich Company Limited764965-1GGekocht via SLS
Rayleigh Jet Nasal AtomizerResyca BV EnschedeSoft Nasal Spray Adaptor
RNAse free waterThermo Fisher ScientificJ60610.EQC
Sizing CuvetteMalvern PanalyticalZEN0040
The Folded Capillary cellMalvern PanalyticalDTS1070
Zetasizer ProMalvern PanalyticalZetasizer Pro
Zetasizer Ultra-Pro ZS Xplorer softwareMalvern PanalyticalN/A

Referenties

  1. Akula, V. R., et al. Effect of heterologous intranasal incovacc(r) vaccination as a booster to two-dose intramuscular COVID-19 vaccination series: a randomized phase 3 clinical trial. Commun Med (Lond). 5 (1), 133(2025).
  2. Van Hoeve, W., et al. Breakup of diminutive Rayleigh jets. Phys Fluids. 22 (12), (2010).
  3. Li, H. Y., et al. Targeted nasal delivery of LNP-mRNAs aerosolised by Rayleigh breakup technology. Int J Pharm. 672, 125335(2025).
  4. He, P., et al. Rayleigh-based soft mist inhalers preserve mRNA-LNP integrity for pulmonary delivery. J Drug Deliv Sci Technol. 115, 107651(2026).
  5. Biesel, A., et al. Soft mist inhaler nebulization by Rayleigh-breakup largely preserves functional integrity of liposomal mRNA in respirable aerosols. Eur J Pharm Sci. 214, 107300(2025).
  6. Chen, J. Z., Finlay, W. H., Martin, A. In vitro regional deposition of nasal sprays in an idealized nasal inlet: comparison with in vivo gamma scintigraphy. Pharm Res. 39 (11), 3021-3028 (2022).
  7. Chen, J. Z., Kiaee, M., Martin, A. R., Finlay, W. H. In vitro assessment of an idealized nose for nasal spray testing: comparison with regional deposition in realistic nasal replicas. Int J Pharm. 582, 119341(2020).
  8. Hopke, P. K., Wang, Z. Fine Particles in Medicine and Pharmacy. Fine Particles in Medicine and Pharmacy. , Springer. US, Boston, MA. (2012).
  9. Wang, H., et al. Evaluation of Rayleigh jet atomizer for intranasal delivery of lipid nanoparticle-siRNA formulations: stability, deposition, and device performance. Int J Pharm. 683, 126084(2025).
  10. Moreno Herrero, J., et al. Compact polyethylenimine-complexed mRNA vaccines. Nat Nanotechnol. 20 (9), 1323-1331 (2025).
  11. Geall, A. J., et al. Non-viral delivery of self-amplifying RNA vaccines. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (36), 14604-14609 (2012).
  12. Xi, J., Lei, L. R., Zouzas, W., Si, X. A. Nasally inhaled therapeutics and vaccination for COVID-19: developments and challenges. MedComm. 2 (4), 569-586 (2021).
  13. Zetasizer Advance Series User Guide. , MAN0592-15-EN edn, Malvern Panalytical. (2023).
  14. Method of aerosolizing nanoparticle formulations. China patent. , CN116723892A (2023).
  15. Casper, J., et al. Polyethylenimine (PEI) in gene therapy: current status and clinical applications. J Control Release. 362, 667-691 (2023).
  16. Jin, Y., et al. A novel experimental approach to measure nebulized droplet deposition pattern and deposition fraction in an idealized mouth-to-throat model. Phys Fluids. 35 (8), (2023).
  17. Darquenne, C. Aerosol deposition in health and disease. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 25 (3), 140-147 (2012).
  18. Liu, J., et al. Turbinate-homing IgA-secreting cells originate in the nasal lymphoid tissues. Nature. 632 (8025), 637-646 (2024).
  19. Debus, H., Baumhof, P., Probst, J., Kissel, T. Delivery of messenger RNA using poly(ethylene imine)-poly(ethylene glycol)-copolymer blends for polyplex formation: biophysical characterization and in vitro transfection properties. J Control Release. 148 (3), 334-343 (2010).
  20. Brandtzaeg, P. Potential of nasopharynx-associated lymphoid tissue for vaccine responses in the airways. Am J Respir Crit Care Med. 183 (12), 1595-1604 (2011).
  21. Foley, R. A., et al. Lipid nanoparticles for the delivery of CRISPR/Cas9 machinery to enable site-specific integration of CFTR and mutation-agnostic disease rescue. bioRxiv. , (2025).
  22. Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat Rev Mater. 6 (12), 1078-1094 (2021).
  23. D'Angelo, I., et al. Hybrid lipid/polymer nanoparticles for pulmonary delivery of siRNA: development and fate upon in vitro deposition on the human epithelial airway barrier. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 31 (3), 170-181 (2018).
  24. Movia, D., Bazou, D., Volkov, Y., Prina-Mello, A. Multilayered cultures of NSCLC cells grown at the air-liquid interface allow the efficacy testing of inhaled anti-cancer drugs. Sci Rep. 8 (1), 12920(2018).
  25. Waltl, E., Eckl-Dorna, J., Selb, R., Valenta, R., Niederberger, V. Characterisation and culture of primary human nasal epithelial cells and the influence of interferon-gamma. Clin Transl Allergy. 4 (2), P21(2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Intranasale mRNA-afgiftePolyethyleenimine-mRNAA549-cellenAlberta Nasal InletGFP-expressieniet-virale mRNA-vectorenvernevelde mRNA-transfectie
Intranasale afgifte van mRNA-polyplexen via Rayleigh-opbraakaerosolen: een in vitro methode voor neusafzetting en functioneel testen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.