Profilering van epidermale groeifactor-DNA-mutaties in circulerende zeldzame cellen met behulp van een celisolatiesysteem en druppeldigitale PCR

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om de isolatie van zeldzame kankercellen uit een geconstrueerd monster met volbloed en spiked in longkankercellen te illustreren. Het protocol maakt gebruik van een semi-geautomatiseerd, labelvrij celisolatieplatform. Verrijkte cellen worden vervolgens geanalyseerd op mutaties in de epidermale groeifactorreceptor met behulp van druppeldigitale PCR.

Samenvatting

Mutaties die worden gevonden binnen het epidermale groeifactorgen (EGFR) zijn cruciaal voor het bepalen van de meest effectieve behandelingen voor patiënten met longkanker. Routinematig testen op EGFR-mutaties kunnen de vorm aannemen van tumorbiopten of analyse van ctDNA uit plasma van patiënten met longkanker. Hoewel het testen van bloedmonsters van patiënten met longkanker routinematig wordt uitgevoerd om inzicht te krijgen in de aanwezigheid of terugkeer van longkanker, via ctDNA-detectie of CTC-detectie, vereist dit doorgaans geen latere moleculaire analyse van de gevangen cellen. De detectie van individuele mutaties binnen het EGFR-gen aanwezig in zeldzame circulerende tumorcellen (CTC's) kan extra inzichten bieden in de potentiële effectiviteit van gerichte therapieën en daarboven, de patiëntprognose, vooral bij niet-kleincellige longkanker (NSCLC). Helaas vormen de zeldzaamheid van zulke circulerende tumorcellen en het ontbreken van gestroomlijnde procedures om hun genomische informatie te onderzoeken een aanzienlijke detectieuitdaging.

Het doel van dit protocol is om het realistische potentieel te illustreren van het opvangen van CTC's uit volbloed en het beoordelen van hun moleculaire inhoud met ddPCR. Een semi-geautomatiseerd, op grootte gebaseerd celisolatieplatform werd gebruikt om circulerende tumorcellen te vangen, die vervolgens werden teruggevonden voor latere moleculaire analyse. Om de aanwezigheid van specifieke EGFR-mutaties in het genomische DNA van gevangen cellen te bepalen, werd ddPCR uitgevoerd met behulp van assays voor EGFR pT790M en EGFR pL858R.

Twee afzonderlijke longkankercellijnen (A549 en H1975) werden actief verrijkt uit volbloed en nauwkeurige kwantificatie van mutaties binnen de cellijnen H1975 werd uitgevoerd met ddPCR.

Inleiding

Met aanhoudend translationeel onderzoek naar de waarde van vloeibare biopten en recente publicaties die specifiek de klinische waarde van ctDNA-monitoring bij therapiekeuze illustreren, komen vloeibare biopsieën¹ volwassen. Vloeibare biopsieën bieden een alternatieve, minder invasieve methode voor kankermonitoring en prognose in vergelijking met conventionele weefselbiopsiemethoden. Uitgebreid onderzoek richt zich op gefragmenteerd DNA dat in bloed wordt gevonden (celvrij DNA, cfDNA), en specifiek op het subcompartiment dat uit tumoren voortkomt, bekend als circulerend tumor-DNA (ctDNA). ctDNA is de afgelopen twee decennia uitgebreid bestudeerd en heeft aangetoond tumor-specifieke genmutaties te bevatten, bijvoorbeeld SNV's en structurele varianten, evenals methylatiemarkers en een onderscheidend fragmentpatroon in vergelijking met niet-tumor cfDNA. Deze specifieke ctDNA-kenmerken worden nu gebruikt om de moleculaire status van kankerpatiënten te monitoren op het gebied van vroege detectie, therapierespons, minimale restziekte (MRD) en resistentie tegen therapiestatus. Evenzo zijn circulerende tumorcellen (CTC's), losgekoppeld van de primaire tumorplaats in bloedvaten, recent geëvolueerd tot veelbelovende biomarkers waarvan het bestaan en de hoeveelheid in het bloed een nauwe correlatie hebben getoond met ziekteprogressie en recidiefpotentieel. Hoewel de allereerste studies naar CTC's vooral gebaseerd waren op hun eiwitmarkerexpressie en opsomming², is er aanzienlijke vooruitgang geboekt in het bestuderen van CTC's op moleculair niveau, waaronder genomische mutatiedetectie in oestrogeenreceptor 1 (ESR1) voor borstkanker, en epidermale groeifactorgen (EGFR) voor verschillende kankers.

EGFR-mutaties zijn cruciaal voor zowel het bepalen van pathogenese en prognose, als voor het bepalen van de meest effectieve behandelingen voor patiënten met longkanker³. Routinematig testen op EGFR-mutaties kunnen de vorm aannemen van solide tumorbiopten bij diagnose of progressie, of recentelijker, het bemonsteren van ctDNA uit plasma van patiënten met terugkerende/refractaire longkanker⁴. In tegenstelling tot ctDNA-gebaseerde benaderingen maakt analyse van CTC-afgeleid genoommateriaal echter directe beoordeling mogelijk van intacte tumorcellen en hun mutatieprofielen. Naast ctDNA MRD-studies kan detectie van mutaties in het EGFR-gen van zeldzame CTC's extra inzicht bieden in de potentiële effectiviteit van behandelregimes en daarnaast de patiëntprognose, vooral bij niet-kleincellige longkanker (NSCLC). De zeldzaamheid van CTC's en het gebrek aan gestroomlijnde protocollen die gebruikmaken van gebruiksvriendelijke instrumenten voor klinieken vormen een ernstige belemmering voor bredere adoptie. Deze beperking benadrukt de noodzaak van een gestandaardiseerde en toegankelijke workflow die zowel efficiënte CTC-isolatie als downstream moleculaire analyse mogelijk maakt. Daarom is het doel van deze studie om een reproduceerbare workflow te presenteren voor de verrijking van circulerende tumorcellen en de daaropvolgende detectie van EGFR-mutaties met behulp van een gecombineerde celisolatie- en digitale PCR-benadering.

Het Genesis Cell Isolation System met microfluïdische celvangglaasjes kan CTC's vangen in een semi-geautomatiseerd proces met hoge levensvatbaarheid en hoge vangefficiëntie, gebaseerd op hun grotere omvang en verminderde vervormbaarheid vergeleken met de primaire witte en rode bloedcelpopulatie ^5,6. Gevangen CTC's kunnen vervolgens worden teruggewonnen uit de microfluidische celvangstgladen door middel van omgekeerde stroming van de dia voor verdere genomische analyse. Om de aanwezigheid van specifieke EGFR-mutaties in het genomische DNA van gevangen cellen vast te stellen, werd ddPCR uitgevoerd op CTC-afgeleid genomisch DNA met behulp van assays voor EGFR T790M en L858R.

Dit protocol, met een model CTC-monster en commercieel verkrijgbare ddPCR-assays, is ontworpen om een toegangspunt te zijn voor gerichte detectie van kankergeassocieerde mutaties in CTC's. Dit protocol biedt een praktische aanpak voor het detecteren van kankergeassocieerde mutaties in circulerende tumorcellen en kan verder onderzoek naar toepassingen van vloeibare biopsie ondersteunen.

Protocol

Ethische verklaring:

Bloedmonsters werden verkregen van erkende bronnen voor onderzoeksdoeleinden, en schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle donoren voorafgaand aan de afname van het monster. Alle experimentele protocollen met menselijke bloedmonsters zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Review Board van een bloedleverancier, Discovery Life Sciences (Alabama, VS). Alle procedures met betrekking tot menselijke bloedmonsters werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische normen van het institutioneel onderzoekscomité en met de Verklaring van Helsinki.

1. Verrijking van kankercellen met behulp van een semi-automatisch celisolatiesysteem

Opmerking: Deze sectie beschrijft de verrijking van circulerende tumorcellen (CTC's) met behulp van een semi-geautomatiseerd celisolatieplatform, gevolgd door EGFR-mutatiedetectie met druppeldigitale PCR. Een model CTC-monster wordt gebruikt om haalbaarheid aan te tonen, en assayvalidatie wordt aanbevolen vóór klinische toepassing. Twee niet-kleincellige longkankercellijnen (NSCLC) werden gebruikt: NCI-H1975 (EGFR L858R/T790M mutaties) en A549 (EGFR wildtype), die dienden als negatieve controle voor mutatiedetectie.

1. Bloedmonster
   1. Zorg ervoor dat geïnformeerde toestemming wordt verkregen van bloeddonoren/patiënten voordat het bloed wordt afgenomen. Verkrijg goedkeuring van de Institutional Review Board (IRB), waar vereist, voor onderzoek met menselijke monsters, inclusief bloed.
   2. Voor haalbaarheidstests kun je een bloedmonster verkrijgen van een geautoriseerde^{derde partij leverancier} voor onderzoeksdoeleinden.
   3. Verzamel perifeer bloed in Ethylenediaminetetraazijnzuur (EDTA) buizen en verwerk het monster binnen 48 uur via het Genesis Enrichment-protocol.
      Opmerking. Voor downstream-analyse en het Genesis Enrichment-protocol worden EDTA-buizen aanbevolen. Streck en EDTA-buis kunnen worden gebruikt voor immunokleuring op de dia-dia's met Genesis Enumeration-protocollen (direct/indirect).
   4. Bewaar bloedmonsters die zijn verzameld in EDTA-buizen bij 2–8 °C tot gebruik. Voor Genesis-celisolatie is geen voorbehandeling nodig en kan volbloed tot 10 mL worden gebruikt voor het Verrijkingsprotocol.
2. Model CTC-monster/klinische monstervoorbereiding
   1. Bereid een celstockoplossing voor met een concentratie van 100–1.000 cellen in een geschikte celkweekmedium van 10 μL of een fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) buffer. Sla deze stap over als er klinische monsters in gebruik zijn.
      OPMERKING: De piekende concentraties die in deze studie worden gebruikt, zijn hoger dan de typisch waargenomen klinische CTC-waarden en zijn uitsluitend bedoeld voor methodedemonstratiedoeleinden.
   2. Voeg de 10 μL celvoorraadoplossing toe aan maximaal 10 mL volbloed van een gezonde donor om een model CTC-monster te maken. Voor klinische monsters moet geen kankercellen in de volbloedmonsters van patiënten worden opgenomen.
   3. Meng het bloedmonster met een gelijke hoeveelheid PBS (1x) en beweeg voorzichtig op een bloedwiegmachine op kamertemperatuur tot gebruik. Als de opslag langer dan een uur duurt, bewaar dan bij 4 °C.
3. CTC-verrijking
   1. Zet het Genesis Cell Isolation System aan en wacht tot het systeem wordt geïnitialiseerd. Dit kan tot 5 minuten duren.
   2. Plaats de afvalpot aan de voet van de stationsvakken en bevestig de afvalpot aan de afvalpot.
   3. Druk de slang in het drukventiel totdat je voelt dat hij op zijn plek klikt, en bevestig de Genesis System-buis op de afvalpot.
   4. Voer een Zelftest uit door op "start" te drukken op het startscherm en de 'Zelftest' op het scherm aan te raken.
   5. Wanneer de Self-Test voltooid is, selecteer je '2.0 Kit Enrichment' in de selectieprotocolopties.
   6. Volg de instructies op het scherm, vul de benodigde gegevensinvoervelden in en voltooi de Priming and Assembly-procedure. Succesvolle priming met 70% ethanol en 1x PBS levert de beste celvangstprestaties en herstel voor de DNA-extractie op. Het primen duurt ongeveer 20 minuten.
   7. Zorg ervoor dat het juiste verrijkingsprogramma (2.0 Kit Enrichment) is geselecteerd en dat alle buisverbindingen en plaatsingen van de slede correct zijn vastgezet voordat de run begint. Vermijd het toevoegen van luchtbellen tijdens het laden van het monster, omdat dit de vloeiconsistentie en de vangefficiëntie kan beïnvloeden.
   8. Geef voorzichtig het modelmonster dat is voorbereid uit stap 1.2.3 (Model CTC Monster/Klinisch Monstervoorbereiding) in de inlaattrechter en ga door met het Verrijkingsprotocol door op 'Resume' te drukken op het systeemscherm.
   9. Wanneer de CTC-vangst is voltooid, zal het semi-geautomatiseerde celisolatiesysteem de gebruiker vragen de afvalpot te verwijderen en het ontstekingsreservoir weer aan te sluiten.
   10. Koppel de Genesis System-buis van de afvalpot en pipeper 4 mL verdunningsbuffer in het primingreservoir.
   11. Bevestig de terugstroomadapter op het primingreservoir en sluit het weer aan op de Genesis System-buis. Druk op Doorgaan op het scherm om het Verrijkingsprotocol voort te zetten. Hierdoor worden de gevangen cellen in de microfluïdische sleuf vrijgegeven aan de inlaattrechter door terugstroming toe te passen.
   12. Verzamel teruggevonden cellen door te pipetten vanuit de inlaattrechter naar een 5,0 mL Eppendorf-buis. Zorg ervoor dat je alle waterige monsters in de inlaattrechter verzamelt, die vaak meer dan 4 ml kunnen zijn.
   13. Centrifugeer het teruggewonnen monster op 600 g gedurende 5 minuten om de gevangen cellen te pelleten voordat de cellyse plaatsvindt.
   14. Verwijder het supernatant voorzichtig en ga door met het DNA-extractieprotocol (Sectie 1.4).
4. DNA-extractie
   Voorzichtigheid: DNAzol BD is schadelijk als het in contact komt met de huid of wordt ingenomen. Vermijd contact met huid en ogen. Gebruik alleen binnen een chemische dampafzuigkap en adem geen nevel/damp/spray uit. Was direct met water in contact met de huid.
   1. Voeg 1 ml DNAzol BD direct toe aan de buis vanaf stap 1.3.14.
   2. Breng het volledige volume van het monster over in een nieuwe Eppendorf DNA LoBind 1,5 mL microcentrifugebuis en schud krachtig.
   3. Incubeer de buis 5 minuten op kamertemperatuur. Draai de buis krachtig en broed minstens 4 minuten op kamertemperatuur.
   4. Zorg voor volledige menging tijdens de lysis- en precipitatiestappen om het DNA-herstel te maximaliseren. Optionele RNase-behandeling kan worden opgenomen als RNA-besmetting een zorg is.
   5. Voeg 400 μL isopropanol direct toe aan het DNAzol BD-cel lysaatmonstermengsel.
   6. Centrifugeer de buis op 10.000 g gedurende 6 minuten om DNA neer te slaan.
   7. Na centrifugatie verwijder je het supernatant en voeg je voorzichtig 0,5 mL DNAzol BD toe aan het gepelleteerde DNA.
   8. Laat de buis vortexen totdat de DNA-pellet volledig is verspreid.
   9. Centrifugeer het mengsel op 10.000 g gedurende 5 minuten.
   10. Verwijder het supernatant en was de DNA-pellet door 1 mL 75% ethanol te pipetten.
   11. Herhaal stappen 9–10 voor in totaal twee wasbeurten.
   12. Verwijder eventueel restanten van ethanol op de bodem van de buis met een micropipet.
       OPMERKING: Zorg ervoor dat de pellet niet volledig droog wordt.
   13. Voeg 20 μL DNase-/RNase-vrij gedeïoniseerd (DI) water toe om het DNA uit de CTC-monsters op te lossen.
   14. Kwantificeer dubbelstrengs DNA (dsDNA) in het monster met behulp van dsDNA-kwantificatie-assay kits/platforms, zoals Qubit 1x dsDNA High Sensitivity Assay Kit of Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis.
   15. Bewaar geëxtraheerde DNA-monsters bij 4 °C of -20 °C om degradatie te voorkomen.
       Pauzepunt: De geëxtraheerde DNA-monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 °C voor kortetermijnopslag of bij -80 °C voor langdurige opslag voordat overgaat naar downstream-analyses.

2. EGFR-mutatieanalyse met ddPCR

Digitale PCR is een geschikte methode om zeldzame mutaties met hoge gevoeligheid en precisie te detecteren. ddPCR-mutatiedetectie-assays die in een enkele buis worden geleverd, omvatten doorgaans een FAM-gelabelde probe die zich richt op een gemuteerd allel en een tweede HEX-gelabelde probe die zich richt op een wildtype-allel.

1. Reactie-opstelling en druppelgeneratie
   1. Ontdooien ddPCR Supermix, ddPCR Mutatiedetectie Assays op ijs.
   2. Draai elke buis in vortex om ervoor te zorgen dat de inhoud homogeen is, omdat er tijdens opslag bij -20 °C een concentratiegradiënt kan ontstaan.
   3. Centrifugeer kort om de inhoud op de bodem van de buis te bezinken en plaats de buis op ijs.
   4. Bereid geëxtraheerde DNA-monsters voor op de gewenste concentratie voordat je de reactiemix bereidt volgens het recept in Tabel 1.
   5. Maak een premix met supermix, assays en restrictie-enzymen, plus water voor alle benodigde monsters voor testen, en voeg monster-DNA afzonderlijk toe als laatste reactiecomponent. Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie DNA-monsters 50 fg–100 ng bedraagt.
      Opmerking: DNA-fragmentatie door restrictievertering vóór druppelvorming wordt aanbevolen om de nauwkeurigheid te verbeteren, viscositeit te verminderen en de toegankelijkheid van templates te vergroten. Directe vertering met 2–5 U restrictie-enzym tijdens de ddPCR-opstelling wordt aanbevolen. Voor EGFR-puntmutatie-assays (T790M/L858R) wordt MseI aanbevolen; Raadpleeg assay-gegevensbladen voor compatibele enzymen voordat je het aanpast. Datasheets zijn beschikbaar voor download voor individuele assays via het Bio-Rad digitale assays-portaal (Bio-Rad Droplet Digital PCR Assays | Thuis)
   6. Bereid een negatieve controle voor voor ten minste één put, die alleen een wildtype-sjabloon bevat in een concentratie vergelijkbaar met de concentratie van onbekende monsters.
   7. Draai de reactiebuizen om grondig te mengen en centrifugeer kort om alle monsters tot aan de onderkant van elke buis te sedimenteren. Laat de reactiebuizen 2 minuten in evenwicht komen bij kamertemperatuur.
   8. Laad 20 μL van elke reactiemix in een monsterput van een microfluidische cartridge (DG8-patroon), gevolgd door 75 μL druppelgeneratieolie voor sondes in de olieputten.
   9. Bedek de cartridge met een pakking en plaats deze in de QX200 Droplet Generator.
   10. Druk op de knop bovenop de Druppelgenerator om het deksel te sluiten. Wanneer het deksel gesloten is, begint de druppelgeneratie automatisch. Deze procedure combineert de monsters en olie in de microkanalen van de microfludiaanse cartridge om een emulsie van ~20.000 nanoliter-druppels per monster te creëren.
2. PCR-versterking (thermische cycluscondities)
   1. Programmeer thermische cycluscondities op een thermische cycler zoals aanbevolen in Tabel 2
   2. Wanneer de druppelgeneratie is voltooid, zijn alle lampjes op het instrument constant groen. Open het instrument door opnieuw op de knop van de druppelgenerator te drukken en verwijder de cartridgehouder en cartridge.
   3. Verwijder de wegwerppakking en aspireer 45 μL druppels uit de cartridge, waarbij je zorgvuldig een lichte hoek op de pipetpunt houdt om te voorkomen dat de druppels verscheuren.
   4. Dodeer druppels in de ddPCR 96-Well-platen en sluit de plaat af met PCR Plate Heat Seal met de PX1 PCR Plate Sealer.
   5. Na het afdichten van de 96-wellplaat met druppels, wordt de 96-well-plaat zorgvuldig overgebracht naar de thermische cycler die in stap 2.2.1 is voorbereid, en gestart de thermische cycling.
3. Druppeluitlezing en data-analyse
   1. Start het ddPCR Droplet Reader-instrument (QX200 Droplet Reader of QX600 Droplet Reader) en een aangesloten computer waarop de QX Manager Software is geïnstalleerd en geconfigureerd.
   2. Zodra de thermische cyclusstap is voltooid, verplaats u de verzegelde 96-wellplaat naar een Droplet Reader-instrument.
   3. Open QX Manager Software om een nieuwe plaatindeling te configureren op basis van experimenteel ontwerp. Klik op het tabblad 'Bord toevoegen' en de software schakelt de knop 'Plaat configureren' in. Klik op 'Plaat configureren' om monstergegevens aan de plaat toe te wijzen.
   4. Vul de gegevens van de plaat en putinformatie in, selecteer de putten, geef de monsterconditie, experimenttype, doelnaam(en), doeltype(s) en referentie: hoofdstuk 1 voor FAM en hoofdstuk 2 voor HEX-kleur.
   5. Klik op 'Toepassen' om de put te laden en selecteer als je klaar bent 'OK'.
   6. Wanneer de plaatindeling voor alle monsters compleet is, selecteer je 'Run' om het druppelleesproces te starten.
   7. Na gegevensverzameling selecteer je monsters in de putselector onder 'Analyze' en stel je de juiste drempel in voor de ddPCR Mutation Detection Assay om mutanten van wildtypesignalen te onderscheiden.
   8. Voor duplexmutatie-assays zoals die in dit protocol worden gebruikt, kunnen drempels automatisch worden ingesteld met de standaardinstellingen van de QX Manager-software (verwijs naar de resultaten in fig).
   9. Als alternatief kunnen drempels handmatig worden ingesteld met behulp van de kruisdraad- of lassomethoden, zodat drempels of lassogrenzen positieve en negatieve clusters scheiden en worden gepositioneerd op basis van clusterlocaties die worden gedefinieerd door zowel positieve als negatieve controles die in elke run zijn opgenomen.
      OPMERKING: Drempels moeten consequent worden ingesteld over monsters binnen een batch met behulp van positieve en negatieve controles om reproduceerbare mutatie-aanroepen te waarborgen.
   10. De gerapporteerde concentratie zijn kopienummers per μL van de uiteindelijke 1x ddPCR-reactie.

Resultaten

Het Genesis-celisolatiesysteem met microfluïdische celvangstslides isoleerde gemiddeld 84% van de gespikede kankercellen in bloedmonsters bij een concentratie van 25–250 cellen·^mL-1 (Figuur 3A). Deze hoge vangstefficiëntie toont de effectiviteit aan van de verrijkingsstap voor het isoleren van zeldzame circulerende tumorcellen uit volbloedmonsters. Optionele immunokleuring van cellen gevangen in microfluïdische celvangstglaasjes met behulp van het systeem Enumeration-protocol toonde zeldzame celidentificatie aan met twee positieve antilichamen tegen cytokeratine, DAPI om nucleaire cellen te identificeren en één negatief antilichaam tegen CD45 dat op de meeste witte bloedcellen tot expressie komt, maar doorgaans niet tot expressie komt op CTC's (Figuur 3B). Dit kleuringspatroon bevestigt de succesvolle identificatie van circulerende tumorcellen, terwijl achtergrondwitte bloedcellen worden uitgesloten.

ddPCR-mutatiedetectie-assays maakten identificatie en profilering van EGFR-mutaties in verrijkte kankercellen mogelijk. Deze studie toonde de detectie van gDNA-mutaties in cellen aan, aanvankelijk verrijkt door het Genesis-platform, met behulp van ddPCR- en mutatiedetectietests. ddPCR-grafieken (Figuur 4) van kankercellijnen A549 (EGFR wildtype) en H1975 (L858R/T790M) voor de twee geteste EGFR-mutaties toonden aan dat ddPCR gevoelig mutaties kan detecteren die aanwezig zijn in de cellijn H1975 na pieken in volbloed en daaropvolgende verrijking via het Genesis-platform. Positieve mutatiesignalen werden waargenomen in H1975-cellen, terwijl er geen mutatiesignalen werden gedetecteerd in A549-cellen, wat de assayspecificiteit bevestigde. De monsters die met controlecellijn A549 waren vergiftigd, toonden geen mutatiedruppels aanwezig, wat bevestigde dat de detectie van mutaties bij L858R en T790M specifiek geassocieerd is met de H1975-cellijn. Deze demonstratie van CTC-isolatie op het Genesis-platform, gevolgd door moleculaire analyse met behulp van ddPCR, kan een krachtig moleculair diagnostisch hulpmiddel bieden voor vloeibare biopsiestudies en preklinische studies, waarbij klinische monsters worden gebruikt om de ziekteprogressie en gepersonaliseerde behandeling te monitoren. Al met al tonen deze resultaten aan dat de gecombineerde verrijkings- en ddPCR-workflow EGFR-mutaties in circulerende tumorcellen betrouwbaar kan detecteren en kwantificeren.

Figuur 1: Workflow van vloeibare biopsie voor het profileren van EGFR DNA-mutaties bij longkanker. (A) Illustratie van tumorheterogeniteit met verschillende EGFR-mutatieprofielen die zijn vastgesteld met conventionele weefselbiopsie en circulerende tumorcellen (CTC's) uit vloeibare biopsie. (B) Schematische workflow voor EGFR DNA-mutatieprofilering in circulerende tumorcellen met behulp van vloeibare biopsie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Demonstratie van EGFR DNA-mutatieprofilering met behulp van geconstrueerde monsters. (A) Bereiding van een model CTC-monster door longkankercellijnen met gedefinieerde EGFR-mutatiestatus in volbloed van een gezonde donor te spiken. (B) Werkwijze die de detectie van EGFR DNA-mutatie in circulerende tumorcellen illustreert met commercieel beschikbare platforms. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Labelvrije isolatie en identificatie van circulerende tumorcellen. (A) Vangstefficiëntie van longkankercellijnen (A549 en H1975) die in volbloedmonsters van gezonde donoren worden gespiked met behulp van een semi-geautomatiseerd zeldzame celisolatieplatform. (B) Immunokleuring van gevangen cellen met cytokeratine-positieve tumorcellen. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. EGFR-mutatieprofilering met behulp van druppelgebaseerde digitale PCR. Tweedimensionale amplitudeplots die de detectie van EGFR-mutatie in verrijkte kankercellen tonen na cellysie en DNA-extractie. A549-cellen (wildtype) vertonen afwezigheid van mutatiespecifieke signalen, terwijl H1975-cellen positieve signalen vertonen voor EGFR L858R- en T790M-mutaties. De assay maakt een gevoelige detectie en kwantificering van mutanten- en wildtype-DNA-populaties mogelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Component	Volume per reactie (μl)	Eindconcentratie
2x ddPCR Supermix voor probes (geen dUTP)	10	1x
20x target (FAM) en wild-type (HEX) primers/probe	1	1x
Beperkingsenzym, verdund (Msel)	1	2-5 U/reactie
Doelmonster en/of DNase-vrij water (NTA)	Variabele	Variabele
Totaal volume	20	-

Tabel 1: Reactie-opstelling voor druppelgebaseerde digitale PCR-mutatiedetectie. Samenstelling en uiteindelijke concentraties van reagentia die worden gebruikt om zeldzame EGFR-mutaties te detecteren in DNA-monsters afkomstig van kankercellen.

Thermische cycling* stap	Temperatuur	Tijd	Ramp Rate	Aantal cycli
	(ºC)		(ºC/sec)
Enzymactivatie	95	10 min	2	1
Denaturatie	94	30 seconden	2	40
Gloeien/verlenging	55	1 min	2	40
Enzymdeactivatie	98	10 min	2	1
Koeling	4	30 min	2	1
Vasthouden (optioneel)	4	∞ (oneindig)	1	1
Gebruik een verwarmd deksel ingesteld op 105ºC en stel het monstervolume in op 40μl voor de C1000 Touch Thermal Cycler met een 96-diepe put reactiemodule.

Tabel 2: Thermische cyclusvoorwaarden voor digitale PCR-versterking. Thermische cyclusparameters gebruikt voor de amplificatie van EGFR-mutatiedoelen met een thermische cycler met een reactiemodule met 96 putjes.

Discussie

De aanwezigheid van circulerende tumorcellen in het bloed van patiënten met solide tumoren is al meer dan 60^{jaar een} onderwerp van onderzoek en wordt erkend als een primaire vloeistofbiopsie van vóór hun eerste opname in de collectieve term in 2010. CTC's zijn echter zeldzaam en moeilijk selectief te isoleren uit volbloed⁹. Er zijn echter talloze methoden om CTC's vast te leggen en te verrijken, zoals geïllustreerd door de volgende reviews^10,11, die fysische/microfludische benaderingen en celoppervlaktemarkerselectiemethoden behandelen. Veel van deze methoden zijn tijdrovend, arbeidsintensief en omvatten vaak meerdere stappen/systemen om de vereiste selectiviteit te bereiken.

Het vastleggen van CTC's uit volbloed in dit protocol is afhankelijk van hun grootte (> 8 μm) en het ontbreken van misvormingen op de achtergrond van fenotypisch normale rode en witte bloedcellen die door de microfluidische poriën binnen de microfluidische celvangglaasjes gaan. Daarom zijn correcte monsterbelasting, juiste sledepriming en het voorkomen van verstopping cruciale stappen voor het behouden van de vangefficiëntie en monsterterugwinning.

Voor het succesvol verlopen van de workflow is het beheer van bloedmonsters de sleutel; ervoor zorgen dat vers bloed wordt gebruikt voor monsterverwerking en het handhaven van de juiste transport- en opslagomstandigheden om hemolyse te voorkomen. De afbraak van rode of witte bloedcellen zal respectievelijk de kwaliteit van CTC-vangst en de gevoeligheid voor detectie van zeldzame genomische varianten beïnvloeden. Als hemolyse, stolling of zichtbare monsterdegradatie wordt waargenomen, moet het monster niet worden verwerkt, omdat deze omstandigheden de CTC-terugwinning en de gevoeligheid voor mutatiedetectie kunnen verminderen.

Aangezien CTC's aanwezig kunnen zijn op niveaus onder 1 CTC per 10 miljoen witte bloedcellen in heel bloed, is het essentieel om zoveel mogelijk volume te vangen als voor verrijking. De microfluidische celvangglaasjes kunnen 10 mL bloed bevatten, vergelijkbaar met standaard bloedvangbuisjes zoals Streck en EDTA, die doorgaans ~7,5–10 mL bloed bevatten. Een vermindering van het verzamelde bloedvolume heeft direct invloed op de CTC-vangstgevoeligheid en de daaropvolgende detectie van genomische varianten. Het verkrijgen van hoeveelheden buiten deze routine van patiënten die behandeld worden, kan zowel klinisch als ethisch uitdagend zijn. Naast het verhogen van het volume van meer dan 10 ml of het gebruik van diagnostische leukaferesemonsters om de WBC/CTC-populaties^{met 12} te vergroten, valt het verhogen van de gevoeligheid bij grotere volumes momenteel buiten het bereik van het Genesis-platform.

Het protocol werd uitgevoerd zoals beschreven in de standaard SOP, maar met zorg voor vers bloed, uitgebreide menging van EDTA met bloed bij afname en zorgvuldige opslag van het verzameld bloed vóór gebruik, wat het potentieel illustreert van dit protocol om te worden toegepast in een klinische setting waar routinematige standaardprocedures worden gewaardeerd. Omdat dit protocol echter werd aangetoond met behulp van gekunstelde monsters, is validatie met klinische patiëntmonsters vereist vóór routinematige klinische implementatie.

De gevoeligheid van detectie van mutaties binnen een CTC-populatie is afhankelijk van zowel de aanwezigheid van CTC's in een standaard volbloedmonster als de daaropvolgende detectie van somatische mutaties binnen die CTC-populatie, wat weer afhankelijk is van de frequentie van de mutatie in de CTC-subpopulatie. Deze twee verstorende factoren zullen uiteindelijk de algehele gevoeligheid voor detectie van mutaties in een gevangen CTC-populatie beperken; met een grotere impact in vroege detectiemonsters, vergeleken met laatstadia-monsters die waarschijnlijk hogere CTC-tellingen en hogere mutatie-dragende CTC-populaties hebben.

Huidige bloedgebaseerde vloeistofbiopsiestudies zijn sterk bevooroordeeld ten gunste van circulerend tumor-DNA dat aanwezig is in plasma als indicatie van tumoraanwezigheid. Typisch is de detectie van ctDNA gebaseerd op de aanwezigheid van tumorspecifieke genomische markers, zoals SNV's, structurele varianten, MSI-H, TMB en CGP. CTC's als minder gebruikte en toch even levensvatbare biomarker in vloeibare biopsie staan erom bekend dat ze in de bloedbaan terechtkomen door groeiende en mogelijk uitzaaiende tumoren⁸. De analyse van CTC's richt zich voornamelijk op celoppervlaktemarkers die worden gebruikt voor hun vangst of voor post-capture validatie met gevestigde of aangepaste antistofpanelen, zoals pan-Cytokeratine, Vimentin, PD-L1, EpCAM, enzovoort. Daarentegen is de moleculaire analyse van CTC's beperkt in adoptie vanwege de uitdagingen bij het selectief verrijken en vangen van CTC's uit volbloed, gevolgd door een nauwkeurige analyse van de CTC-subpopulatie. De huidige methode maakt gebruik van een gestandaardiseerde workflow met gevestigde protocollen voor CTC-vastlegging, gevolgd door moleculaire analyse met ddPCR en kant-en-klare assays voor bekende pathologisch relevante genomische mutaties in gefabriceerde volbloedmonsters. Deze benadering is belangrijk omdat het mutatieprofilering direct vanuit verrijkte CTC's mogelijk maakt, als aanvulling op plasma ctDNA-gebaseerde vloeibare biopsiemethoden.

Met de huidige aanpak kunnen gevangen zeldzame CTC's worden onderzocht op zowel hun aanwezigheid in volbloed als op de aanwezigheid van pathologisch relevante genomische markers binnen de CTC-populatie. Studies hebben aangetoond dat het waardevol is van het beoordelen van zowel het ctDNA-profiel van kankerpatiënten als het CTC-reservoir dat parallel aan ctDNA¹³ circuleert, waarbij de beoordeling van beide mutatiebronnen het totale moleculaire landschap van individuele patiënten uitbreidt. Dit heeft het potentieel voor de ontwikkeling van pathologische testparadigma's binnen het bereik van translationeel onderzoek, maar uiteindelijk in een klinische omgeving. Het nieuwe paradigma zou zowel de aanwezigheid van CTC als indicatie van kankeraanwezigheid/progressie als pathologische mutaties in de CTC-gevangen cellen omvatten, wat mogelijk wijst op klonale expansie of therapeutische resistentie¹⁴. De implicatie hiervan is dat de ontwikkeling van metastase en klonale expansie, gevolgd door daaropvolgende resistentie tegen geneesmiddelen, zowel op ctDNA-niveau als op CTC-niveau gezamenlijk kan worden gemonitord, wat direct invloed heeft op de therapiekeuze bij latere kankerstadia.

Toekomstige toepassingen kunnen het aanpassen van deze workflow aan aanvullende kankergeassocieerde mutaties en het testen van de prestaties ervan in longitudinale klinische monsters omvatten.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Genesis Cell Isolation System	Bio-Rad Laboratories	12019822	Instrument (Referred to as "Semi-automated cell isolation system")
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad Laboratories	1864002	Instrument
QX200 Droplet Reader or QX600 Droplet Reader	Bio-Rad Laboratories	1864003 or 12013328	Instrument (Referred to as "Droplet Reader instrument")
PX1 PCR Plate Sealer	Bio-Rad Laboratories	1814000	Instrument
C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module	Bio-Rad Laboratories	1851197	Instrument
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific Inc.	Q33226	Instrument
Celselect Slides			Consumable (Referred to as Microfluidic Cell Capture Slides)
Celselect Slides Enrichment Kit 2.0	Bio-Rad Laboratories	17009455	Consumable
DNAzol BD	Molecular Research Center, Inc.	DN129	Reagent
MseI restriction enzyme	New England Biolabs	R0525S	Reagent
ddPCR Mutation Detection Assay: EGFR T790M	Bio-Rad Laboratories	Assay ID dHsaMDV2010019	Assay
ddPCR Mutation Detection Assay: EGFR L858R	Bio-Rad Laboratories	Assay ID dHsaMDV2010021	Assay
Qubit 1X dsDNA High Sensitivity Assay Kit	Invitrogen	Q33230	Assay kit
DG8 Cartridges for QX200 Droplet Generator	Bio-Rad Laboratories	1864008	Consumable
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad Laboratories	1863005	Consumable
Automated Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad Laboratories	1864110	Consumable (optional)
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)	Bio-Rad Laboratories	1863023	Reagent
PCR Plate Heat Seal	Bio-Rad Laboratories	1814040	Pierceable foil seal
DNA LoBind Microcentrifuge Tube, 1.5 ml	Eppendorf	022431021	Consumable
ddPCR 96-Well Plates	Bio-Rad Laboratories	12001925	Consumable