Method Article

Driedimensionale co-cultuurmethode voor de studie van indirecte interacties tussen verschillende celtypen over een gereconstrueerd basementmembraan

DOI:

10.3791/70027

⸱

April 17th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Memorial University of Newfoundland, 2Beatrice Hunter Cancer Research Institute, 3Grupo Multidisciplinar de Oncología Traslacional & University Research Institute for Health Sciences (IUNICS), Health Research Institute of the Balearic Islands (IdISBa) & University of the Balearic Islands, 4Ciber Fisiopatología Obesidad y Nutrición (CB06/03), Instituto Salud Carlos III, 5Department of Biomedical Sciences, Ontario Veterinary College, University of Guelph

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft een eenvoudige methode voor de driedimensionale co-cultuur van twee celtypen, gescheiden door een gereconstrueerd basalmembraan, die weinig gespecialiseerde apparatuur vereist en gemakkelijk geanalyseerd kan worden met diverse experimentele technieken.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Driedimensionale (3D) co-cultuur is een snel evoluerende techniek voor onderzoekers die cel-celinteracties nauwkeurig willen bestuderen met behulp van in vitro experimenten. De beperkingen van monolaagcelkweek, waaronder beperkte interacties tussen de cellulaire en extracellulaire omgeving en verstoorde celmorfologie, worden aangepakt door het simuleren van de in vivo cellulaire omgeving. Met behulp van een steiger om structurele ondersteuning te bieden en biologisch actieve extracellulaire matrixcomponenten te bevatten, vertonen 3D-culturen gedragingen en morfologieën die meer overeenkomen met weefsel. Het integreren van meerdere celtypen in dit soort 3D-omgeving maakt het mogelijk om cel-celinteracties binnen een biomimetisch modelsysteem te bestuderen. Er is een breed scala aan 3D-cocultuurtechnologieën ontstaan, elk met zijn eigen voordelen en uitdagingen. Vaak vereisen deze technologieën gespecialiseerde apparatuur, een complexe opstelling of specifieke technische kennis. Daarnaast bestaan er enkele gestandaardiseerde methoden om indirecte cel-celinteracties te bestuderen tussen twee celtypen die gescheiden zijn door een gereconstitueerd basalmembraan. Hier beschrijven we een 3D-co-cultuurmethode die slechts fundamentele technische vaardigheden vereist en die breder toepasbare materialen gebruikt om indirecte cel-celinteracties over een basalmembraan succesvol te reproduceren. Een monolaag van cellen wordt bedekt met een laag extracellulaire matrix, in de vorm van matrigel, en een tweede celtype wordt erbovenop geplaatst. De resulterende co-kweek wordt vijf dagen gehandhaafd, waarna cellen worden geanalyseerd op morfologische veranderingen door immunofluorescentie of uit de co-kweek worden gehaald voor meer gedetailleerde genomische, transcriptomische of proteomische analyses. Dit protocol is ideaal om de impact van cel-cel communicatie op celgedrag te bestuderen wanneer fysiek contact wordt verboden door een basalmembraan. Naarmate onderzoekers blijven kiezen voor meer in vivo-relevante celkweekmethoden, is een gestroomlijnde aanpak noodzakelijk om hoge toegangsdrempels te vermijden.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vitrocelkweek is een robuuste, snelle en veelgebruikte onderzoeksmethode. Hoewel traditionele celkweekmethoden krachtig zijn, verschillen ze sterk van een in vivo omgeving. De ruimtelijk beperkte aard van monolaagcelkweek leidt tot veranderingen in genexpressie, morfologie en biochemie 1,2,3. Driedimensionale (3D) kweektechnieken pakken dit verschil aan, doordat cellen worden gekweekt in een steiger die de extracellulaire matrix (ECM) simuleert die aanwezig is in organen en weefsels. In 3D-kweek vertonen cellen morfologie en gedrag die meer lijken op die van in vivo 4,5. Echter, 3D-kweek alleen reproduceert niet volledig de vele componenten van een in vivo micro-omgeving, omdat het bijdragen van andere celtypes6 mist.

Directe (contact tussen cellen) en indirecte cel-cel interacties spelen een grote rol in het gedrag van cellen in vivo 7,8. Het recapituleren van deze interacties vereist 3D-co-cultuurmodellen, waarbij meerdere celtypen samen worden gekweekt in een 3D-omgeving. Met deze technieken kan een in vivo-achtige groeiomgeving in vitro worden gecreëerd, wat de biologische relevantie van de resultaten verbetert 9,10. Hoe specifieker de omgeving is die voor een bepaald experiment nodig is, hoe complexer de methodologie wordt. Er ontbreekt een gestandaardiseerd modelsysteem dat kan worden gebruikt om cel-celinteracties tussen cellen die gescheiden zijn door een basalmembraanmatrix te bestuderen. Dit protocol is daarom ontworpen om cel-celinteracties die plaatsvinden over een basale membraanmatrix op een robuuste, reproduceerbare manier te simuleren. Aangepast van een eerder vastgesteld 3D-kweekmodel11, gebruikt de techniek een laag matrigel, hierbij aangeduid als ECM-gel, om fysiek twee verschillende celtypen in cultuur te scheiden, terwijl afgescheiden factoren doorlaten. Het was oorspronkelijk ontworpen om de indirecte impact van adipocyten op mesenchymale borstkankercellen te bestuderen, maar kan eenvoudig worden aangepast om verschillende celtypen te accommoderen. Er moet zorgvuldig worden overwogen of deze methode geschikt is voor een bepaald experimenteel ontwerp. Deze methode staat geen directe cel-cel interactie toe en moet daarom beperkt blijven tot het modelleren van in vivo-scenario's waarbij indirecte communicatie tussen cellen via een basale membraanmatrix plaatsvindt. Dit systeem zou bijvoorbeeld niet ideaal zijn om de interacties tussen cytotoxische T-cellen en tumorcellen te modelleren, omdat ze vaak direct interageren. Overweeg in plaats daarvan biologische scenario's waarin een basalmembraan de twee cellen van interesse op natuurlijke wijze scheidt. Deze methode kan bijvoorbeeld worden toegepast op de studie van interacties tussen tumorcellen en vasculaire endotheelcellen voorafgaand aan intravasatie.

Een veelgebruikte alternatieve 3D-co-cultuurmethode is het gebruik van gespecialiseerde microfluidica-chips, of "organ-on-a-chip (OoC)". OoC-systemen zijn krachtig en kunnen worden aangepast aan individuele experimenten, maar vereisen aanzienlijke tijd en middelen die worden besteed aan chipontwerp, materiaalkeuze, randapparatuur, optimalisatie en dataverzameling12,13. Daarnaast is er momenteel geen standaardmateriaal of methode die de biologische en fysieke aanwijzingen van de basale membraanmatrix kan geven zonder microfludiïde stroming14 te verstoren. Daarom brengt het toepassen van OoC-technologie op studies van cel-celinteracties over het basale membraan verdere uitdagingen met zich mee. De in dit protocol beschreven methode streeft ernaar een gestandaardiseerd alternatief te bieden dat biologische relevantie en toegankelijkheid behoudt.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol (Figuur 1A) schetst een 3D-co-kweeksysteem dat is ontworpen om cel-celinteracties te replicituleren over een basale membraanmatrix. Downstreamanalyse is mogelijk met behulp van confocale microscopie (Figuur 1B) of door cellen uit de co-cultuur te oogsten (Figuur 1C). Door gebruik te maken van een 'sandwich'-constructie, waarbij een laag ECM-gel tussen twee celpopulaties wordt geplaatst, vereist het protocol geen gespecialiseerde apparatuur en kan het worden uitgevoerd met basiskennis van moderne celkweektechnieken.

1. 3D Co-cultuurvoorbereiding

OPMERKING: Het beschreven protocol is bedoeld als een representatieve toepassing van de 3D-co-kweekmethode met behulp van 3T3-L1 adipocyten en MDA-MB-231 borstkankercellen. Het gebruik van verschillende celtypen vereist optimalisatie van de celzaaidichtheid en het vooraf testen van ECM-gelpartijen om de effectiviteit te waarborgen. Dit protocol richt zich op het gebruik van een no-adipocyte control en conditioned media-controle. Afhankelijk van het experimentele doel kunnen meer controles nodig zijn.

  1. Celkweek en oplossingsbereiding
    1. Verzamel en vestig culturen van 3T3-L1 pre-adipocyten en MDA-MB-231 borstkankercellijnen. Kweek en onderhoud zelfstandig alle cellen met behulp van aseptische techniek in een klasse II biologische veiligheidskast en standaard adherent celkweekmethoden15. Houd 3T3-L1-cellen in Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM) aangevuld met 10% (v/v) Newborn Calf Serum (NBCS) en 1% penicilline-streptomycine (10.000 U/mL). Houd MDA-MB-231-cellen in RPMI 1640, aangevuld met 10% Fetaal Bovin Serum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (10.000 U/mL).
      OPMERKING: Laat nooit 3T3-L1 cellen meer dan 80% samenvloeien tijdens onderhoud, en gebruik geen culturen na het20e passagegetal.
    2. Verkrijg of bereid een standaardoplossing van 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4.
    3. Bereid 50 mL PBS-glycine wasoplossing door 0,375 g glycine toe te voegen aan 50 mL PBS voor een uiteindelijke glycineconcentratie van 100 mM. Bewaar de oplossing tot 12 maanden op 4 °C.
    4. Bereid 10 mL permeabilisatiebuffer voor door 50 μL Triton X-100 toe te voegen aan 9,5 mL PBS. Vul tot 10 mL voor een uiteindelijke concentratie van 0,5% (v/v) Triton X-100. Bewaar op 4 °C en gebruik het binnen 1 maand.
    5. Bereid 50 mL immunofluorescentie (IF) buffer voor door 50 μg rundserumalbumine (BSA), 100 μL Triton X-100 en 25 μL Tween-20 tot 45 mL PBS toe te voegen. Vul tot 50 mL voor een uiteindelijke concentratie van 0,1% (w/v) BSA, 0,2% (v/v) Triton X-100 en 0,05% (v/v) Tween-20. Bewaar op 4 °C en gebruik het binnen 1 maand.
    6. Bereid 10 mL blokkerende buffer voor door 1 mL dierserum toe te voegen aan 9 mL IF-buffer voor een uiteindelijke concentratie van 10% serum. Bewaar op 4 °C en gebruik het binnen 1 maand.
      OPMERKING: De soortidentiteit van het serum hangt af van de gastsoort van de secundaire fluorescentie-antilichamen die worden gebruikt (zie 2.2.4).
    7. Ontdooi ECM-gel (totale eiwitconcentratie ~9-9,5 mg/mL) bij 4 °C 's nachts. Bereid 500 μL aliquots voor in 1,5 mL microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 °C.
      OPMERKING: ECM-gel is zeer variabel en moet worden geverifieerd om het verwachte gedrag in elk celtype te induceren. Verschillende celtypen kunnen verschillende eiwitconcentraties of matrixstijfheid vereisen.
      OPMERKING: Gebruik altijd voorgekoelde pipettips en -containers bij het hanteren van ECM-gel om polymerisatie bij kamertemperatuur te voorkomen. Houd de ECM-gel altijd op ijs tijdens het hanteren.
  2. Adipocytdifferentiatie
    1. Zaad 50.000 tot 80.000 3T3-L1 pre-adipocyten in 0,5 mL standaard groeimedium in 2 putten van een 4-put kamerslide. De lege putten zullen worden gebruikt voor no-adipocyte en geconditioneerde mediacontroles.
      OPMERKING: Kamerglaascelculturen zijn gevoelig voor mechanische verstoring. Vermijd vacuümaspiratie van media en gebruik een zachte pipettechniek met handmatige pipettoren.
    2. Zaad 50.000 tot 80.000 3T3-L1 pre-adipocyten in 0,5 mL standaard groeimedium in één put van een 24-put weefselkweekplaat. Dit wordt gebruikt om geconditioneerd medium te verzamelen voor de geconditioneerde mediacontrole.
    3. Laat beide culturen 100% samenvloeiing bereiken over 24 uur.
    4. Begin adipogenese door groeimedium te vervangen door adipogenese-initiatiemedium, bestaande uit DMEM aangevuld met 10% FBS, 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) en 1 μM dexamethason. Incubeer de cellen 48 uur bij 37 °C in een 5% CO2-incubator.
    5. Na 48 uur vervangt u het gebruikte medium door een nieuw adipogeneseprogressiemedium, bestaande uit DMEM met 10% FBS en 10 μg/mL insuline. Incubeer cellen nog eens 48 uur bij 37 °C in een 5% CO2-incubator.
    6. Voordat je doorgaat met 3D-co-kweek, bevestig visueel de aanwezigheid van lipidedruppels in >60% van de cellen. Als de ophoping van lipidendruppels traag verloopt, vervang dan progressiemedia door DMEM met 10% FBS en monitor het lipidengehalte elke 24 uur.
  3. Overlay en onderhoud van 3D-cocultuur
    1. Ontdooi ECM-gel bij 4 °C 's nachts voordat je doorgaat met de overlay.
      OPMERKING: Om effecten van lot-to-lot variabiliteit te voorkomen, wordt aanbevolen om dezelfde batch ECM-gel te gebruiken voor alle experimenten binnen één studie.
    2. Na succesvolle differentiatie van 3T3-L1's verwijder je het gebruikte kweekmedium, waardoor er een kleine buffer van ~50 μL medium overblijft.
    3. Voeg voorzichtig 110 μL ECM-gel toe aan elke adipocytenhoudende put van de kamerglaas, waarbij je de adipocytenmonolaag niet verstoort.
      OPMERKING: ECM-gel stolde snel bij kamertemperatuur. Om voortijdige matrixpolymerisatie te voorkomen, bewaar de ECM-gel altijd op ijs en gebruik tips die voorgekoeld zijn bij -20°C.
    4. Voeg 110 μL ECM-gel toe aan de lege no-adipocyte controleput. Om een gelijkmatige verspreiding van matrigel te garanderen, voeg je dropwise toe in de hoeken van de put en in het midden van de put. Gebruik de pipettip om de matrigel voorzichtig over het kweekoppervlak te verspreiden zonder te schrapen.
    5. Incubeer de sparaad 1 uur bij 37 °C zodat de ECM-gel kan polymeriseren.
    6. Tijdens deze incubatiestap verzamel en tel je MDA-MB-231-cellen
      OPTIONEEL: Zie stap 1.4 voor details over het fluorescerend labelen van deze cellen.
    7. Bereid een verdund suspensiemateriaal van MDA-MB-231-cellen met 30.000 cellen/mL in een melkgroeimedium met 2% ECM-gel (v/v).
      OPMERKING: De optimale celzaaidichtheid varieert per celtype en moet worden geoptimaliseerd voordat experimenten plaatsvinden. OPMERKING: Melkgroeimedium is een commercieel verkrijgbaar celkweekmedium dat geoptimaliseerd is voor melkepitheelcellen. Het bevat 0,4% hypofyse-extract van runderen, 10 ng/mL epidermale groeifactor (recombinant mens), 5 μg/mL insuline (recombinant mens) en 0,5 μg/mL hydrocortison. Het co-cultuurmedium moet zorgvuldig worden gekozen om te voldoen aan de behoeften van beide celtypen.
    8. Zodra de ECM-gel is gepolymeriseerd, voeg je voorzichtig 450 μL MDA-MB-231 suspensie toe aan elke put. Dit resulteert in een totaal aantal cellen van 13.500 cellen per put.
      OPMERKING: Een ongelijke overlay van de celsuspensie over de gel is in deze stap mogelijk. Bekijk visueel de zijkanten van de kamer en tik zachtjes op alle kanten van de kamer om het gelijkmatig te verdelen.
    9. Voeg aan de adipocytencultuur op de 24-wellplaat 450 μL melkgroeimedium toe dat 2% ECM-gel bevat (v/v). Oogst en vervang het medium elke 48 uur.
    10. Houd de co-teelt maximaal 5 dagen in stand, met mediawissels elke 48 uur.
      OPMERKING: Vermijd vacuümaspiratie en gebruik zacht pipetteren. Loskoppeling van de ECM-gel is een mogelijk probleem dat kan ontstaan tijdens co-cultuur onderhoud.
    11. Alleen voor de geconditioneerde mediabeheersingsbron verdun de geoogste adipocyt (uit stap 1.3.9) geconditioneerde media 1:1 met verse media voordat je gebruikte co-cultuurmedia op dag 2 en 4 vervangt.
      OPMERKING: Op dit punt is de co-kweekperiode voltooid en moet deze worden geanalyseerd door de culturen te fixeren en te kleuren om morfologie en markerexpressie vast te stellen (zie sectie 2), of door cellen uit de co-cultuuromgeving te halen en cellen voor te bereiden op downstream analyse (zie sectie 3).
  4. Fluorescerende cellabeling (optioneel)
    OPMERKING: Het labelen van overliggende cellen kan worden uitgevoerd vóór stap 1.3.7 om te helpen bij het identificeren van overliggende cellen tijdens immunofluorescentiebeeldopname.
    1. Bereid een 5 mM voorraadoplossing van Carboxyfluoresceine Diacetate Succinimidylester (CFSE) door 10 mg CFSE op te lossen in 4,22 mL DMSO. Bewaar in 500 μL aliquots bij -20 °C, beschermd tegen licht.
    2. Na het tellen van cellen uit stap 1.3.6, was je cellen één keer met 5 mL PBS. Sussen de resulterende pellet opnieuw in 1x PBS tot een uiteindelijke concentratie van 1.000.000 cellen/mL.
    3. Voeg 1 μL 5 mM CFSE per mL celsuspensatie toe om een uiteindelijke werkconcentratie van 5 μM te bereiken. Incubeer de celsuspensie gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
    4. Demp de CFSE-kleuring door 5 volumes kweekmedium toe te voegen. Incubeer nog eens 5 minuten op kamertemperatuur.
    5. Pelletcellen en twee keer wassen met PBS om resterende CFSE te verwijderen. Susselt cellen opnieuw in voorverwarmd melkgroeimedium. Incubeer nog eens 10 minuten op kamertemperatuur om te zorgen dat er geen kleurstof achterblijft.
    6. Zaadcellen fluorescerend gelabeld zoals beschreven in stap 1.3.7. De rest van het protocol kan worden uitgevoerd zoals beschreven.

2. Immunofluorescentie

  1. Fixatie
    OPMERKING: Om depolymerisatie van ECM-gel en verlies van monsters tijdens het wassen te voorkomen, laat alle reagentia voor gebruik tot kamertemperatuur in evenwicht komen.
    1. Na 5 dagen co-cultuur vervang je het medium door 500 μL PBS.
      OPMERKING: Stappen 2.1.2 tot 2.3.7 kunnen worden uitgevoerd onder niet-steriele omstandigheden.
    2. Verwijder PBS en vervang met 2% paraformaldehyde (PFA) in PBS (vers bereid) op kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
      OPMERKING: ECM-gel is gevoelig voor PFA en kan leiden tot loslaten van de gellaag.
      VOORZICHTIG: PFA ontbindt na verloop van tijd tot formaldehyde. Vermijd inademing van dampen, zorg voor voldoende ventilatie en draag altijd de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (zoals handschoenen, labjas, oogbescherming) bij het hanteren van PFA.
    3. Verwijder PFA en spoel de putjes met 500 μL PBS-Glycine wasoplossing gedurende 15 minuten op kamertemperatuur met zachte roering.
      OPMERKING: Het gebruik van PBS-Glycine wash is cruciaal om te voorkomen dat vrije aldehyden achtergrondfluorescentie produceren. Was niet in PBS zonder glycine.
    4. Herhaal stap 2.1.3 twee keer voor in totaal drie wasbeurten. Zie 2.1.5 voor opslagcondities, ga naar stap 2.2.2 als dat niet nodig is.
    5. Op dit punt kan het protocol tot 1 week worden gepauzeerd en kan de dia's worden opgeslagen bij 4 °C. Om de glaasglaas op te slaan, vul je alle putten met 1 ml PBS en sluit je de deksel van de kamerglaasje af met een dun lint parafilm. Plaats de glaasje plat in een lichtdichte verpakking, bovenop een nat, gevoelig weefsel om te voorkomen dat culturen uitdrogen.
  2. Antilichaamkleuring
    1. Breng eerder bewaarde dia's op kamertemperatuur, verwijder PBS en was de putten 15 minuten met 500 μL verse PBS met zachte schudding. Sla deze stap over als je rechtstreeks vanaf stap 2.1.4 doorgaat.
    2. Permeabiliseer cellen met 500 μL permeabilisatiebuffer voor 15 minuten bij kamertemperatuur zonder onrust.
    3. Was wells met 500 μL PBS, met 15 minuten zacht bewegen. Herhaal dit twee keer voor in totaal 3 wasbeurten.
    4. Voeg 500 μL blokkeringsbuffer toe aan elke put en incubeer 1 uur bij kamertemperatuur met zachte schudding.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de bronsoort van het serum in de blokkerende buffer overeenkomt met de gastheer van het secundaire antilichaam. In dit protocol gebruiken we ezelsserum en ezelsecundaire antilichamen.
    5. Verdun de primaire antistoffen van belang in IF-buffer, volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Verwijder de blokkerende buffer en voeg 300 μL verdunde antistofoplossing toe aan elke put.
    6. Sluit de hoes van de kamerdia's af met parafilm en plaats de slide in een lichtdichte container. Broed een nacht uit bij 4 °C met zachte roering.
    7. Was de putten met 500 μL IF-buffer, met 15 minuten zacht bewegen. Herhaal dit twee keer voor in totaal 3 wasbeurten.
    8. Verdun geschikte, fluorescerend gelabelde secundaire antistoffen in IF-buffer, volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Voeg 300 μL secundaire antistofverdunning toe aan elke put en incubeer 1 uur op kamertemperatuur met zachte roering.
      OPMERKING: Vermijd langdurige blootstelling aan licht na deze stap om fotobleaching te beperken.
    9. Herhaal stap 2.2.7.
    10. Verdun een 300 μM standaardoplossing van 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) 1:800 in PBS. Voeg 300 μL toe aan elke put en incubeer 20 minuten op kamertemperatuur, met zachte schudding.
    11. Was cellen met 500 μL PBS gedurende 5 minuten met zachte roering. Herhaal één keer.
  3. Schuifmontage
    1. Verwijder zoveel mogelijk resterende PBS zonder de culturen te verstoren. Vervang het deksel en scheid de kamer van de glazen schuif met het gereedschap van de fabrikant van de kamergeleider.
    2. Met een delicaat taaktpapier veeg je de randen van de glaasje af om resterende PBS te verwijderen zonder de ECM-gel te verstoren.
    3. Spuit langzaam siliconenkit rond de randen van de slede met een spuit en een 18G naald. Laat de siliconen 3 minuten uitharden.
    4. Terwijl de siliconen uitharden, voeg je 1-2 druppels antifade montagemateriaal toe aan elke put. Vermijd bubbels. Als er bubbels ontstaan, gebruik dan een pipet om ze voorzichtig te verwijderen zonder de cultuur te beschadigen.
    5. Nadat de siliconen is uitgehard, laat je voorzichtig een glazen deksel onder een ondiepe hoek zakken. Gebruik een pincet of een pipettip om luchtbellen te verwijderen terwijl de coverslip wordt neergelaten. Gebruik zachte druk om te voorkomen dat de dekmantel breekt.
    6. Plaats de glaap in een lichtdichte bak op kamertemperatuur en laat hem een nacht uitharden. De diparat kan vervolgens worden opgeslagen bij 4 °C en het protocol kan tot 1 week worden gepauzeerd.
      OPMERKING (Optioneel): Om de slides beter te verzegelen, breng je transparante nagellak aan op de randen van de coverslip 1 uur na het coatslippen.
    7. Beeldslides met een confocale fluorescentiemicroscoop met 10-20x vergroting. Leg vijf willekeurige gezichtsvelden vast om operatorbias te minimaliseren.

3. Het oogsten van co-culturen voor downstream analyse

OPMERKING: Het oogsten van cellen of biomoleculen is onverenigbaar met immunofluorescentie. Het wordt aanbevolen om coculturen te kweken die bedoeld zijn voor andere downstream analyses in standaard 24-put kweekschotels met dezelfde celconcentraties en volumes als beschreven in secties 1 en 2.

  1. Celextractie
    1. Verwijder het gebruikte medium en was het goed voorzichtig met ijskoude PBS. Herhaal één keer voor in totaal twee wasbeurten.
    2. Voeg met een breedboring pipettip 1 mL ijskoude celhersteloplossing toe, hierna de terugwinningsoplossing genoemd. Pipetteer voorzichtig op en neer om de ECM-gellaag te verstoren. Breng vloeistof over naar een 1,5 mL microcentrifugebuis.
      OPMERKING: Cell recovery solution is een commercieel verkrijgbare niet-enzymatische oplossing die is ontworpen om cellen die in ECM-gel zijn ingebed voorzichtig te bevrijden. Het is een propriëtaire samenstelling en kan onverenigbaar zijn met bepaalde celtypen. Als alternatief kan enzymatische depolymerisatie van de ECM-gel worden overwogen met milde proteïnasen zoals Dispase of Accutase. Dit vereist 37 °C incubaties samen met optimalisatie van de incubatietijd.
    3. Voeg 250 μL ijskoude terugwinningsoplossing toe aan elke put om eventuele resterende cellen te verzamelen. Overbrengen in de bijbehorende microcentrifugebuis.
    4. Draai de buizen 4-5 keer om te mengen.
    5. Zet de buisjes over op ijs en incubeer 60 minuten met voorzichtige roering. Elke 10 minuten keer de buisjes 2-3 keer om te voorkomen dat de inhoud van de buis bezinkt.
    6. Centrifugebuizen op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C
    7. Controleer de aanwezigheid van een zichtbare celpellet. Verwijder voorzichtig het supernatant en voeg 1 ml ijskoude 1x PBS toe. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Herhaal één keer voor in totaal twee wasbeurten. Verwacht dat de pellet 80-90% van de aanvankelijk gezaaide cellen bevat, waarbij de verhoudingen van elk celtype constant blijven.
      OPMERKING: Op dit punt kan de celpellet worden gelyseerd om eiwit- of nucleïnezuren te verzamelen. Gelyseerde pellets kunnen worden opgeslagen bij -80 °C en het protocol kan 3 maanden worden gepauzeerd. Lysis is niet compatibel met 3.2.
  2. Single-cell suspension voorbereiding
    1. Repusser pellet in 200 μL van 0,25% trypsine-EDTA. Daarna incubeer je bij 37 °C gedurende 3-4 minuten.
    2. Voeg 600 μL complete groeimedium toe om de spijsvertering van trypsine te blusten.
    3. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder supernatant en voeg 500 μL PBS op kamertemperatuur toe.
    4. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal één keer voor in totaal twee wasbeurten.
    5. Repussieve pellet in 80 μL PBS met 0,04% BSA, filtersuspensie met een 40 μm celfilter.
    6. Verdun 5 μL suspensie in 5 μL trypanblauw. Tel cellen en beoordeel de levensvatbaarheid met een hemacytometer. Cellen zijn nu klaar voor downstream analyse.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de effectiviteit van dit protocol aan te tonen voor het bestuderen van de effecten van cel-celinteracties over een basalmembraan, zijn Figuur 2 en Figuur 3 hergebruikt uit een eerdere publicatie (Pallegar et al.16) als representatieve uitkomsten. Figuur 4 en Figuur 5 zijn nieuwe gegevens en zijn gegenereerd om de aanpassingskracht van dit prot...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het ontbreken van complexe cel-celinteracties in traditionele celkweek benadrukt de noodzaak van verbeterde orgaan- en weefselmodellen om medicijnresponsen en ziekteprogressie in vivo nauwkeuriger te bestuderen. De ontwikkeling van 3D-co-kweeksystemen heeft bijgedragen aan het opvullen van deze kloof door studie van de gevolgen van cel-celinteracties mogelijk te maken zonder in vivo studies te hoeven doen 9,12. ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ontwikkeling van de methode werd gedeeltelijk gefinancierd door de Cancer Research Society. GRK werd ondersteund met financiering van de Carol Ann Cole Graduate Studentship van de Canadian Cancer Society via het Cancer Research Training Program van het Beatrice Hunter Cancer Research Institute. PMMB werd ondersteund door de MOBILITAS-programmasubsidie (2024) van het Health Research Institute of the Balearic Islands (IdISBa). Figuur 1 is gemaakt met BioRender.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
24 Well Tissue Culture PlateCorning3524
24 x 60 mm Cover GlassUltident Scientific170-C2460
4% Paraformaldehyde in PBSInvitrogenJ61899.AKVerdund tot 2% in 1x PBS
4-Well Chambered Culture SlidesFalcon354114
Alexa Fluor 647 AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.705-607-003
Bright-Line HemacytometerHausser Scientific3120
CellTrace CFSE Proliferation KitInvitrogenC34570
Cell Recovery SolutionCorning354253
DAPISigma-Aldrich Canada Co.D9542
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, DyLight 594InvitrogenSA5-10168
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647InvitrogenA31573
DMEM/F-12, no phenol redGibco21041025
Dulbecco's Modified Eagle Media, High Glucose, PyruvateGibco11995-065
Fetal Bovine Serum, Canada OriginGibco12483-020
Flowmi Cell Strainers, 40 µMBel-Art136800040
GE Advanced Silicone Window and Door, ClearHenkel International2811093
Goat Polyclonal Anti ZO-1SantaCruz BiotechnologySC8146Primaire antilichaam, niet meer leverbaar
Rat Monoclonal Anti ZO-1SantaCruz BiotechnologySC33725Alternatief primair antilichaam om SC8416 anti ZO-1 te vervangen
Mammary Epithelial Cell Basal MediumPromocellC-21210
Matrigel, Phenol Red-free, Growth Factor Reduced, LDEV-freeCorning356231Eiwitconcentratie: 9-9.6 mg/mL
Mouse Monoclonal Anti-VimentinSigma-Aldrich Canada Co.V2258Primair antilichaam
Newborn Calf Serum, New Zealand OriginGibco16010159
Penicillin-streptomycinGibco15140-122
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4Gibco10010023
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogenP36934
Purified Mouse Anti-E-CadherinBD Biosciences610181Primair antilichaam
Rabbit Polyclonal Anti-Claudin 7AbcamAB27487Primair antilichaam
RPMI 1640, GlutamineGibco11875-093
SupplementMixPromocellC-39115
Trypan Blue Stain (0.4%)Gibco15250-061
Trypsin 0.25%-EDTAGibco25200056

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of medical science: AMS. 14 (4), 910-919 (2018).
  2. Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene expression perturbation in vitro--a growing case for three-dimensional (3D) culture systems. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).
  3. Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  4. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  5. Lagies, S., et al. Cells grown in three-dimensional spheroids mirror in vivo metabolic response of epithelial cells. Communications Biology. 3 (1), 246(2020).
  6. Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism. Developmental Cell. 18 (6), 884-901 (2010).
  7. Su, J., et al. Cell-cell communication: new insights and clinical implications. Signal Transduction and Targeted Therapy. 9 (1), 196(2024).
  8. Anderson, N. M., Simon, M. C. The tumor microenvironment. Current biology: CB. 30 (16), R921-R925 (2020).
  9. Abuwatfa, W. H., Pitt, W. G., Husseini, G. A. Scaffold-based 3D cell culture models in cancer research. Journal of Biomedical Science. 31 (1), 7(2024).
  10. Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7 (1), 45270(2017).
  11. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  12. Leung, C. M., et al. A guide to the organ-on-a-chip. Nature Reviews Methods Primers. 2 (1), 33(2022).
  13. Srivastava, S. K., Foo, G. W., Aggarwal, N., Chang, M. W. Organ-on-chip technology: Opportunities and challenges. Biotechnology Notes. 5, 8-12 (2024).
  14. Gu, P., Xu, A. Interplay between adipose tissue and blood vessels in obesity and vascular dysfunction. Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders. 14 (1), 49-58 (2013).
  15. Noel, V., Berry, M. D. Culture of Adherent Cancer Cell Lines. Cancer Cell Biology: Methods and Protocols. , 19-29 (2022).
  16. Pallegar, N. K., Garland, C. J., Mahendralingam, M., Viloria-Petit, A. M., Christian, S. L. A Novel 3-Dimensional Co-culture Method Reveals a Partial Mesenchymal to Epithelial Transition in Breast Cancer Cells Induced by Adipocytes. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 24 (1), 85-97 (2019).
  17. Martin, T. A., Ye, L., Sanders, A. J., Lane, J., Jiang, W. G. Cancer Invasion and Metastasis: Molecular and Cellular Perspective. Madame Curie Bioscience Database [Internet]. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK164700/ (2013).
  18. Ma, W., Tavakoli, T., Derby, E., Serebryakova, Y., Rao, M. S., Mattson, M. P. Cell-extracellular matrix interactions regulate neural differentiation of human embryonic stem cells. BMC developmental biology. 8, 90(2008).
  19. Kim, Y. J., Lee, H. S., Kim, D., Byun, H. K., Koom, W. S., Koh, W. Bilayer 3D co-culture platform inducing the differentiation of normal fibroblasts into cancer-associated fibroblast like cells: New in vitro source to obtain cancer-associated fibroblasts. Bioengineering & Translational Medicine. 10 (1), e10708(2024).
  20. Sourouni, M., et al. Establishment of a 3D co-culture model to investigate the role of primary fibroblasts in ductal carcinoma in situ of the breast. Cancer Reports. 6 (4), e1771(2023).
  21. Salimbeigi, G., Vrana, N. E., Ghaemmaghami, A. M., Huri, P. Y., McGuinness, G. B. Basement membrane properties and their recapitulation in organ-on-chip applications. Materials Today Bio. 15, 100301(2022).
  22. Xu, K., Buchsbaum, R. J. Isolation of mammary epithelial cells from three-dimensional mixed-cell spheroid co-culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3760(2012).
  23. Ooi, J. Y. Y., Tsang, Y. S., McMahon, L. P., Wong, L. Protocol for in vitro immunofluorescence staining in a Transwell co-culture system. STAR protocols. 6 (4), 104162(2025).
  24. Wallisch, S., et al. Protocol for establishing a coculture with fibroblasts and colorectal cancer organoids. STAR Protocols. 4 (3), 102481(2023).
  25. Ildiz, E. S., Gvozdenovic, A., Kovacs, W. J., Aceto, N. Travelling under pressure - hypoxia and shear stress in the metastatic journey. Clinical & Experimental Metastasis. 40 (5), 375-394 (2023).
  26. Vukicevic, S., Kleinman, H. K., Luyten, F. P., Roberts, A. B., Roche, N. S., Reddi, A. H. Identification of multiple active growth factors in basement membrane Matrigel suggests caution in interpretation of cellular activity related to extracellular matrix components. Experimental Cell Research. 202 (1), 1-8 (1992).
  27. Kozlowski, M. T., Crook, C. J., Ku, H. T. Towards organoid culture without Matrigel. Communications Biology. 4 (1), 1387(2021).
  28. Ahmad, Z., et al. Versatility of Hydrogels: From Synthetic Strategies, Classification, and Properties to Biomedical Applications. Gels. 8 (3), 167(2022).
  29. Jinka, R., Kapoor, R., Sistla, P. G., Raj, T. A., Pande, G. Alterations in Cell-Extracellular Matrix Interactions during Progression of Cancers. International Journal of Cell Biology. 2012, 219196(2012).
  30. Short, A. R., Czeisler, C., Stocker, B., Cole, S., Otero, J. J., Winter, J. O. Imaging Cell-Matrix Interactions in 3D Collagen Hydrogel Culture Systems. Macromolecular Bioscience. 17 (6), (2017).
  31. Zeng, F., Yang, W., Huang, J., Chen, Y., Chen, Y. Determination of the lowest concentrations of aldehyde fixatives for completely fixing various cellular structures by real-time imaging and quantification. Histochemistry and Cell Biology. 139 (5), 735-749 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Three Dimensional Co CultureBasement MembraneIndirect Cell InteractionsCell Cell CommunicationExtracellular MatrixBiomimetic ModelImmunofluorescence AnalysisMorphological ChangesIn Vitro Cell CultureMatrigel Scaffold
Video Coming Soon

Related Articles