Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Dit artikel beschrijft een eenvoudige methode voor de driedimensionale co-cultuur van twee celtypen, gescheiden door een gereconstrueerd basalmembraan, die weinig gespecialiseerde apparatuur vereist en gemakkelijk geanalyseerd kan worden met diverse experimentele technieken.
Driedimensionale (3D) co-cultuur is een snel evoluerende techniek voor onderzoekers die cel-celinteracties nauwkeurig willen bestuderen met behulp van in vitro experimenten. De beperkingen van monolaagcelkweek, waaronder beperkte interacties tussen de cellulaire en extracellulaire omgeving en verstoorde celmorfologie, worden aangepakt door het simuleren van de in vivo cellulaire omgeving. Met behulp van een steiger om structurele ondersteuning te bieden en biologisch actieve extracellulaire matrixcomponenten te bevatten, vertonen 3D-culturen gedragingen en morfologieën die meer overeenkomen met weefsel. Het integreren van meerdere celtypen in dit soort 3D-omgeving maakt het mogelijk om cel-celinteracties binnen een biomimetisch modelsysteem te bestuderen. Er is een breed scala aan 3D-cocultuurtechnologieën ontstaan, elk met zijn eigen voordelen en uitdagingen. Vaak vereisen deze technologieën gespecialiseerde apparatuur, een complexe opstelling of specifieke technische kennis. Daarnaast bestaan er enkele gestandaardiseerde methoden om indirecte cel-celinteracties te bestuderen tussen twee celtypen die gescheiden zijn door een gereconstitueerd basalmembraan. Hier beschrijven we een 3D-co-cultuurmethode die slechts fundamentele technische vaardigheden vereist en die breder toepasbare materialen gebruikt om indirecte cel-celinteracties over een basalmembraan succesvol te reproduceren. Een monolaag van cellen wordt bedekt met een laag extracellulaire matrix, in de vorm van matrigel, en een tweede celtype wordt erbovenop geplaatst. De resulterende co-kweek wordt vijf dagen gehandhaafd, waarna cellen worden geanalyseerd op morfologische veranderingen door immunofluorescentie of uit de co-kweek worden gehaald voor meer gedetailleerde genomische, transcriptomische of proteomische analyses. Dit protocol is ideaal om de impact van cel-cel communicatie op celgedrag te bestuderen wanneer fysiek contact wordt verboden door een basalmembraan. Naarmate onderzoekers blijven kiezen voor meer in vivo-relevante celkweekmethoden, is een gestroomlijnde aanpak noodzakelijk om hoge toegangsdrempels te vermijden.
In vitrocelkweek is een robuuste, snelle en veelgebruikte onderzoeksmethode. Hoewel traditionele celkweekmethoden krachtig zijn, verschillen ze sterk van een in vivo omgeving. De ruimtelijk beperkte aard van monolaagcelkweek leidt tot veranderingen in genexpressie, morfologie en biochemie 1,2,3. Driedimensionale (3D) kweektechnieken pakken dit verschil aan, doordat cellen worden gekweekt in een steiger die de extracellulaire matrix (ECM) simuleert die aanwezig is in organen en weefsels. In 3D-kweek vertonen cellen morfologie....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dit protocol (Figuur 1A) schetst een 3D-co-kweeksysteem dat is ontworpen om cel-celinteracties te replicituleren over een basale membraanmatrix. Downstreamanalyse is mogelijk met behulp van confocale microscopie (Figuur 1B) of door cellen uit de co-cultuur te oogsten (Figuur 1C). Door gebruik te maken van een 'sandwich'-constructie, waarbij een laag ECM-gel tussen twee celpopulaties wordt geplaatst, vereist het protocol geen gespecialiseerde apparatuur en kan het worden uitgevoerd met basiskennis van moderne celkweektechnieken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Om de effectiviteit van dit protocol aan te tonen voor het bestuderen van de effecten van cel-celinteracties over een basalmembraan, zijn Figuur 2 en Figuur 3 hergebruikt uit een eerdere publicatie (Pallegar et al.16) als representatieve uitkomsten. Figuur 4 en Figuur 5 zijn nieuwe gegevens en zijn gegenereerd om de aanpassingskracht van dit prot.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Het ontbreken van complexe cel-celinteracties in traditionele celkweek benadrukt de noodzaak van verbeterde orgaan- en weefselmodellen om medicijnresponsen en ziekteprogressie in vivo nauwkeuriger te bestuderen. De ontwikkeling van 3D-co-kweeksystemen heeft bijgedragen aan het opvullen van deze kloof door studie van de gevolgen van cel-celinteracties mogelijk te maken zonder in vivo studies te hoeven doen 9,12. .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.
De ontwikkeling van de methode werd gedeeltelijk gefinancierd door de Cancer Research Society. GRK werd ondersteund met financiering van de Carol Ann Cole Graduate Studentship van de Canadian Cancer Society via het Cancer Research Training Program van het Beatrice Hunter Cancer Research Institute. PMMB werd ondersteund door de MOBILITAS-programmasubsidie (2024) van het Health Research Institute of the Balearic Islands (IdISBa). Figuur 1 is gemaakt met BioRender.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 24 Well Tissue Culture Plate | Corning | 3524 | |
| 24 x 60 mm Cover Glass | Ultident Scientific | 170-C2460 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Invitrogen | J61899.AK | Verdund tot 2% in 1x PBS |
| 4-Well Chambered Culture Slides | Falcon | 354114 | |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. | 705-607-003 | |
| Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 3120 | |
| CellTrace CFSE Proliferation Kit | Invitrogen | C34570 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich Canada Co. | D9542 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, DyLight 594 | Invitrogen | SA5-10168 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A31573 | |
| DMEM/F-12, no phenol red | Gibco | 21041025 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Media, High Glucose, Pyruvate | Gibco | 11995-065 | |
| Fetal Bovine Serum, Canada Origin | Gibco | 12483-020 | |
| Flowmi Cell Strainers, 40 µM | Bel-Art | 136800040 | |
| GE Advanced Silicone Window and Door, Clear | Henkel International | 2811093 | |
| Goat Polyclonal Anti ZO-1 | SantaCruz Biotechnology | SC8146 | Primaire antilichaam, niet meer leverbaar |
| Rat Monoclonal Anti ZO-1 | SantaCruz Biotechnology | SC33725 | Alternatief primair antilichaam om SC8416 anti ZO-1 te vervangen |
| Mammary Epithelial Cell Basal Medium | Promocell | C-21210 | |
| Matrigel, Phenol Red-free, Growth Factor Reduced, LDEV-free | Corning | 356231 | Eiwitconcentratie: 9-9.6 mg/mL |
| Mouse Monoclonal Anti-Vimentin | Sigma-Aldrich Canada Co. | V2258 | Primair antilichaam |
| Newborn Calf Serum, New Zealand Origin | Gibco | 16010159 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36934 | |
| Purified Mouse Anti-E-Cadherin | BD Biosciences | 610181 | Primair antilichaam |
| Rabbit Polyclonal Anti-Claudin 7 | Abcam | AB27487 | Primair antilichaam |
| RPMI 1640, Glutamine | Gibco | 11875-093 | |
| SupplementMix | Promocell | C-39115 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin 0.25%-EDTA | Gibco | 25200056 |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dit artikel is gepubliceerd
Video binnenkort beschikbaar