Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Kwantitatieve ratiometrische analyse van FRET-gebaseerde biosensoren in Arabidopsis thaliana maakt live-meting van analyten in subcellulaire compartimenten mogelijk

365 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70028

⸱

24 februari 2026

 , 
1Department of Biology, Texas A&M University

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren een protocol voor kwantitatieve analyse van moleculen of ionen in subcellulaire compartimenten van levende cellen met behulp van Förster-resonantie energieoverdracht (FRET)-gebaseerde biosensoren. Het omvat gestandaardiseerde beeldvorming, binaire maskerverwerking en ratiometrische analyse met lineaire regressie toegepast op fosfaat in Arabidopsis thaliana (A. thaliana), maar is breed toepasbaar op andere biosensoren en organismen.

Samenvatting

Fluorescerende biosensoren bieden een niet-invasieve en veelzijdige benadering om dynamische veranderingen in metaboliet- of ionenconcentraties binnen levende cellen te monitoren. Specifiek maken FRET-gebaseerde biosensoren ratiometrische metingen mogelijk die subcellulaire analyteniveaus rapporteren terwijl ze onafhankelijk zijn van de expressieniveaus van de biosensoren. We beschrijven een uitgebreid en gestandaardiseerd protocol voor de kwantitatieve ratiometrische analyse van FRET-gebaseerde biosensoren in planten. Het protocol begeleidt gebruikers bij de voorbereiding van live-monsters, confocale beeldverwerving van donoren, FRET- en acceptorkanalen, binaire maskergeneratie voor subcellulaire interessegebieden, gevolgd door regressie-gebaseerde ratiometrische data-analyse. De primaire output is regressie-gebaseerde ratiometrische uitlezing die kwantitatieve vergelijkingen mogelijk maakt tussen genotypen, weefsels, ontwikkelingsstadia en behandelomstandigheden. Met behulp van de cpFLIPPi-5.3m biosensor voor anorganisch fosfaat als voorbeeld, demonstreren we de meting van anorganische fosfaatniveaus in het chloroplaststroma van A. thaliana. Dit analytische kader is breed toepasbaar op andere FRET-gebaseerde biosensoren en modelsystemen, waardoor precieze ruimtelijke kwantificering van metabolieten en ionen in vivo mogelijk is. Deze strategie levert meetbare inzichten in de subcellulaire dynamiek van metabolieten en ionen, ter ondersteuning van vergelijkingen onder verschillende experimentele omgevingen.

Inleiding

Het monitoren van metaboliet- en ionendynamiek in levende plantencellen is essentieel om te begrijpen hoe metabole routes en signaalnetwerken in ruimte en tijd gecoördineerd zijn om groei en ontwikkeling te ondersteunen 1,2. Cellulaire metabolietniveaus fluctueren snel als reactie op omgevingssignalen zoals nutriëntbeschikbaarheid, lichtintensiteit en stress3. Hiervan is het niveau van anorganisch fosfaat (Pi) bijzonder belangrijk, met sleutelrollen in energieoverdracht, signaaloverdracht en metabole regulatie, maar de subcellulaire dynamiek blijft moeilijkte meten.

Standaard colorimetrische assays en fosfor-31 kernmagnetische resonantie, (³¹P)-NMR, kunnen totale of compartimentele Pi schatten, maar missen enkelcelresolutie en hebben beperkte temporele precisie 5,6. Hoewel synchrotrone röntgenspectrometrie en radiotracerbeeldvorming subcellulaire of fluxinformatie leveren, kunnen ze Pi niet betrouwbaar onderscheiden van gefosforyleerde metabolieten en zijn ze vaak invasief. Niet-waterige fractionering en enzymgebaseerde kinetische assays bieden indirecte schattingen van stromale en cytosolische Pi, maar deze methoden zijn arbeidsintensief en gevoelig voor besmetting 7,8. Samen onderstrepen deze beperkingen de noodzaak van niet-destructieve methoden met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie voor het monitoren van metabolieten zoals Pi, zoals live beeldvorming van FRET-gebaseerde biosensoren.

Genetisch gecodeerde, op FRET gebaseerde biosensoren zijn krachtige hulpmiddelen voor in vivo analyses van intracellulaire ionen- en metabolietdynamiek. Vroege studies toonden het nut van dergelijke biosensoren aan bij het monitoren van glucose-, sucrose- en ATP-concentraties in cellen 9,10,11. Meer recente ontwikkelingen hebben deze benadering uitgebreid om calcium, nitraat, fosfaat, auxine, abscisinezuur en gibberelline te monitoren, wat waardevolle inzichten biedt in de regulatie van voedingsstoffen en hormonen 12,13,14,15,16.

cpFLIPPi-5.3m is een op FRET gebaseerde Pi-biosensor die geoptimaliseerd is om subcellulaire Pi-niveaus in plantcellen17 te monitoren. Deze biosensor bestaat uit een cyanobacterieel Pi-bindend eiwit, geflankeerd door een FRET-donor (eCFP, versterkt cyaanfluorescend eiwit) en een FRET-acceptor (cpVenus, een gemodificeerde variant van het Venusgele fluorescerende eiwit), en ondergaat een conformationele verandering bij Pi-binding. Deze verandering verandert het Pi-afhankelijke FRET-afgeleide fluorescentiesignaal, dat wordt vastgelegd door confocale beeldvorming, zodat een toename van de Pi-concentratie resulteert in een lagere FRET/donorverhouding. Pi-afhankelijke ratiometrische analyse wordt uitgevoerd tijdens de nabewerking van beelden door de intensiteiten van de acceptor en donoremissies18 te vergelijken.

Kwantitatieve ratiometrische FET-analyse in levend plantweefsel vereist correctie voor spectrale doorbloeding en kruisexcitatie van respectievelijk de donor (CFP) en acceptor (cpVenus) fluoroforen18. Doorbloeding ontstaat wanneer CFP-emissie wordt gedetecteerd in het FET-kanaal, terwijl kruisexcitatie het gevolg is van excitatie van cpVenus tijdens CFP-excitatie. Deze spectrale artefacten kunnen variëren tussen cellen en subcellulaire compartimenten, met name in gepigmenteerde plantweefsels, en verstoren daarom ratiometrische metingen. Om gecorrigeerde of sensitieuze FRET-emissie te verkrijgen, worden door- en kruisexcitatiebijdragen als volgt van het ruwe FRET-signaal afgetrokken:

Sensitized FRET emissie = Raw FRET emissie - doorbloeding - kruisexcitatie

Correctiefactoren voor doorbloeding en kruisexcitatie worden bepaald door planten te beelden die afzonderlijk CFP of cpVenus expresseren op dezelfde cellulaire en subcellulaire locaties als biosensor18. Gesensibiliseerde RET-emissie wordt vervolgens als volgt berekend:

Sensitized FRET emissie = Raw FRET emissie - (CFP-emissie × doorloopcorrectiefactor) - (cpVenus-emissie × kruisexcitatiecorrectiefactor)

De verhouding van sensitieuze FET-emissie tot donoremissie (FRET-ratio) geeft relatieve veranderingen in ligandconcentratie aan en is onafhankelijk van biosensorexpressieniveaus19.

De cpFLIPPi-5.3m biosensor is met succes gericht op verschillende subcellulaire compartimenten van A. thaliana en andere soorten, waardoor de visualisatie van Pi-dynamicamogelijk is. Deze biosensor onthulde heterogeniteit in cytosolische Pi-distributie en -transport tussen weefsels en heeft chloroplaststromale Pi-fluctuaties gekoppeld aan transporteractiviteit en fotosynthetische prestaties20,21. Omdat de biosensor veranderingen rapporteert binnen een gedefinieerd dynamisch bereik, vereist interpretatie dat het bereik in vivo Pi-niveaus omvat onder stabiele beeldvormingsomstandigheden. Ongelijkmatige verlichting of zeer lage biosensor-abundantie kan ratiometrische metingen beïnvloeden, wat het belang benadrukt van gestandaardiseerde acquisitie-instellingen en passende negatieve regelaars zoals de Pi-ongevoelige bedieningssensor20. Wanneer de variatie in de FET-ratio tussen interessegebieden (ROI's) minimaal is, is regressieanalyse mogelijk niet passend en wordt het poolen van ROI-gemiddelden aanbevolen.

In dit artikel presenteren we een gedetailleerd protocol voor kwantitatieve ratiometrische analyse van cpFLIPPi-5.3m in A. thaliana, inclusief confocale beeldvorming, beeldsegmentatie met behulp van binaire maskers en FET-ratioberekeningen voor dynamische monitoring van Pi in levende cellen. Deze methode biedt een reproduceerbare workflow voor het analyseren van FRET-gebaseerde biosensorsignalen, waarbij ratiometrische gegevens worden geanalyseerd met lineaire regressie en statistische vergelijkingen over experimentele omstandigheden. Representatieve gegevens worden getoond met behulp van de ophoping van gealterde chloroplaststroma Pi in pht2; 1, een chloroplast Pi-transportermutant die de cpFLIPPi-5.3m sensor21,23 uitdrukt. Dit protocol helpt onderzoekers om FRET-gebaseerde ratiometrische beeldvorming toe te passen op andere experimentele systemen door biosensorspectrale correcties, beeldvormingsinstellingen en kwantitatieve analysestappen te beschrijven. Door beeldverwerving en regressie-gebaseerde analyse te standaardiseren binnen gedefinieerde experimentele contexten, ondersteunt de workflow consistente vergelijking van FRET-antwoorden over monsters die onder gelijke omstandigheden zijn geanalyseerd. Het is geschikt voor degenen die snelle en compartimentspecifieke veranderingen in analyteniveaus in levende plantweefsels willen meten, inclusief mutanten of transgene lijnen met veranderd metaboliettransport of metabolisme. Deze gestandaardiseerde aanpak zal de reproduceerbaarheid van kwantitatieve live-celbeeldvormingsstudies in de plantbiologie vergemakkelijken. Naast de hier beschreven chloroplastgelokaliseerde Pi-biosensing kan de analytische strategie worden aangepast aan andere FRET-gebaseerde biosensoren en organisme-specifieke weefsels, mits biosensor-specifieke kalibratie- en controlemetingen worden vastgesteld.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Arabidopsis transgene lijnen die cpFLIPPi-5.3m en cpFLIPPi-null (cytosolische en plastide gerichte varianten) tot expressie brengen, werden eerdergegenereerd met 17,18 en pht2; 1-1 (CS19883) werd verkregen van het Arabidopsis Biological Resource Center, MS medium, afdekglazen, perfluorodecaline, confocale microscoop en een 40x olie-immersieobjectief (numerieke apertuur 1,3), excitatielasers (CFP/445 nm en cpVenus/515 nm of instrument-geschikte emissiegolflengten), emissiefilters voor CFP, cpVenus/FRET, en cpVenus-acceptor, camera of detectoren, beeldanalysewerkstation, FIJI24 en Excel.

1 . Monstervoorbereiding

  1. Generatie van transgene A. thaliana-lijnen
    1. Klon de cpFLIPPi-5.3m biosensor en Pi-insensitive control (cpFLIPPi-Null), donor-only (CFP) en acceptor-only (cpVenus) controles in plantexpressievectoren17.
    2. Voor stabiele expressie transformeer A. thaliana-planten in de sgs3-13 mutante achtergrond via Agrobacterium tumefaciens floral dip, oogst T1-zaden en selecteert transformanten op 0,5x Murashige & Skoog (MS) agarplaten met het juiste selectiemiddel, bijvoorbeeld fosfinotricine (10 μg/mL).
    3. Steriliseer A. thaliana-zaden die de biosensoren uitdrukken door ze 1 minuut onder te dompelen in 70% ethanol, 1 minuut over te steken naar 50% bleekmiddel, en spoel daarna 6-10 keer af met steriel water.
      VOORZICHTIG: Ethanol en bleekmiddel zijn irriterende stoffen en moeten worden behandeld terwijl ze passende persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) dragen. Voer zaadsterilisatie uit in een chemische dampkap of goed geventileerde ruimte om inademing van dampen te voorkomen en meng nooit direct bleekmiddel en ethanol. Verwijder afvaloplossingen volgens de institutionele richtlijnen voor chemische veiligheid.
    4. Stratificeer zaden bij 4°C in het donker gedurende 2-3 dagen om de kieming te synchroniseren, en breng vervolgens zaden over in agar-gestolde of vloeibare 0,5x MS medium met 0,25% sucrose en de gewenste Pi-concentratie (250 μM) voor het experimentele ontwerp. Neem de selectieagent op bij het selecteren van transformanten.
    5. Platen overbrengen naar een gecontroleerde groeikamer ingesteld op 21°C, 16 uur licht: 8 uur donkere fotocyclus, 120 μmol·m⁻²·s⁻¹ lichtintensiteit en ~60% relatieve luchtvochtigheid. Kweek zaailingen 4-7 dagen om wortels te fotograferen of zet zaailingen 21 dagen in de grond om bladeren te fotograferen.
    6. Bij het testen van Pi-behandelingen, plaats je zaailingen in het gewenste Pi-medium (bijv. 250 μM Pi voor Pi replete; 10 μM Pi voor Pi-deficient) en houd de behandeling vol gedurende de gedefinieerde periode (bijv. 48 uur bij acute Pi-deprivatie).
    7. If possible, screen plants for adequate sensor expression by imaging for donor or acceptor fluorescence (low-intensity excitation) using a fluorescence stereo microscope (7-‬10x magnification).
    8. Evalueer lijnen in dezelfde genetische achtergrond die cpFLIPPi-nul uitdrukken als ligandengevoelige controlegroepen.

2 . Confocale beeldvorming

  1. Voor wortels kun je zaailingen in hun groeimedium/steriel water op een glazen glijbaan plaatsen. Bedek voorzichtig met een kleine deklaag om de wortels glad te maken zonder compressie. Beeld direct.
  2. Voor bladeren verwijder je het doelblad (bijvoorbeeld het derde of vierde blad bij 21 dagen oude planten) en plaats je het adaxiale oppervlak naar beneden in een dia.
  3. Infiltreer met 10-15 μL perfluorodecaline om luchtruimtes te reinigen indien nodig, en bedek voorzichtig met een klein glasgewicht om het monster plat te maken. Beeld direct.
  4. Gebruik een objectief met een hoge NA-waarde die geschikt is voor levende cellen (bijv. 40× / 1,2-1,3 NA). Gebruik hetzelfde doel voor alle monsters om de vergelijkbaarheid te behouden.
  5. Met behulp van de Metamorph-software stelt u de excitatie- en emissiekanalen in en maakt u beelden (Figuur 1).
    OPMERKING: Voor het opvangen van de Donor (CFP) emissie: excitatie bij ~445 nm (of instrument-geschikte CFP-lijn) en het verzamelen van donoremissie (bijv. 470-500 nm bandpas) kunnen worden gebruikt. Zo werd bijvoorbeeld excitatie van de 445 nm laser bij 70% (Figuur 1A) met een belichtingstijd van 1000 ms (Figuur 1B) gebruikt om de CFP-emissie vast te leggen. Voor het opvangen van de FRET (sensitized acceptor emission): excitatie bij donorgolflengte (445 nm) en verzameling van de acceptoremissieband (bijv. 530-560 nm). Voor het opvangen van het directe acceptorkanaal: excitatie bij acceptorexcitatie (bijv. 500-515 nm) en verzameling van dezelfde acceptoremissieband als bij FRET.
  6. Verzamel beelden achtereenvolgend: neem donorexcitatie/donoremissie vast, donorexcitatie/FRET emissie, daarna acceptorexcitatie/acceptoremissie. Houd de beeldtijd per veld kort om fotobleaching te beperken (500-1000 ms).
    OPMERKING: Voor elke cellulaire locatie (wortelcytosol, bladmesofylcytosol, chloroplaststroma) bepaal je het optimale laservermogen, detectorversterking en belichtingstijd (Figuur 1) zodanig dat de gemiddelde pixelintensiteiten boven de lokale achtergrond liggen maar onder de detectorverzadiging. Houd identieke opname-instellingen voor donor-excitatiekanalen (donor en FRET) voor een bepaalde locatie. Beeldvormingsparameters zijn afhankelijk van het monster, de microscoop, de lichtbron en het detectiesysteem, en moeten daarom empirisch worden bepaald, met acceptabele bereiken die worden geëvalueerd en gedocumenteerd via regressieanalyse zoals beschreven in dit protocol. De hier gebruikte beeldopnamesoftware is Metamorph versie 7.
  7. Gebruik dezelfde detectorgevoeligheid (bijvoorbeeld hier, versterking van 2,4x en nul offset) voor alle beelden voor een doellocatie. Als je meerdere detectoren gebruikt, karakteriseer dan de spectrale responsen voor elke detector en documenteer deze daarmee.
  8. Maak controlebeelden voor elk weefsel/genotype van interesse.
    1. Beeld ongetransformeerd wildtypeweefsel af om achtergrondautofluorescentie voor elk kanaal te bepalen.
    2. Beeld planten die donor-only (CFP) en acceptor-only (cpVenus) uitdrukken op dezelfde opname-instellingen voor elke locatie om spectrale correctiecoëfficiënten af te leiden (doorbloeding en kruisexcitatie). Maakt beelden van meerdere individuen (≥6-8) met een bereik van emissieintensiteiten.

3 . Beeldverwerking

  1. Open de ruwe beelden van donor-excitatie (aangeduid als CC voor donorexcitatie/emissie), FRET (CY genoemd voor donorexcitatie/acceptoremissie) en acceptorkanalen (aangeduid als YY voor acceptorexcitatie/emissie) kanalen in analysesoftware zoals FIJI of ImageJ. (Figuur 2).
  2. Bepaal de gemiddelde achtergrondintensiteit per kanaal door meerdere (5-10) ROI's op equivalente locaties te bemonsteren van niet-getransformeerde planten die met dezelfde instellingen zijn afgebeeld. Trek de gemiddelde achtergrondwaarde af van elk overeenkomstig kanaalbeeld.
  3. Stappen om te volgen in FIJI
    1. Klik op Tabblad Analyseren> Instellen Metingen > Selecteer gemiddelde grijswaarde. Meet de intensiteit van de achtergrond door een specifieke ROI of een gemiddelde van het hele beeld te kiezen.
    2. Klik op het tabblad Analyseren> Meten. Sla de waarden op in een Excel-spreadsheet en bereken de gemiddelde achtergrondwaarden voor elk kanaal. Drempel het donorbeeld (CFP) om de biosensor-ruimtelijke grens te definiëren (donor heeft doorgaans het laagste signaal). Converteer het drempeldonorbeeld naar een binair masker (Figuur 3 A).
    3. Klik op tabblad afbeelding> pas aan> drempel.
    4. Er zal een venster voor drempel opengaan. Kies de methode Max Entropy voor het bepalen van de drempel. Stel de ruimtelijke grens vast, in dit geval het chloroplaststroma, en pas de drempel toe. Dit genereert een zwart-wit binair beeld (Figuur 3 B).
    5. Klik op Tab Wiskunde> Divide> Voer waarde 255 in. Het beeld wordt helemaal wit. Sla deze binaire maskerafbeelding op als een .tiff bestand.
    6. Vermenigvuldig het binaire masker met alle drie de achtergrondafgetrokken afbeeldingen om gemaskeerde afbeeldingen te maken voor analyse (Figuur 3C).
    7. Open het binaire maskerbestand in FIJI.
    8. Klik op tabblad Proces> Wiskunde>Vermenigvuldigen.
    9. Kies het binaire masker als een van de afbeeldingen en de achtergrond-afgetrokken CC-afbeelding als de andere.
    10. Herhaal de stappen voor CY en YY.
    11. Teken ROI's op de gemaskeerde beelden die passen bij de bestudeerde structuur (hele cel, cytosol, chloroplaststromaal). Voor elke ROI extraheren we de gemiddelde pixelintensiteiten voor donor-, FRET- en directe acceptorkanalen. Bewaar ROI-metadata (afbeeldingsnaam, coördinaten, experimentele conditie, replicat-ID) voor downstream statistische analyse.
    12. Open CC-, CY- en YY-afbeeldingen.
    13. Klik op Tab Wiskunde> Trek af> voer gemiddelde achtergrondwaarde in. Dit kan ook gebeuren vlak voordat de sensitized FRET in Excel wordt berekend.
    14. Open het gemaskeerde CC-bestand.
    15. Klik op Tab Process > Afbeeldingscalculator. Vermenigvuldig CC met het gemaskeerde CC-afbeeldingsbestand. Dit opent een nieuw 32-bits afbeeldingsbestand.
    16. Teken ROI's met de juiste FIJI-tools in de hoofdtaakbalk. Hier wordt bijvoorbeeld het chloroplaststroma geselecteerd met het "Oval" ROI-instrument. Voeg de ROI's toe aan een ROI-manager (ctrl+T). Kies 5-10 ROI's per afbeelding. Vink "Toon alles". Deze ROI's kunnen worden opgeslagen als een apart metabestand (Figuur 3D). Sluit de ROI-manager niet.
    17. Klik op Tab Analyseren> Stel metingen in> Selecteer gemiddelde grijswaarde.
    18. Klik op "Meten" in de ROI-manager.
    19. De gemiddelde pixelwaarden van de gekozen ROI's verschijnen als een lijst in een apart venster.
    20. Kopieer deze gegevens naar Excel. Sluit de ROI-manager niet.
    21. Herhaal de vermenigvuldiging van het gemaskeerde CC-bestand met de CY- en YY-afbeeldingen om metingen van dezelfde ROIs te verkrijgen met de ROI-manager in elk afzonderlijk kanaal. Sla de waarden op in Excel.

4. Ratiometrische analyse

  1. Open Microsoft Excel om de volgende bewerkingen uit te voeren (Figuur 4).
  2. Berekening van de correctiecoëfficiënten.
    1. Voor elke cellulaire locatie wordt de intensiteiten van het FRET-kanaal (Y-as) van donor-only planten uitgezet tegen donorintensiteiten (X-as). Pas een lineaire regressie aan. De helling is de donor-doorloopcoëfficiënt (aangeduid als a).
    2. Herhaal door de intensiteiten van het FRET-kanaal van alleen acceptor-installaties (Y-as) te plotten tegen directe acceptorintensiteiten (X-as). De helling is de acceptor-kruisexcitatiecoëfficiënt (aangeduid als b).
    3. Gebruik ≥15-20 ROI's van meerdere installaties om robuuste coëfficiënten te verkrijgen. Voor het chloroplaststroma worden 50-60 chloroplasten gekozen.
  3. Bereken de gesensibiliseerde FRET voor elke ROI als
    Sensibiliseerde FRET = Rauwe FRET - (een × donor) - (b × acceptor)
    waarbij a en b locatie-specifieke coëfficiënten zijn die hierboven zijn afgeleid (Figuur 4).
  4. Plot gesensibiliseerde FRET (Y-as) versus donorkanaalintensiteiten (X-as) voor gepoolde ROI's. Fit een lineaire regressie en Excel zal een fit bieden in het formaat y = mx + c, waarbij y overeenkomt met de gevoelig geïnsitieerde RET-intensiteiten, x met de donorintensiteiten, c met het y-interceptie, en m met de helling van de regressie. Let op R² voor de aangepaste regressies. Typisch varieert R² van 0,8-1, wat een goede fit vertegenwoordigt (Figuur 4).
  5. Voor cytosolische en stromale metingen wordt de helling van FRET/donor (Sensitized FRET ÷ donor) berekend en gebruikt als de ratiometrische uitlezing, ook wel de FRE-verhouding genoemd.
    OPMERKING: De fout van de fit voor de regressie vertegenwoordigt de standaardfout van de helling (gebruik de LINESS-functie in Excel). Gebruik locatie-specifieke selectie consequent over de monsters en genotypen van interesse. Lineaire regressie toegepast op gegevens van meerdere ROI's en onafhankelijke installaties bevestigt dat de FET-ratio onafhankelijk is van de sensorabundantie.
  6. Kalibratie, besturing en het onderscheiden van niet-specifieke effecten.
    1. Gebruik cpFLIPPi-null (liganden-gevoelige variant) parallel uitgedrukt en identiek verwerkt om mogelijke niet-specifieke veranderingen in RET-verhouding (pH, ionensterkte, fotofysica) te onderscheiden van Pi-specifieke veranderingen.
    2. Aggregeer ROI-niveau gegevens met velden: genotype, compartiment, replicate plant ID, ROI ID, donor, acceptor, ruwe FRET, sensitized FRET, fitted ratio (indien van toepassing). Behoud de rauwe intensiteit.
    3. Voor populatievergelijkingen gebruik je de regressie-afgeleide hellingen als primaire statistieken; rapporteer hellingen ± SE en % relatieve fout.
    4. Pas passende inferentiele statistieken toe (bijv. Student's t-test of ANOVA) op regressie-afgeleide parameters. Gebruik niet-parametrische tests als verdelingen de normaliteit schenden. Corrigeer meerdere vergelijkingen waar van toepassing.
  7. Kwaliteitscontrolechecklist (voordat data wordt geaccepteerd)
    1. Controleer dat alle drie de kanalen voor elk beeld onder de detectorverzadiging liggen en een adequate signaal-ruisverhouding hebben (>2-10x achtergrond).
    2. Bevestig dat donor- en acceptor-single-fluorofoorcontroles op identieke instellingen zijn afgebeeld en lineaire relaties opleverden voor het afleiden van correctiecoëfficiënten a en b.
    3. Bevestig dat de beeldregistratie nauwkeurig is en dat maskers de biosensor-bevattende gebieden correct definiëren.
    4. Bevestig dat cpFLIPPi-null control verwacht ontbreekt aan Pi-gevoeligheid.
  8. Representatieve kwaliteitscontrole-metrics om te helpen bij het uitsluiten van beelden
    1. Verzadigingssnelheid: Minder dan 1-2% van de pixels bereikt de maximale intensiteit (65.535) voor 16-bits afbeeldingen.
    2. Achtergrondniveau: De gemiddelde intensiteit in celvrije gebieden varieert van ~50-200 eenheden.
    3. Pixelintensiteitsbereik: De gemiddelde intensiteiten liggen ruim boven de achtergrond, maar blijven onder de verzadiging (~2.000-20.000 eenheden).
    4. Signaal-ruisverhouding (SNR): Waarden moeten boven de 2-10 uitkomen.

5. Statistische test voor het verschil tussen twee regressiehellingen

  1. Bepaal of twee hellingen (regressie-afgeleide FRET-ratio-hellingen van twee genotypen of behandelingen) significant verschillen25.
  2. Bereken de teststatistiek en vrijheidsgraden als volgt
    figure-protocol-1
    met vrijheidsgraden df = n1 + n2 - 4. m1 en m2 komen overeen met de hellingen uit lineaire regressie, sb1 en sb2 verwijzen naar de standaardfout van elke helling (verkrijgen uit LINEST of regressie-output) en n1 en n2 zijn de steekproefgroottes (aantal ROI's dat wordt gebruikt om bij elke regressie te passen).
  3. Verkrijg een tweezijdige p-waarde voor t met df (bijvoorbeeld gebruik een t-verdelingstabel of een online calculator26). Bij gebruik van de online calculator (Figuur 5C) voer je de sb1 en sb2 en n1 en n2 in die in de vorige stap verkregen zijn om de p-waarde en teststatistieken te berekenen.
  4. De interpretatie zal zijn om de nulhypothese (hellingen verschillen niet significant) te verwerpen als p < α (bijv. α = 0,05). Rapporteer b1, b2, sb1, sb2, t, df en p.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Confocale beeldvorming

Met behulp van confocale microscopie en Metamorph-software werden aparte kanalen verkregen om de FRET donor- en acceptorsignalen in A. thaliana bladweefsels van wildtype (WT) en de pht2 te visualiseren; 1 chloroplast Pi-transportermutant (Figuur 2). Representatieve afbeeldingen illustreren duidelijke subcellulaire lokalisatie van de Pi-biosensor, waarbij chloroplasten gemak...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol biedt een gestandaardiseerde benadering voor de kwantificatie van metabolieten of ionen in levende cellen met behulp van FRET-gebaseerde biosensoren. Belangrijke voordelen zijn niet-invasieve ratiometrische meting en toepasbaarheid op meerdere subcellulaire compartimenten 17,20,21,22. Het gebruik van binaire maskers en lineaire regressie verbetert ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs geven geen belangenconflicten aan met betrekking tot dit werk.

Dankbetuigingen

Wij erkennen de bijdragen van voormalige leden van het W.K.V.-lab, wier inspanningen de ontwikkeling van dit protocol hebben ondersteund. Financiële steun werd geleverd door het Amerikaanse ministerie van Energie, Office of Science, Bioimaging Technology Program (DE-SC0014037) en Basic Energy Sciences (DE-FG02-04ER15559). A.S.R. werd deels ondersteund door fondsen van het Hagler Institute for Advanced Study, Texas A&M University.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
40X olie-onderdompeling objectief Olympushttps://www.edmundoptics.in/p/olympus-uplxapo-40x-oil-immersion-objective/55558/?srsltid=AfmBOoo0cqmgz7SoQ3ZCUvlJn_LeA37O42aX5BbFqF76k40CwQLNVn4PObjectieflens voor beeldvorming 
Dekglasjes / dekglasjesVWR48393-081Dekglasje voor monsterplaatsing
FIJI (ImageJ)Open source2.9.0Beeldanalysesoftware
Omgekeerde Olympus IX81 microscoopOlympushttp://www.olympusconfocal.com/brochures/pdfs/ix81.pdfConfocale beeldvormingssysteem
iXon3 897 EMCCD-camera Andor Technologyhttps://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-camera-series/ixon-life-897Onderdeel van confocale beeldvormingssysteem
MetaMorph software V7Molecular Devices.LLCVersie 7Beeldanalysewerkstation
Microsoft Excel Microsoft Suitev16.68Software voor gegevensanalyse
Murashige & Skoog (MS) medium CaissonMSP11-10LTPlantengroeimedium
Perfluorodecalin (Acros Organic)Acros OrganicsP9900-25GBeeldvormingsmedium
FosfinotricineSigma77182-82-2Antibioticum
PlantengroeikamerraamConvironAangepastGroeikamerraam
Yokogawa CSU-X1 spinning disk confocal unitYokogawahttps://www.yokogawa.com/solutions/products-and-services/life-science/spinning-disk-confocal/csu-x1-confocal-scanner-unit/Onderdeel van confocale beeldvormingssysteem

Referenties

  1. Frommer, W. B., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Genetically encoded biosensors based on engineered fluorescent proteins. Chem Soc Rev. 38 (10), 2833-2841 (2009).
  2. Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative imaging with fluorescent biosensors. Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).
  3. Sweetlove, L. J., Fernie, A. R. The role of dynamic enzyme assemblies and substrate channelling in metabolic regulation. Nat Communications. 9 (1), 2136(2018).
  4. Plaxton, W. C., Tran, H. T. Metabolic adaptations of phosphate-starved plants. Plant Physiol. 156 (3), 1006-1015 (2011).
  5. Mimura, T. Regulation of phosphate transport and homeostasis in plant cells. Int. Rev. Cytol. 191, 149-200 (1999).
  6. Roberts, J. K., Wemmer, D., Ray, P. M., Jardetzky, O. Regulation of cytoplasmic and vacuolar pH in maize root tips under different experimental conditions. Plant Physiol. 69 (6), 1344-1347 (1982).
  7. Gerhardt, R., Heldt, H. W. Measurement of subcellular metabolite levels in leaves by fractionation of freeze-stopped material in nonaqueous media. Plant Physiol. 75, 542-547 (1984).
  8. Farquhar, G. D., Caemmerer, S. V., Berry, J. A. A biochemical model of photosynthetic CO2 assimilation in leaves of C3 species. Planta. 149 (1), 78-90 (1980).
  9. Deuschle, K., Chaudhuri, B., Okumoto, S., Lager, I., Lalonde, S., Frommer, W. B. Rapid metabolism of glucose detected with FRET glucose nanosensors in epidermal cells and intact roots of Arabidopsis RNA-silencing mutants. Plant Cell. 18 (9), 2314-2325 (2006).
  10. Fehr, M., Takanaga, H., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. Evidence for high-capacity bidirectional glucose transport across the endoplasmic reticulum membrane by genetically encoded fluorescence resonance energy transfer nanosensors. Mol Cell Biol. 25 (24), 11102-11112 (2005).
  11. Imamura, H., Nhat, K. P. H., Togowa, H., Noji, H. Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (37), 15651-15656 (2009).
  12. Lanquar, V., Grossman, G., Vinkenborg, J. L., Merkx, M., Thomine, S., Frommer, W. B. Dynamic imaging of cytosolic zinc in Arabidopsis roots combining FRET sensors and RootChip technology. New Phytol. 202 (1), 198-208 (2014).
  13. Sadoine, M., De Michele, R., Župunski, M., Grossmann, G., Castro-Rodríguez, V. Monitoring nutrients in plants with genetically encoded sensors: achievements and perspectives. Plant Physiol. (1), 195-216 (2023).
  14. Tagliani, A. AuxSens, a FRET-based auxin biosensor. Mol Plant. 14 (7), 1051-1052 (2021).
  15. Rowe, J., Grangé-Guermente, M., Exposito-Rodriguez, M. Next-generation ABACUS biosensors reveal cellular ABA dynamics driving root growth at low aerial humidity. Nat Plants. 9 (7), 1103-1115 (2023).
  16. Rowe, J. H., Rizza, A., Jones, A. M. Quantifying Phytohormones in vivo with FRET Biosensors and the FRETENATOR Analysis Toolset. Meth Mol Biol. 2494, 239-253 (2022).
  17. Mukherjee, P., Banerjee, S., Wheeler, A., Ratliff, L. A., Irigoyen, S., Garcia, L. R., Lockless, S. W., Versaw, W. K. Live imaging of inorganic phosphate in plants with cellular and subcellular resolution. Plant Physiol. 167 (3), 628-638 (2015).
  18. Banerjee, S., Garcia, L. R., Versaw, W. K. Quantitative imaging of FRET-based sensors for cell and organelle-specifc analyses in plants. Microsc Microanal. 22, 300-310 (2016).
  19. Xia, Z., Liu, Y. Reliable and global measurement of fluorescence resonance energy transfer using fluorescence microscopes. Biophys J. 81 (4), 2395-2402 (2001).
  20. Sahu, A., Banerjee, S., Raju, A. S., Chiou, T., Garcia, L. R., Versaw, W. K. Spatial profiles of phosphate in roots indicate developmental control of uptake, recycling, and sequestration. Plant Physiol. 184 (4), 2064-2077 (2020).
  21. Raju, A. S., Kramer, D. M., Versaw, W. K. Genetically manipulated chloroplast stromal phosphate levels alter photosynthetic efficiency. Plant Physiol. 196 (1), 385-396 (2024).
  22. Zhang, S., Daniels, D. A., Ivanov, S., Jurgensen, L., Müller, L. M., Versaw, W. K., Harrison, M. J. A genetically encoded biosensor reveals spatiotemporal variation in cellular phosphate content in Brachypodium distachyon mycorrhizal roots. New Phytol. 234 (5), 1817-1831 (2022).
  23. Versaw, W. K., Harrison, M. J. A chloroplast phosphate transporter, PHT2;1, influences allocation of phosphate within the plant and phosphate-starvation responses. Plant Cell. 14 (8), 1751-1766 (2002).
  24. Schindelin, J., Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., Preibisch, S., Rueden, C., Saalfeld, S., Schmid, B., Tinevez, J., White, D. J., Hartenstein, V., Eliceiri, K., Tomancak, P. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Cohen, J. Applied multiple regression/correlation analysis for the behavioral sciences. , https://psycnet.apa.org/record/2002-18109-000 (2003).
  26. Soper, D. S. Significance of the difference between two slopes calculator. , https://www.danielsoper.com/statcalc (2025).
  27. Castellani, C. M., Torres-Ocampo, A. P., Breffke, J., White, A. B., Chambers, J. J., Stratton, M. M., Maresca, T. J. Live-cell FLIM-FRET using a commercially available system. Meth Cell Biol. 158, 63-89 (2020).
  28. Kanno, S., Cuyas, L., Javot, H., Bligny, R., Gout, E., Dartevelle, T., Hanchi, M., Nakanishi, T. M., Thibaud, M. C., Nussaume, L. Performance and limitations of phosphate quantification: guidelines for plant biologists. Plant and Cell Physiol. 57 (4), 690-706 (2016).
  29. Verma, A. K., Noumani, A., Yadav, A. K., Solanki, P. R. FRET based biosensor: principle applications recent advances and challenges. Diagnostics. 13 (8), 1375(2023).
  30. Banerjee, S., Versaw, W. K., Garcia, L. R. Imaging cellular inorganic phosphate in Caenorhabditis elegans using a genetically encoded FRET-based biosensor. PLoS One. 10 (10), e0141128(2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

FRET biosensorenlive cell imagingconfocale microscopieregressieanalysemeting van anorganisch fosfaatchloroplaststromakwantificering van metabolieten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.