Geïntegreerde Microplate- en HPTLC-strategie voor het bepalen en profileren van totale fenolen en flavonolen in citruspeel-extracten

Samenvatting

Deze studie presenteert een gecombineerde AlCl₃/Folin–Ciocalteu-benadering voor HPTLC-profilering en kwantificering van flavonolen/5-hydroxyflavonen en fenolverbindingen in citrusschillen, aangevuld met microplaatanalyse.

Samenvatting

Fenolverbindingen en flavonoïden dragen aanzienlijk bij aan de antioxidantactiviteit en functionele waarde van citrusbijproducten. Conventionele colorimetrische assays, hoewel veel gebruikt, missen chromatografische scheiding en kunnen worden beïnvloed door chemische interferenties. Dit protocol biedt een geïntegreerde analytische workflow die microplaatspectrofotometrische assays combineert met high-performance dunnelaagchromatografie (HPTLC) voor de bepaling en profilering van het totale fenolgehalte (TPC) en het totale flavonolgehalte plus 5-hydroxyflavonen (TFHC) in citruspeel-extracten. Ethanolische extracten van kalk (Citrus aurantifolia) en mandarijn (Citrus reticulata) schillen werden geëvalueerd met behulp van Folin–Ciocalteu (FC) en aluminiumchloride (AlCl₃) assays in een 96-put microplaatformaat, gevolgd door HPTLC-analyse met twee sequentiële mobiele fasen en dubbele postchromatografische derivatisatie. Microplaatmetingen leverden TPC-waarden op van 74,2 mmol/g voor kalk en 72,8 mmol/g voor mandarijn, terwijl TFHC-waarden respectievelijk 15,5 mmol/g en 6,0 mmol/g waren. HPTLC-scheiding loste vier fenolbanden op in kalk en zes in mandarijn. Twee kalkbanden werden selectief gevisualiseerd na AlCl₃-derivatisatie, wat consistent is met flavonolen of 5-hydroxyflafonen. De som van de door HPTLC geschatte fenolische bads was respectievelijk 22,0 en 20,8 mmol/g droogstof voor kalk en mandarijn, terwijl TFHC 13,4 mmol/g in kalk bereikte en niet werd gedetecteerd in mandarijn. Deze bevindingen tonen aan dat microplaat-assays een snelle en gevoelige schatting van de totale inhoud bieden, terwijl HPTLC de selectiviteit verbetert door verbindingsseparatie en functioneel-groep-specifieke derivatisatie. De gecombineerde strategie maakt high-throughput screening gevolgd door chromatografische bevestiging mogelijk, wat een praktisch en reproduceerbaar platform biedt voor fytochemische karakterisering van complexe plantmatrices.

Inleiding

Citrusschillen zijn een bijproduct van de sapindustrie en hebben de aanwezigheid aangetoond van functionele verbindingen zoals^{antioxidanten.} Ze zijn gebruikt als neurobeschermende voedingsmiddelen², ontstekingsremmende, anti-acne cosmeceuticals³ en voedseladditieven⁴. Verschillende van deze bioactiviteiten worden toegeschreven aan flavonoïden⁵ en aan fenolverbindingen⁶. Algemene methoden om de totale hoeveelheid flavonoïden en fenolen te schatten zijn vastgesteld in de literatuur⁷, waarbij de meest voorkomende de Folin-Ciocalteu voor het totale fenolische gehalte (TPC)⁸ is, en de aluminiumchloride voor totale flavonoïde verbindingen (TFC)⁹ door spectrofotometrie. De Folin-Ciocalteau-methode werd in 1927 voor het eerst gepubliceerd¹⁰, gebaseerd op een aanpassing van de Folin-Denis-reactie¹¹, beide gebaseerd op een redoxreactie van fosfhotungstisch-fosphomolibdische verbindingen. De Folin-Ciocalteau-methode meet de reductieve capaciteit van fenolische verbindingen¹². De aluminiumchloride- en flavonoïdetest werd voor het eerst voorgesteld in 1960, gebaseerd op complexen tussen het metaal en flavonoïde liganden¹³.

Beide spectrofotometrische assays zijn nuttige instrumenten om het totale gehalte fytoverbindingen die vaak in plantaardig materiaal voorkomen te schatten en te vergelijken. Ze zijn echter onderhevig aan verschillende beperkingen. Zo ontstaan er enkele beperkingen door het gebruik van externe standaarden¹⁴, waarbij algemeen wordt aangenomen dat de chemische aard van de standaard de signaalrespons niet significant beïnvloedt. In de praktijk is deze aanname moeilijk te valideren, omdat molaire absorptiviteit afhangt van factoren zoals conjugatie en andere structurele kenmerken die moeilijk te standaardiseren zijn in natuurlijke producten. Zo evalueerden Appel et al.¹⁵ TPC van elf eikensoorten en ontwikkelden de zogenaamde "zelfstandaard"-benadering, waarbij verschillen van meer dan 50% in de hellingen van de kalibratiecurves werden gerapporteerd. Zelfstandaardgebruik is een strategie die is ontworpen om dezelfde samenstellende mix van verbindingen als aanwezig in het monster weer te geven, waardoor een betere overeenkomst komt met het werkelijke Totale Fenolische Gehalte (TPC) in het^{monster 16}. Zelfstandaarden geven ook enige informatie over de verhouding tussen reactieve groepen en het gemiddelde molecuulgewicht; het is echter arbeidsintensief en moeilijk te standaardiseren.

De totale flavonoïdeverbindingen-assay op basis van aluminiumchloridecomplexatie is kritisch geëvalueerd in recente studies^17,18, die concludeerden dat AlCl₃ specifiek complexen vormt met twee subgroepen flavonoïden: flavonolen en 5-hydroxyflavonen. Flavonolen vertonen doorgaans de maximale opname rond 440 nm, terwijl 5-hydroxyflavonen rond 415 nm absorberen. Daarnaast kunnen bepaalde flavonoïden intrinsieke absorptie vertonen binnen het bereik van 415–440 nm, zelfs zonder derivatisatie, en de toename van absorptiviteit bij complexvorming varieert per afzonderlijke verbinding. Bovendien missen beide colorimetrische assays scheiding en kunnen ze daarom geen onderscheid maken tussen verschillende fenolische bestanddelen; Hoewel deze eigenschap voordelig kan zijn voor het schatten van de totale inhoud, resulteert het in beperkte specificiteit. Deze overwegingen benadrukken de noodzaak van een analytische strategie die individuele componenten oplost vóór colorimetrische detectie, waardoor echte assay-responsen worden onderscheiden van spectrale of chemische interferenties.

Ondanks deze beperkingen blijven dergelijke assays waardevolle instrumenten voor de algemene screening van bioactieve fenolverbindingen in plant- en fruitextracten¹⁹. Om potentiële interferenties te beoordelen, is het gebruik van een high-performance dunne laag chromatografie (HPTLC) methode, die werd aangetoond met zowel Folin–Ciocalteu- als AlCl₃-reagentia, een effectieve aanpak. Chromatografische scheiding maakt het mogelijk om interfererende stoffen met bestaande absorptiebanden vóór complexatie te detecteren, terwijl fotografische documentatie gelijktijdige analyse van meerdere absorptiemaxima mogelijk maakt. Daarnaast biedt HPTLC-analyse verschillende voordelen ten opzichte van meer uitgebreide chromatografische technieken zoals HPLC–MS/MS, waaronder een lager oplosmiddelverbruik, kortere analysetijd door gelijktijdige verwerking van meerdere monsters (tot 18 per plaat)²⁰, en een vergemakkelijkte interpretatie van complexe mengsels vanwege de selectiviteit van postchromatografische derivatisatie²¹.

In dit werk presenteren we een geïntegreerd protocol voor de bepaling van de specifieke verbindingen bestaande uit het totale polyfenolgehalte (TPC) en het totale aantal flavonolen plus 5-hydroxyflavonen (TFHC) in citruspeel-extracten met behulp van high-performance dunne-laag chromatografische (HPTLC) scheiding, samen met een algemene inhoudsschatting gebaseerd op een microplaat-colorimetrische assay. Planaire chromatografische kwantificering van fenolverbindingen wordt uitgevoerd met behulp van het Folin–Ciocalteu-reagens, terwijl aluminiumchloridederivatisatie uitsluitend wordt toegepast voor de chromatografische identificatie van banden die overeenkomen met flavonolen en 5-hydroxyflafonen. In deze benadering is TFHC-bepaling gebaseerd op de Folin–Ciocalteu-respons van chromatografisch opgeloste en chemisch geïdentificeerde verbindingen, in plaats van op aluminiumchloridecomplexatie voor kwantificatie. De HPTLC-analyse maakt verbindingsspecifieke scheiding en visualisatie mogelijk, waardoor individuele fenolische bestanddelen kunnen worden geïdentificeerd en potentiële spectrale interferenties worden gedetecteerd. Daarnaast wordt een microplaat-gebaseerde spectrofotometrische methode gepresenteerd voor snelle schatting van de totale TPC en TFHC, die een complementair high-throughput screeninginstrument biedt voor complexe plantmatrices.

Protocol

1. Bereiding van fruitschillen

1. Verwijder ongeveer 50 g schillen van elke vrucht, en scheid ze van het eetbare gedeelte. Voor onze representatieve resultaten werden mandarijnen gekocht in een lokale winkel (geïmporteerd uit Chili, Isabellijnen), en werden limoenen verzameld van een boom nabij San José, Costa Rica (bewijsexemplaar JVR-16434).
2. Doe de schillen in een plastic ziplockzak en vries ze in op -20 °C gedurende minstens 2 uur.
3. Breng de bevroren schillen over in een voorgekoelde vriesdroger, houd de zakken open en breng vacuüm (0,1 mbar) een nacht aan tot ze volledig droog zijn.
4. Maal elk gedroogd materiaal tot ongeveer 0,1 mm met een mesmolen.

2. Extractie

1. Weeg ongeveer 100 mg droog, gemalen citrusschil (kalk of mandarijn) en plaats het in een glazen buis van 15 mL.
2. Voeg 3 ml 60% ethanol toe aan de buis.
3. Sonicaer het mengsel in een ultrasoon bad gedurende 10 minuten bij 40 °C om plantcellen te verstoren en de afgifte van fytochemicaliën te bevorderen.
4. Centrifugeer het monster op 850 × g gedurende 10 minuten.
5. Breng het ethanolische supernatant voorzichtig over in een 10 mL volumetrische kolf met een Pasteur-pipet, waarbij verstoring van het sediment wordt vermeden.
6. Voeg nog eens 3 mL 60% ethanol toe aan de buis met het vochtige vaste residu.
7. Herhaal de hierboven beschreven sonicatie- en centrifugatiestappen in stappen 2.3 en 2.4.
8. Breng het supernatant over naar dezelfde volumetrische kolf en combineer het met het vorige extract.
9. Voer een derde extractie uit door de vorige stappen (2.6–2.8) te herhalen.
10. Zuur het gecombineerde extract (≈9 mL) met twee druppels 0,1 mol/L HCl (om de stabiliteit van anthocyaninen en andere fenolische verbindingen te verhogen) en breng het volume tot 10 mL met methanol.
11. Voer deze procedure driemaal uit voor elk monster.

3. Totale flavonolen en 5-hydroxyflavonen (TFHC) door microplaatspectrofotometrie

1. Bereid een quercetine-standaardoplossing voor (100 μg/mL) of een equivalente flavonoïdestandaard.
   1. Weeg 10 mg quercetine met een balans met 0,1 mg precisie.
   2. Los de quercetine op in ongeveer 5 mL 95% ethanol en breng de oplossing over in een 10 mL volumetrisch kolf dat als de standaardoplossing wordt aangeduid.
   3. Spoel de beker twee keer af met 2 ml 95% ethanol en voeg de spoelingen toe aan de kolf.
   4. Breng het volume tot de norm met 60% ethanol.
   5. Bereid standaardoplossingen (10–100 μg/mL) en een blank voor in 1,5 mL microcentrifugebuizen volgens Tabel 1.
   6. Zorg ervoor dat alle monsters en standaarden binnen een absorptiebereik van 0,2–0,8 vallen, waarbij de concentraties indien nodig worden aangepast.
   7. Bereid de microplaatindeling voor door 60 μL blanco, monster of standaard in elke put te doseren volgens Figuur 1. Voer drie replicaties uit per sample of standaard.
   8. Dozeer waterige oplossingen van 2% aluminiumchloride, 5% natriumacetaat en 80% methanol in aparte reagentiareservoirs.
      OPMERKING: Ga voorzichtig om met aluminiumchloride en methanolische oplossingen. Aluminiumchlorideoplossingen zijn irriterend en methanol is giftig door inname, inademing en huidopname. Vermijd huid- en oogcontact en draag geschikte PBM
   9. Voeg met een 8-kanaals multikanaals pipet 10 μL AlCl₃-oplossing, 10 μL natriumacetaatoplossing en 200 μL 80% methanol toe aan elke put.
   10. Schud het bord op gemiddelde intensiteit gedurende 10 seconden en laat het 30 minuten in het donker incuberen.
   11. Meet de absorptie bij 415 nm. Als schudden niet mogelijk is, meng dan handmatig met een micropipet vóór de incubatie (Figuur 2).
   12. Interpolleer monsterabsorptiewaarden van de kalibratiecurve en pas indien nodig verdunnings-, volumetrische en massacorrectiefactoren toe.

Tabel 1: Hoeveelheden quercetinestandaarden voor de kalibratiecurve van totale flavonolen en 5-hydroxyflavonen (TFHC). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Figuur 1: Microplaatindeling voor totale flavonolen en 5-hydroxyflavonen (TFHC) microplaatanalyse. (A) Schema van microplaat. (B) Software Gen5 layoutprogramma. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Microplate-software-opstelling voor analyse van totale flavonolen en 5-hydroxyflavonen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Totale polyfenolische inhoud (TPC) door microplaatspectrofotometrie

1. Bereid een standaardcurve voor gallinezuur voor (0,000–0,120 mg/mL).
   1. Weeg ongeveer 0,0123 g gallische zuur (98% zuiverheid) met een analytisch weeggewicht en los het op in gedestilleerd water.
   2. Breng de oplossing over in een 10 mL volumetrische kolf, spoel twee keer af en vul tot aan de markering met gedestilleerd water om de voorraadoplossing te verkrijgen.
   3. Bereid een werkoplossing door 1 mL van de bouillon te verdunnen tot 10 mL met gedestilleerd water.
   4. Bereid kalibratiestandaarden voor door de werkoplossing verder te verdunnen volgens Tabel 2.
   5. Pas de concentraties aan als de absorptiewaarden buiten het bereik van 0,2–0,8 vallen.
   6. Bereid het Folin–Ciocalteu werkreagens voor door het commerciële reagens 1:14 te verdunnen met gedestilleerd water.
      OPMERKING: Folin–Ciocalteu-reagens en zoutzuuroplossingen zijn corrosief. Vermijd spetters en direct contact. Voer reagenshantering uit in een dampkap.
   7. Pipetteer 30 μL van elk monster, standaard of blanco, in een 96-wells microplaat volgens de lay-out in figuur 3A, met drie replicaten per monster.
   8. Voeg 215 μL Folin–Ciocalteu werkreagens toe aan elke put met behulp van een multikanaalpipet.
   9. Voeg 50 μL 20% natriumcarbonaatoplossing toe aan elke put en meng grondig met een micropipet.
   10. Incubeer de plaat 20 minuten bij 40 °C met beweging (Figuur 3B).
   11. Meet de absorptie op 755 nm.

Tabel 2: Hoeveelheden gallische zuurnormen voor de kalibratiecurve van het totale fenolgehalte (TPC). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Figuur 3: Microplaatindeling en software-setup voor microplaatanalyse van totale fenolische inhoud (TPC). (A) Indeling. (B) Softwareprogramma. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Algemene omstandigheden gebruikt voor hoogwaardige dunnelaagchromatografie-analyse

1. Standaardcurves
   1. Bereid standaardoplossingen van quercetine en gallinezuur (elk 100 μg/mL) voor zoals hierboven beschreven in sectie 3 en sectie 4.
   2. Breng gallinezuur aan op zes banen met volumes van 2, 4, 6, 8, 10 en 12 μL.
   3. Breng 5 μL galluszuur en quercetine afzonderlijk aan op aparte banen voor identificatie.
2. Plaatindeling:
   1. Gebruik een 10 × 20 cm silicagel 60 F₂₅₄ aluminium-achterste TLC-plaat als stationaire fase.
   2. Stel de toepassingsparameters als volgt in: Y-positie 7,0 mm, bandlengte 6,0 mm, eerste X-positie 14,0 mm, afstand tussen sporen 9,4 mm.
   3. Breng 10 μL van elk extract per band aan met stikstof als spuitgas.
   4. Stel de afstand van de oplosmiddelvoorkant in op 70 mm.
3. Plaatontwikkeling:
   1. Ontwikkel platen in een handmatige kamer met 40 ml mobiele fase, en laat 10 minuten toe voor kamerverzadiging met filterpapier in contact met de mobiele fase en de kamerwand om de dampen van de mobiele fase te helpen de kameratmosfeer te verzadigen.
   2. Ontwikkel platen met MP1 of MP2, waarbij dubbele ontwikkeling wordt uitgevoerd wanneer dat is aangegeven. Mobile Phase 1 (MP1), die bestaat uit ethylacetaat: mierenzuur: azijnzuur: water (100:11:11:26); en MP2 gemaakt van tolueen: ethylacetaat: mierenzuur (5:4:1).
      OPMERKING: Ontwikkel HPTLC-platen in een dampkap. Mobiele fasecomponenten (ethylacetaat, tolueen, mierenzuur en azijnzuur) zijn vluchtig, en tolueen en ethylacetaat zijn zeer brandbaar. Vermijd inademing van damp en elimineer ontstekingsbronnen.
   3. Laat borden op kamertemperatuur drogen.
4. Derivatisatie
   1. Spuitplaten met Folin–Ciocalteu-reagens (300 μL reagens + 600 μL 50% ethanol), kort drogen met een heteluchtpistool en spuiten met 1 mL 10% natriumcarbonaat in 50% ethanol.
   2. Spray andere platen apart met 1% aluminiumchloride in 50% ethanol.
5. Warmteplaten gelijkmatig met een heteluchtpistool totdat de kleurontwikkeling stabiliseert en platen volledig droog zijn.

6. Ontwikkeling voor analyse van totale flavonolen en 5-hydroxyflavonen (TFHC) en totale fenolische inhoud (TPC) door middel van hoogwaardige dunnelaagchromatografie

1. Breng monsters toe in driedubbele banen samen met referentiebanen voor gallinezuur en quercetine (voor identificatie, zoals beschreven in stap 5.1.4).
2. Ontwikkel een plaat met MP1.
3. Ontwikkel de plaat opnieuw met MP2.
4. Derivatiseer de plaat met FC-reagens zoals eerder beschreven.
5. Documenteer de plaat met witte verlichting, evenals 254 nm en 366 nm UV-verlichting.
6. Herhaal de procedure en vervang de laatste stap voor AlCl_{3-derivatisatie} , zoals weergegeven in Figuur 4.

Figuur 4: VisionCat-stappen voor analyse van TPC en TFHC door HPTLC. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

Extractiecondities
Het algemene extractieprotocol dat hier wordt beschreven, gebruikt 60% ethanol, zoals eerder gerapporteerd²²%. Wanneer geëxtrapoleerd naar andere plantaardige bronnen, kunnen extractiecondities worden geoptimaliseerd in termen van de polariteit van het oplosmiddel en het aantal cycli. Een uitgebreide motivering voor het kiezen van zowel het oplosmiddel als het aantal cycli is elders beschreven¹⁶. De selectie van oplosmiddelen kan worden geleid door eerdere literatuur en polariteitsindices; In het algemeen worden hydroalcoholische mengsels van ethanol of methanol, evenals aceton, aanbevolen. Het optimale aantal extractiecycli (n) kan worden geëvalueerd door een vast totaal volume van 10 mL te delen in 1–5 cycli van 10/n mL, gevolgd door het poolen van de vloeibare extracten. De efficiëntie van verschillende extractiecyclusnummers wordt vervolgens statistisch vergeleken om de conditie te identificeren die de maximale absorptie in de TPC-assay oplevert.

Microplaten- en HPTLC-kwantificatie
De standaard kalibratiecurves voor zowel de microplaattest als de HPTLC-analyse zijn weergegeven in Figuur 5. Voor de bepaling van het totale fenolische gehalte (TPC) door de Folin–Ciocalteu-microplaatmethode en voor HPTLC-platen die met hetzelfde reagens zijn afgeleid, werden kalibratiecurves vastgesteld met gallienzuur als referentieverbinding. Galzuur werd niet alleen gekozen omdat het een van de meest gebruikte standaarden is voor TPC-kwantificatie, maar ook omdat het onder dezelfde mobiele fasecondities kan worden geëlueerd als toegepast op kalk- en mandarijnmonsters. Quercetine werd ook geëvalueerd als een potentiële standaard voor de HPTLC-test; het bleek echter ongeschikt voor dit chromatografisch systeem, omdat het co-elueerde met het oplosmiddelfront en niet betrouwbaar kon worden gekwantificeerd. Desalniettemin werd TFHC bepaald met quercetine als referentiestandaard, aangezien gallinezuur geen gekleurd complex vormt met aluminiumchloride, aangezien het noch flavonol noch een 5-hydroxyflavonon is.

Figuur 5: HPTLC-plaat van kalk, mandarijn, gallisch zuur en quercetine ontwikkeld sequentieel met MP1 gevolgd door MP2, en afzonderlijk gederivateerd met aluminiumchloride (AlCl₃) en Folin–Ciocalteu (FC) reagentia. Het chromatografisch profiel na AlCl₃-derivatisatie wordt getoond. Afkortingen: FC, Folin–Ciocalteu-derivatisatie; AlCl₃, derivatie van aluminiumchloride; W, witte lichtverlichting; 366, UV-verlichting op 366 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De resultaten voor het totale fenolgehalte (TPC) en het totale flavonoïde- en hydroxycinnaminzuurgehalte (TFHC) worden weergegeven in Tabel 3. Zoals verwacht waren TFHC-waarden significant lager dan TPC-waarden, ongeveer vijf keer lager in kalkmonsters en twaalf voude lager in mandarijnmonsters.

Tabel 3: Resultaten voor het totale fenolgehalte van mandarijn en kalk volgens microplate-methode. Afkortingen: Abs: absorptie, CV: variatiecoëfficiënt, DF: verdunningsfactor, GAE: gallische zuurequivalenten, IR: onafhankelijke replicatie, QE: quercetine-equivalenten, Rep: herhaling, SD: standaarddeviatie, TFHC: totale flavonolen en 5-hydroxiflavonverbindingen, TPC: Totale fenolische inhoud, en gemiddeld. *Berekend op basis van droge stof. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Evenzo worden de resultaten verkregen uit de HPTLC-analyse samengevat in Tabel 4. Chromatografische scheiding maakt het mogelijk om individuele banden te visualiseren die overeenkomen met verschillende verbindingen. Vier fenolische bestanddelen werden aangetroffen in kalkmonsters en zes in mandarijnmonsters. Geen van deze banden kwam overeen met de retentiefactoren van de gebruikte referentiestandaarden (gallinezuur en quercetine), wat overeenkomt met de verwachtingen.

Tabel 4: Resultaten voor het totale fenolische gehalte en banden die overeenkomen met AlCl₃ toonden verbindingen aan het licht door HPTLC gederivateerd met AlCl₃. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 4 toont ook het totale fenolische gehalte dat is geschat uit HPTLC-analyse, berekend als de som van de individuele chromatografisch gedetecteerde verbindingen (analoog aan TPC). Daarnaast bevat de tabel het cumulatieve gehalte van de banden die aan flavonolen of 5-hydroxyflavanen zijn toegekend (Rf = 0,46 en 0,62 in kalk; geen enkele gevonden in mandarijn). Deze banden leken geel na derivatisatie met AlCl₃ en vertoonden gelige fluorescentie onder 366 nm UV-verlichting. Er werd echter geen zichtbare kleuring waargenomen vóór de derivatisatie, zoals weergegeven in Figuur 5.

Voor HPTLC-analyse biedt Folin-Ciocalteu (FC) derivatisatie een uitgebreide detectie van fenolische verbindingen, hoewel kleine interferenties kunnen optreden. Ook kleurt aluminiumchloride (AlCl₃) derivatie selectief een subset van flavonoïden. De gecombineerde toepassing van beide reagentia verbetert de standaardisatie van de methode en verzacht enkele van de inherente beperkingen van beide benaderingen. Opmerkelijk is dat het onwaarschijnlijk is dat een niet-flavonoïde verbinding zowel de karakteristieke blauwe kleur onder FC als de geel-rode absorptie onder AlCl₃ vertoont. Daarnaast kunnen reeds bestaande chromoforen als interferenties worden uitgesloten als ze met dezelfde intensiteit zichtbaar zijn vóór derivatisatie.

Zoals getoond in Figuur 5, vertoonde het kalkextract twee banden bij Rf 0,62 en 0,46, die niet detecteerbaar waren op de onontwikkelde plaat maar duidelijk zichtbaar werden na zowel Folin–Ciocalteu (FC) als AlCl₃-derivatisatie. Dit gedrag ondersteunt hun flavonoïde karakter, mogelijk overeenkomend met neoeriocitrin en hesperidine²³. Extra fenolische bestanddelen werden waargenomen bij Rf 0,21 en 0,37 in kalk, en bij Rf 0,36, 0,39, 0,42, 0,46, 0,54 en 0,89 in mandarijn. Deze banden waren detecteerbaar na FC-derivatisatie, maar niet na AlCl₃-behandeling, wat suggereert dat ze overeenkomen met niet-flavonoïde fenolische verbindingen. Volgens de literatuur zijn de belangrijkste niet-flavonoïde fenoliden die in mandarijn worden gerapporteerd onder andere chlorogenzuur en transferulinezuur^24,25. In kalk zijn andere eerder beschreven verbindingen coumarinezuur en dihydroxyferulinezuur²³. Toch vereist bevestiging van deze opdrachten analyse met aanvullende referentiestandaarden.

HPTLC mobiele fasen vergelijking
Beide mobiele fasen zijn ontwikkeld als een aanpassing van eerder gerapporteerde systemen 26,27,28. De meer polaire mobiele fase (MP1, Figuur 6A) bood een superieure scheiding van fenolische bestanddelen vergeleken met MP2. Daarentegen maakte de minder polaire mobiele fase (MP2) (Figuur 6B) het mogelijk om zowel monstercomponenten als referentiestandaarden gelijktijdig binnen dezelfde chromatografische run te behouden. Onder MP2-omstandigheden waren de Rf-waarden van de steekproefbestanddelen echter relatief laag, waarbij sommige verbindingen dicht bij de oorsprong bleven, zoals weergegeven in Figuur 6. Om deze beperking te verhelpen, werd een dubbele ontwikkelprocedure ingevoerd waarbij MP1 gevolgd werd door MP2. Deze strategie zorgde voor verbeterde migratie en resolutie van de monstercomponenten, terwijl kwantificatie mogelijk was tegen gallische zuurstandaarden op dezelfde plaat onder identieke chromatografische omstandigheden. Quercetine vertoonde een zwakke gele kleur vóór de AlCl₃-behandeling, die intensiever werd na derivatisatie. Voor zowel kalk- als mandarijnextracten werden twee duidelijke banden waargenomen, naast een band die aan de oorsprong overbleef. Bovendien werd een gele band met een Rf-waarde van 0,14 duidelijk zichtbaar na de AlCl₃-derivatisatie.

Figuur 6: HPTLC-platen van kalk, mandarijn, gallisch zuur en quercetine ontwikkeld met mobiele fase 1 (A) en mobiele fase 2 (B). Voor elke plaat komen de sporen van links naar rechts overeen met: ontwikkelde (niet-gederivatiseerde), Folin–Ciocalteu-gederivateerde en AlCl₃-gederivateerde samples. De visualisatie werd uitgevoerd onder wit licht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Monsterverzameling en opslag zijn cruciale stappen om de integriteit van fytochemische analyses te waarborgen. Na het verzamelen moeten monsters onder gekoelde omstandigheden worden vervoerd en zo snel mogelijk gevriesdroogd worden om degradatie te minimaliseren. Hoewel gedroogde biologische materialen over het algemeen stabiel zijn, zijn extracten in oplossing aanzienlijk labieler, zelfs wanneer ze onder koeling worden bewaard. Daarom worden analytische bepalingen bij voorkeur uitgevoerd op vers bereide extracten. Langdurige opslag, zelfs enkele dagen onder koude en lichtbeschermde omstandigheden, of enkele uren bij kamertemperatuur, kan leiden tot waarneembare veranderingen in chromatografische profielen, waaronder veranderingen in bandintensiteit en de vorming van neerslag. Deze veranderingen gaan meestal gepaard met chemische transformaties zoals oxidatie, hydrolyse of complexatiereacties. Daarom moeten alle reagentia en extracten worden opgeslagen en verwerkt onder koude en donkere omstandigheden om hun chemische stabiliteit te behouden.

Bij het vergelijken van beide technieken (Tabel 3 en Tabel 4) zijn systematische kwantitatieve verschillen duidelijk. In zowel kalk als mandarijn waren de TPC-waarden verkregen door de microplaattest ongeveer drie keer hoger dan die van HPTLC. Bij kalk was TPC 74,2 mmol/g per microplaat tegenover 22,0 mmol/g DM door HPTLC, terwijl TFHC-waarden respectievelijk 15,5 mmol/g en 13,4 mmol/g waren. In het mandarijn bereikte TPC 72,8 mmol/g per microplaat vergeleken met 20,8 mmol/g per HPTLC. Voor TFHC leverde de microplaatmethode 6,0 mmol/g op, terwijl HPTL geen overeenkomstige banden detecteerde.

Deze discrepanties kunnen worden verklaard door de intrinsieke beperkingen en responsmechanismen van elke methode. De Folin–Ciocalteu (FC) assay staat bekend om niet alleen te reageren met fenolische verbindingen, maar ook met diverse niet-fenolische reducerende stoffen, waaronder ascorbinezuur, tyrosine, mierzuur en azijnzuur²⁹, evenals andere laagmoleculaire reductieven. Dergelijke verbindingen dragen bij aan het totale spectrofotometrische signaal, wat mogelijk leidt tot een overschatting van TPC. Daarnaast kunnen kleine fenolische bestanddelen samen de totale absorptie in de microplaattest verhogen, zelfs als hun individuele concentraties te laag zijn om duidelijke, kwantificeerbare banden in HPTLC te produceren. Sommige kleine of sterk polaire metabolieten kunnen ook niet worden vastgehouden, opgelost of zichtbaar worden onder de gebruikte chromatografische omstandigheden.

Figuur 7: Schematische weergave van AlCl₃-complexen gevormd met flavonolen en 5-hydroxyflavonen. (A) Flavonolen en (B) 5-hydroxyflafonen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Methodologische verschillen in detectiechemie dragen verder bij aan de waargenomen variaties. De FC-reactie veroorzaakt een aanzienlijke toename van de absorptie door de vermindering van het reagens, wat resulteert in een hoge analytische gevoeligheid. Daarentegen is de AlCl₃-methode relatief niet-specifiek en berust op complexvorming met bepaalde flavonoïden. Flavonolen vertonen doorgaans de maximale absorptie rond 410 nm, terwijl 5-hydroxyflavonen rond 440 nm¹⁸ absorberen, en hun complexen met Al³⁺ zijn geïllustreerd in Figuur 7. De toename van absorptie na complexvorming is echter relatief bescheiden, waardoor de AlCl₃-assay gevoeliger is voor interferentie door gekleurde matrixcomponenten, waaronder flavonoïden zelf.

Ondanks deze beperkingen vertegenwoordigt het gecombineerde gebruik van FC- en AlCl₃-derivatisatie in HPTLC een krachtige aanvullende strategie voor fenolanalyse. Deze benadering koppelt de hoge gevoeligheid van de FC-reactie aan de structurele discriminatie die wordt geleverd door AlCl₃-complexatie en chromatografische scheiding. Bovendien vertonen verschillende flavonolen kenmerkende gelige banden onder UV-verlichting³⁰, wat de classificatie en bevestiging van verbindingen verder ondersteunt.

Microplaatmethoden zijn bijzonder voordelig voor screening met hoge doorvoer. Ze vereisen minimale monstervoorbereiding, een laag reagentiaverbruik en maken gelijktijdige analyse van tientallen monsters mogelijk. Onder typische laboratoriumomstandigheden kan een volledige microplaattest in ongeveer 4 uur worden uitgevoerd met behulp van breed beschikbare instrumentatie. Deze kenmerken maken microplaat-assays zeer geschikt voor snelle vergelijkende studies, routinematige kwaliteitscontrole en de voorlopige evaluatie van grote monsterverzamelingen. Daarentegen is HPTLC tijd- en arbeidsintensiever en duurt een volledige analytische workflow die doorgaans 7–8 uur vereist. Het is ook afhankelijk van gespecialiseerde instrumentatie die mogelijk niet in alle laboratoria beschikbaar is, en het gebruik van speciale platen en derivatisatiereagentia verhoogt de kosten per analyse. Een andere beperking is dat metabolieten die in zeer lage concentraties aanwezig zijn, onder standaard visualisatiecondities mogelijk ondetecteerbaar blijven. Deze praktische en gevoeligheidsgerelateerde beperkingen worden echter gecompenseerd door het belangrijkste voordeel van chromatografische scheiding^30,31. HPTLC maakt de resolutie van individuele bestanddelen in complexe plantmatrices mogelijk, bevestiging van echte assay-responsen en detectie van potentiële storende verbindingen. Bovendien maakt selectieve postchromatografische derivatisatie een eenvoudige classificatie van verbindingen in functionele groepen mogelijk (bijv. flavonolen en 5-hydroxyflavonen), wat de chemische interpretatie verder vergroot dan de totale inhoudsschatting.

Daarom kan de analytische workflow in grootschalige studies beginnen met microplaat-assays om snel monsters met verhoogde niveaus van doelverbindingen te identificeren. Geselecteerde monsters kunnen vervolgens worden onderworpen aan HPTLC-analyse om individuele bestanddelen te visualiseren, selectiviteit te beoordelen en mogelijke interferenties te evalueren via duale derivatisatie. Deze geïntegreerde strategie (geïllustreerd in Figuur 8) combineert snelheid en doorvoer met chemische specificiteit en structureel inzicht.

Figuur 8: Voorgestelde workflow voor steekproefscreening en analyse. (A) Hoogdoorvoer microplaatscreening van een grote batch monsters. (B) HPTLC-analyse van geselecteerde monsters voor kwantificering met de Folin–Ciocalteu-methode en voor identificatie van flavonolen en 5-hydroxyflavonen via AlCl₃-derivatisatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

In vergelijking met HPTLC biedt HPLC gekoppeld aan hoge-resolutie massaspectrometrie (HPLC–HRMS)—het meest voorkomende alternatief in de literatuur—een ongeëvenaarde gevoeligheid en ondubbelzinnige structurele identificatie van individuele verbindingen³². Desalniettemin zijn HPLC–HRMS-analyses van nature trager, omdat elke chromatografische run sequentieel moet worden uitgevoerd en ze aanzienlijk hogere kosten met zich meebrengen op het gebied van instrumentatie, zuiverheidseisen van het oplosmiddel en het gebruik van oplosmiddelen. Bovendien vereist functionele class-screening vaak complexe gegevensverwerking en interpositie-specifieke interpretatie, terwijl HPTLC directe visuele groepering van verbindingen na derivatisatie mogelijk maakt. HPTLC vormt daardoor een effectief tussenplatform tussen snelle microplaatscreening en uitgebreide HPLC–MS-analyse, waarbij doorvoer, kosten en chemische selectiviteit worden afgewogen in balans.

Flavonoïde- en fenolanalyse heeft brede toepassingen in de voedingswetenschap, nutraceuticals, farmaceutica, landbouw en materiaalonderzoek. In de voedingswetenschap wordt het gebruikt om de antioxidantcapaciteit, authenticiteit, houdbaarheid en kwaliteitscontrole van producten zoals sappen, wijnen en theeën te evalueren, evenals ter ondersteuning van agronomische studies, waaronder het bepalen van de optimale oogsttijd op basis van fenolische rijpheid³³. In de nutraceuticale sector is fenolprofiel essentieel voor de standaardisatie en kwaliteitsborging van botanische extracten en commerciële producten zoals groene thee-extractcapsules, druivenzaadextractsupplementen, quercetintabletten en citrusbioflavonoïde formuleringen. In farmaceutisch en biomedisch onderzoek ondersteunen deze analyses het screenen van bioactieve verbindingen met antioxidante, ontstekingsremmende en antimicrobiële potentie⁶. In de landbouw en plantfysiologie helpt fenolische bepaling bij het evalueren van de stressreacties van planten en het sturen van strategieën voor gewasverbetering. Daarnaast helpt fenolische karakterisering in de materiaalkunde—met name in studies naar plantaardige corrosie-remmers^34,35—bij het correleren van chemische samenstelling met adsorptiegedrag en beschermende efficiëntie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.5 mL eppendorf buisjes	Eppendorf
10 mL volumetrische kolven	Eisco Labs	CH0451B	10/19 Polypropyleen Stop, Borosilicaat Glas, Amber - Witte Graduatiemerk, Tolerantie ±0.025 ml
100 µL en 1000 µL micropijptipjes	generic
100–1000 µL micropipet	Eppendorf	Research Plus
10–100 µL micropipet	Eppendorf	Research Plus
15 mL glazen buisjes met dop	generic
50 mL bekers	generic
8-kanaals multichannel micropijptip	ThermoSciecntific
96-wells microplates	Greiner	655891	Polycicloolefin, glazen bodem, zwart
Analytische weegschaal			±0.0001 g
Automatische TLC-monsternemer	CAMAG	ATS4
Centrifuge	ThermoSciecntific	Sorvall ST8R	≥850 × g
Filterpapier	Whatman		Voor kamersaturatie
Vriesdroger	LABCONCO	Model 10
Kunststof reagentia reservoirs	Eppendorf
Spatelkapel met Vlak Einde en Lepel Einde	Merck chemicals	HS15906
Synergy HT Multi-Detectie Microplate Reader	BioTek Instruments	Synergy HT
TLC silicagel 60 F254 aluminium-onderstel platen (10 × 20 cm)	Merck
TLC spuit	Sigma-Aldrich		20 mL
TLC Visualizer	CAMAG	2
Ultrasoon bad/reiniger	Creworks	ZX-040	met temperatuurregeling bij 40 °C
UV Lamp	UPV	UVGL-58
VisionCATS software	CAMAG
Zip-lock tassen	Generic		1/4 kwart gallon