Methodenartikel

Fenotypische profilering van door MPTP geïnduceerde Parkinson-achtige gedragsfenotypes bij zebravislarven op basis van gedragsexperiment

DOI:

10.3791/70041

⸱

15 mei 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry, State Key Laboratory of Discovery and Utilization of Functional Components in Traditional Chinese Medicine, Key Laboratory of Chemical Biology (Ministry of Education), NMPA Key Laboratory for Technology Research and Evaluation of Drug Products, School of Pharmaceutical Sciences, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 2College of Information Engineering, Ningde Normal University, 3Digital Fujian Research Institute of Big Data for Elderly Rehabilitation and Nursing, 4Department of Neurology, Qilu Hospital Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 5Key Laboratory of Bioactive Materials, Ministry of Education, Nankai University, 6Jinan Microecological Biomedicine Shandong Laboratory

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol stelt een gedragsfenotyperingsparadigma vast bij met MPTP behandelde zebravislarven om Parkinson-achtige motorische en niet-motorische tekorten te evalueren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel introduceert een uniek, multiparametrisch gedragsfenotyperingsprotocol voor door MPTP veroorzaakte Parkinson (PD) bij larvale zebravissen. Chemische inductie van PD-achtige pathologie bij zebravissen biedt een hoogdoorvoer, genetisch hanteerbaar systeem, maar de meeste studies hebben zich nauw gericht op basale locomotorische assays of eenvoudige licht-donker overgangen. Dergelijke beperkte benaderingen slagen er niet in het bredere spectrum van PD-gerelateerde disfuncties te omvatten, variërend van bradykinesie en sensorimotorische tekorten tot angstachtig gedrag en slaapstoornissen. Om deze kloof te dichten, ontwikkelde deze studie een geïntegreerde batterij van 6 complementaire assays: de locomotorische test om de algemene locomotorische en verkennende aandrijving te beoordelen; thigmotacsi-beoordeling om angstgerelateerde edge-preference gedragingen te detecteren; startle response test om bradykinesie en verminderde motorische reactiviteit te registreren; licht-donker uitdagingsassays om risicogedrag en stressrespons te evalueren; fotomotorische responsparadigma's (inclusief stroboscooplichtstimulatie) om sensorimotorische en reflexieve bewegingen te kwantificeren; en monitoring van slaap-waakregulatie om slaap-wakkergedrag te meten. Larvale zebravissen worden blootgesteld aan subletale concentraties MPTP van 1 dag na bevruchting (dpf) tot 5 dpf, waarbij gedragsbeoordelingen worden gestart vanaf 4 tot 6 dpf. Geautomatiseerde tracking met hoge resolutie genereert per assay meerdere gedragseindpunten. Deze benadering onthult eerder onopgemerkte PD-achtige veranderingen, zoals een verstoorde slaaparchitectuur, verminderde habituatieleer, sensorimotorische en reflexieve bewegingen, wat vroege niet-motorische symptomen weerspiegelt. Door deze assays te combineren verkrijgen onderzoekers een uitgebreid gedragssymptoom dat de complexiteit van menselijke PD beter weerspiegelt. Dit protocol vergroot het paradigma voor het bestuderen van PD-pathogenese, het screenen van kandidaat-therapieën en het verkennen van omgevingsmodulatoren. Het illustreert het doel van de collectie om innovatieve diermodellen te presenteren die de relevantie van de translatie vergroten door robuuste, veelzijdige fenotypering.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ziekte van Parkinson (PD) is de op één na meest voorkomende neurodegeneratieve aandoening na de ziekte van Alzheimer1. De prevalentie en het aantal getroffenen zijn de afgelopen jaren gestaag toegenomen, wat wereldwijd een aanzienlijke volksgezondheidsuitdaging vormt. Het incidentiepercentage van PD stijgt aanzienlijk rond deleeftijd van 3,4 jaar. Klinisch manifesteert PD zich zowel door motorische symptomen – zoals dyskinesie, bradykinesie, rusttremor en houdingsinstabiliteit – als via diverse niet-motorische symptomen, waaronder cognitieve stoornissen, angst en slaapstoornissen5. Momenteel hangt de diagnose van PD voornamelijk af van de aanwezigheid van motorische symptomen6; Tegen de tijd dat deze symptomen zichtbaar worden, is er echter al meer dan 60% van de dopamineneuronen in de substantia nigraverloren. Hoewel niet-motorische symptomen vaak eerder optreden, bemoeilijkt het ontbreken van specifieke en objectieve beoordelingscriteria vroege diagnose en interventie8. Momenteel bestaat de primaire behandeling voor PD uit het toedienen van levodopa9, dat in de hersenen wordt omgezet in dopamine, waardoor het dopamineniveau in het striatum wordt aangevuld. Hoewel deze behandeling de symptomen tijdelijk kan verlichten, stopt het de progressie van de ziekteniet. Daarom is verder onderzoek naar de pathogenese van PD en drugsscreening essentieel.

Het bouwen van geschikte diermodellen is cruciaal voor het onderzoek naar de pathogenese van PD en anti-PD geneesmiddelenscreening. Nu zijn er drie hoofdmodellen voor PD-studies: chemische inductiemodel11, genbewerkingsmodel12 en humane xenotransplantatiemodel13. Veelgebruikte modeldieren zijn knaagdieren, zoals muizen14, en niet-menselijke primaten zoals apen15. Recentelijk hebben zebravissen (Danio rerio) steeds meer aandacht gekregen in PD-studies vanwege hun voordelen zoals kleine grootte, snelle groei, hoge genetische homologie met mensen en transparante embryo's16. Het gebruik van neurotoxine MPTP (1-methyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine) om dopamineneuronschade17,18 te induceren, is een klassieke methode om een PD-model te construeren. Zebravissen die worden blootgesteld aan subletale MPTP-concentraties vertonen verschillende PD-achtige gedragsfenotypes19.

De meeste zebravis-PD-studies concentreren zich tegenwoordig echter vooral op basis locomotorisch gedrag of eenvoudige licht-donker overgangen16,20, en eendimensionale gedragstests zijn moeilijk om de complexe gedragskenmerken van PD volledig te weerspiegelen, vooral de gedragsveranderingen in niet-motorische functies. Aangezien PD een ziekte is die meerdere neurogedragssystemen omvat buiten motorische controle 21,22,23, is een multiparametrische gedragsfenotype-evaluatiemethode dringend nodig om de multisysteemfenotypes te vangen.

Daarom bouwt deze studie een meervoudig, parametrisch en snel gedragsfenotyperingsassayprotocol om de PD-achtige gedragsfenotypes bij met MPTP behandelde zebravislarven beter te beschrijven. Een subletale dosis MPTP (50 μM)25 werd toegediend aan larven van 1 tot 5 dagen na bevruchting (dpf)16,20,26. Van 4 tot 6 dpf16, 20, 24 voerden we 6 gedragstests uit: monitoring van slaap-waakregulatie, fotomotorische responsparadigma's, thigmotacsi-beoordeling, locomotorische beoordeling, startle response test en licht-donker challenge assays. Deze gedragsbeoordelingen behandelen zowel motorische als niet-motorische aspecten, zoals bewegingstekorten, sensorimotorisch, gewoonteleer, risicobereidheid, stressrespons en slaap-wakkerritme.

Met behulp van het Zebrabox high-throughput videotrackingsysteem en de kwantitatieve analysemethode hebben we verschillende gedragsparameters geëxtraheerd en gekwantificeerd en de gedragsverschillen tussen de door MPTP behandelde groep en de wildtype (WT) groep statistisch vergeleken. In vergelijking met bestaande zebravis-PD-assays vangt deze multiparametrische gedragsbatterij motorische en niet-motorische fenotypes binnen een gestandaardiseerd kader. Het geautomatiseerde trackingsysteem zorgt voor objectieve gedragsgegevensverzameling en hoge reproduceerbaarheid. Daarnaast maakt de kleine lichaamsgrootte van de larven het mogelijk om individuele dieren in multi-well platen te plaatsen, wat een hoge doorvoerbeoordeling mogelijk maakt. De bovenstaande voordelen zijn gunstig voor het diepgaand analyseren van het pathologische mechanisme van PD, het screenen van de kandidaatgeneesmiddelen of verbindingen, en het onderzoeken van de invloed van omgevingsfactoren op het ontstaan of de ontwikkeling van PD.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie met zebravissen werd uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor dierenverzorging en -gebruik, en werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van de School of Pharmaceutical Sciences, Shandong University (nr.YXDW2025-0056). De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. MPTP-voorbereiding

  1. Bereid 1× E3-medium door 100× E3-bouillonoplossing 1:100 te verdunnen met ultrazuiver water (bijvoorbeeld 5 mL 100× E3 met 495 mL ultrazuiver water om 500 mL 1× E3-medium te verkrijgen).
    OPMERKING: Bereid E3 medium vers op de dag van gebruik.
  2. Bereid een 1 mM MPTP-voorraadoplossing door 5,0 mg MPTP-poeder toe te voegen aan een 50 mL centrifugebuis en E3-medium toe te voegen aan een eindvolume van 25 mL (gebruik de centrifugebuis als mengcontainer, maar centrifugatie is niet nodig). Label de oplossing als 1 mM MPTP stockoplossing. Bewaar de bouillonoplossing in het donker.
  3. Bereiding van 50 μM MPTP-oplossing: 2,5 mL van de 1 mM MPTP-voorraadoplossing in een schone container en verdun met 47,5 mL E3-medium om een eindvolume van 50 mL te verkrijgen bij een eindconcentratie van 50 μM MPTP. Het resterende deel van de voorraadoplossing bleef in het donker opgeslagen.
    VOORZICHTIG: MPTP is een krachtig neurotoxine en moet met uiterste voorzichtigheid worden behandeld. Draag altijd passende persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), waaronder handschoenen, een laboratoriumjas en beschermende brillen. Verwijdering van MPTP-afval volgens institutionele bioveiligheidsrichtlijnen.

2. Voorbereiding en groepering van zebravisembryo's

  1. Selecteer geslachtsrijpe mannelijke en vrouwelijke volwassen zebravissen en voer gecontroleerde fokkerij uit met kweekbakken met verwijderbare scheidingswanden. Om 20:00 uur plaats je mannelijke en vrouwelijke zebravissen apart in de broedbakken in een verhouding van 2:3, en scheid je ze met verdelers.
  2. Verwijder de volgende dag om 8:00 uur scheidingsdelen om paring mogelijk te maken, zodat het paaien wordt gestart. Verzamel embryo's na 1 uur en was ze drie keer met schoon systeemwater.
  3. Plaats embryo's in 100 mm petrischaaltjes met vers E3-medium en breng ze uit bij 28 °C onder een lichtcyclus van 14 uur / 10 uur donker (lichten aan van 08:00 tot 22:00 uur).
    OPMERKING: Niet meer dan 50 embryo's per schaaltje met 20 mL medium om een normale ontwikkeling te waarborgen.
  4. Verwijder bij 1 dpf voorzichtig de onbevruchte, misvormde en abnormale embryo's met een Pasteur-pipet, en vervang de oplossing met zebravisembryo's. Voor de WT-groep vervang je het bestaande medium door een vers E3-embryomedium. Voor de MPTP-behandelde groep vervangt u het medium door een 50 μM MPTP-oplossing (Figuur 1A), en brengt u beide groepen terug naar de incubator.
  5. Voor beide groepen vervang je de oplossing en verwijder je elke 24 uur alle dode of ongezonde embryo's. Voor de met MPTP behandelde groep vervang je de MPTP-oplossing dagelijks vanaf de ochtend van 1 dpf tot de ochtend van 4 dpf (Figuur 1A). Vervolgens wordt de MPTP-behandelde groep vanaf de ochtend van 5 dpf overgezet naar E3-medium tot het einde van het experiment.
    OPMERKING: Vervang de oplossing voorzichtig met een Pasteur-pipet. Aspireer het medium langzaam vanaf de rand van de Petrischaal en voeg verse oplossing toe langs de wand van de Petrischaal om verstoring van de embryo's te minimaliseren.

3. Monitoring van slaap- en waakregulatie

  1. Bij 4 dpf selecteer je om 18:00 uur zebravislarven uit elke groep en breng je ze over op een plaat met 96 putten met een aangepaste 3 mL Pasteur-pipet met de punt afgesneden, één larve per put (Figuur 1B). De eerste vier rijen vertegenwoordigen de WT-groepen, en de laatste vier rijen de MPTP-groepen (48 zebravissen in elke groep).
    OPMERKING: Om te voorkomen dat zebravissen prikkelen of beschadigen, past u Pasteur-pipetten aan door de punt (10 mm) af te snijden zodat er een brede boring ontstaat die groter is dan de grootte van 4 dpf zebravislarven (lichaamslengte is meer dan 3,7mm).
  2. Bekijk elke put met een stereomicroscoop om te controleren of het uiterlijk van elke zebravislarve gezond is, de vinnen open en regelmatig zwaaien, het lichaam rechtop staat en de zwemblaas is opgeblazentot 29. Nadat je hebt gecontroleerd dat de zebravissen in elke put gezond zijn, vul je elke put met E3 medium.
    OPMERKING: Vul elke put met E3 medium tot bijna uitstulping, zodat de oppervlaktespanning behouden blijft. Voeg voorzichtig de vloeistof toe om belletjes en overstromingen van de kruisput te voorkomen.
  3. Na het overbrengen van de vis en vloeistof in een plaat met 96 putjes, plaats je deze in de Zebrabox-kamer om 30 minuten te acclimatiseren voorafgaand aan de slaap-waakgedragstest.
    OPMERKING: Maak de onderkant van de plaat zorgvuldig schoon voordat je de 96-well-plaat in de Zebrabox-kamer plaatst om te voorkomen dat vuil de video-tracking resultaten beïnvloedt.
  4. Open de Zebralab-videotrackingsoftware, selecteer de kwantisatiemodus en zorg ervoor dat de 96-wellplaat centraal op de bodem van de Zebrabox-kamer is geplaatst.
  5. Stel de lichtinstelling zo in dat het licht om 22:00 uur uitgaat en om 8:00 uur het licht aan, wat overeenkomt met de lichtomstandigheden wanneer de zebravis wordt grootgebracht. Overdag ligt het witte licht meestal rond de 1000 lux. Stel de softwareparameters als volgtin: 29: detectiedrempel 40; burst, 25 (drempel voor on-beweging); bevriezen (drempel voor beweging bij beweging), 4; Containergrootte, 60 s; Totale monitoringstijd: 52 uur (20:00 uur op de eerste dag tot 00:00 uur op de derde dag). Begin de slaap-wakkerprocedure om 20:00 uur.
    OPMERKING: Zodra de procedure is gestart, moet je elk geluid en trilling van buitenaf tijdens het experiment verbieden, zodat het normale slaap-waakritme van zebravissen niet wordt aangetast. Om waterverdamping tijdens langdurige monitoring te voorkomen, bedek de 96-well-plaat met transparante plasticfolie.
  6. Na 52 uur stop je het slaap-wake-experiment en sla je het databestand op. Verwijder de 96-well-plaat uit de ZebraBox.
    OPMERKING: Met behulp van MATLAB en Excel zijn noodzakelijke parameters zoals het aantal slaapbuien (slaap wordt gedefinieerd als periodes van inactiviteit van minstens 1 minuut)29, gemiddelde slaapduur (gemiddelde duur van slaapperiodes), totale slaapduur (alle duur van slaapperiodes gedurende de monitoringperiode), slaaplatentie (tijd van een lichte overgang tot het begin van de eerste slaap), Gemiddelde activiteit (gedefinieerd als lokomotorische activiteit gedurende de hele monitoringperiode) en wakkere activiteit (gedefinieerd als locomotorische activiteit alleen tijdens de wakkere periode, exclusief de slaapperiodes) werden geëxtraheerd en geanalyseerd uit het databestand.
    1. Gebruik een Student's t-test om de verschillen tussen de WT-groep en de MPTP-behandelde groep te vergelijken. Plot daarnaast de slaapcurve, de wakkerheidscurve en de gemiddelde activiteitscurve van zebravissen over de 52 uur met behulp van MATLAB-software.

4. Fotomotorische responsparadigma's

OPMERKING: Fotomotorische responsparadigma's (inclusief stroboscooplicht) zijn high-throughput gedragstests bij 5 dpf-larven om sensorimotorische en reflexieve bewegingsveranderingen te kwantificeren als reactie op een plotselinge lichtovergang. Deze test werd uitgevoerd met een plaat met 96 putjes, inclusief 2 paradigma's: (1) een lichtovergang van 1 minuut duisternis naar 1 minuut constant licht (1000 lx), en (2) een stroboscooplichtrespons waarbij 1 minuut duisternis naar 1 minuut stroboscopisch licht bij 10 Hz werd overgegaan.

  1. Plaats de 5 dpf larven in een plaat met 96 putten (1 larve per put) (Figuur 1B) en vul elke put met E3-medium. Verdeel in totaal 96 larven gemiddeld in de WT-groep en de MPTP-groep.
  2. Donker-constant lichtparadigma:
    1. Plaats de 96-put plaat met 5 dpf larven in de zebrabox en laat de larven 5 minuten in het donker acclimatiseren voor de test.
    2. Open de Tracking-online analysemodus.
    3. Stel het lichtovergangsprogramma als volgt in: 0-60 s: Donker, 60-120s: Constant licht (1000 lx).
    4. Start het protocol, verzamel gerelateerde bewegingsparameters elke 6 seconden gedurende de 120 seconden assay.
    5. Stop het protocol bij 120s , exporteer het databestand. Plaats de larven 5 minuten in volledige duisternis om de omgeving te laten wennen, zodat ze voorbereid zijn op de volgende donkere stroboscopische lichttest.
  3. Donker-stroboscopisch lichtparadigma:
    1. Stel het lichtovergangsprogramma als volgt in: 0-60 s: Donker, 60-120s: stroboscopisch licht (1000 lx) bij 10 Hz.
      OPMERKING: Een stroboscop van 10 Hz komt overeen met 10 lichtpulsen per seconde. In ZebraLab implementeer je dit door de lichtintensiteit te wisselen van 0 naar 1000 lx elke 100 ms.
    2. Na voltooiing van de 5 minuten durende donkere aanpassing begin je met de donker-naar-stroboscoop lichtassay. Verzamel bewegingsparameters elke 6 seconden gedurende de 120 seconden test.
  4. Data-analyse: Zodra de assay is afgerond, exporteer je het databestand. Gebruik MATLAB-software om elke 6 seconden de zwemafstand te halen. Plot de totale afstand (gemiddelde waarde per 6 seconden) die in de 2 minuten periode voor beide assays is gezwommen. Bereken de vriesindex door de totale afstand die in 1 minuut in het donker wordt afgelegd af te trekken van de totale afgelegde afstand in delichte 30.
    OPMERKING: Bevriezingsindex < 0 duidt op bevriezingsgedrag; Vriesindex > 0 duidt ontsnapping aan; Vriesindex = 0 betekent geen reactie. Gebruik een Student's t-test en een tweerichtings-ANOVA om de verschillen tussen de WT-groep en de MPTP-behandelde groep te vergelijken. In totaal werden 48 zebravislarven (n = 48) gebruikt voor elke groep.

5. Beoordeling van thigmotaxis

  1. Selecteer twee platen met 6 putjes, vul elke put met 4 mL E3 medium.
  2. Bij 5 dpf werden zebravislarven uit de WT-groep en MPTP-behandelde groep verzameld en in twee platen met 6 putten geplaatst (één is de WT-groep, de andere de MPTP-behandelde groep, 1 larve per put) (Figuur 1C).
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de beginpositie van de larven in het midden van de putten ligt.
  3. Voor de thigmotacsi-beoordeling moeten de putplaten 15 minuten van tevoren op de juiste plek van de Zebrabox worden geplaatst om ruimte te bieden.
  4. Gegevensverzameling en -analyse: Met de functie Draw Area tekenen we twee concentrische cirkels in het observatiegebied van elke put (de straal van de middelcirkel is 1/2 van de straal van het gat) (Figuur 1C), en de resterende parameters worden gelijkgesteld aan de locomotorische beoordeling. Begin met het protocol voor 5 minuten thigmotaxie-beoordeling en doe een parallel experiment.
    OPMERKING: Na afloop van het programma zal Zebralab-software binnen 5 minuten de baan van zebravislarven genereren en diverse gerelateerde bewegingsparameters. In het databestand vertegenwoordigt an1 het volledige oppervlak van elke put, en an2 de binnenste zone van elke put. Dus totale dis(an1) en totale dur(an1) duiden de totale zwemafstand en totale tijd in de hele put aan, terwijl totale dis(an2) en totale dur(an2) respectievelijk de afstand en tijd in de binnenste zone weergeven.
    1. Bereken de thigmotaxis met de volgende formules:
      Bereken het percentage van de zwommen afstand in de buitenste zone:
      figure-protocol-1
      Bereken het percentage van de tijd die in de buitenzone wordt doorgebracht:
      figure-protocol-2
    2. Gebruik een Student's t-test om de verschillen in thigmotaxis tussen de WT-groep en de MPTP-behandelde groep te vergelijken. In totaal werden 24 zebravislarven (n = 24) per groep gebruikt.

6. Locomotorische beoordeling

  1. Bij 5 dpf selecteren zebravislarven uit de WT-groep en de MPTP-behandelde groep, en respectievelijk worden overgebracht naar twee platen met 12 putten (één is de WT-groep, de andere de MPTP-behandelde groep, 1 larve per put, met 2 mL E3-medium) (Figuur 1D).
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de grootte van de zebravislarven vergelijkbaar is, en de geselecteerde larven moeten open vinnen, een rechtopstaande houding, goede uitzetting van de zwemblaas en regelmatige beweging hebben.
  2. Plaats vóór de locomotorbeoordeling de putplaat 15 minuten van tevoren in de testpositie van de Zebrabox om aan te passen.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de lichtomstandigheden tijdens de aanpassing overeenkomen met de lichtomstandigheden tijdens de test.
  3. Na een acclimatisatieperiode van 15 minuten selecteer je de trackingmodus-online analyse, registreer je de bewegingsactiviteit van elke larve gedurende 5 minuten met een geautomatiseerd geautomatiseerd videotrackingsysteem. Met Zebralab-software verzamel ik elke 60 seconden bewegingssporen en diverse gerelateerde bewegingsparameters, exporteer ik het volledige databestand en gebruik ik MATLAB om de totale afstand en gemiddelde snelheid van elke larve in 5 minuten te analyseren.
    1. Gebruik een Student's t-test en een tweerichtings-ANOVA om de verschillen tussen de WT-groep en de MPTP-behandelde groep te vergelijken. In totaal werden 24 zebravislarven (n = 24) per groep gebruikt.

7. Startle response test

OPMERKING: Deze test meet de visuele schrikrespons (VSR), ook wel dark-flash geïnduceerde schrik, veroorzaakt door plotselinge overgangen naar duisternis. Deze schrikresponstest beoordeelt een fototisch opgewekte visuele schrik die wordt opgewekt door abrupte, millisecondeschaal donkere flitsen. In tegenstelling tot het donker-stroboscooplichtparadigma, dat herhaalde lichtpulsen omvat om aanhoudende gedragsreacties te evalueren, richt deze test zich op snelle, reflexieve motorische reacties op een acute visuele prikkel.

  1. Preparaten: bij 5 dpf selecteer zebravislarven uit de WT-groep en de MPTP-behandelde groep, en breng ze respectievelijk over naar twee platen met 12 putten (één is de WT-groep, de andere de MPTP-behandelde groep, 1 larve per put, met 2 mL E3-medium) (Figuur 1D).
  2. Plaats vóór de startle response-test de putplaat 5 minuten van tevoren in de testpositie van de Zebrabox om zich aan te passen.
  3. Stel de stimulatieparameters in: open de Zebralab-software , start de Tracking-online analysemodus, open de Licht-triggerinterface , selecteer Gebruik een van de 3 triggermethoden hieronder, schakel Verbeterde stimuli in, zet op Wanneer sessie wordt gestart; in het overgangsschema wordt het donkere flitsritme als volgt gedefinieerd (het programma begint na 21 seconden te activeren): Transitie 1: 5 ms, 100% lichtintensiteit; Overgang 2: 2890 ms, 100% lichtintensiteit; Overgang 3: 5 ms, 0% lichtintensiteit; Overgang 4: 100 ms, 0% lichtintensiteit; vink de lijst van overgangen aan om periodiek te flashen.
  4. Start protocol: zorg ervoor dat de Numeriscope-video-opnamefunctie is ingeschakeld, high-throughput geautomatiseerde tracking genereert een multidimensionale dataset met 30 gedrags-eindpunten in deze test uit de jaren 90.
  5. Data-analyse: Na voltooiing van de startle response assay exporteer je de ruwe databestanden en importeer je ze in de MATLAB-software voor analyse. Bereken de zwemafstand van elke larve in intervallen van 3 seconden, samen met de gemiddelde zwemsnelheid.
    1. Identificeer de piekbewegingsafstand, pieksnelheid of responslatentie na de flashstimulus voor elke groep. Gebruik een Student's t-test en een tweerichtings-ANOVA om de verschillen tussen de WT-groep en de MPTP-behandelde groep te vergelijken. In totaal werden 24 zebravislarven (n = 24) per groep gebruikt.

8. Licht-donker uitdagingstest

  1. Bij 5 df overbrengen zebravislarven individueel in twee platen met 24 putten (Figuur 1E), met één larve per put en 1 mL E3-medium per put. Elke plaat bevatte 24 larven, en de twee platen met 24 putjes waren gelijkmatig verdeeld in de WT-groep en de MPTP-behandelde groep (n = 24 per groep).
  2. Plaats vóór het testen de 24-wellplaat in het aangewezen testgebied binnen de Zebrabox voor een lichtacclimatisatieperiode van 5 minuten om de testomgeving aan te passen. Activeer de Tracking-Online Analysemodus. Configureer het lichtprogramma als volgt: 6 minuten constant licht gevolgd door 4 minuten volledige duisternis (Figuur 1E). De totale testtijd is 10 minuten en de intervaltijd voor het verzamelen van datapunten is 60 seconden.
    OPMERKING: De globale 6 minuten licht is bedoeld voor acclimatisatie en habituatie, zodat stabiele basisreacties op de beweging en speciale licht-donker responsenzijn 31,32.
  3. Stop op de 10eminuut met het opnemen van gedrag en sla data op. Haal het bord voorzichtig uit de Zebrabox.
  4. Voor elke larve haal je de zwemafstand op elke 60 seconden afstand. Bereken de afstand die wordt afgelegd tijdens de lichte fase (0-6 minuut), de donkere fase (7-10minuut) en de totale periode van 10 minuten. Kwantificeer het thigmotaxis-gedrag en de habituatieleerprestaties in de donkere fase.
    OPMERKING: Habituatieleren wordt gedefinieerd als de vermindering van een gedragsrespons wanneer een dier wordt blootgesteld aan een continue prikkel/omgeving33,34, en het werd beoordeeld door statistisch de gemiddelde totale afstand (mm) te vergelijken tijdens de 1e minuut en de 4eminuut na de licht-donker overgang. Gebruik een Student's t-test en een tweerichtings-ANOVA om de verschillen tussen de WT-groep en de MPTP-behandelde groep te vergelijken. In totaal werden 24 zebravislarven (n = 24) per groep gebruikt.

9. Verwijdering van MPTP-afval

OPMERKING: Spray en veeg na elk gedragsexperiment oppervlakken die met MPTP in contact zijn (bijvoorbeeld laboratoriumbanken en de ZebraBox) met vers bereide natriumhypochloriet (bleekmiddel; ≥10% v/v).

  1. Verzamel het vloeibare afval (inclusief resterende blootstellingsoplossingen en spoelmiddelen) en vast afval (bijv. Pasteur-pipetten, handschoenen, petrischalen en multi-well platen) van MPTP. Merk ze duidelijk als gevaarlijk neurotoxisch afval.
  2. Behandel besmet vloeibaar afval en vaste materialen met vers bereid natriumhypochloriet (bleekmiddel; ≥10% v/v) gedurende minstens 24 uur om decontaminatie te garanderen, gevolgd door verwijdering volgens de institutionele regelgeving.
  3. Euthanaseer met MPTP behandelde zebravislarven door ze te dompelen in een verdunde natriumhypochlorietoplossing (bijv. 1:5 verhouding van 6% bleekmiddel tot water) gedurende 5 minutenen 35 minuten. Bevestigde dood door gebrek aan beweging en hartslag. Behandel de gedesinfecteerde larven en media als gevaarlijk biologisch afval voor institutionele verwijdering (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monitoring van slaap-wakkerregulatie
De 52-uur slaap-wake regulatiemonitoring begon bij 4 dpf en werd uitgevoerd met behulp van een 96-well plaat. Zebravissen in MPTP-behandelde groepen vertoonden significante verstoringen in slaapstructuur vergeleken met de WT-groep. Representatieve slaapcurves, plots van waakactiviteit en gemiddelde activiteitssporen zijn weergegeven in Figuur 2. Parameters van slaap-waakregulatieanalyse bij zebravislar...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie ontwikkelde en verifieerde een uitgebreid protocol om MPTP-geïnduceerd PD-achtig gedragsfenotype te evalueren en te analyseren. Dit protocol bevatte 6 verschillende tests: locomotorische beoordeling, thigmotacis-assay, startle response test, fotomotorische responsparadigma's (inclusief stroboscooplichtstimulatie), licht-donker challenge assay en monitoring van slaap-wake regulatie, om de motorische en niet-motorische defecten van PD te evalueren en weer te geven. De resultate...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs geven geen belangenconflicten aan.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (nr. 21906095), Shandong University Young Scholar Future Program Sponsorship, de Shandong Natural Science Foundation (nr. ZR2019BB018), de Fundamentele Onderzoeksfondsen van de Universiteit van Shandong (nr. 2017GN0030), de China Postdoctoral Science Foundation (nr. 2018M640640). Het wordt ook ondersteund door zowel het Open Research Fund 2025 van het Digital Fujian Institute of Big Data for Elderly Rehabilitation and Nursing (subsidienummer BDRI202502) en het Open Onderzoeksfonds 2025 van het Key Laboratory of Bioactive Materials, Ministerie van Onderwijs, Nankai Universiteit (subsidienummer SWHX-202503). Onderzoeksproject van Jinan Microecological Biomedicine Shandong Laboratorium (subsidienummer JNL-2023002KF). De auteurs willen het Laboratoriumdierencentrum, Qilu Ziekenhuis van de Universiteit van Shandong, en Dr. Sun Chengxi van de afdeling Klinisch Laboratorium van het Qilu Ziekenhuis van de Universiteit van Shandong bedanken voor hun hulp tijdens het experiment.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100× E3 stock solutionShanghai Feixi BiotechnologyN/Abevattend 34,8 g NaCl, 1,6 g KCl, 5,8 g CaCl2·2H2O, en 9,78 g MgCl2·6H2O per liter
12-Well Cell Culture PlateNEST Biotechnology712011Niet-behandeld, niet-pyrogeen, steriel, polystyreen.Gebruikt voor gedragstesten bij zebravislarven
24-Well Cell Culture PlateNEST Biotechnology702011Niet-behandeld, niet-pyrogeen, steriel, polystyreen.Gebruikt voor gedragstesten bij zebravislarven
3 mL Pasteur PipetteBiologix30-0238A1
6-Well Cell Culture PlateNEST Biotechnology703011Niet-behandeld, niet-pyrogeen, steriel, polystyreen.Gebruikt voor gedragstesten bij zebravislarven
96-Well Cell Culture PlateNEST Biotechnology701011Niet-behandeld, niet-pyrogeen, steriel, polystyreen.Gebruikt voor gedragstesten bij zebravislarven
MATLAB R2020aMathWorks, USA N/AMATLAB R2020a, campus-wide licentie verkregen vanuit Shandong University software portaal (softms.sdu.edu.cn).Gebruikt voor statistische analyse van gedragsdata van zebravislarven.
Microsoft ExcelMicrosoftN/AMicrosoft Excel (onderdeel van Microsoft Office), versie geïnstalleerd via Shandong University gelicentieerde software portaal (softms.sdu.edu.cn).
MPTP(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine) Beyotime411252815 mg
PetrischaalNEST Biotechnology704202100 mm, steriele, makkelijk te grijpen handvat, TC-behandeld
NatriumhypochlorietoplossingMacklinS817439stock huishoudelijke bleekoplossing (6-14% actieve chloorbasis), verdund tot ≥10% v/v voor oppervlakte- en afvalontsmetting; ook verdund 1:5 (6% bleek: water) voor euthanasie van MPTP-behandelde zebravislarven.
Stereo MicroscoopOlympusSZX2 series
Zebrabox High-Resolution Video Tracking System Viewpoint, Frankrijk N/A
Zebralab Software Viewpoint, Frankrijk N/AVersie (3,52,3,87)

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Elbaz, A., Carcaillon, L., Kab, S., Moisan, F. Epidemiology of Parkinson's disease. Rev. Neurol. (Paris). 172 (1), 14-26 (2016).
  2. Elgueta, D., et al. Analyzing the Parkinson's disease mouse model induced by adeno-associated viral vectors encoding human alpha-synuclein. J Vis Exp. (185), e63313(2022).
  3. Peng, S. Y., Liu, P., Wang, X. W., Li, K. Y. Global, regional and national burden of Parkinson's disease in people over 55 years of age: a systematic analysis of the global burden of disease study, 1991-2021. BMC Neurol. 25, 178(2025).
  4. Zhu, J. Q., et al. Temporal trends in the prevalence of Parkinson's disease from 1980 to 2023: a systematic review and meta-analysis. Lancet Healthy Longev. 5 (7), 464-479 (2024).
  5. Goldman, J. G. Non-motor symptoms and treatments in Parkinson's disease. Neurol Clin. 43 (2), 291-317 (2025).
  6. Kobylecki, C. Update on the diagnosis and management of Parkinson's disease. Clin Med. (Lond). 20 (4), 393-398 (2020).
  7. Zhou, J., Li, J., Papaneri, A. B., Kobzar, N. P., Cui, G. Dopamine neuron challenge test for early detection of Parkinson's disease. NPJ Parkinsons Dis. 7, 116(2021).
  8. Tolosa, E., Garrido, A., Scholz, S. W., Poewe, W. Challenges in the diagnosis of Parkinson's disease. Lancet Neurol. 20 (5), 385-397 (2021).
  9. Salat, D., Tolosa, E. Levodopa in the treatment of Parkinson's disease: Current status and new developments. J. Parkinsons Dis. 3 (3), 255-269 (2013).
  10. Kalia, L. V., et al. Disease-modifying therapies for Parkinson's disease: Lessons from multiple sclerosis. Nat Rev Neurol. 20 (12), 724-737 (2024).
  11. Thirugnanam, T., Santhakumar, K. Chemically induced models of Parkinson's disease. Comp. Biochem. Physiol C Toxicol Pharmacol. 252, 109213(2022).
  12. Crabtree, D. M., Zhang, J. H. Genetically engineered mouse models of Parkinson's disease. Brain Res. Bull. 88 (1), 13-32 (2012).
  13. Hallett, P. J., et al. Successful function of autologous iPSC-derived dopamine neurons following transplantation in a non-human primate model of Parkinson's disease. Cell Stem Cell. 16 (3), 269-274 (2015).
  14. Dovonou, A., et al. Animal models of Parkinson's disease: bridging the gap between disease hallmarks and research questions. Transl. Neurodegener. 12, 36(2023).
  15. Potts, L. F., et al. Modeling Parkinson's disease in monkeys for translational studies: A critical analysis. Exp. Neurol. 256, 133-143 (2014).
  16. Doyle, J. M., Croll, R. P. A critical review of zebrafish models of Parkinson's disease. Front. Pharmacol. 13, 835827(2022).
  17. Bagwell, E., Larsen, J. A. A review of MPTP-induced Parkinsonism in adult zebrafish to explore pharmacological interventions for human Parkinson's disease. Front. Neurosci. 18, 1451845(2024).
  18. Feng, X. -Z., et al. Behavioral assessments of spontaneous locomotion in a murine MPTP-induced Parkinson's disease model. J Vis Exp. 143, e58653(2019).
  19. Razali, K., Kumar, J., Mohamed, W. M. Y. Characterizing the adult zebrafish model of Parkinson's disease: a systematic review of dynamic changes in behavior and physiology post-MPTP administration. Front. Neurosci. 18, 1432102(2024).
  20. Brinez-Gallego, P., et al. Experimental models of chemically induced Parkinson's disease in zebrafish at the embryonic larval stage: A systematic review. J Toxicol Environ Health B Crit Rev. 26 (4), 201-237 (2023).
  21. Xu, Z. H., et al. Deep clinical phenotyping of Parkinson's disease: Towards a new era of research and clinical care. Phenomics. 2 (5), 349-361 (2022).
  22. Tinaz, S. Functional connectome in Parkinson's disease and Parkinsonism. Curr Neurol Neurosci Rep. 21, 24(2021).
  23. Costa, H. N., et al. Parkinson's disease: A multisystem disorder. Neurosci Bull. 39 (1), 113-124 (2023).
  24. Christensen, C., Thorsteinsson, H., Maier, V. H., Karlsson, K. Æ Multi-parameter behavioral phenotyping of the MPP⁺ model of Parkinson's disease in zebrafish. Front Behav Neurosci. 14, 623924(2020).
  25. Zhang, S., et al. Anti-Parkinson's disease activity of phenolic acids from Eucommia ulmoides Oliver leaf extracts and their autophagy activation mechanism. Food Funct. 11 (2), 1425-1440 (2020).
  26. Maleski, A. L. A., et al. Integrated behavioral and proteomic characterization of MPP⁺-induced early neurodegeneration and Parkinsonism in zebrafish larvae. Int J Mol Sci. 26 (14), 6762(2025).
  27. Vauti, F., et al. All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish. PLoS One. 15 (8), e0237167(2020).
  28. Parichy, D. M., et al. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  29. Lee, D. A., Oikonomou, G., Prober, D. A. Large-scale analysis of sleep in zebrafish. Bio Protoc. 12 (3), e4313(2022).
  30. Shen, Q., et al. Rapid well-plate assays for motor and social behaviors in larval zebrafish. Behav Brain Res. 391, 112625(2020).
  31. Rock, S., et al. Detailed analysis of zebrafish larval behaviour in the light-dark challenge assay shows that diel hatching time determines individual variation. Front Physiol. 13, 827282(2022).
  32. Hillman, C., Kearn, J., Parker, M. O. A unified approach to investigating 4 dpf zebrafish larval behaviour through a standardised light/dark assay. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 134, 111084(2024).
  33. Best, J. D., et al. Non-associative learning in larval zebrafish. Neuropsychopharmacol. 33 (5), 1206-1215 (2008).
  34. Gomez-Laplaza, L. M., Gerlai, R. Latent learning in zebrafish (Danio rerio). Behav Brain Res. 208 (2), 509-515 (2010).
  35. Winn, A. A., Prestia, K. A., Peneyra, S. M. Testing alternative surface disinfection agents for zebrafish (Danio rerio) embryos. J Am Assoc Lab Anim Sci. 60 (5), 510-518 (2021).
  36. Wagle, M., Nguyen, J., Lee, S., Zaitlen, N., Guo, S. Heritable natural variation of an anxiety-like behavior in larval zebrafish. J Neurogenet. 31 (3), 138-148 (2017).
  37. Maximino, C., et al. Measuring anxiety in zebrafish: a critical review. Behav Brain Res. 214 (2), 157-171 (2010).
  38. Schnorr, S. J., Steenbergen, P. J., Richardson, M. K., Champagne, D. L. Measuring thigmotaxis in larval zebrafish. Behav Brain Res. 228 (2), 367-374 (2012).
  39. Dekens, M. P. S., Fontinha, B. M., Gallach, M., Pflugler, S., Tessmar-Raible, K. Melanopsin elevates locomotor activity during the wake state of the diurnal zebrafish. EMBO Rep. 23 (5), e51528(2022).
  40. Lee, H. B., et al. Key HPI axis receptors facilitate light adaptive behavior in larval zebrafish. Sci Rep. 14 (1), 7759(2024).
  41. Cavanagh, J. F., Kumar, P., Mueller, A. A., Richardson, S. P., Mueen, A. Diminished EEG habituation to novel events effectively classifies Parkinson's patients. Clin Neurophysiol. 129 (2), 409-418 (2018).
  42. Bedrossiantz, J., Prats, E., Raldua, D. Neurotoxicity assessment in adult Danio rerio using a battery of behavioral tests in a single tank. J Vis Exp. 201, e65869(2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Zebravismodel voor de ziekte van ParkinsonMPTP inductiegedragsfenotyperingzebravislarvenlocomotorische assaybeoordeling van thigmotaxisschrikreactietestlicht donkeruitdagingslaap waakmonitoringgeautomatiseerde videotracken

Gerelateerde artikelen