Tweekleurige multivezelfotometrie-opnames van het Social Behavior Network bij muizen

Samenvatting

Vezelfotometrie is een van de meest gebruikte technieken om calciumactiviteit van neurale populaties in de diepe hersenen te registreren. Hier beschrijven we een protocol voor aanpasbare, multisite tweekleurenbeeldvorming van calciumactiviteit en andere dynamische fluorescerende signalen van diepe hersenneurale populaties bij muizen.

Samenvatting

Vezelfotometrie, het bulk-vastleggen van signalen via een glasvezelkabel, is een nuttige methode om calciumactiviteit van groepen neuronen in het vrij bewegende knaagdier op te nemen. Met name maakt deze methode het richten op kleine populaties genetisch gespecificeerde neuronen in meer ventrale en minder toegankelijke hersengebieden tot een behandelbaar probleem, omdat het lastig blijft om op cellulaire resolutie te registreren. Deze techniek kan worden opgeschaald om van meerdere locaties gelijktijdig op te nemen met een gebundelde multifiber-methode en kan meerdere celtypen targeten met genetische strategieën op elke geregistreerde locatie. Hier bieden we een protocol voor het bouwen en invoegen van aangepaste multifiberarrays voor het targeten van het sociale gedragsnetwerk van de muis (tot 12 sites). Dit protocol beschrijft de chirurgische procedures die nodig zijn voor het succesvol targeten van meerdere locaties met behulp van onze aangepaste multivezelarrays en de virale aanpak voor het afgeven van groen- en roodverschuifte fluorescerende indicatoren van calciumactiviteit voor gelijktijdige beeldvorming van twee genetisch geïdentificeerde neurale populaties op elke locatie. We demonstreren hoe we vanuit deze regio's kunnen opnemen met een commercieel verkrijgbaar complementair metaaloxide-halfgeleider (CMOS) camerasysteem tijdens sociaal gedrag. Verder demonstreert dit protocol methoden voor kwaliteitscontrole en beschrijft het een preprocessing-pijplijn voor ruiscorrectie en standaardisatie. Tot slot bespreken we enkele mogelijke toepassingen van het hulpmiddel om nieuwe bevindingen te ontdekken over grootschalige hersennetwerken.

Inleiding

Vezelfotometrie, de bulkopname van fluorescerende signalen via glasvezelkabels, is uitgegroeid tot een krachtige techniek om neurale populatieactiviteit in diepe hersengebieden te meten. Vaak zijn deze gebieden niet gemakkelijk toegankelijk met micro-endoscopie of traditionele elektrofysiologische benaderingen ^1,2,3. Een belangrijk doel in de hedendaagse systeemneurowetenschap is het identificeren en ontrafelen van de berekeningen die worden gebruikt door grootschalige, celtype-specifieke hersennetwerken die betrokken zijn bij het genereren van gedrag. Neuropixelprobes en commercieel verkrijgbare multifiberferrules blinken uit in het opnemen van lineair uitgelijnde neurale populaties 4,5,6,7, terwijl widefield corticale beeldvorming uitstekende dekking biedt van oppervlakkige corticale dynamica ^8,9. Het gelijktijdig opnemen van ruimtelijk verspreide maar functioneel verbonden subcorticale neurale populaties is echter technisch uitdagend^gebleven 5,10,11,12. Verder is het mogelijk om meerdere diepe hersenstructuren te targeten met meerdere enkelvezelferrules voor fotometrie, maar deze aanpak is beperkt tot neurale populaties die voldoende van elkaar verwijderd zijn om meerdere ferrules te implanteren¹². Op maat gemaakte multifiber fotometrie-arrays vullen deze kloof door gelijktijdige opnames mogelijk te maken vanuit vele subcorticale gebieden bij vrij handelende dieren met minimale beperkingen, waardoor een uniek venster wordt geboden op netwerkcoördinatie tijdens complexe gedragingen.

Het sociale gedragsnetwerk (SBN) vormt een ideaal systeem om grootschalige hersennetwerkdynamiek te onderzoeken. De SBN is een dicht onderling verbonden en evolutionair geconserveerde set subcorticale structuren die betrokken zijn bij het genereren van sociaal gedrag, en die is geïdentificeerd bij alle gewervelden^klassen 13,14,15. Deze structuren omvatten traditioneel, maar zijn niet beperkt tot, het laterale septum, het preoptische gebied, de beddingkern van de stria terminalis, de voorste en ventromediale hypothalamische kernen, de mediale amygdala, nucleus accumbens en periaqueductaal grijs 13,14,15. Binnen de SBN spelen specifieke neurale populaties gedefinieerd door moleculaire markers een cruciale rol in de regulatie van sociaal gedrag. SBN ɣ-aminoboterzuur-erge (GABAerge) neuronen (gemarkeerd door de expressie van de vesiculaire GABA-transporter, of VGAT) en glutamaterge neuronen (gemarkeerd door expressie van de vesiculaire glutamaattransporter, of VGlut) vertegenwoordigen de belangrijkste exciterende en remmende celtypen binnen het netwerk en spelen waarschijnlijk dissociabele rollen in de modulatie van sociale actie 16,17,18,19. Naast deze klassieke neurotransmittersystemen speelt geslachtshormoonsignalering een cruciale rol in de werking van het netwerk. Bijvoorbeeld, veel mannelijke en vrouwelijke sociale gedragingen vereisen de expressie van oestrogeenreceptor alfa, en activiteit in SBN-neuronen die deze receptoren tot expressie brengen, drijft dit gedrag causaal^aan 16,20,21,22,23,24,25,26 . Daarnaast zijn SBN-neurale populaties verrijkt met liganden en receptoren van vele neuromodulerende systemen, waaronder dopamine, argininevasopresfine, oxytocine, opioïden, tachykinine, neuropeptide Y, prolactine, orexine, agouti-gerelateerde peptiden, melanocortinen, kisspeptine en gonadotrofine-releasing hormoon 17,18,19,27,28,29,30,³¹, en recente vooruitgang in genetisch gecodeerde sensoren maakt het nu mogelijk om veel van deze diverse signaalmoleculen te volgen 32,33,34,35,36,37,38. Omdat SBN-neurale populaties ruimtelijk verspreid zijn over subcorticale structuren, kunnen traditionele experimentele voorbereidingen (zoals extracellulaire elektrofysiologie, corticale oppervlaktebeeldvorming en eerdere benaderingen van multivezelfotometrie) de moment-tot-moment activiteitsdynamiek over dit grootschalige hersennetwerk niet vastleggen. Toch kunnen op maat gemaakte multisite vezelfotometrieplatforms door calciumdynamiek in genetisch gedefinieerde neurale populaties te monitoren naast neuromodulator-releasepatronen, onthullen welke specifieke celtypen en signaalmoleculen bepaalde kenmerken van sociaal gedrag coderen, wat nieuwe mechanistische inzichten biedt.

Hier ontwikkelden we een aanpasbaar platform voor multisite, tweekleurige vezelfotometrie die gelijktijdige opname mogelijk maakt van maximaal 12 hersengebieden in vrij handelende muizen. Met deze benadering voerden we tweekleurige fotometrie-opnames uit van calciumactiviteit van 22 geïdentificeerde neurale populaties verspreid over 11 SBN-hersengebieden, naast metingen van dopaminefluctuaties in de nucleus accumbens met een GPCR-activatie-gebaseerde-DA-sensor (GRAB-DA1m)³³ (Tabel 1). Dit protocol (Figuur 1) beschrijft de constructie van aangepaste multifiberarrays, chirurgische procedures voor het targeten van meerdere deep-brain sites, virale afgiftestrategieën voor het expresseren van dubbele calciumindicatoren (GCaMP³⁹ en RCaMP⁴⁰), gegevensverzameling met een commercieel beschikbaar CMOS-camera-gebaseerd vezelfotometriesysteem, kwaliteitscontrolemethoden en een preprocessingpijplijn voor ruiscorrectie en signaalstandaardisatie. Cruciaal is dat onze preprocessing-pijplijn isosbestische controlegolflengte-opnames bevat, waarmee we bewegingsartefactcorrectie kunnen uitvoeren. We hanteren een regressie-gebaseerde benadering⁴¹ om bewegingsartefacten te corrigeren, waardoor signaalnauwkeurigheid wordt gegarandeerd tijdens intensief sociaal gedrag zoals bestijgen of vechten. Omdat onze op maat gemaakte multivezelfotometriemethode tegelijkertijd activiteit kan monitoren die verspreid is over zowel proximale als distale deep-brain structuren, terwijl celtype-specificiteit van de opnames behouden blijft via genetische targeting^42,43, biedt het aanzienlijke voordelen ten opzichte van alternatieve benaderingen voor het registreren van neurale activiteitsdynamiek in deep-brain, grootschalige hersennetwerken.

Dit protocol is optimaal geschikt voor experimenten die gelijktijdige opnames vereisen van ruimtelijk verspreide subcorticale hersengebieden (≥4 locaties) bij vrij functionerende dieren, met name bij het onderzoeken van netwerkniveau-dynamiek over genetisch gedefinieerde celtypen of het volgen van neuromodulatorafgifte naast neurale activiteit. De benadering is vooral waardevol voor het bestuderen van naturalistisch gedrag waarbij krachtige beweging betrokken is (bijv. sociale interacties), waarbij onze bewegingsartefactcorrectiepijplijn zorgt voor signaalgetrouheid. Onderzoekers die zoeken naar single-cel resolutie, onderscheid tussen somatische en axonale signalen, of opnames van oppervlakkige corticale gebieden, kunnen alternatieve benaderingen (bijv. miniatuurmicroscopie, Neuropixels of breedveldbeeldvorming) echter geschikter vinden. Belangrijke praktische overwegingen zijn onder andere chirurgische complexiteit, de noodzaak van op maat gemaakte multifiberarray-fabricage en het opzetten van de benodigde materiaalinfrastructuur (3D-printmogelijkheden, glasvezelgereedschappen).

Protocol

OPMERKING: Dit protocol is getest en gevalideerd met volwassen muizen van 8–25 weken oud. Muizen werden gehuisvest bij 21–26 °C en 30%-70% luchtvochtigheid in een 12 uur durende omgekeerde donker-lichtcyclus (UIT: 10:00 uur; OP: 22:00 uur). Experimenten vonden uitsluitend plaats tijdens de subjectieve actieve (donkere) fase. Voedsel en water werden ad libitum verstrekt. Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van Princeton University en waren in overeenstemming met de normen van de National Institutes of Health.

1. Multifiber Array en Patchcord Fabricage (Figuur 1A)

1. Fabriceer patchcord (Figuur 2A).
   1. Verkrijg een patchkabel met 12 vezelvertakkingen en print de meegeleverde patchcordconnector en stereotactische booraccessoires (Supplemental File 1, Supplemental File 2, Supplemental File 3) met hars (treksterkte: 8,7 kilopond/vierkante inch [ksi], e-module: 377 ksi, warmteafbuiging: 138 °F, verlenging: 8%).
   2. Bouw de meegeleverde polijstpuck (Supplemental File 4) uit een roestvrijstalen staaf met een diameter van 2 inch en voeg een uitsparing van de grootte van de multifiberarray in het midden van de puck toe.
   3. Maak de overtollige hars handmatig uit de doorgaande gaten van de deuvelpen in de multivezelarray met een 1,22 mm x 11 mm boorkop. Zelfs bij precisie-3D-printen zijn de gaatjes in de deuvelpen iets te klein voor de deuvel om doorheen te gaan.
   4. Boor door glasvezel-doorgaatjes.
      1. Steek legeringsstalen deuvelpennen (1,19 mm x 12,7 mm) in alle 4 pengaten van het stereotactische booraccessoire en plaats de patchcordconnector onderzijde omhoog in het stereotactische booraccessoire, waarbij de deuvelpennen door de doorgaande gaten van de deuvelpinnen van de multivezelarray gaan.
      2. Draai de M4-stelschroeven in de schroefgaten van schroefdraad om de patchcordconnector vast te zetten en bevestig het stereotactische booraccessoire in het stereotactische frame.
      3. Steek een 0,25 mm x 5,5 mm boor in de stereotactische boor en monteer de boor aan het stereotactische frame. Met deze boor wordt de yaw, pitch en roll van de multifiberarray vlak gemaakt met een maximale afwijkingstolerantie van ±0,03 mm.
         OPMERKING: Vlak yaw en pitch op de meest voorste en achterste posities van de 3D-print, vlak rol bij de vier hoeken van de multifiber array.
      4. Boor in het midden boven een van de 3D-geprinte vezelgaten en stel de stereotactische frame-X/Y-coördinaten in op de ML (X) en AP (Y) coördinaten van het bijbehorende hersengebied (Tabel 1). Verplaats de boor naar de nieuwe (0, 0) coördinaten op het stereotactische frame om de boor boven het voorste dowel-pin doorgaatgat te centreren.
      5. Gebruik de 0,25 mm x 5,5 mm boor om elk vezeldoorgang tot een diepte van 5,5 mm uit te boren bij de stereotactisch gedefinieerde coördinaten (Tabel 1).
         OPMERKING: Gebruik een lang stuk overtollige vezel om te controleren of alle gaten volledig zijn vrijgemaakt voordat je de multifiberarray uit het stereotactische frame verwijdert. Dit beperkt het aantal keren dat de multifiberarray moet worden egaliseerd en geboord om de doorgaande gaten te verwijderen.
   5. Sluit aan de patchcordconnector en de vertakkende patchkabel
      1. Maak >10 cm van de patchcordvezels bloot. Knip vezels af met een vezeltekening om te zorgen dat ze even lang zijn. Plaats vervolgens elk een stuk van 3/16" en 5/16" krimpslang rond de 12 vezels op het patchcord.
         OPMERKING: De buis beschermt eventuele blootgestelde vezels nadat ze in de connector zijn gelijmd.
      2. Steek elke vezel in een van de doorgaande gaten in de patchcordconnector, zodat ongeveer 0,3 mm vezel aan de onderkant zichtbaar is. Na het inbrengen van alle vezels gebruik je een naaldpunt van 21–27 G om secondelijm aan te brengen op het bovenoppervlak van de patchcordconnector om de vezels op hun plaats te zetten.
      3. Breng epoxy aan op het bovenoppervlak van de patchcordconnector in een piramidevorm van 0,5–1 cm hoog. Zorg ervoor dat er geen epoxy op een andere plek komt dan het bovenoppervlak waar de vezels zijn aangebracht. Laat epoxy 's nachts op kamertemperatuur uitharden.
      4. Gebruik een heteluchtpistool op de laagste stand om de krimpbuis over de epoxy en de blootliggende vezel erboven te laten krimpen (<3–5 cm).
         OPMERKING: Raak de krimpbuis niet aan om brandwonden te voorkomen.
      5. Knip een stuk zachte plastic buis met een binnendiameter van 3 mm door tot de lengte van de resterende blootgestelde vezels, snijd een snede langs de rand van de buis en omsluit de resterende blootgestelde vezel in de buis.
      6. Kleur de heldere buis met een ondoorzichtige zwarte stift om te voorkomen dat de vezels zichtbaar zijn, zodat verlichting van blootgestelde vezels tijdens beeldvormingsexperimenten wordt geminimaliseerd.
   6. Poets het patchcord.
      1. Zet de patchcordconnector onderaan in de custom polijstpuck. Polijst de patchcordconnector op polijstplaten van 6 μm, 3 μm, 1 μm en vervolgens 0,01 μm korrel polijstplaten met 10–20 bewegingen in de vorm van het oneindig symbool/vel. Voor de 1 μm en 0,01 μm korrelplaten voeg je 5 druppels gedestilleerd water toe voordat je polijst.
      2. Veeg het oppervlak van de connector om overtollig gedestilleerd water te verwijderen. Controleer op vezeloneffenheden of scheuren aan de gepolijste zijde van de patchcordconnector met een brightfield-microscoop en, als die er zijn, herhaal je polijsten.
   7. Controleer de patchcord-uitgang.
      1. Verbind het Sub-miniatuur versie A (SMA) connectoruiteinde van de patchkabel met een CMOS-camera-gebaseerd vezelfotometrie-imagingsysteem. Met behulp van visuele coderingssoftware volgt u de handleiding van het fotometriebeeldsysteem en richt u de CMOS-camera op het SMA-uiteinde van de patchcord.
         OPMERKING: De handleiding wordt regelmatig bijgewerkt om aan te sluiten bij software-updates. Omdat de visuele code voor het fotometriesysteem vaak verandert bij nieuwe softwarereleases, bevat deze handleiding de meest actuele informatie over huidige softwarereleases.
      2. Meet de 470 nm patchcorduitgang bij 20% vermogen met een optische vermogensmeter. Herhaal stap 1.1.7 als de patchcorduitgang < 2,5 mW is.
2. Fabriceer een multivezelarray.
   1. Print de meegeleverde multifiberarray (Supplemental File 5, Supplemental File 6) met resin met de technische specificaties beschreven in stap 1.1.1.
   2. Maak een multifiberarray klaar.
      1. Steek M0.6 messing zeskantmoeren in elk van de vier sleuven in de zijhoeken van de multivezelarray en lijn het gat van de zeskantmoer uit in het midden van de opening.
      2. Breng een enkele druppel secondelijm aan vanaf de zijkant van elke zeskantmoer-sleuf met een naaldpunt van 21–27 G, en voeg indien nodig extra druppels toe voor versterking. Laat de lijm 5 minuten op kamertemperatuur drogen voordat je doorgaat naar de volgende stap.
      3. Schraap alle lijm aan de zijkanten van de multifiberarray weg met een scheermesje om te zorgen dat het in de polijstpuck past.
      4. Als overtollige secondelijm aan de oppervlaktezijde van de multifiberarray is opgedroogd, polijst dan het oppervlak van de multifiberarray met de custom polijstpuck en 30 μm korrel polijstplaten totdat de lijm is verwijderd en het oppervlak van de multifiberarray vlak is.
      5. Maak het overtollige resin handmatig uit de doorgaande gaten van de deuvelpen in de multivezelarray met een 1,22 mm boor.
   3. Boor doorlopende gaten (Figuur 2B-C).
      1. Steek leglegeringsstalen deuvelpennen (1,19 mm x 12,7 mm) in alle 4 pengaten van het stereotactische booraccessoire en plaats de multifiberarray aan de oppervlaktezijde (vlakke zijde) omhoog in het stereotactische booraccessoire, waarbij de deuvelpennen door de doorgaande gaatjes van de deuvelpin van de multivezelarray gaan.
      2. Herhaal stap 1.4.2– stap 1.4.5.
   4. Maak vezels klaar voor de multifiberarray.
      1. Strip de plastic behuizing van een sectie van 200 μm, 0,39 NA optische vezel met behulp van een vezelstripper. Maak de vezel schoon met ethanol.
      2. Snijd de vezels in ~3–5 cm lange secties met een vezelhak. Spleet deze secties verder doormidden met een vezelscribe. Gebruik een brightfield-microscoop om ervoor te zorgen dat ten minste één uiteinde van de gespleten delen vrij is van afbrekingen of onzuiverheden. Gebruik alleen vezels met minstens één onbeschadigd uiteinde.
      3. Plak een nauwkeurige liniaal van minstens 15 mm lang onder de brightfield-microscoop. Plaats de ongeschonden zijde van de vezel op de 0 mm positie op de liniaal (Figuur 2D). Snijd vezels op de gewenste lengte voor elk doelgebied (Tabel 1).
         OPMERKING: De vezellengte wordt berekend door 6 mm toe te voegen aan de stereotactische D/V-coördinaat voor de diepste vezel, en vervolgens die waarde voor alle vezels aan te passen om het verschil tussen hun D/V-coördinaat en de D/V-coördinaat van de diepste vezel te evenaren.
   5. Steek vezels in de multifiberarray.
      1. Plaats de multivezelarray met het oppervlak naar beneden in de fabricagehouder. Lijn het stuk uit en zet het vast met deuvelpennen.
      2. Pas de vezellengte aan op de locatie (Tabel 1) en plaats gespleten vezels in de juiste doorgaande gaten in de multifiberarray met de ongeschonden zijde naar boven. Zorg ervoor dat alle vezels helemaal naar binnen zijn geduwd voordat de volgende stap plaatsvindt.
      3. Breng secondelijm aan met een naaldpunt van 21–27 G om alle vezels op hun plaats te lijmen. Laat de lijm minimaal 30 minuten op kamertemperatuur inwerken voordat je doorgaat.
   6. Polijst de multifiberarray door stap 1.1.6 te herhalen met multifiberarray aan het oppervlak naar beneden (Figuur 2E).
   7. Controleer de efficiëntie van de multifiberarray.
      1. Maak het gepolijste oppervlak van de multivezelarray schoon met ethanol en breng er vervolgens index matching gel op. Steek 4 deuvelpennen in de patchcordconnector en bevestig de multifiberarray met G5-schroeven en bijbehorende schroevendraaier (Figuur 2F).
      2. Gebruik een powermeter om de 470 nm en 560 nm LED-uitstraling van de multifiberarray te meten. Bereken efficiëntie met deze waarden:
         
      3. Als de efficiëntie <75% is, herhaal dan stappen 1.2.7.1–1.2.7.2.
         OPMERKING: Als het opnieuw polijsten de efficiëntie niet verbetert en er geen vlekken op de vezels zijn, is het mogelijk dat de vezels op de multifiberarray niet uitlijnen met de patchcordconnector.
   8. Maak een multifiberarray klaar voor gebruik (Figuur 2G).
      1. Steek 4 deuvelpennen in de doorgaande gaten in de multivezelarray. Zorg ervoor dat de deuvelpennen niet meer dan 1 mm uit de hersenzijde van de multivezelarray steken.
      2. Plaats secondelijm aan de hersenzijde op de deuvelpennen. Laat de lijm minstens 10 minuten op kamertemperatuur drogen voordat je de multivezelarray gebruikt.

2. Chirurgie (Figuur 1B)

1. Maak operatieruimte en gereedschap klaar.
   1. Schoon stereotactisch frame om een aseptisch werkgebied te garanderen.
   2. Koop steriele, oplosbare hechtingen.
   3. Autoclave een paar fijne tangen, fijne schaar en twee bulldogklemmen.
   4. Zorg ervoor dat de vaporizer gevuld is met isofluran. Zorg ervoor dat de slangen voor de isoflurantie-, vacuüm- en zuurstofleidingen stevig zijn aangesloten op de vaporizer, inductiekamer en de neuskegel van het stereotactische frame.
2. Verkrijg jRCaMP1b, GCaMP6f en GRAB-DA1m adeno-geassocieerde virussen.
   VOORZICHTIG: Draag altijd persoonlijke beschermingsmiddelen bij het omgaan met virussen.
   1. Verdun virussen tot een werkzame concentratie van 1x10,¹³ en 4x10¹³ delen/milliliter indien nodig.
   2. Bereid een 1:1 mengsel van jRCaMP1b en GCaMP6f adeno-geassocieerde virussen voor.
   3. Plaats een aliquot van het 1:1 jRCaMP1b:GcaMP6f virale mengsel en een aliquot van GRAB-DA1m virus op ijs om de temperatuur op 4 °C te houden.
3. Induceer narcose.
   1. Plaats de muis in de inductiekamer en sluit de kamerdeur. Begin de zuurstofstroom naar de vaporizer met 1 L/min.
   2. Leid de gasstroom naar de inductiekamer en zet de vacuümleiding aan om overtollig gas uit de kamer te verwijderen. Stel de vaporizer in op een isofluraneconcentratie tussen 3% – 5%.
4. Zet de muis over naar het stereotactische frame.
   1. Zodra de ademhaling van de muis is vertraagd tot 1 ademhaling/s, verplaats je de muis naar het stereotactische frame. Haak de voorste snijtanden van de muis in de gleuf in het mondstuk van de neuskegel en draai de neuskegel strakker om de neus van de muis.
   2. Schakel de gasstroom over naar het stereotactische kader met de isofluranconcentratie ingesteld op 1%–2% om de anesthesie te behouden. Schakel de vacuümleiding om gas uit de neuskegel te verwijderen.
      OPMERKING: Monitor de ademhaling van de muis tijdens de operatie en pas de isofluranconcentratie aan indien nodig om diepe anesthesie te behouden met een ademhalingsfrequentie van 1 ademhaling/s. Diepe anesthesie moet periodiek tijdens de operatie worden bevestigd door ervoor te zorgen dat de muis niet reageert op een knellende teen.
   3. Stel het verwarmingssysteem in op een lichaamstemperatuur van 35 °C en breng optische zalf aan op de ogen van de muis om te voorkomen dat ze uitdrogen.
   4. Plaats stereotactische oorbalkjes zodat ze aan weerszijden van de schedel drukken, iets dorsaal en voor de gehoorgangen. Trek de oorbenen aan en zorg ervoor dat de schedel van de muis op zijn plaats zit door zachte druk uit te oefenen op de bovenkant van het hoofd van de muis.
5. Bereid de hoofdhuid voor op de incisie.
   1. Knip of scheer het haar bovenop het hoofd van de muis totdat het kort is. Breng ontharingsgel aan op de bovenkant van het hoofd van de muis en laat het ongeveer een minuut intrekken. Verwijder de resterende gel met een schoon wattenstaafje.
   2. Herhaal 2.5.1 indien nodig totdat alle haren op de bovenkant van het hoofd zijn verwijderd.
   3. Desinfecteer de huid bovenop het hoofd met wattenstaafjes om betadien (10% povidon-jodiumoplossing) aan te brengen, gevolgd door een 70% ethanoloplossing.
6. Ontbloot de schedel.
   1. Snijd een incisie langs de middenlijn van de schedel, die loopt van iets achter lambda tot iets vooraan de rostrale rhinale ader.
      OPMERKING: De rhostrale rhinale vena is het bloedvat dat zich op het dorsale oppervlak van de hersenen bevindt tussen de reukbol en de prefrontale cortex.
   2. Snijd en verwijder geschoren huid rond de zijkanten van deze incisie om een druppelvormige snede te vormen die de pariëtale botten, de voorste punt van het intrapariëtale bot en het deel van de neusbotten dat zich vóór de rostrale neusvena bevindt bloot (Figuur 2H).
   3. Maak het schedeloppervlak voorzichtig schoon met 0,9% zoutoplossing en een schoon wattenstaafje.
7. Vlak de schedel.
   1. Bepaal waar de rostrale neusvena de sagittale naad ontmoet. Markeer dit punt met een steriel scalpelmesje.
   2. Plaats een #92 carbid boorbit in de stereotactische boor en monteer de boor op het stereotactische frame. Gebruik de stereotactische manipulator om de punt van de boor op het schedeloppervlak te positioneren op het gemarkeerde punt en nul de X-, Y- en Z-coördinaten van de boor te zetten.
   3. Gelijke helling van de schedel door Z-diepte te meten op het gemarkeerde punt en -8,25 mm achter deze punt. Gelijk de gier van de schedel door de laterale afstand tussen het gemarkeerde punt en de positie -8,25 achterste te meten. Vlak rol door Z-diepte te meten op posities ±2,0–2,5 mm vanaf de middenlijn op posities -2,0, -4,5 en -7,0 mm ten opzichte van het gemarkeerde punt.
8. Voer craniotomieën en duratomieën uit.
   1. Vervang de boor door een #76 of #78 hardmetalen boor. Nul de boor op de gemarkeerde positie bij de aansluiting van de sagittale hechting, rostrale rhinale ader en schedeloppervlak.
   2. Verplaats de boor naar de A/P- en M/L-coördinaten van elk hersengebied (Tabel 1). Op elke locatie boren ze een craniotomie en verwijder je voorzichtig de dura mater bij elke craniotomie met een lege spuittip van 27G of kleiner.
9. Injecteer het virus.
   1. Trek glazen micropipetten zodat de punt minstens 7 mm taps toeloopt en een tipopening van 10–30 μm heeft.
      OPMERKING: Herstart stappen 2.9.2–2.9.12 als de micropipet na een van de volgende stappen luchtbellen bevat.
   2. Vul een lege glazen micropipettip met minerale olie. Steek de micropipettip in de nanoliter-injector en zet hem vast. Gebruik de nanoliter-injectorinterface om zoveel mogelijk minerale olie uit de micropipet te verwijderen.
   3. Bevestig de nanoliterinjector op het stereotactische frame. Knip een klein stukje paraffinewasvel af en leg het op het hoofd van de muis.
   4. Pipette 1 μL van het jRCaMP1b:GCaMP6f virusmengsel op de paraffinewas. Laat de punt van de nanoliterinjector zakken zodat de glazen micropipettip in het virusmengsel zit en vul de micropipet met virus via de interface van de injector.
   5. Herhaal 2.9.4 totdat alle virussen die gebruikt zullen worden overgedragen zijn aan de nanoliterinjector (Tabel 1). Verwijder en gooi de paraffinewas weg in een container voor biohazard afval.
   6. Nul de injectormicropipettip op de gemarkeerde positie bij de overgang van de sagittale naad, rostrale rhinale ader en schedeloppervlak.
   7. Beginnend met de meest ventrale naar de meest dorsale injectieplaats (Tabel 1), beweeg de micropipettip naar elke plek, laat deze zakken zodat het het hersenoppervlak raakt, en zet de Z-positie op het stereotactische frame nul.
   8. Op elke plaats laat je de micropipettip in de hersenen zakken tot deze 0,1 mm ventral is ten opzichte van de injectieplaats. Vervolgens hef je de micropipettip 0,1 mm naar de laatste injectieplaats. Laat het omliggende weefsel 30 seconden rond de punt van de micropipet zakken.
   9. Met behulp van de nanoliter-injectorinterface injecteer je 300 nL van het 1:1 jRCaMP1b:GcaMP6f virusmengsel met een snelheid van 1–2 nL/s om het mengsel op de huidige injectieplaats te verspreiden.
   10. Laat de micropipettip minstens 5 minuten na voltooiing van de injectie op de injectieplaats blijven. Tilt langzaam de micropipetpunt uit de hersenen om het risico te verminderen dat het virus dorsaal langs de injectiebaan verspreidt.
   11. Na het injecteren van het 1:1 jRCaMP1b:GcaMP6f virale mengsel op elke locatie, gebruik je de nanoliter-injectieinterface om de zuiger van de nanoliterinjector terug te brengen naar de oorspronkelijke positie. Verwijder de micropipet en gooi deze weg in een container voor scherpe afval voor biohazard.
   12. Indien nodig herhaal je stappen 2.9.2–2.9.11 voor elk hersengebied dat wordt beoogd voor GRAB-DA1m-expressie. Op elke doellocatie injecteer je 150 nL in plaats van de 300 nL die voor het virusmengsel wordt gebruikt.
10. Implanteer multifiber array.
    1. Bevestig de multifiberarray aan het stereotactische frame met een eventuele bevestiging die de multifiberarray kan vasthouden met de deuvelpennen om deze stabiel te houden tijdens de implantatie (Figuur 2I).
    2. Pas de positie van de multivezelarray zo aan dat elke vezel uitgelijnd is met het centrum van zijn respectievelijke craniotomie en met de langste vezel die op het hersenoppervlak rust. Zet de stereotactische manipulator op nul op deze locatie en laat de multifiberarray langzaam zakken tot deze 0,25 mm boven de D/V-positie van de diepste virusinjectie ligt (Tabel 1, Figuur 2J).
    3. Plaats een koud mengschaaltje op ijs en voeg er 1 schepje cementpoeder, 4 druppels vloeibare basis en 1 druppel katalysator aan toe. Meng 20 seconden.
       OPMERKING: Herhaal deze stap telkens wanneer vloeibaar cement wordt gebruikt en er meer nodig is.
    4. Gebruik een spuit en een naald van 23–31 G om vloeibaar cement over te brengen in de ruimte tussen de multivezelarray en de schedel.
    5. Breng vloeibaar cement aan met een dunne plastic applicator of spuitnaald om de vier zijden van de multivezelarray volledig te bedekken, waarbij een piramidevorm ontstaat uit de schedel (Figuur 2K). Laat het cement minstens 15 minuten drogen.
    6. Naai de huid samen langs de incisie om te voorkomen dat de schedel zichtbaar is.
11. Laat de muis herstellen.
    1. Verlaag de isofluranconcentratie tot 0.
    2. Zet de muis van een stereotactisch frame naar een verwarmingskussen en wacht tot de muis alert en mobiel is voordat je hem terug in de kooi zet.
    3. Laat de muis minstens twee weken herstellen voordat je met experimenten begint.

3. Multisite, tweekleurige calciumbeeldvorming (Figuur 1C)

1. Configureer Data Acquisition Device (DAQ).
   1. Verbind de GND met de AGND-poort boven de Ch7-poort met een elektrische draad.
   2. Verbind de DIO0 met een elektrische draad op de Ch0-poort.
2. Verbind het fotometriesysteem met de DAQ.
   1. Verbind het uiteinde van de Baby Neill Constant (BNC) connector van een gesplitste BNC-kabel (BNC-connector aan het ene uiteinde, rode en zwarte elektrische draden aan het andere uiteinde) op de ingangspoort van het fotometriesysteem. Verbind het BNC-connectoruiteinde van een andere gesplitste BNC-kabel op de uitvoerpoort van het fotometriesysteem.
   2. Neem de split BNC-kabel die is aangesloten op de ingang van het fotometriesysteem en verbind het rode draaduiteinde met de DIO1-poort van de DAQ. Neem de gesplitste BNC-kabel die op de uitvoerpoort van het fotometriesysteem is aangesloten en verbind het rode draaduiteinde met de Ch1-poort van de DAQ.
   3. Verbind de zwarte aardedraden van beide gesplitste BNC-kabels op de DAQ GND-poort.
3. Synchroniseer gedrag en fotometriecamera's.
   1. Zet meerdere gedragscamera's in één rij voor gelijktijdige opnames van gedrag vanuit meerdere hoeken.
      1. Verbind de opto-geïsoleerde uitgang (pin 4, witte draad) van de primaire gedrag camera met de niet-geïsoleerde ingang van de secundaire camera (pin 1, groene draad) met een weerstand van 3,3 KΩ. Verbind de 3,3 V uitgang van de primaire camera (pin 3, rode draad) op dezelfde 3,3 KΩ weerstand en op Ch2 op de DAQ.
      2. Verbind de opto-geïsoleerde uitgang van elke secundaire camera met behulp van een 3,3 KΩ weerstand.
      3. Verbind de aarde van de primaire camera (pin 6, bruine draad) met de aarde van elke secundaire camera. Verbind alle camera-aarddraden met de DAQ AGND-poort boven de Ch2-poort en met de uitgangsaarde van het fotometriesysteem.
4. Configureer de camera-gedragsinstellingen met behulp van de bijbehorende beeldsoftware.
   1. Stel de "Acquisition Frame Rate" in op 45 Hz en de versterking op 1.
   2. Stel de belichtingstijd in op 2998 μs, de belichtingsondergrens op 100 μs en de belichtingsbovengrens op 150.000 μs.
      OPMERKING: "Acquisitie-framerate" is mogelijk niet de daadwerkelijke framerate die wordt vastgelegd. Afhankelijk van de belichtingstijd en de gevraagde databandbreedte moet deze waarde mogelijk hoger worden ingesteld dan de uiteindelijke beeldfrequentie. Pas indien nodig de "Acquisitieframesnelheid" zo aan dat de weergegeven "Resulterende Framerate" 40 Hz is.
5. Configureer DAQ-software (Supplemental File 7).
   1. Voeg in de DAQ-software de DAQ toe als een 'Apparaat' en schakel over naar het 'Configuratiepaneel'.
   2. In het tabblad 'Kanalen', onder 'Analoge Input', activeer je kanalen 0–2. Activeer kanaal 0 onder 'Digitaal'.
      OPMERKING: Ch0 komt overeen met het transitor-transitor logic (TTL) signaal, Ch1 met het fotometriesysteem, en Ch2 met de daisy-chained camera's.
   3. Onder 'Analog Input' noem je kanaal 0 "TTL", kanaal 1 "Photometry_system" en kanaal 2 "Behavior_cameras", wat staat voor "Transitor-Transistor Logic". Onder 'Digitaal', noem kanaal 0 "TTL_trigger".
   4. Zet in het tabblad 'Triggers' triggers op handmatig. Stel in het tabblad 'Sample Rates' de samplefrequentie in op 350 Hz.
   5. Schakel over naar het 'Display Panel' en plaats de vensters 'Strip', 'Scalar' en 'Output' in de grafische gebruikersinterface.
6. Configureer fotometriesysteemsoftware (Supplemental File 8).
   1. Ontwikkel een workflow in de visuele coderingssoftware om een 5 V TTL-puls te accepteren om de opnames te activeren en om de tijdstempel voor elk frame, de fluorescentie-emissies voor de rode en groene kanalen per vezel, en de ruwe video op te slaan, zoals beschreven in de handleiding van het fotometriesysteem.
   2. Gebruik de node voor het fotometriesysteem in de workflow om ervoor te zorgen dat het systeem is ingesteld om afwisselende frames van 560, 470 en 415 nm LED's op 120 Hz op te nemen voor een functionele framerate van 40 Hz.
      OPMERKING: Deze tijddelingsmultiplexing (TDM)-benadering behandelt spectrale overlap tussen GCaMP en RCaMP door hun excitatie temporeel te scheiden, zodat elke indicator onafhankelijk wordt aangeslagen over opeenvolgende frames. Het hier gebruikte opnamesysteem gebruikt geoptimaliseerde banddoorlaatemissiefilters (groen kanaal: 500–530 nm; rood kanaal: >580 nm longpass) die spectrale kruisspraak verder minimaliseren door gedetecteerde fotonen te beperken tot golflengten die voornamelijk door elke indicator worden uitgezonden. De isosbestische golflengte van 415 nm exciteert zowel GCaMP als RCaMP evenveel, maar veroorzaakt minimale calciumafhankelijke fluorescentieveranderingen, waardoor een bewegingsartefact-controlesignaal wordt geleverd. Samen zorgen TDM-excitatie en spectrale filtering ervoor dat 470 nm-frames voornamelijk GCaMP-activiteit vastleggen (Figuur 3A), 560 nm-frames voornamelijk RCaMP-activiteit vastleggen (Figuur 3B), en 415 nm-frames calcium-onafhankelijke referentiesignalen voor bewegingscorrectie bieden.
7. Voer in vivo fotometrie-opnames uit.
   1. Krijg een muis die virale injecties en implantatie van een multifiber array heeft ondergaan zoals beschreven in stap 2.
   2. Maak de verbindingsvlakken van de patchkabel en de geïmplanteerde multivezelarray schoon met ethanol en een wattenstaafje. Met behulp van de node voor het fotometriesysteem in de visuele coderingsworkflow en een fotometer, stel je elk van de 415, 470 en 560 LED-vermogensniveaus in om ongeveer 1,2 mW verlichting uit de patchkabel te leveren.
   3. Breng index-matching gel aan op het verbindingsoppervlak van de patchcord. Lijn de patchkabel uit op de geïmplanteerde multifiberarray van de muis met de deuvelpennen van de array en schuif de patchkabel naar beneden tot het vlak ligt met het oppervlak van de geïmplanteerde multifiberarray.
   4. Draai de patchcord-schroeven aan om de multifiberarray in de patchkabel vast te zetten. Laat de muis wennen voordat de experimenten beginnen (Figuur 2L–M).
   5. Stel bestandsnamen in.
      1. Voor elke gedragscamera druk je op de rode cirkel 'opname'-knop om het opnamevenster in de gedragscamera-opnamesoftware te openen en de bestandsnaam op te geven.
      2. Open het DAQ-softwareprogramma, klik op de tandwielknop en ga naar 'logging options', en geef de bestandsnaam op.
      3. Klik op de 'PhotometryWriter'-node van de visuele coderingsworkflow van het fotometriesysteem om de bestandsnaam op te geven.
   6. In de opnamevensters voor de gedragscamerasoftware klik je op 'opname starten' voor elke camera. Vervolgens druk je op de afspeelknop in de visuele coderingsworkflow van het fotometriesysteem, en druk je op opnemen in de DAQ-software.
   7. Klik op de TTL-schakelaar om synchroon op te nemen over alle camera's.
   8. Opname beëindigen.
      1. Klik op de TTL-schakelaar om de synchrone camera-opnames te beëindigen
      2. Druk op de stopknop in de visuele coderingsworkflow voor het fotometriesysteem, "stop opname" in de registratievensters van de gedragscamera.
   9. Herhaal stappen 3.7.5–3.7.8 tot het einde van de experimenten en koppel de muis los.
      OPMERKING: Na experimenten kunnen fotometrie- en gedragscameradatastromen worden uitgelijnd met aangepaste code met behulp van de uitvoer van de DAQ-software. Specifiek: (1) de verandering in TTL-spanning geeft het tijdstip aan van TTL-aanzet en -offset, (2) veranderingen in gedragsspanning van de camera geven aan wanneer de camerasluiter opent en sluit om elk frame van gedragsvideo vast te leggen, en (3) de initiële verandering in de fotometriesysteemspanning die op de DAQ wordt geregistreerd, kan worden vergeleken met de TTL-starttijd en de fotometriecamera-tijdstempels die door de visuele coderingssoftware worden uitgegeven om de fotometriecamera-tijdstempels te bepalen.

4. Gegevensverwerking (Figuur 1D, Aanvullend Bestand 9)

1. Preprocessing calciumbeeldvormingsgegevens.
   1. De-interleave-frames van calciumbeeldgegevens om aparte signaalstromen te creëren die zijn opgenomen als reactie op 415 nm, 470 nm en 560 nm LED's.
   2. Gebruik het Adaptive Iteratively Reweighted Penalized Least Squares algoritme (airPLS)⁴⁴ om baseline drift te corrigeren.
   3. Bereken ΔF/F met behulp van:
      
      OPMERKING: De basisperiode moet een stabiel tijdperk zijn vóór experimentele manipulatie (bijvoorbeeld vóór het introduceren van een sociale partner). Als de basisperiode te kort is (<2–3 min) of grote fluctuaties vertoont die mogelijk besmet zijn door bewegingsartefacten, overweeg dan te normaliseren met de gemiddelde fluorescentie over de hele sessie in plaats van een beperkte basisperiode.
2. Correct voor bewegingsartefacten (Figuur 4A).
   1. Gebruik een regressie-gebaseerde benadering, hoewel alternatieve methoden geschikt zijn (zie Tabel 2)
   2. Z-score ΔF/F-signalen waarbij de mediaan wordt gebruikt om de signaalmagnitude over regio's te normaliseren:
      
   3. Pas Lasso-regressie toe met L1-regularisatie. Lasso (Least Absolute Shrinkage and Selection Operator) voert automatische featureselectie uit door de coëfficiënten van niet-informatieve voorspellers naar nul toe te verkleinen.
      1. Voer rasterzoektocht uit over regularisatieparameters (α = 0,0001, 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100). De rasterzoekopdracht identificeert de optimale balans tussen modelcomplexiteit en overfitting. Deze stap kan volledig geautomatiseerd worden met crossvalidatieroutines die beschikbaar zijn in standaard machine learning-bibliotheken (bijvoorbeeld scikit-learn in Python).
      2. Voor tweekleurige fotometrie (onze aanbevolen aanpak) gebruik je alle beschikbare 415 nm isosbestische controlekanalen over de 12 opnamegebieden als voorspellers (zie Figuur 4B–C en Resultaten voor de onderbouwing). Voor enkelkleurfotometrie (alleen GCaMP of alleen RCaMP), beperk de predictormatrix tot alleen het isosbestische signaal van dezelfde vezel als het calciumsignaal dat wordt gecorrigeerd.
      3. Kies het model dat de gemiddelde kwadraatfout tussen het voorspelde en het waargenomen signaal minimaliseert.
   4. Trek de voorspelde bewegingscomponent af van het signaal om gecorrigeerde activiteit te verkrijgen.
3. Zacht het signaal met een Savitzky-Golay-filter met een venster van 725 ms.

Resultaten

Om gelijktijdig tot 12 SBN-hersengebieden op te nemen, hebben we een aanpasbare multifiberarray gebouwd volgens het bovenstaande protocol. Na herstel van de operatie werden de muizen geregistreerd tijdens sociale interactie (Figuur 5). Voor alle experimenten mochten mannelijke CD1-proefmuizen in hun thuiskooi interactie hebben met mannelijke Balb/c-muizen. We gebruikten Vgat-Cre-muizen om jRCaMP1b⁴⁰ in GABAerge neuronen op een Cre-afhankelijke manier tot expressie te brengen over 11 SBN-hersengebieden, GCaMP6f³⁹ in niet-GABAerge cellen op een Cre-exclusieve manier⁴⁵ over dezelfde hersengebieden, en GRAB-DA1m³³ in de nucleus accumbens⁴² (Tabel 1). Histologische bevestiging van vezeltargeting is te vinden in onze eerdere publicaties^42,43. Hier probeerden we de prestaties van verschillende methoden voor motion artifact-correctie te testen. Specifiek vergeleken we de effectiviteit van het gebruik van: (1) alleen een mediaanfilter; (2) Lassoregressie met L1-regularisatie waarbij alleen isosbestische signalen van dezelfde vezel worden gebruikt (single-predictor benadering)¹¹ en (3) Lassoregressie met isosbestische signalen van alle vezels als voorspellers (multi-predictor benadering)^41,42 (Figuur 4A). Cruciaal is dat de Lasso-gebaseerde methoden het ruwe signaal corrigeren met behulp van het activiteitsonafhankelijke fluorescerende signaal dat wordt gegenereerd als reactie op de isosbestische frequentie (415 nm) LED, terwijl mediaanfiltersmoothing het activiteitsonafhankelijke signaal niet meeneemt.

We beoordeelden bewegingscorrectie met twee verschillende metingen: absolute hoogfrequente ruis en jitter. Hoogfrequente ruis werd gedefinieerd als de standaardafwijking van de eerste afgeleide van het signaal, die de omvang van snelle signaalfluctuaties weerspiegelt. Jitter werd gedefinieerd als de variatiecoëfficiënt van de afgeleide van het signaal, die de grootte van de frame-to-frame signaalvariabiliteit ten opzichte van het gemiddelde van de afgeleide van het signaal weerspiegelt. We ontdekten dat beide op lasso gebaseerde benaderingen (single-predictor en multi-predictor) het mediaanfilter aanzienlijk overtroffen in het verminderen van zowel hoogfrequente ruis als jitter, waarbij multi-predictor correctie marginaal beter presteerde dan single-predictor correctie (Figuur 4C–D; Hoogfrequente ruis, n=414 voor 23 signalen over 18 opnamesessies: Kruskal-Wallis-test, H = 501,9420, p < 0,001; post-hoc Mann-Whitney U-tests met Bonferroni-correctie: Gladde versus Single-site regressie ***p < 0,001, Smoothed vs Multi-site regressie ***p < 0,001, Single-site vs Multi-site **p = 0,0073; Jitter: Kruskal-Wallis test, H = 495,6685, p < 0,001; post-hoc Mann-Whitney U-tests met Bonferroni-correctie: Gladde vs Single-site regressie ***p < 0,001, Smoothed vs Multi-site regressie ***p < 0,001, Single-site vs Multi-site ***p = 0,0006). Specifiek toonde de multi-predictor benadering (met alle vezelisosbestics) voordelen voor rode kanaal (RCaMP) signalen: 5 van de 12 rode signalen vertoonden significant minder restruis vergeleken met correctie van enkele voorspeller (n = 18 opnames/regio). Voor jitter toonden BNST (t-test, t = 5,42, ***p < 0,001), POA (t-test, t = 2,68, *p = 0,011), AH (t-test, t = 2,66, *p = 0,012) en PAG (Mann-Whitney U-test, U = 279, ***p < 0,001) superioriteit van meerdere voorspellers. Voor hoogfrequente ruis toonden BNST (Mann-Whitney U test, U = 285, ***p < 0,001), POA (Mann-Whitney U test, U = 292, ***p < 0,001), AH (t-test, t = 7,10, ***p < 0,001), PAG (t-test, t = 13,72, ***p < 0,001) en LHb (t-test, t = 5,47, ***p < 0,001) superioriteit van multi-voorspellers. Green channel (GCaMP) signalen vertoonden geen significante verschillen tussen de twee Lasso-benaderingen in alle 12 regio's voor jitter- of hoogfrequente ruismetrieken (alle p>0,05, voor volledige lijst van statistische tests zie Tabel 3). Dit suggereert dat voor tweekleurige fotometrie het opnemen van cross-channel isosbestische informatie de bewegingscorrectie voor rode signalen verbetert, waarschijnlijk omdat groene kanaalisosbestica schonere bewegingsinformatie bieden. Deze gegevens tonen aan dat bewegingsartefactcorrectie met isosbestische regressiemethoden aanzienlijk beter presteert dan eenvoudige filtermethoden, waarbij multikanaalregressie specifieke voordelen biedt voor dual-color opnames.

Figuur 1. Opname vanaf het Social Behavior Network met behulp van multisite, tweekleurige vezelfotometrie. (A) Schematische weergave van hoe een multifiberarray gebouwd moet worden. (B) Schematische weergave van de operatieworkflow. (C) Schematische weergave van tweekleurige calciumbeeldvormingsexperimenten. (D) Voorbeeld van het gebruik van een isosbestisch signaal om een bewegingsgecorrigeerd signaal te berekenen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Afbeeldingen van belangrijke procedures voor fabricage en chirurgie. (A) Gefabriceerde patchkabel klaar om te worden gebruikt voor opname. (B) Multifiberarray geplaatst in een aangepaste stereotactische houder met de 0,25 mm x 5,5 mm boor boven een glasvezeldoorgang. (C) Multivezelarray met alle vezeldoorgangen vrijgemaakt en zeskantmoeren vastgelijmd. (D) Een vezel splijten met een vezelscribe. (E) Multifiberarray met alle vezels superlijm en geplaatst op een custom polijstpuck. (F) Vergrote weergave van hoe de patchcordconnector op de multifiberarray moet worden uitgelijnd en vastgeschroefd. (G) Volledig gebouwde multivezelarray met deuvelpennen die op hun plaats zijn gelijmd. (H) Muis bevestigd aan het stereotactische frame met een hoofdhuidincisie om de schedel bloot te leggen. (I) Gefabriceerde multifiberarray gekoppeld aan een stereotactische manipulator om de multifiberarray tijdens de operatie te manoeuvreren. (J) Vergroot beeld van de multifiberarray die in de hersenen wordt neergelaten. (K) Multivezelarray volledig neergelaten en met tandcement aan de schedel bevestigd. (L) Multifiberarray op een dier dat stevig is aangesloten op de patchkabel vóór opname. (M) Uitgezoomde weergave van dier in kooi met patchkabel aangesloten vóór en/of tijdens de opname. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Spectrale scheiding. Voorbeeldsporen die minimale spectrale crosstalk tussen calciumindicatoren aantonen. GCaMP6f (blauwe) signalen tonen robuuste activatie tijdens 470 nm excitatie, maar een verwaarloosbare respons op 560 nm excitatie. jRCaMP1b (rood) signalen vertonen het omgekeerde patroon met sterke activatie vanaf 560 nm, maar minimale respons op 470 nm verlichting. (A) Gelijktijdig GCaMP6f- en jRCaMP1b-signalen opgenomen met alleen 470 nm verlichting. (B) Hetzelfde als (a), maar alleen met 560 nm verlichting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. Vergelijking van verschillende methoden voor multivezel signaalverwerking. (A) Schema dat multi-site regressie-gebaseerde correctie van het fotometriesignaal weergeeft. Deze aanpak omvat sequentiële verwerkingsstappen waarbij alle beschikbare isosbestische signalen van 415nm lineair worden toegespand aan elk calciumafhankelijk signaal. Voorspelde bewegingscomponenten worden van dit signaal afgetrokken om de uiteindelijke uitlezing van activiteit te produceren. z-gescorede ΔF/F-signalen van twee signalen met sterke aanwezigheid van bewegingsartefacten. (B) Van boven naar beneden: isosbestisch signaal van hetzelfde vezel-/beeldvormingskanaal dat bewegingsartefacten weergeeft, alleen gladde RCaMP (links) of GCaMP (rechts) signaal (mediaangefilterd, groen), hetzelfde vezel-/beeldkanaal regressiegecorrigeerd signaal (cyaan), multivezel regressie-gecorrigeerd signaal (blauw). (C) Links: Gemiddelde hoogfrequente ruisscore voor elk opgenomen signaal (n = 21 sessies). Hoogfrequente ruis wordt berekend als de standaardafwijking van de eerste afgeleide van elk signaal. Ruisscores worden weergegeven voor 1) baseline-gecorrigeerd maar ongecorrigeerd signaal (grijs), 2) baseline-gecorrigeerd en mediaan-gefilterd signaal (roze), 3) baseline- en single-fiber regressie-gecorrigeerd signaal met Savitsky-Golay smoothing (cyaan), en 4) baseline- en multi-fiber regressie-gecorrigeerd signaal met Savitsky-Golay smoothing (blauw). Center: Gemiddeld percentage ruis verwijderd met alleen smoothing, single-fiber of multi-fiber regressie, geaggregeerd over alle 23 signalen. Het percentage verwijderde ruis wordt berekend als het aandeel hoogfrequente ruis dat voortkomt uit correctie ten opzichte van het totale ruisniveau in het ruwe, door de basislijn gecorrigeerde signaal. De gegevens worden gerapporteerd als gemiddelde ± SEM (Kruskal-Wallis test, H = 501,9420, p < 0,001; post-hoc Mann-Whitney U tests met Bonferroni-correctie: Gladde versus Single-site regressie ***p < 0,001, Smoothed vs Multi-site regressie ***p < 0,001, Single-site vs Multi-site **p = 0,0073). Rechts: Percentage signalen waarbij hoogfrequente ruis statistisch verschillend is volgens single-fiber versus multi-fiber regressie-gebaseerde correctie, gescheiden op signaaltype. Voor elk van de 23 signalen werden ruisniveaus na correctie op één locatie vergeleken met ruisniveaus na multi-site correctie, met behulp van onafhankelijke t-tests (indien normaal verdeeld) of Mann-Whitney U-tests (niet-parametrisch alternatief). Blauwe segmenten geven signalen aan waarbij multi-site correctie resulteerde in significant minder ruis dan single-site correctie (p < 0,05). Grijze segmenten geven signalen aan zonder significant verschil tussen correctiemethoden. Cyaansegmenten geven signalen aan waarbij correctie van één locatie tot aanzienlijk minder ruis leidde. E: Vgat- GCaMP6f. DA: GRAB-DA. I: Vgat+ jRCaMP1b. (D) Hetzelfde als (C) maar met frame-to-frame variabiliteit (jitter), berekend als de afgeleide van de variatiecoëfficiënt van elk signaal (Kruskal-Wallis test, H = 495,6685, p < 0,001; post-hoc Mann-Whitney U tests met Bonferroni-correctie: Gladde vs Single-site regressie ***p < 0,001, Smoothed vs Multi-site regressie ***p < 0,001, Single-site vs Multi-site ***p = 0,0006). Voor een volledige lijst van statistische tests en resultaten, zie Tabel 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5. Multi-site presentatie van dual-color vezelfotometrie. Representatieve signalen van meerdere indicatortypes die gelijktijdig worden geregistreerd tijdens sociaal gedrag (resident-intruder test, indringer-intree-epoch). Sporen tonen niet-genormaliseerde en baseline-subtracted, maar niet bewegingartefact-gecorrigeerde GCaMP6f (Cre-negatieve neuronen), jRCaMP1b (GABAerge Vgat-Cre+ neuronen) en GRAB-DA1m (dopaminesensor in nucleus accumbens) over sociale gedragsnetwerksites in hetzelfde dier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1. Viruscoördinaten en vezellengtes voor elk doelwit sociaal gedragsnetwerk en hersengebied. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2. Vergelijking van bewegingsartefactcorrectiemethoden voor multi-site vezelfotometrie. Onderliggende principes, optimale gebruiksscenario's, voordelen en beperkingen van de volgende bewegingsartefactcorrectiemethoden: eenvoudige lineaire regressie, Lasso-regressie met L1-regularisatie (met multi-predictorbenadering), Bayesiaanse generatieve modellering, frequentiegebaseerde schaal en iteratief herwogen kleinste kwadraten. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3. Details en resultaten van de statistische tests die in Figuur 4 worden gebruikt. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend Dossier 1. 3D-printbestand voor patchcordconnector.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Supplemental File 2. 3D printbestand voor patchcordconnector zonder doorgaande gaten.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Supplemental File 3. 3D printbestand voor stereotactisch booraccessoire.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend Dossier 4. Op maat gemaakte polish-puckblauwdruk.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Supplemental File 5. 3D printbestand voor multisite fotometrie-array gericht op 12 SBN-locaties.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Supplemental File 6. 3D printbestand voor multisite fotometrie-array zonder doorgaande gaten die doelpunten targeten.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 7. DAQ-configuratiebestand voor DAQ-software.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend Dossier 8. Visueel codeerbestand voor fotometriesysteem.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 9. Python-code gebruikt in Protocol Step 4 en voor bewegingsartefacten corrigeerde vergelijkingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Vezelfotometrie is een nuttige en kosteneffectieve techniek om populatiecalciumactiviteit te registreren vanuit diepe hersengebieden of specifieke celtypen in het vrij^{bewegende dier.} Door gelijktijdig van meerdere hersengebieden op te nemen, kan de gebruiker de dynamiek vergelijken tussen regio's of projecties tijdens naturalistisch gedrag of hoofdfixaties ^5,7,12. Hier beschrijven we methoden om in twee kleuren op te nemen van maximaal 12 hersengebieden in het subcorticale "sociale gedragsnetwerk" van de hersenen met behulp van een op maat gemaakte vezelarray en een commercieel verkrijgbaar camerasysteem. Hieronder bespreken we cruciale stappen bij de implementatie van deze methode, mogelijke aanpassingen en probleemoplossingsstrategieën, en het belang en de beperkingen ervan ten opzichte van bestaande benaderingen.

Het protocol bestaat uit drie hoofdfasen. Ten eerste vereist de fabricage van multivezelarrays en patchcords dat op maat gemaakte 3D-geprinte onderdelen op stereotactische coördinaten worden geboord, gevolgd door het inbrengen, polijsten en kwaliteitscontrole om ≥75% lichttransmissie-efficiëntie te garanderen. Nauwkeurige booruitlijning (±0,03 mm tolerantie) en grondig polijsten zijn cruciaal. Veelvoorkomende storingen zijn onder andere efficiëntie bij lage lichttransmissies (<75%) en verstopte glasvezeldoorboringen. Een lage efficiëntie ontstaat meestal door vezelbeschadigingen tijdens het afsplitsen of onjuiste polijsten. Oplossingen omvatten het controleren van elke vezeluiteinde onder brightfield-microscopie vóór het inbrengen van elke vezeluiteinde zonder vlekken (stap 1.1.6.2), opnieuw polijsten met de volledige korrelprogressie (6 μm → 0,01 μm, stap 1.1.6.1), en het zorgen dat het vezelklijvblad scherp is. Om de doorvoersnelheid te verbeteren, kunnen laboratoria workflowwijzigingen implementeren, zoals aangepaste vezelsnijjigs met precisietranslatiefasen of lasergebaseerde snijsystemen (stap 1.2.4). Commerciële 3D-printfabrikanten met hoogprecisiesystemen kunnen de behoefte aan handmatig boren verminderen (stappen 1.1.3–1.1.4, stap 1.2.3), hoewel de dimensionale nauwkeurigheid per batch kan variëren.

Ten tweede omvat chirurgische implantatie schedelvlakken (±0,03 mm tolerantie), virale injecties op 11–12 locaties en multifiber array-implantatie gevolgd door cementfixatie. De richtnauwkeurigheid wordt aangetast wanneer schedelnivellering de tolerantie overschrijdt. Dit kan worden verminderd door de helling te meten op meerdere voor-posterieure punten van 8,25 mm uit elkaar en de rol te meten op ±2,0–2,5 mm laterale posities, terwijl de oorbalken de schedel volledig stabiliseren. Luchtbellen bij virusinjectiemicropipetten verhinderen nauwkeurige toediening en vereisen het herstarten van de voorbereiding van micropipeten (stap 2.9). Tijdens de implantatie van een multivezelarray vermijd je cementcontact met vezeltips door cementpiramides van het schedeloppervlak omhoog te bouwen (stappen 2.10.3–2.10.5) en zorg je voor voldoende droogtijd (≥15 min).

Ten derde omvat opname en gegevensverwerking camerasynchronisatie via een DAQ-systeem, LED-vermogenskalibratie (0,1 mW uitgang/vezel, 1,2 mW uitgang/12-vezel patchkabel) en signaalvoorverwerking met isosbestische besturing. De hier geïntroduceerde bewegingscorrectiepijplijn gebruikt Lasso-regressie, die goed geschikt is voor multi-kanaal voorspellerconfiguraties omdat deze automatisch oninformatieve voorspellers naar nul verkleint, waarbij alleen die worden behouden die betekenisvol bijdragen aan artefactcorrectie. Deze eigenschap maakt het bijzonder voordelig voor dual-color fotometrie: door isosbestische signalen van zowel rode als groene kanalen als voorspellers op te nemen, maakt Lasso selectief gebruik van de kanalen die echte bewegingsinformatie dragen, wat zorgt voor aanzienlijk betere ruisreductie in rode kanaal (RCaMP) signalen vergeleken met correctie van dezelfde vezel alleen (Figuur 4C–D). Omdat Lasso de meest informatieve voorspellers automatisch identificeert, wordt het gebruik van alle beschikbare isosbestische kanalen als input sterk aanbevolen. Dat gezegd hebbende, is lassoregressie een van de verschillende geldige correctiemethoden; alternatieven zijn onder andere Bayesiaanse generatieve modellering⁴⁶, frequentiegebaseerde schaal⁴⁷ en iteratief herwogen kleinste kwadraten (IRLS)⁴⁸, die allemaal waarschijnlijk vergelijkbare artefactreductie opleveren, met implementatierichtlijnen in Tabel 2. Aanhoudend slechte signaalkwaliteit ondanks geoptimaliseerde voorverwerking duidt waarschijnlijk op hardware- of chirurgische problemen, en stappen 1–2 moeten opnieuw worden overwogen

Naast deze procedurele overwegingen brengt tweekleurige fotometrie extra technische uitdagingen met zich mee met betrekking tot spectrale scheiding. Een cruciale overweging bij dual-color fotometrie is het beheren van spectrale overlap tussen groene en rode calciumindicatoren. Hoewel het volledig elimineren van spectrale crosstalk een uitdaging is vanwege overlappende emissiespectra van GCaMP en RCaMP, vermindert onze temporele multiplexingbenadering met interleaved LED-excitatie (470 nm voor GCaMP, 560 nm voor RCaMP, 415 nm isosbestisch) en geoptimaliseerde banddoorlaatemissiefilters dit probleem aanzienlijk. In de praktijk observeren we minimale crosstalk: 470 nm stimulatie veroorzaakt verwaarloosbare activiteit in het rode kanaal, en omgekeerd bij 560 nm stimulatie in het groene kanaal (Figuur 3). Onderzoekers die zich zorgen maken over residuele spectrale overlap kunnen hun systemen verder optimaliseren door smalbandige emissiefilters met maximale spectrale scheiding te selecteren op basis van hun specifieke indicatorcombinaties.

In vergelijking met andere benaderingen voor grootschalige neurale opnames biedt op maat gemaakte tweekleurige multisite vezelfotometrie veel belangrijke voordelen. Ten eerste, terwijl single fiber photometrie ^1,2,3, hedendaagse extracellulaire opnames ^4,6, of corticale oppervlaktebeeldvorming ^{benaderingen 8,9} beperkt zijn tot één of een ruimtelijk beperkte set hersengebieden (bijvoorbeeld aan het corticale oppervlak), maakt het aanpasbare 3D-printontwerp dat we hier delen het mogelijk om tot 12 hersengebieden overal in de hersenen te targeten met 200 μm optische vezels. Ter vergelijking: commercieel verkrijgbare multifiber ferrules ^5,7 ondersteunen slechts 100 μm glasvezel en zijn op vergelijkbare wijze beperkt tot een beperkte set hersengebieden direct ventral van de lineaire array van de ferrule. Wat betreft het targeten en opnemen vanuit specifieke hersengebieden, is de belangrijkste afweging tussen de vezeldiameter en het gezichtsveld van het fotometriesysteem. De 3D-geprinte multivezelarrays uitgerust met 200 μm vezels nemen op van een groter gebied per locatie vergeleken met commercieel verkrijgbare multivezelferrules. In het huidige protocol beperkt het cameraveld van het fotometriesysteem het opnemen tot 12 optische vezels bij 200 μm. Deze beperking kan worden overwonnen door de vezeldiameter te verkleinen tot 100 μm voor maximaal 60 vezels of door een op maat gemaakt fotometriesysteem te bouwen met een groter cameraobjectief.

Tot slot is dit aanpasbare, tweekleurige multisite vezelfotometrieplatform gebruikt om de neurale activiteitsdynamiek van twee genetisch verschillende neurale populaties over 11-12 hersengebieden longitudinaal te volgen. Met een Cre-in/Cre-uitsluitende strategie die Cre-afhankelijke RCaMP en Cre-uitsluitende GCaMP uitdrukt over SBN-populaties in een Vgat-cre-muis, werd aangetoond dat zowel agressieve ervaring als observatie gedeelde patronen van SBN-brede activiteitsdynamiek bevorderen tijdens toekomstige defensieve sociale interacties⁴². Met dezelfde virale strategie in een Esr1-cre muis om van oestrogeenreceptor-alfa-expressieve en niet-expressieve neuronen te registreren, werden territorium-specifieke patronen van sociaal gedrag geassocieerd met snelle, hormoongevoelige herschaling van een SBN-brede sociale actiecode, wat de gedragsgerelateerde activiteit in het thuisgebied⁴³ stimuleerde. Deze gebiedsspecifieke verschillen in gedrag en netwerkcodering vereisen circulerende testosteron bij mannelijke muizen. Hoewel deze studies een virale benadering en één Cre-lijn gebruikten, kunnen toekomstige studies deze methoden uitbreiden met intersectionele virale benaderingen, genetisch expressieve calciumindicatoren of fluorescerende reporters van neuromodulator- en neuropeptide-signalering.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
#76 drill bit	Drill Bit City	#76
#78 drill bit	Drill Bit City	#78
#92 drill bit	Drill Bit City	#92
0.01 μm grit polijstplaten	ThorLabs	LFCF2
0.25 mm x 5.5 mm boorbits	Drill Bit City	aangepast product	0.25 x 5.5 mm boorbitje, contact opgenomen met bedrijf om te bouwen
1 μm grit polijstplaten	ThorLabs	LF1D
12 vezel-vertakt patchord	Doric Lens	CustomBBP(12)_200/220/3000-0.37 _5m_SMA-12xCL_LAF
200 μm optische vezel	ThorLabs	FT200UMT
3 μm grit polijstplaten	ThorLabs	LF3D
30 μm grit polijstplaten	ThorLabs	LF30D
6 μm grit polijstplaten	ThorLabs	LF6D
Absorbeerbare hechting	Ethicon	J421H
Adaptive Iteratively Reweighted Penalized Least Squares documentatie	Google	N/A	https://code.google.com/archive/p/airpls/
Legering staal stiftpennen	McMaster-Carr	98381a983
Gedraagcamera's	Teledyne FLIR	Blackfly S
Bonsai	Bonsai Software Foundation	versie 2.9.0
Brightfield Microscoop	Leica	ES2
Bulldogklemmen	FineScienceTools	18038-45
DAQ	Measurement Computing	MC USB-200 series DAQ
DAQ-software	Measurement Computing	DAQami
Boor	Kopf Instruments	Model 1911 Stereotaxic Drill
Vezel klover	ThorLabs	XL411/CLVB
Vezel fotometrie systeem	Neurophotometrics	FP3002
Vezel fotometrie systeem handleiding	Neurophotometrics	N/A	Webpagina waarop apparaathandleiding wordt gehost: https://neurophotometrics.com/documentation
Vezel scribe	ThorLabs	S90C
Vezelstripper	ThorLabs	T10S13
Fijne pincetten	FineScienceTools	11252-00
Fijne schaar	FineScienceTools	14084-08
G5 aandrijfschroeven	Open Ephys Production Site	OEPS-7105
G5 schroevendraaier	Open Ephys Production Site	OEPS-7121
GCaMP6f	PNI Viral Neuroengineering Lab	EF1a-Cre out-GCaMP6f-WPRE-hGHpA
GRAB-DA	Addgene	hSyn-GRAB_DA1m-WPRE-hGHpA
Verwarmingskussen	Adroit Medical Supplies	HTP-1500
Verwarmingssysteem	Kent Scientific	RT-0515
Isofluraan	Covetrus	29405
jRCaMP1b	Addgene	pAAV.Syn.Flex.NES-jRCaMP1b.WPRE.SV40
M0.6 Messing zeskantmoeren	MetricScrews.us	21614
Metabond cement reagentia en gereedschappen	Parkell	S380
MicroFine ABS-achtige 3D-prints	ProtoLabs	aangepast product	Zie aanvullende codebestanden 1-3, 5, 6
Nanoliter injector	Drummond Scientific Company	Nanoject II	nanoliter injector
Parrafinwasvellen	Amcor	ParaFilm M All-Purpose Laboratory Film
Pipetter	ThermoFisher Scientific	4641310N
Polijstschijf	Princeton University Physics Department Machine Shop	aangepast product	Zie aanvullend codebestand 4
Powermeter	ThorLabs	PM100D
Puralube optische zalf	Dechra	P1490-1
Python	Python Software Foundation	N/A
Zacht plastic slang voor patchkabel	McMaster-Carr	3774N4
SpinView	Teledyne FLIR	versie 1.25.0.52	Beeldverwerkingssoftware die de gedragscamera's bestuurt
Stereotactisch frame	Kopf Instruments	Model 1900
TMAC-documentatie	N/A	N/A	TMAC-code: https://github.com/Nondairy-Creamer/tmac
Slang voor stereotactisch frame	Saint-Gobain	E-3603
Verdamper	Kent Scientific	VetFlo Vaporizer