Zuivering en identificatie van antimicrobieel eiwit uit de groene alg Tetraspora Sp. CU2551

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een workflow voor het onderzoeken van intacte antimicrobiële eiwitten met behulp van meerdere technieken, waaronder optimalisatie van eiwitextractiebuffers, algencelverstoring, eiwitfractionering door ionenuitwisselingschromatografie, eiwitscheiding met SDS-PAGE en antimicrobiële activiteitsassays. Het actieve eiwit werd vervolgens bevestigd en geïdentificeerd met behulp van LC-MS/MALDI-TOF analyse.

Samenvatting

Antimicrobiële resistentie (AMR) is een toenemende wereldwijde gezondheidsbedreiging, waardoor de ontdekking van nieuwe antimicrobiële middelen noodzakelijk is. Algenafgeleide eiwitten en peptiden krijgen steeds meer aandacht vanwege hun bioactieve potentieel; gestandaardiseerde protocollen voor het onderzoeken van antimicrobiële peptiden (AMP's) in groene algen, met name Tetraspora sp. CU2551, blijven echter beperkt. Dit protocol beschrijft een stapsgewijze workflow voor de isolatie, zuivering en karakterisering van antimicrobiële intacte eiwitten uit de groene alg Tetraspora sp. CU2551. De procedure integreert geoptimaliseerde eiwitextractie, chromatografische fractionering, elektroforetische scheiding, screening van antimicrobiële activiteit en eiwitidentificatie. Eiwitextractiecondities worden eerst geoptimaliseerd om achtergrondremmende effecten die afkomstig zijn van buffercomponenten te verminderen. Wanneer de identiteit van het actieve peptide onbekend is, wordt een pull-down assay toegepast om de eiwitbinding tussen verschillende ionenuitwisselingsharsen te beoordelen en om de keuze van een geschikte zuiveringsmatrix te begeleiden. DEAE-Sepharose ionenuitwisselingschromatografie is een geschikte methode om antimicrobiële eiwitfracties te verrijken. Alle fracties worden systematisch geëvalueerd op antimicrobiële activiteit en geanalyseerd met SDS-PAGE. De eiwitband die overeenkomt met de hoogste antimicrobiële activiteit, samen met een duidelijk elektroforetisch profiel, wordt verwijderd en onderworpen aan LC-MS/MALDI-TOF analyse voor eiwitidentificatie. De workflow wordt verder aangevuld met in silico-analyses om antimicrobiële peptide-gerelateerde eigenschappen te voorspellen met behulp van publiek beschikbare bio-informatische tools. Dit protocol biedt een veelzijdig kader voor de ontdekking van antimicrobiële eiwitten en kan gemakkelijk worden aangepast aan andere algensoorten en aanverwante biotechnologische toepassingen.

Inleiding

Antimicrobiële resistentie (AMR) vormt een toenemende wereldwijde gezondheidsuitdaging¹, wat het belang benadrukt van voortdurende strategieën om nieuwe antimicrobiële middelen uit natuurlijke bronnen te identificeren. Hoewel er steeds meer onderzoek is naar de antimicrobiële eigenschappen van eiwitten en peptiden afkomstig van algen ^2,3. De meeste studies richten zich op peptide- of hydrolysaatgebaseerde benaderingen⁴, en gestandaardiseerde methoden om de activiteit van hele algeneiwitten te behouden en te evalueren blijven beperkt⁵. Dit artikel beschrijft een methode gericht op het isoleren, zuiveren en evalueren van intacte eiwitten uit de groene alg Tetraspora sp. CU2551 voor antimicrobiële activiteit.

Het protocol beschrijft een stapsgewijs proces dat bestaat uit de extractie van hele eiwitten, fractionering door ionenuitwisselingschromatografie, beoordeling van antibacteriële eigenschappen, gelgebaseerde eiwitseparatie, eiwitidentificatie door massaspectrometrie en voorspelling van antimicrobiële peptiden met behulp van in silico-technieken. De effectiviteit van antibacteriële middelen wordt beoordeeld met standaard agardiffusie- en vloeistofgroeiinhibitietests op typische Gram-positieve en Gram-negatieve bacteriestammen ^4,6. Deze benadering maakt het mogelijk om geïdentificeerde antimicrobiële activiteit te koppelen aan specifieke eiwitfracties of elektroforetische banden, in plaats van te vertrouwen op verteerde peptidemengsels of uitsluitend op computationele voorspellingen die mogelijk niet in slagen antimicrobiële eiwitten of AMP-achtige sequenties buiten de canonieke databasedefinities ^7,8 te identificeren.

Het volgen van dit protocol stelt lezers in staat om betrouwbaar bioactieve eiwitfracties te verkrijgen met potentiële antimicrobiële eiwitsequenties, geschikt voor toekomstige validatie en functionele beoordeling. Representatieve bevindingen wijzen op de identificatie van bioactieve fracties die zowel bekende als onbekende eiwitkandidaten bevatten. Dit protocol biedt een veelzijdig en praktisch kader voor het identificeren van antimicrobiële stoffen uit intacte eiwitten verkregen uit algen en andere biologische bronnen.

Protocol

Deze studie betrof geen menselijke deelnemers, dieren of gewervelde proefpersonen. Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor bioveiligheid en onderzoeksethiek van de School of Science, King Mongkut's Institute of Technology Ladkrabang (KMITL), Thailand. Alle microbiële experimenten werden uitgevoerd onder Biosafety Level 2 (BSL-2) laboratoriumcondities volgens de WHO en de nationale bioveiligheidsnorm⁹.

Draag tijdens alle experimentele procedures passende persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder laboratoriumjassen, handschoenen en mondkapjes. Verzamel en verwijder chemisch en zilverhoudend afval volgens de institutionele richtlijnen voor gevaarlijk afvalbeheer voordat het wordt gestuurd naar een erkend afvalverwerkingsbedrijf.

Bereid geconcentreerde voorraadoplossingen van gevaarlijke chemicaliën, waaronder natriumdodecylsulfaat, β-mercaptoethanol en formaldehydehoudende zilverkleuringsreagentia, in een chemische dampkap. Voer experimenten uit met lage werkconcentraties en kleine volumes op de laboratoriumbank volgens de standaard laboratoriumveiligheidspraktijken.

1. Algencultuur

OPMERKING: Handhaven aseptische omstandigheden gedurende de algenteelt.

1. Bereiding van startercultuur
   1. Bereid steriel TAP-medium (pH 7,0)¹⁰ voor en doop 150 mL in steriele 500 mL Erlenmeyer-flessen.
   2. Inoculeer het medium met een 1% (v/v) inoculum van Tetraspora sp. CU2551 met behulp van een aseptische techniek in een Klasse I bioveiligheidskast.
   3. Incubeer de culturen in een lichtuitgeruste schudbroedmachine bij 35 °C, 120 rpm en 45,9 μmol/m²/s gedurende 48 uur. Gebruik de volledig volwassen cultuur als startpunt voor de opschalingscultuur.
2. Opschaling en celoogst
   1. Breng 25 ml startercultuur over in 275 ml verse, steriele TAP-medium. Breng de culturen 48 uur onder dezelfde omstandigheden uit.
   2. Oogst de algencellen door centrifugatie bij 3.800 × g gedurende 15 minuten bij 25 °C.
   3. Was de celpellets één keer met steriel gedestilleerd water en centrifugeer opnieuw op 3.800 × g gedurende 15 minuten bij 25 °C.
   4. Verwijder het supernatant volledig en bewaar de algcelpellets bij −20 °C tot verdere verwerking.

2. Formulering van de lysisbuffer en screening van achtergrondremming

VOORZICHTIG: Hanteer SDS en β-mercaptoethanol met rubberen of nitril handschoenen. Open de geconcentreerde fles β-mercaptoethanol in een chemische dampkap.

1. Lysisbuffervoorbereiding
   1. Bereid de referentie lysisbuffer¹¹ voor, bestaande uit 10 mM Tris-HCl (pH 9,0) aangevuld met 0,1% w/v SDS en 38 mM β-mercaptoethanol.
      OPMERKING: Kritieke stap: Optimaliseer SDS- en β-mercaptoethanolconcentraties om vals-positieve antimicrobiële activiteit te voorkomen.
   2. Bereid volledige faculteitssets van lysisbuffer voor door natriumdodecylsulfaat (SDS) (0, 0,01, 0,05 of 0,1% w/v) en β-mercaptoethanol (0, 0,5, 1 of 2 mM) te variëren, waarmee 16 formuleringen worden gegenereerd.
      OPMERKING: De samenstellingen van alle geteste lysisbufferformuleringen zijn samengevat in Tabel 1. Voeg β-mercaptoethanol direct toe voor gebruik.
2. Achtergrondscreening van antimicrobieel
   1. Gebruik een papieren pons om 6 mm schijven te maken van No. 42 Whatman papier. Breng 5 μL van elke lysisbufferformulering aan op de papieren schijf en voer schijfdiffusieassays uit volgens CLSI-richtlijnen⁶. Incubeer de assayplaten bij 37 °C gedurende 20 uur en beoordeel de inhibitiezones.
      1. Testformuleringen tegen Bacillus subtilis TISTR 1248, Staphylococcus aureus TISTR 746, Escherichia coli TISTR 074 en Pseudomonas aeruginosa TISTR 2370.
   2. Selecteer de formulering die geen remmende activiteit vertoont voor latere eiwitextractie.

3. Eiwitextractie

OPMERKING: Houd monsters op lage temperatuur tijdens sonicatie en centrifugatie.

1. Ontdooi bevroren algenpellets (uit stap 1.2.5) bij 37 °C en vries opnieuw in bij −20 °C. Herhaal vries-ontdooicycli (-20 °C / 37 °C) 3 keer.
2. Voeg optimale lysisbuffer (10 mM Tris-HCl, pH 9,0, 0,01% SDS, 2 mM β-mercaptoethanol) toe aan een eindvolume van 5 mL en houd monsters op ijs gedurende de downstream verwerking. Verstoor de cellen door sonicatie van de sonode (25 kHz, 500 W, 40% amplitude, 1 s aan/uit, 5 minuten).
3. Voeg Protease Inhibitor Cocktail toe volgens de instructies van de fabrikant en meng voorzichtig.
4. Centrifuge-lysaten op 3.800 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C en verzamelen het supernatant als ruwe eiwitextract.
5. Verhelder de extracten door centrifugatie bij 10.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verzamel en bewaar de supernatanten bij 4 °C.

4. Evaluatie van antimicrobiële activiteit

1. Schijfdiffusie-assays
   1. Kweek pathogene bacteriën (Bacillus subtilis TISTR 1248, Staphylococcus aureus TISTR 746, Escherichia coli TISTR 074 en Pseudomonas aeruginosa TISTR 2370) op nutriëntenagar bij 37 °C gedurende 16-18 uur.
   2. Met een steriele aluminium lus schraap je de kolonies van agaroppervlakken en hersuspendeer je in 0,9% (w/v) NaCl. Stel bacteriële suspensies aan naar 0,5 McFarland-standaard en swab gelijkmatig op Mueller-Hinton-agarplaten.
   3. Plaats steriele papieren schijven op geïnoideerde agaroppervlakken en breng 5 μL testmonsters aan. Incubeer de platen bij 37 °C gedurende 16-20 uur en meet de inhibitiezones met een Vernier-remklauw.
      OPMERKING: Houd gelijke afstand tussen alle schijven.
2. MIC- en MBC-bepaling
   1. Bereid bacteriële suspensies voor op 2 × 10⁶ CFU/mL in 4x Mueller-Hinton-bouillon.
   2. Pipetteer 50 μL van de bacteriële suspensies en 100 μL van de seriël verdunde eiwitmonsters in 96-wellplaten en pas alle putten aan op een eindvolume van 200 μL met behulp van een 10 mM Tris-HCl-buffer (pH 7,5).
   3. Gebruik 5 μL streptomycine (50 μg) als positieve controle. Gebruik 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) en 0,9% (met v) NaCl als negatieve controle.
   4. Incubeer platen bij 37 °C gedurende 20 uur en bepaal MIC als de laagste concentratie zonder zichtbare bacteriële groei.
   5. Plaat aliquoten van heldere putten naar Mueller-Hinton-agar om MBC te bepalen.
3. Bepaling van de bacteriële groeicurve
   1. Bereid bacteriële suspenties voor op 1 × 10⁶ CFU/mL in 2x Mueller-Hinton-bouillon.
   2. Incubeer 100 μL bacteriecultuur met 100 μL eiwitmonsters in een 96-wellplaat bij 37 °C gedurende 20 uur.
   3. Gebruik 5 μL streptomycine (50 μg) als positieve controle. Gebruik steriel gedestilleerd water, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) en 500 mM NaCl in 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) als controle.
   4. Meet OD₆₀₀₀ elke 30 minuten met een microplaatlezer met orbitale intermitterende schuddingen (2 minuten voor de meting).
   5. Bereken groeicurves en specifieke groeipercentages.
      OPMERKING: Hoge eiwitconcentraties kunnen de metingen van optische dichtheid verstoren.

5. Pull-down assay en eiwitzuivering

1. Pull-down assay
   1. Equilibriseer DEAE-Sepharosehars met een 10 mM Tris-HCl-buffer (pH 8,0) of CM-Sepharosehars met 10 mM fosfaatbuffer (pH 7,0).
   2. Meng 100 μL gebalanseerde hars met 500 μL ruwe eiwitextract, voeg vervolgens 100 μL van de bijbehorende evenwichtsbuffer toe (10 mM Tris-HCl, pH 8,0 voor DEAE; 10 mM fosfaatbuffer, pH 7,0 voor CM). Incubeer met een zachte inversie (10 inversies).
   3. Centrifugeer kort, verzamel het supernatant en evalueer de antimicrobiële activiteit met schijfdiffusie-assay.
   4. Selecteer de werkhars (DEAE-Sepharose). Voor pH-optimalisatie evenwichtig te zijn met 10 mM Tris-HCl bij pH 7,0, 7,5, 8,0, 8,5 of 9,0 en volg stap 5.1.1-5.1.3.
   5. Selecteer de pH-conditie die antimicrobiële activiteit toont voor ionenuitwisselingschromatografie.
2. Op ionenuitwisselingschromatografie gebaseerde eiwitzuivering
   1. Verpak DEAE-Sepharose hars in een glaschromatografiekolom (16 mL bedvolume) en equilibreer met een 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7,5) bij 25 °C voor 10 kolomvolumes.
   2. Laad 15 mL ruwe eiwitextract (sectie 3.6) met een debiet van 8 mL/min.
   3. Was de kolom met een equilibratiebuffer totdat de absorptie bij 280 nm onder de 0,05 daalt.
   4. Eluteer gebonden eiwitten met een lineaire 0-500 mM NaCl-gradiënt in 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) over 500 mL bij 8 mL/min.
   5. Verzamel 5 mL fracties, monitor de absorptie bij 280 en 220 nm, en houd fracties op ijs. Bewaar fracties bij 4 °C tot antimicrobiële screening en eiwitanalyse.

6. SDS-PAGE en zilverkleuring

OPMERKING: Bereid zilverkleurige oplossingen voor in een chemische dampkap en draag passende persoonlijke beschermingsmiddelen. Bereid alle oplossingen vers voor.

1. Verwijder eiwitfracties met 12% SDS-PAGE¹² en visualiseer banden met zilverkleuring¹³.
2. Exciseer doel-eiwitbanden en dien monsters in voor MALDI-TOF MS-analyse.
3. Identificeer eiwitten door database-zoekopdrachten tegen NCBInr.

7. Antimicrobiële peptidevoorspelling

1. Haal kandidaat-eiwitsequenties op uit NCBInr-analyse.
2. Evalueer het antimicrobiële potentieel met behulp van publiek beschikbare AMP-voorspellingstools (bijv. DBAASP, APD3, AMPScanner, CAMPR4) en databases.
3. Extracteer voorspellingsresultaten, waaronder antimicrobiële kansscores, voorspelde classificatie en fysisch-chemische eigenschappen (netto lading, hydrofobe residuinhoud, GRAVY-index [ExPASy ProtParam] en amfipathiciteit).
4. Integreer computationele resultaten over platforms heen om kandidaat-antimicrobiële eiwitten te prioriteren voor downstream-validatie.
   OPMERKING: In silico-voorspellingen ondersteunen ze kandidaatselectie en vormen ze geen definitieve classificatie van antimicrobiële peptiden.

8. Statistisch testen

1. Voer alle experimenten uit in biologisch drievoudig exemplaar. Analyseer gegevens met eenrichtings-ANOVA, gevolgd door Duncans multiple range test of passende post hoc-analyses met een betrouwbaarheidsniveau van 95%.

Resultaten

De ontwikkelde werkwijze op intacte eiwitten, die geoptimaliseerde eiwitextractie, ionenuitwisselingsfractie, antimicrobiële screening en eiwitidentificatie integreert, maakte met succes de detectie van bioactieve eiwitfracties uit Tetraspora sp. CU2551 mogelijk. Dit protocol is ontworpen om achtergrondartefacten te minimaliseren terwijl de integriteit van het native eiwit behouden blijft, waardoor antimicrobiële activiteit direct geassocieerd kan worden met gedefinieerde chroma...

Discussie

Om betrouwbare antimicrobiële uitmetingen met dit protocol te verkrijgen, moeten verschillende cruciale stappen zorgvuldig worden gecontroleerd, vooral tijdens eiwitextractie en vroege bioactiviteitsscreening. Het optimaliseren van de lysisbuffer is essentieel, aangezien achtergrondremming van buffercomponenten een veelvoorkomende bron is van vals-positieve resultaten bij antimicrobiële eiwitscreening. De antimicrobiële activiteit die werd waargenomen bij de oorspronkelijke bufferformule...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Acrylamide/Bis-acrylamide Solution	Bio-Rad Laboratories	1610156	Voor SDS-PAGE gelbereiding Categorie: Chemisch
Alcohol Lamp / Bunsen Burner	Verschillende	—	Voor aseptische techniek Categorie: Instrument
AMPScanner	George Mason University (Veltri et al.)	—	Deep learning-based AMP voorspellingstool Categorie: Software / Database
Antimicrobial Peptide Prediction Tools (DBAASP, APD3, AMPscanner, CAMPR4)	Verschillende academische bronnen	—	In silico AMP-analyse Categorie: Software / Database
APD3	Wang Lab, University of Nebraska	—	Antimicrobial Peptide Database Categorie: Software / Database
Autoclave	Tomy	—	Sterilisatie van media en materialen Categorie: Instrument
Biosafety Cabinet Class I/II	Verschillende	—	Aseptische handeling Categorie: Instrument
BioTool 2.0	Bruker Daltonics	—	Tool voor het visualiseren van MS-spectra en peptiden Categorie: Software
Bradford Reagent	Merck	B6916	Eiwit kwantificering Categorie: Chemisch
CAMPR4	Indian Institute of Technology Bombay	—	Collectie van antimicrobiële peptiden Categorie: Software / Database
Centrifuge, Eppendorf 5415R Refrigerated Microcentrifuge	Eppendorf	—	Microcentrifugeren Categorie: Instrument
Centrifuge, Thermo Scientific Megafuge 8R	Thermo Fisher Scientific	—	Grootvolume centrifugeren Categorie: Instrument
Chromatography Column (Glass)	Verschillende	—	Ionenuitwisselingschromatografie Categorie: Glaswerk
CM-Sepharose Resin	Merck	CEF100	Cation-uitwisselingshars Categorie: Chemisch (Hars)
Cotton Swab	Verschillende	—	Bacterie inoculatie Categorie: Plasticwerk
Cuvette, Quartz	Hellma Analytics	—	UV spectrofotometrie Categorie: Glaswerk
DBAASP	Institute of Bioorganic Chemistry (Rusland)	—	Database van antimicrobiële activiteit en peptidestructuren Categorie: Software / Database
DEAE-Sepharose Resin	Merck	DEFF100	Anion-uitwisselingshars Categorie: Chemisch (Hars)
Erlenmeyer Flask, 100 mL	Verschillende	—	Algen cultivatie Categorie: Glaswerk
Erlenmeyer Flask, 500 mL	Verschillende	—	Algen cultivatie Categorie: Glaswerk
Escherichia coli TISTR 074	TISTR, Thailand	—	Test micro-organisme Categorie: Biologisch materiaal
ExPASy ProtParam	Swiss Institute of Bioinformatics	—	Online tool voor het berekenen van fysisch-chemische eigenschappen van eiwitten Categorie: Software / Database
Formaldehyde	Merck	1.04002	Zilverkleuring Categorie: Chemisch
Freezer (-20 °C)	Verschillende	—	Stapel opslag Categorie: Instrument
Gel Electrophoresis System (Mini-PROTEAN Tetra)	Bio-Rad Laboratories	—	SDS-PAGE Categorie: Instrument
Glass Test Tube (16 × 150 mm)	Pyrex / Duran	—	Stapel behandeling Categorie: Glaswerk
Gloves, Nitrile	Verschillende	—	Persoonlijke bescherming Categorie: Plasticwerk
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x)	Thermo Fisher Scientific	87786	Protease inhibitie Categorie: Chemisch
Incubator	Verschillende	—	Bacterie cultuur Categorie: Instrument
Incubator Shaker	Verschillende	—	Algen cultuur Categorie: Instrument
Inoculating loop	Elke laboratorium leverancier	—	Microbiële overdracht Categorie: Consumptie
KCl	Merck	P5405	Buffer bereiding Categorie: Chemisch
MALDI-TOF Mass Spectrometer (Reflex IV)	Bruker Daltonics	—	Eiwit identificatie Categorie: Instrument
MASCOT	Matrix Science	—	Zoekmachine voor eiwit identificatie via MS data Categorie: Software / Database
MASCOT 2.2	Matrix Science	—	Eiwit identificatie Categorie: Software
Measuring Cylinder	Pyrex	—	Volume meting Categorie: Glaswerk
Microcentrifuge Tube (1.5 mL)	-	—	Stapel verwerking Categorie: Plasticwerk
Microcentrifuge Tube (2.0 mL)	-	—	Stapel verwerking Categorie: Plasticwerk
Micropipette (100–1000 µL)	-	—	Vloeistof behandeling Categorie: Instrument
Micropipette (1–10 µL)	-	—	Vloeistof behandeling Categorie: Instrument
Micropipette (1–5 µL)	-	—	Vloeistof behandeling Categorie: Instrument
Micropipette (1–5 mL)	-	—	Vloeistof behandeling Categorie: Instrument
Micropipette (20–200 µL)	-	—	Vloeistof behandeling Categorie: Instrument
Microplate Reader	BioTek	—	OD600 meting Categorie: Instrument
Mueller–Hinton Agar/Broth	Verschillende	—	Antimicrobiële assays Categorie: Medium
Nanodrop / Biodrop Spectrophotometer	Verschillende	—	Eiwit meting Categorie: Instrument
NCBInr database	National Center for Biotechnology Information	—	Non-redundant eiwit database Categorie: Software / Database
Nutrient Agar