Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Metagenomische Next-Generation Sequencing van cerebrospinaal vocht voor de detectie van ziekteverwekkers van het centrale zenuwstelsel

292 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70075

⸱

17 april 2026

 ,  ,  , 
1University of California, San Francisco Weill Institute for Neurosciences, Department of Neurology, University of California, San Francisco

In dit artikel

Samenvatting

Dit onderzoeksprotocol schetst een geoptimaliseerde workflow voor metagenomische next-generation sequencing (mNGS) van cerebrospinale vloeistof. Door uitdagingen aan te pakken die uniek zijn voor monsters met een lage biomassa, maakt de methode robuuste detectie van ziekteverwekkers mogelijk in diverse hulpbronnenomgevingen, wat een veelzijdige basis biedt voor onderzoeksapplicaties voor neuroinfectieziekten.

Samenvatting

Metagenomische next-generation sequencing (mNGS) is uitgegroeid tot een krachtig hulpmiddel voor onbevooroordeelde detectie van pathogeen en transcriptieprofilering van gastheer in klinische en onderzoeksomgevingen. Hoewel het nut ervan bij het diagnosticeren van infecties van het centrale zenuwstelsel (CZS) steeds meer wordt erkend, vormen cerebrospinale vloeistofmonsters (CSF) unieke uitdagingen vanwege de lage nucleïnezuurconcentratie en de vatbaarheid voor degradatie. Deze studie presenteert een geoptimaliseerd onderzoeksgebaseerd protocol voor Illumina-sequencingplatforms, afgestemd op CSF-mNGS, met inbegrip van monsterbehandeling, nucleïnezuurextractie, bibliotheekvoorbereiding, sequencing en bio-informatische analyse. Kwaliteitscontrolemethoden die zich kunnen aanpassen aan zowel hoge als lage hulpbronnen worden ook aangeboden, waaronder alternatieven voor capillaire elektroforese. Deze studie toont de robuustheid van het protocol aan via twee representatieve cohorten: een diepgaande, op NovaSeq gebaseerde workflow en een kostenbewuste NextSeq-gebaseerde workflow. In deze cohorten werden pathogenen in meer dan 50% van de gevallen gedetecteerd, wat het diagnostische potentieel van de methode onderstreept, zelfs met aanpassingen die beperkte middelen nodig hadden. Dit protocol faciliteert reproduceerbare CSF-mNGS, wat een basis biedt voor diverse toepassingen in neuroinfectieziekteonderzoek en diagnostiek.

Inleiding

Metagenomische next-generation sequencing (mNGS) is een steeds meer gebruikte moleculaire techniek die het mogelijk maakt een breed spectrum aan nucleïnezuren te detecteren binnen een gegeven omgevings- of gastheermonster1. Door het overgrote deel van het genetisch materiaal binnen een monster te amplificeren en te sequencen, vereist mNGS geen vooropgezette hypothese over de specifieke micro-organismen die aanwezig kunnen zijn. mNGS heeft bruikbaar gebleken als diagnostisch hulpmiddel in diverse klinische omgevingen, zoals bij het opsporen van ongebruikelijke ziekteverwekkers of atypische presentaties van infectieziekten 1,2,3. Bovendien wordt het transcriptieprofiel van de gastheer ook vastgelegd door de RNA-sequencinggegevens die door de mNGS-assay worden gegenereerd, waardoor onderzoekers de immuunrespons van de gastheer op verschillende ziektetoestanden beter kunnen begrijpen4. De toepasbaarheid van mNGS op een breed scala aan klinische en onderzoekscontexten, samen met de dramatische kostendaling van generieke sequencing in de afgelopen decennia, heeft geleid tot een enorme groei in het gebruik vandeze technologie.

In het bijzonder heeft mNGS veelbelovend getoond bij het opsporen van infecties van het centrale zenuwstelsel (CZS), die nog steeds moeilijk te diagnosticerenzijn 2,6,7. Voor de komst van klinische mNGS-testen onderzocht het California Encephalitis Project de oorzaken van encefalitis in de hele staat en ontdekte dat meer dan de helft van de gevallen niet werd gediagnosticeerd, ondanks het gebruik van een uitgebreid panel van moleculaire tests en gedetailleerde klinische evaluatie8. Nu, meer dan twee decennia later, heeft een klinisch gevalideerde cerebrospinale vloeistof (CSF) mNGS-test de aanwezigheid van pathogene organismen in het CSF vastgesteld bij bijna 15% van de patiënten met vermoedelijke CNS-infecties over een periode van zeven jaar7. Bovendien werd onder patiënten met bevestigde infectieziektes één op de vijf alleen gediagnosticeerd door deze klinische CSF mNGS-assay, wat het nut van deze testmethode7 benadrukt. Daarnaast hebben studies ook aangetoond dat het potentieel is om de kans op verschillende CNS-infecties te voorspellen op basis van het transcriptoom van de gastheer dat wordt gegenereerd door de mNGS-assay 9,10,11.

De toegankelijkheid van deze veelbelovende techniek wordt echter beperkt door uitdagingen die uniek zijn voor CSF-monsterbehandeling en -verwerking. In het bijzonder is de hoeveelheid CSF-DNA en RNA vaak lager dan de minimale hoeveelheid die door bibliotheekvoorbereidingskits12,13 is gespecificeerd. De kwaliteit van nucleïnezuren kan ook suboptimaal zijn, aangezien CSF-monsters die voor klinische doeleinden worden verzameld vaak worden opgeslagen op temperaturen waarbij DNAses en RNAsesactief kunnen blijven. Dit artikel beschrijft een onderzoeksgebaseerd CSF mNGS-protocol voor Illumina-sequencingplatforms dat is geoptimaliseerd om de kans op het genereren van bruikbare data voor pathogeendetectie te maximaliseren (Figuur 1).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol is ontwikkeld en getest met behulp van monsters die zijn verzameld als onderdeel van studies goedgekeurd door de UCSF Institutional Review Board.

figure-protocol-1
Figuur 1: Cerebrospinale vloeistof (CSF) metagenomische next-generation sequencing (mNGS) monsterverwerking en analytische workflow voor pathogeendetectie. Dit diagram toont de belangrijkste stappen in de CSF mNGS wet-lab en bio-informatische routes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Overwegingen bij het behandelen van CSF-monsters

OPMERKING: mNGS-resultaten zijn optimaal als de voorbereiding van de CSF-bibliotheek plaatsvindt tijdens het verzamelen, of als CSF-monsters worden bewaard via snap-freezing in vloeibare stikstof, gevolgd door langdurige opslag bij -80 °C15. Als alternatief kan het gebruik van conserverende oplossingen zoals DNA/RNA-schild bij het verzamelen van monsters langere tijden bij kamertemperatuur mogelijk maken, namelijk16,17. Dit kan te verkiezen zijn in situaties waarin er zorgen zijn over de betrouwbaarheid van de koelketen. Daarnaast kan het vermijden van onnodige vries-dooicycli ook helpen om de integriteit van nucleïnezuren te behouden, en het kan raadzaam zijn om monsters vooraf te aliquoteren op het moment van verzameling als er meerdere analytische workflows worden verwacht voor de CSF-monsters18,19.

2. Extractie van CSF-nucleïnezuur

VOORZICHTIG: Voer uit in een geschikte bioveiligheidskast met handschoenen en een laboratoriumjas om het risico op overdracht van infectieuze organismen te verminderen. Reagentia zijn schadelijk als ze worden doorgeslikt, ingeademd of in contact komen met huid. Verwijder gebruikte materialen als gevaarlijk chemisch afval in overeenstemming met lokale regelgeving.

  1. De Quick-DNA/RNA Kit werkt over het algemeen goed voor monsters met een lage hoeveelheid nucleïnezuren.
  2. Ontdooi de CSF-monsters op ijs, doe vervolgens 100 μL–1 mL van elk monster over in een 1,5 mL buis en centrifugeer op 16.000 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten.
  3. Pipette voorzichtig het supernatant af, waarbij de pellet (die vaak onzichtbaar is voor het blote oog) en 100 μL supernatant achterblijft.
  4. Voeg 100 μL DNA/RNA Shield toe aan de resterende 100 μL supernatant en pellet, en meng grondig met de pipet.
  5. Voeg vervolgens 600 μL DNA/RNA lysisbuffer en pipetmengsel toe totdat de oplossing homogeen is.
  6. Volg de rest van het DNA/RNA-extractieprotocol zoals beschreven door de fabrikant in aanvullende bijlagen A, met de volgende belangrijke aanpassingen specifiek voor CSF:
    1. Voer alle centrifugatiestappen uit gedurende 1 minuut op maximale snelheid (~21.000 x g) behalve de laatste DNA/RNA-wasstap, die 3 minuten op maximale snelheid moet duren.
    2. Eluteer het monster door 22 μL (in plaats van 25 μL) nucleasevrij water direct aan de kolommatrix toe te voegen, en incubeer vervolgens 3 minuten bij kamertemperatuur. Het hogere volume resulteert doorgaans in een grotere totale hoeveelheid nucleïnezuur dat uit de kolom wordt geëluerd.
    3. Na eluatie pipetteer je de doorstroom-door terug op de kolommatrix en centrifugeer je opnieuw een minuut op maximale snelheid. Breng het monster over naar een nieuwe 1,5 mL opslagbuis en ga direct over tot bibliotheekvoorbereiding of opslag bij -80 °C.

3. CSF RNA-bibliotheekvoorbereiding

VOORZICHTIG: Voer uit in een geschikte bioveiligheidskast, met handschoenen en een laboratoriumjas. Reagentia zijn schadelijk als ze worden doorgeslikt, ingeademd of in contact komen met huid. Verwijder gebruikte materialen als gevaarlijk chemisch afval in overeenstemming met lokale regelgeving.

OPMERKING: Belangrijke overwegingen voorafgaand aan het begin: rRNA-depletie heeft de voorkeur boven polyadenylatieverrijking voor isolatie van mRNA, aangezien de rRNA-depletie geen extra kraalreinigingsstappen vereist (wat de opbrengst van bruikbaar mRNA kan verminderen), en sommige neuroinvasieve RNA-virustranscripten geen polyadenylatie hebben. ERCC (External RNA controls consortium) RNA Spike-In kan worden toegevoegd als kwaliteitscontrolemaatregel, hoewel dit niet strikt noodzakelijk is. Als het RNA na extractie bij -80 °C is opgeslagen, ontdooi dan op ijs voordat het begint.

  1. RNA-fragmentatie en priming: Pipet-mix het volgende in een polymerasekettingreactie (PCR) buis: 3,5 μL RNA-monster, 0,5 μL 1:2500 verdund ERCC spike-in, 4 μL eerste-streng reactiebuffer (5x), 1 μL willekeurige primers en 1 μL 1:100 verdund rRNA (Table of Materials). In een thermocycler zet je het verwarmde deksel op 105 °C en incubeer je de monsters op 75 °C gedurende 2 minuten, 70 °C voor 2 minuten, 65 °C voor 2 minuten, 60 °C voor 2 minuten, 55 °C voor 2 minuten, 37 °C voor 5 minuten en 25 °C voor 5 minuten.
  2. Eerstestreng cDNA-synthese: Pipette mengt het gefragmenteerde en geprimeerde RNA (10 μL) met 8 μL nucleasevrij water en 2 μL eerstestrengs synthese-enzymmix. In een thermocycler zet je het verwarmde deksel op 105 °C en becubeer je de monsters op 25 °C gedurende 10 minuten, 42 °C gedurende 15 minuten en 70 °C gedurende 15 minuten.
  3. Tweede-streng cDNA-synthese: Pipettenmix het eerste-streng gesynthetiseerde DNA (20 μL) met 8 μL tweede-streng synthese reactiebuffer, 4 μL tweede-streng synthese enzymmix en 48 μL nuclease-vrij water. In een thermocycler incubeer je de monsters 1 uur bij 16 °C, met het verwarmde deksel uitgeschakeld.
  4. Voer een magnetische kraalzuivering uit (aanvullende bijlagen B) met een verhouding van 1,8x SPRI magnetische kralen (144 μL). Eluteer in 53 μL nucleasevrij water en breng 50 μL van de uiteindelijke supernatant (met gezuiverde dubbelstrengs cDNA) over in een schone nucleasevrije PCR-buis. Op dit punt kunnen de monsters veilig worden ingevroren bij -20 °C 's nachts indien nodig.
  5. cDNA-bibliotheek eindvoorbereiding: Als het monster 's nachts bij -20 °C is bewaard, ontdooi dan op ijs voordat het opnieuw wordt gestart. Pipette mengt het gezuiverde ds-cDNA (50 μL) met 7 μL eindprep-reactiebuffer en 3 μL eindprep-enzymmix.
  6. In een thermocycler incubeer je de monsters bij 20 °C gedurende 30 minuten en 65 °C gedurende 30 minuten, met het verwarmde deksel gesloten.
  7. Adapterligatie (voer deze stap uit op ijs): Maak een verdunning van de adapter van 1:100 in nucleasevrij water. Pipetteer het eindpreparatreactiemengsel (60 μL) in een buis met 30 μL ligatie-meestermix, 1 μL ligatieversterker en 2,5 μL 1:100 verdunde adapter. Zorg ervoor dat de adapter apart wordt toegevoegd (bijvoorbeeld niet vooraf gemengd met de ligatie-mastermix of ligatie-enhancer) om de vorming van adapterdimeren te voorkomen.
  8. In een thermocycler incubeer je de monsters bij 20 °C gedurende 15 minuten, met het verwarmde deksel uitgeschakeld.
  9. Ga direct over tot magnetische kralenzuivering (Aanvullende bijlage 2) met een verhouding van 0,9x SPRI magnetische kralen (87 μL).
  10. Eluteer in 17 μL nucleasevrij water en breng 15 μL van het uiteindelijke supernatant over naar een schone nucleasevrije PCR-buis
  11. Barcoding PCR: Pipett het gezuiverde, adapter-geligeerde cDNA (15 μL) in een buis met 3 μL USER-enzym, 25 μL Q5 Master Mix en 10 μL unieke barcodeprimers. In een thermocycler zet je het verwarmde deksel op 105 °C, breng je de monsters uit op 37 °C gedurende 15 minuten, daarna 98 °C gedurende 30 s, en voer je vervolgens 19 cycli uit van 98 °C voor 10 s en 65 °C voor 75 s. Rond de PCR af door 5 minuten te incuberen op 65 °C.
  12. Voer een laatste magnetische kraalzuivering uit met een verhouding van 0,8x magnetische kralen (43 μL). Eluteer in 23 μL nucleasevrij water en breng na de laatste parelscheidingsstap 20 μL over in een schoone, nucleasevrije PCR-buis. Op dit punt kunnen de monsters veilig worden ingevroren bij -20 °C 's nachts indien nodig.

4. CSF DNA-bibliotheekvoorbereiding

VOORZICHTIG: Werk in een geschikte kast met een bioveiligheidsniveau met handschoenen en een laboratoriumjas. Reagentia zijn schadelijk als ze worden doorgeslikt, ingeademd of in contact komen met huid. Verwijder gebruikte materialen als gevaarlijk chemisch afval in overeenstemming met lokale regelgeving.

  1. Als het geëxtraheerde DNA 's nachts bij -20 °C is opgeslagen, ontdooi dan op ijs voordat je opnieuw begint.
  2. DNA-fragmentatie en eindvoorbereiding: Meng de buffer voor de reactie van de eerste streng grondig door te vortexen en de oplossing te mengen met een pipet om eventuele neerslag opnieuw te laten ophangen. Pipetmix bevat 3,5 μL van het geëxtraheerde DNA, 22,5 μL nucleasevrij water, 7 μL eerste-streng reactiebuffer en 2 μL eerste-streng enzymmix.
  3. In een thermocycler zet je het verwarmde deksel op 105 °C en incubeer je de monsters op 37 °C gedurende 5 minuten, daarna op 65 °C gedurende 30 minuten.
  4. Het adapterligatie en het barcode PCR-proces is identiek voor de DNA- en RNA-bibliotheken. Herhaal secties 7–10 van de "CSF RNA Library Preparation" met het gefragmenteerde en eindvoorbereide DNA om de DNA-bibliotheekvoorbereiding te voltooien.

5. Kwaliteitscontrole en pooling van bibliotheken

  1. Kwantificeer de concentratie van de monsterbibliotheken via de DNA-kwantificatiekit en de bijbehorende fluorometer. Watercontroles moeten aanzienlijk lagere (of niet kwantificeerbare) concentraties hebben vergeleken met de rest van de monsters.
  2. Beoordeel de grootte van de monsterbibliotheek door de monsters te laten draaien op een geautomatiseerde capillaire elektroforesemachine.
  3. Als er als alternatief geen geautomatiseerde capillaire elektroforesemachine beschikbaar is, versterk dan 1-2 μL van het monster verder door een PCR-reactie met Illumina universele primers uit te voeren, en vervolgens een elektroforese van 10 μL van het eindproduct op een 2% agarosegel. Verwijder gebruikte materialen als gevaarlijk chemisch afval in overeenstemming met lokale regelgeving.
    OPMERKING: De optimale bibliotheeklengte is ongeveer 400–500 basenparen, dus toekomstige fragmentatie-incubaties moeten dienovereenkomstig worden aangepast als de bibliotheekgroottes groter of korter zijn dan gewenst. Daarnaast is het cruciaal om te beoordelen op de aanwezigheid van adapterdimeren, die ongeveer 150 basenparen lang zijn en optreden wanneer twee adaptermoleculen per ongeluk met elkaar samengaan zonder insertsequentie. Zelfs als ze in kleine hoeveelheden aanwezig zijn, clusteren en sequencen adapterdimers efficiënt op de flowcel, waardoor het aandeel bruikbare reads tijdens een sequencingrun afneemt. Als er adapterdimere aanwezig zijn, voer dan een extra magnetische kraalzuivering uit met een verhouding van 0,8x SPRI-magnetische kralen. (Opmerkelijk is dat als >10% van het monster adapterdimeer is, het mogelijk 2-3 rondes magnetische parelzuivering kan kosten om de meeste adapterdimeren te verwijderen).
  4. Om een vergelijkbare diepte van sequencing over monsters binnen dezelfde sequencingrun te garanderen, is het noodzakelijk om equimolaire hoeveelheden van elk monster samen te voegen. Als de bibliotheekgroottes vergelijkbaar zijn over alle monsters, voeg dan simpelweg equivalente massa's van elke RNA-bibliotheek samen en herhaal dit afzonderlijk voor elke DNA-bibliotheek.

6. Volgordeoverwegingen

  1. De gepoolde monsters zijn nu klaar voor sequencing op Illumina-sequencingapparaten. Als je intern sequenceert (in plaats van via een gespecialiseerde sequencing core-faciliteit), denatureer en verdun dan zorgvuldig de gepoolde bibliotheken volgens de instructies van het sequencing-apparaat voordat je de pool op de reagentcartridge laadt (de typische concentratie is 4 nM voor de meeste Illumina-sequencingplatforms).
  2. Bereken de geschatte sequencingdiepte door de verwachte dataopbrengst voor de Illumina-flowcel te delen door het aantal gemultiplexeerde monsters in de run.
    OPMERKING: Het bepalen van de gewenste sequencingdiepte hangt af van verschillende factoren, waaronder kosten, het gebruikte sequencing-apparaat en de doelstellingen van het experiment. Twee voorbeelden van verschillende sequencingdieptes worden hieronder gepresenteerd in de sectie Representatieve Resultaten.

7. Data-analyse voor het opsporen van ziekteverwekkers

  1. Maak gebruik van het open-source webgebaseerde platform Chan Zuckerberg ID (CZID, https://www.czid.org, Illumina mNGS Pipeline v8.3) om de metagenomische analyse voor het opsporen van ziekteverwekkers uit te voeren. CZID bevat ook opties om samples te uploaden via de commandoregelinterface en directe overdracht van een Illumina BaseSpace-account naar CZID. Een gedetailleerd overzicht van de analyse van CZID mNGS-gegevens is beschikbaar op https://chanzuckerberg.zendesk.com/hc/en-us/articles/13770737266196-Guide-to-mNGS-Data-Analysis
  2. Log in bij CZID, klik op "upload", selecteer "metagenomics" voor analysetype en selecteer de input fastq-bestanden uit de sequencing-run. Voer de benodigde informatie in voor elk monster, inclusief monsternaam, monstertype (CSF) en nucleotide (RNA of DNA).
    OPMERKING: De geüploade bestanden ondergaan geautomatiseerde verwerking via de CZID-pijplijn, die verschillende computationele tools bevat zoals STAR, Bowtie2, Trimmomatic, PriceSeq en GSNAP, onder andere, om lage kwaliteit leesopdrachten en menselijke leessequenties te verwijderen. De pijplijn lijnt vervolgens de gefilterde sequenties uit en assembleert ze met behulp van de nucleotide (NT) en eiwit (NR) databases van het National Center for Biotechnology Information (NCBI) via respectievelijk de softwareprogramma's Minimap2 en DIAMOND. De uiteindelijke CZID-output omvat NT/NR-taxontellingen en contig-tellingen (aaneengesloten, overlappende segmenten die tijdens de assemblage worden gegenereerd) voor elk monster.
  3. Na verwerking klik je op de projectmap met de voorbeelden en ga je naar het samenvattingsdashboard.
  4. Scroll naar beneden om het aantal reads per monster te bekijken (en vergelijk het met het verwachte aantal reads op basis van de gebruikte Illumina-flowcel en het aantal monsters dat in de sequencing run is gemultiplexed), het percentage reads dat door kwaliteitscontrolefiltering komt, en de dubbele compressieverhouding om te beoordelen op biased PCR-overamplificatie.
  5. De aanwezigheid van besmetting door nucleïnezuurfragmenten uit de omgeving - verkregen tijdens het CSF-monsterverzamelingsproces, hetzij tijdens extractie/bibliotheekvoorbereiding - is een veelvoorkomend verschijnsel. Om te bepalen of bacteriële, schimmel- en parasitaire reads echte positieven zijn, kunnen mogelijke methoden worden overwogen die gebruikmaken van de genormaliseerde readcounts (reads per million, of rPM):
    1. Maak een achtergrondmodel (bijvoorbeeld met watermonsters die zijn geëxtraheerd, voorbereid en gesequenced) direct binnen CZID om taxonen met rPM's die vergelijkbaar zijn met of lager zijn in hoeveelheid ten opzichte van het achtergrondmodel (en dus waarschijnlijk verontreiniging vertegenwoordigen) eruit te filteren. Controleer binnen de projectmap elk van de watercontrolemonsters en klik vervolgens op "achtergrondmodel" om het aan te maken. Selecteer bij het analyseren van elk monster het achtergrondmodel en klik op "threshold filters" om een "NTZ Score" > 1 (of hoger) toe te passen om waarschijnlijke verontreinigingen eruit te filteren.
    2. Gebruik vooraf bepaalde rPM-drempels, zoals rpM-monster > 10* (gemiddelde rPM-controles), of log10 (rPM-monster) minstens 1 log groter dan log 10 (gemiddelde rPMhele cohort). Download eerst de taxon-specifieke rPM voor elk monster door elk monster op de projectpagina te controleren, op downloaden te klikken en "Gecombineerde Steekproef Taxon Resultaten" te selecteren. Het resulterende .csv-bestand kan naar wens worden geanalyseerd met statistische software zoals R of Stata.
      OPMERKING: Gezien de lagere relatieve hoeveelheid virale pathogenen, moet elk virus met bekend neuroinvasief potentieel en ten minste één read die aansluit bij het virale genoom als positief worden beschouwd (en idealiter bevestigd via herhaalde mNGS of pathogen-specifieke klinische tests). Daarnaast vereist de analytische pijplijn dat elke lezing in het fastq-bestand computationeel is uitgelijnd met het meest waarschijnlijke referentiegenoom in de NCBI-database. Daardoor kunnen sommige reads relatief niet-specifiek zijn voor een bepaald pathogeen en theoretisch kunnen ze zijn uitgelijnd op een breed scala aan organismen in plaats van het specifieke taxon dat in CZID is toegewezen. Gezien dit risico moet handmatige bevestiging van positieve calls worden uitgevoerd door de uitlijning te bevestigen via de webgebaseerde NCBI BLAST-tool (de specifieke reads voor een taxon kunnen direct van CZID naar NCBI BLAST worden verzonden door op het blast-icoon naast het betreffende taxon te klikken).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Kwaliteitscontrole van de bibliotheek
Na DNA/RNA-extractie is de gemeten concentratie van het geëxtraheerde DNA doorgaans 1–10 ng/μL. De concentratie van het geëxtraheerde RNA ligt echter vaak in de orde van pg/μL, waardoor het vaak niet detecteerbaar is door spectrofotometers. Na de voorbereiding van de bibliotheek zijn de gezuiverde en geamplificeerde cDNA- en DNA-bibliotheken doorgaans respectievelijk 0,5–10 ng/μL en 10–30 ng/μL. De capillaire elektroforese- en ele...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Er zijn belangrijke overwegingen die aanpassingen aan dit protocol kunnen vereisen, afhankelijk van de gewenste sequencingdiepte, het gebruikte sequencingplatform en de beschikbaarheid van apparatuur voor kwaliteitscontrole. Desalniettemin tonen de twee hier gepresenteerde representatieve cohorten aan dat robuuste detectie van pathogeen mogelijk is binnen een breed scala aan experimentele omstandigheden. Specifiek toonde Cohort B aan dat, ondanks verschillende kostenbesparende maatregele...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

M.R.W. ontvangt niet-gerelateerde onderzoekssubsidies van Roche/Genentech, Novartis en Kyverna Therapeutics en is oprichter en bestuurslid van Delve Bio Inc. Hij heeft adviesdiensten geleverd aan Pfizer, Vertex Pharmaceuticals, Ouro Medicines en Indapta Therapeutics.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door financiering van het Fogarty International Center van de National Institutes of Health onder Award Number D43TW009343. We willen de vele onderzoekers van het Wilson Lab, UCSF en CZI bedanken die hebben bijgedragen aan de ontwikkeling en optimalisatie van mNGS-protocollen voor diverse onderzoekstoepassingen in de afgelopen jaren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.2mL PCR tube stripEppendorf30124359
1.5 mL DNA LoBind TubesEppendorf30108051
1.5 mL Safe Lock tubesEppendorf30120191
ERCC RNA Spike-In MixThermo Fisher4456740
High Sensitivity D1000 ReagentsAgilent5067-5585
Invitrogen Collibri Library Amplification Master MixThermo FisherA38539050
Mastercycler x50Thermo Fisher6311000010
NEBNext Multiplex Oligos for IlluminaNew England Biolabs7335S/L
NEBNext Ultra II DNA Library Prep KitNew England BiolabsE7645
NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for IlluminaNew England BiolabsE7770
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles)Illumina20024907
NextSeq 550IlluminaN/a
QIAseq FastSelect -rRNA HMR KitQuiagen334386
Qubit 1X dsDNA High Sensitivity Assay KitQubitQ33230
Qubit 4 FluorometerThermo Fishern/a
Quick-DNA/RNA Microprep Plus Kit ZymoD7005
TapeStation 4150AgilentG2992AA

Referenties

  1. Chiu, C. Y., Miller, S. A. Clinical metagenomics. Nat Rev Genet. 20 (6), 341-355 (2019).
  2. Wilson, M. R., et al. Clinical metagenomic sequencing for diagnosis of meningitis and encephalitis. N Engl J Med. 380 (24), 2327-2340 (2019).
  3. Forbes, J. D., Knox, N. C., Ronholm, J., Pagotto, F., Reimer, A. Metagenomics: the next culture-independent game changer. Front. Microbiol. 8, (2017).
  4. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  5. DNA Sequencing Costs: Data. , National Human Genome Research Institute (US). https://www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/DNA-Sequencing-Costs-Data (2026).
  6. Wilson, M. R., et al. Chronic meningitis investigated via metagenomic next-generation sequencing. JAMA Neurology. 75 (8), 947-955 (2018).
  7. Benoit, P., et al. Seven-year performance of a clinical metagenomic next-generation sequencing test for diagnosis of central nervous system infections. Nat Med. 30 (12), 3522-3533 (2024).
  8. Glaser, C. A., et al. In search of encephalitis etiologies: diagnostic challenges in the California encephalitis project, 1998-2000. Clinical Infectious Diseases. 36 (6), 731-742 (2003).
  9. Ramachandran, P. S., et al. Integrating central nervous system metagenomics and host response for diagnosis of tuberculosis meningitis and its mimics. Nat Commun. 13, 1675(2022).
  10. Xing, Z., et al. Integrating DNA/RNA microbe detection and host response for accurate diagnosis, treatment, and prognosis of childhood infectious meningitis and encephalitis. J Transl Med. 22, 583(2024).
  11. Omura, C., et al. 298. Host response profiling from clinical metagenomic sequencing data for diagnosis of central nervous system infections. Open Forum Infect Dis. 12 (1), (2025).
  12. Andriuk, L. V., Skochiĭ, P. G. Nucleic acids of the cerebrospinal fluid in acute disorders of cerebral circulation. Zh Nevropatol Psikhiatr Im S S Korsakova. 88 (7), 32-34 (1988).
  13. Olausson, J., et al. Optimization of cerebrospinal fluid microbial DNA metagenomic sequencing diagnostics. Sci Rep. 12 (1), 3378(2022).
  14. Becskei, A., Rahaman, S. The life and death of RNA across temperatures. Comput Struct Biotechnol J. 20, 4325-4336 (2022).
  15. Wang, C., Liu, H. Factors influencing degradation kinetics of mRNAs and half-lives of microRNAs, circRNAs, lncRNAs in blood in vitro using quantitative PCR. Sci Rep. 12 (1), 7259(2022).
  16. Cb, T., et al. DNA/RNA preservation in glacial snow and ice samples. Frontiers in microbiology. 13, (2022).
  17. Kazantseva, J., et al. Optimisation of sample storage and DNA extraction for human gut microbiota studies. BMC microbiology. 21 (1), (2021).
  18. Xiaoli, J., et al. The impact of repeated freeze-thaw cycles on the quality of biomolecules in four different tissues. Biopreservation and biobanking. 15 (5), (2017).
  19. Kellman, B. P., et al. Multiple freeze-thaw cycles lead to a loss of consistency in poly(A)-enriched RNA sequencing. BMC genomics. 22 (1), (2021).
  20. Zinter, M. S., Mayday, M. Y., Ryckman, K. K., Jelliffe-Pawlowski, L. L., DeRisi, J. L. Towards precision quantification of contamination in metagenomic sequencing experiments. Microbiome. 7 (1), 62(2019).
  21. Mayday, M. Y., Khan, L. M., Chow, E. D., Zinter, M. S., DeRisi, J. L. Miniaturization and optimization of 384-well compatible RNA sequencing library preparation. PLoS One. 14 (1), e0206194(2019).
  22. Sakiyama, Y., et al. Brain biopsy and metagenomic sequencing enhance aetiological diagnosis of encephalitis. Brain Commun. 7 (3), fcaf1650(2025).
  23. Sakiyama, Y., Yuan, J., Yoshimura, A., Takei, J., Ando, M., Takashima, H. Etiological insights of encephalitis and encephalitis-like central nervous system diseases: brain tissue metagenomic next-generation sequencing. Neurology. 102 (7-1), 3782(2024).
  24. Sun, J., et al. Correcting PCR amplification errors in unique molecular identifiers to generate accurate numbers of sequencing molecules. Nat Methods. 21 (3), 401-405 (2024).
  25. Tan, J. K., et al. Laboratory validation of a clinical metagenomic next-generation sequencing assay for respiratory virus detection and discovery. Nat Commun. 15 (1), 9016(2024).
  26. Prasanna, A. kshatha Clin-mNGS: Automated pipeline for pathogen detection from clinical metagenomic data. , https://github.com/AkshathaPrasanna/Clin-mNGS (2025).
  27. Marra, P. S., et al. Metagenomic next-generation sequencing in patients with infectious meningoencephalitis: a comprehensive systematic literature review and meta-analysis. Open Forum Infect Dis. 12 (5), ofaf274(2025).
  28. Ramachandran, P. S., Wilson, M. R. Metagenomics for neurological infections - expanding our imagination. Nat Rev Neurol. 16 (10), 547-556 (2020).
  29. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87(2014).
  30. Simner, P. J., Miller, S., Carroll, K. C. Understanding the promises and hurdles of metagenomic next-generation sequencing as a diagnostic tool for infectious diseases. Clin Infect Dis. 66 (5), 778-788 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Metagenomische sequencingpathogeendetectieextractie van nucle nezurenlibrary preparatiezuivering met magnetische beadscapillaire elektroforesebio informatische analysegasttranscriptomics
Metagenomische Next-Generation Sequencing van cerebrospinaal vocht voor de detectie van ziekteverwekkers van het centrale zenuwstelsel
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.