Dit protocol beschrijft een tweefasige zuur-oplosmiddelextractiemethode om korteketenvetzuren uit laag-invoer muisuitwerpselmonsters te isoleren zonder derivatisatie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Extractie van kortketenvetzuren uit muizenuitwerpselen met behulp van een tweefasige zuur–oplosmiddelmethode
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Dit artikel beschrijft een protocol voor het extraheren van korteketenvetzuren (SCFA's) uit laag-input muisontlastingsmonsters met behulp van een tweefasige zuur-oplosmiddel extractiestrategie. De methode is ontworpen voor individuele fecale inputs van ongeveer 20–50 mg en maakt gebruik van verdund zoutzuur en ethylacetaat om fase-scheiding zonder derivatisatie mogelijk te maken. Het protocol bestaat uit fecale homogenisatie, verzuring, organische oplosmiddelverdeling en centrifugatie bij lage temperatuur, en kan worden uitgevoerd met standaard laboratoriumapparatuur die algemeen beschikbaar is in onderzoekslaboratoria. Na extractie zijn SCFA's geschikt voor downstream-analyse door routinematige gaschromatografie-gebaseerde platforms. Succesvolle uitvoering van het protocol wordt aangetoond door het detecteren van duidelijk opgeloste SCFA-pieken bij karakteristieke retentietijden boven achtergrondruis, zoals aangetoond bij belangrijke fecale SCFA's waaronder acetaat, propionaat en butyraat uit individuele muismonsters. Dit protocol pakt een veelvoorkomende procedurele uitdaging in kleine dierstudies aan door een gestandaardiseerde workflow te bieden voor fecale SCFA-extractie uit beperkt monstermateriaal, terwijl compatibiliteit met routinematige analytische workflows behouden blijft.
Inleiding
Dit protocol is ontwikkeld om het extraheren van korteketenvetzuren (SCFA's) uit muisfecale monsters met lage input mogelijk te maken in een formaat dat compatibel is met routinematige gaschromatografie (GC)-gebaseerde analyse. SCFA's zijn vluchtige organische vetzuren met minder dan zes koolstofatomen, voornamelijk waaronder azijnzuur, propionzuur en boterzuur, die worden geproduceerd door darmmicrobiota door de fermentatie van onverteerbare voedingsvezels1. Het kwantificeren van deze metabolieten van individuele muizen is vaak vereist in kleine dierstudies waarbij het ontlasting beperkt is en monsters gekoppeld zijn aan gedrags-, metabole of fysiologische fenotypes 2,3,4,5,6. Een praktische, laag-input extractieworkflow is daarom noodzakelijk om experimentele ontwerpen te ondersteunen die vertrouwen op SCFA-metingen per dier.
Bestaande benaderingen voor fecale SCFA-analyse brengen verschillende methodologische beperkingen met zich mee. Het kwantificeren van SCFA's in fecale monsters blijft analytisch uitdagend vanwege hun vluchtigheid, lage abundantie en de complexiteit van biologische matrices7. Standaardworkflows vereisen vaak derivatisatiestappen, grote monstervolumes en gespecialiseerde apparatuur zoals geautomatiseerde vloeistofbehandeling, gespecialiseerde homogenisatieplatforms of vaste-fase extractiekolommen 8,9,10,11. Deze eisen kunnen de toegankelijkheid en schaalbaarheid beperken, vooral in muisstudies waar de uitwerpseloutput per dier minimaal is en longitudinale of genotype-specifieke bemonstering vaakvoorkomt 12,13,14. Als gevolg hiervan blijft er een methodologische kloof voor protocollen die SCFA-extractie uit kleine fecale inputs zonder derivatisatie mogelijk maken, terwijl ze compatibel blijven met standaard gaschromatografieworkflows.
Het hier beschreven protocol vult deze kloof door een tweefasige zuur–oplosmiddelextractiestrategie toe te passen met verdund zoutzuur en ethylacetaat. De workflow bestaat uit fecale homogenisatie, verzuring, verdeling van organische oplosmiddelen en centrifugatie bij lage temperatuur, en is ontworpen om te werken met kleine fecale ingangsmassa's. In tegenstelling tot derivatisatie-gebaseerde workflows die extra chemische modificatiestappen of gespecialiseerde monstervoorbereidingsplatforms vereisen, maakt dit protocol directe extractie van SCFA's mogelijk in een formaat dat compatibel is met routinematige GC-gebaseerde analyse met standaard laboratoriumapparatuur2.
Deze methode is bedoeld voor studies waarbij SCFA-extractie uit beperkte hoeveelheden muizenuitwerpselmateriaal nodig is, vooral wanneer individuele metingen nodig zijn of wanneer de beschikbaarheid van monsters het experimentele ontwerp beperkt. Het is geschikt voor GC-gebaseerde analyse van veelvoorkomende SCFA's (C2–C6) in fecale monsters, maar is niet ontworpen voor toepassingen die derivatisatie-afhankelijke detectie, ultra-trace kwantificering buiten GC-gevoeligheid of beoordeling van systemische SCFA-concentraties vereisen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het Permanent Comité voor Dieren in Mass General Brigham (MGB), Boston, MA, VS, keurde het voorgaande dierenprotocol goed, dat was ontworpen om het aantal gebruikte dieren te minimaliseren. Dit protocol voldoet aan de richtlijnen en regelgeving van de National Institutes of Health. Dit manuscript is samengesteld volgens de ARRIVE-richtlijnen. Het protocoldiagram is weergegeven in Figuur 1 en de benodigde materialen staan vermeld in de Materiaaltabel.
Figuur 1: Diagram van het protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
1. Ontlastingsmonsters verzamelen en voorbereiden
- Verzamel verse fecale (~30 mg) monsters in aparte 1,5 mL microcentrifugebuizen. Noteer de exacte fecale invoermassa voor elk monster om een nauwkeurige normalisatie van SCFA-concentraties mogelijk te maken.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de buit schone flesjes, handschoenen en pincet voor elk monster bevat. Alle glaswerk en instrumenten moeten vóór gebruik geautoclaveerd zijn. Dit protocol is gevalideerd voor fecale inputmassa's van ongeveer 20–50 mg per monster, waarbij ~30 mg als representatieve input wordt gebruikt. De extractievolumes blijven binnen dit bereik constant gehouden. - Plaats en label het benodigde aantal centrifugebuisjes dat bij de monsters hoort.
- Bereid verdund zoutzuur (0,5 M; pH 1–2) voor door langzaam geconcentreerd HCl (12 M, ACS-reagenskwaliteit) toe te voegen aan ultrazuiver water.
VOORZICHTIG: HCl is corrosief; Het kan ernstige brandwonden veroorzaken aan huid, ogen en luchtwegen. Gevaarlijk om in te ademen. - Ontdooi monsters op kamertemperatuur gedurende 30–45 minuten, of tot ze volledig ontdooid zijn.
2. Homogenisatie en verzuring van monsters
- Voeg 255 μL van de 0,5 M HCl-oplossing toe aan elk centrifugebuisje.
- Neem een nieuw flesje en vul het met 70% ethanol om te gebruiken voor het schoonmaken van pincetten. Maak de pincet schoon door ze in de ethanol te dopen en ze vervolgens te drogen op een schoon keukenpapier.
VOORZICHTIG: Ethanol is brandbaar en kan huid en ogen irriteren; Het inademen van dampen kan duizeligheid veroorzaken. - Zet een ethanolbad voor de stampers in door de stampers in een container te plaatsen en deze te vullen met 70% ethanol totdat alle stampers volledig onder water zijn.
- Haal het juiste monster uit de monsterbox. Haal het deksel van het flesje en verwijder één monster (~30 mg) van de ontlasting.
- Plaats de ontlastingsmonsters in de bijbehorende centrifugebuisjes.
- Zodra alle monsters in de juiste centrifugebuisjes zijn geplaatst, haal je een stamper uit het ethanolbad. Droog de stamper af met een schoon keukenpapier.
OPMERKING: Gebruik voor elk monster een nieuwe stamper. - Gebruik de stampers om de ontlastingsmonsters correct te vermalen en op te lossen, zie Figuur 2. Maal het fecale monster totdat er een visueel homogene suspensie is verkregen, zonder zichtbare vaste fragmenten.
Figuur 2: Malen van fecale monsters met een stamper. Vers verzamelde ontlasting wordt gemalen om een uniforme consistentie voor SCFA-analyse te bereiken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Leg de gebruikte stampers in een lege doos om later te wassen.
- Vortex de monsters met een pulsvormige vortexmixer op maximale snelheid gedurende 10 seconden, met buisjes stevig afgedekt.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de centrifugeflesjes goed zijn afgedekt om te voorkomen dat het mengsel morst.
3. SCFA-extractie en faseafscheiding
- Centrifugeer de monsters op 16.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C, zodat de centrifuge goed in balans wordt gebracht.
- Na het starten van de centrifuge labelen we de nieuwe centrifugebuisjes met de monsters. Verwijder de monsters uit de centrifuge zodra de centrifugatie is voltooid.
- Stel de 200 μL pipet in op 120 μL. Verzamel na centrifugatie zorgvuldig 120 μL van het waterige supernatantant, zodat de pellet niet wordt verstoord. Doe het supernatant over in de nieuw gelabelde centrifugebuisjes en gooi de pellet weg.
- Voeg een gelijke hoeveelheid (120 μL) ethylacetat toe aan de nieuw gelabelde flesjes met de supernatante vloeistof. Herhaal dit voor alle samples.
VOORZICHTIG: Ethylacetaat is brandbaar en kan huid, ogen en ademhalingssysteem irriteren. Vermijd het inademen van dampen en langdurig contact. - Breng de monsters weer naar de centrifuge. Zorg ervoor dat de centrifuge goed in balans is en dat het rotordeksel goed vastzit. Draai op 2.374 × g gedurende 20 minuten bij 4 °C.
- Na centrifugatie wordt zorgvuldig 120 μL van de bovenste organische fase verzameld zonder de onderste waterige fase te verstoren. Breng het geëxtraheerde SCFA-bevattende supernatant over in nieuwe, gelabelde centrifugebuisjes.
OPMERKING: Het verzamelde volume kan minder zijn dan 120 μL. Als er een emulsie aanwezig is op het grensvlak, verleng dan de centrifugatie of koel de monsters op ijs totdat er een duidelijke fase-scheiding is bereikt. Procedurele blanco monsters die parallel zonder fecaal materiaal worden verwerkt, kunnen worden opgenomen als een optionele kwaliteitscontrole om achtergrondniveaus van SCFA's te beoordelen die door reagentia of hantering worden geïntroduceerd. - Controleer eerdere flesjes om te controleren of de onderste laag niet per ongeluk is opgetrokken.
OPMERKING: Stappen met zuurtoevoeging en het omgaan met organisch oplosmiddel moeten snel worden uitgevoerd, waarbij buisjes waar mogelijk worden afgedekt, om verdampings- of verdampingsverliezen te minimaliseren.
4. Extracten, verwerking en opslag
- Zoek een extractiebox op en label het correct, en plaats de geëxtraheerde monsters erin.
OPMERKING: Monsters kunnen veilig worden gepauzeerd na het verzamelen van organische fase door de extracten tot 24 uur op −20 °C te bewaren in dicht afgesloten buizen, waarna ze worden overgebracht naar −80 °C voor langere tijd. - Plaats de doos in een vriezer van -80 °C om te wachten op SCFA-analyse.
OPMERKING: Omdat zowel ethylacetaat als SCFA zeer vluchtig zijn, moeten geëxtraheerde monsters direct na opslag worden geanalyseerd bij −80 °C. Langdurige opslag kan de integriteit van het monster in gevaar brengen.
5. Gaschromatografie-analyse
- Analyseer de geëxtraheerde SCFA's met GC met behulp van een gefuseerde silica-capillaire kolom met een vrije vetzuur-stationaire fase bij debietsnelheden van respectievelijk 30, 300 en 20 mL/min voor waterstof, lucht en stikstof. Injecteer een 1 μL aliquot van het organisch extract voor analyse.
- Voor kwantitatieve toepassingen worden interne standaarden en kalibratieprocedures (bijv. 2-ethylbutyrinezuur) zoals eerder beschreven2.
OPMERKING: Gedetailleerde instrumentspecifieke instellingen zijn te vinden in de gerefereerde methoden14.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het bovenstaande protocol heeft geëxtraheerde SCFA-aliquots van 120 μL opgeleverd, overeenkomend met het aantal fecale monsters waaruit ze zijn afgeleid. Succesvolle uitvoering van het extractieprotocol wordt aangegeven door de aanwezigheid van duidelijk gedefinieerde SCFA-pieken op karakteristieke retentietijden met signaalintensiteit boven achtergrondruis. Wanneer uitgevoerd zoals beschreven, levert het protocol fecale SCFA-profielen op die geschikt zijn voor kwantitatieve vergelijking...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol bevat verschillende kritieke stappen die zorgen voor een efficiënte en reproduceerbare extractie van SCFA's uit kleine volumes muizenuitwerpselen. Het protocol maakt gebruik van een tweefasen-zuur-oplosmiddel extractiesysteem met gedefinieerde volumes verdund zoutzuur en ethylacetaat, dat is afgestemd op de fysisch-chemische eigenschappen van SCFA's als laagmoleculaire, zwakke organische zuren. Verzuring brengt SCFA's in hun geprotoneerde vorm, waardoor ionische interacties ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.
Dankbetuigingen
Wij erkennen dankbaar de financiële steun voor deze studie die door de National Institutes of Health is verleend via R21AG065606 en R21AG08176 toegekend aan Yiying Zhang, evenals steun van de Borten Family Foundation en de Tang Family gift aan Yiying Zhang.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Centrifuge | ThermoFisher | 75003424 | "Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge" |
| Centrifuge vials | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Microtube Rack | Millipore Sigma | HS29025F-5EA | |
| Ethyl acetate | ThermoFisher | 022912.K2 | HPLC Grade, ≥99.5% |
| Green pestles | Fisher Scientific | 50-189-9195 | |
| HCl | Fisher Scientific | SA49 | ACS Certified (10 N, stock solution); diluted to 0.5 M for use |
| 1000 µL pipette | USA Scientific | 7110-1000 | |
| 1000 µL pipette tips | USA Scientific | 1111-2821 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | Molecular Biology Grade, 70% solution |
| 200 µL pipette | USA Scientific | 7100-2200 | |
| 200 µL pipette tips | USA Scientific | 1110-1800 | |
| Tweezers | ThermoFisher | 046638.KT | |
| Vortex | Fisher scientific | 50-136-7909 | "Research Products International Corp VORNADO Miniature Vortex Mixer, Purple Cup" |
Referenties
- Koh, A., De Vadder, F., Kovatcheva-Datchary, P., Bäckhed, F. From dietary fiber to host physiology: short-chain fatty acids as key bacterial metabolites. Cell. 165 (6), 1332-1345 (2016).
- Zhang, Y., et al. Transmission of Alzheimer's disease-associated microbiota dysbiosis and its impact on cognitive function: evidence from mice and patients. Mol Psychiatry. 28 (10), 4421-4437 (2023).
- Sun, Y., et al. PYY-mediated appetite control and obesity alleviation through short-chain fatty acid-driven gut-brain axis modulation by Lacticaseibacillus rhamnosus HF01 isolated from Qula. J Dairy Sci. 108 (8), 7960-7978 (2025).
- He, J., et al. Short-chain fatty acids and their association with signalling pathways in inflammation, glucose and lipid metabolism. Int J Mol Sci. 21 (17), 6356(2020).
- Fock, E., Parnova, R. Mechanisms of blood-brain barrier protection by microbiota-derived short-chain fatty acids. Cells. 12 (4), 657(2023).
- Kachoueiyan, F., et al. Butyrate: a key mediator of gut-brain communication in Alzheimer's disease. Metab Brain Dis. 40 (5), 189(2025).
- Kim, K. S., Lee, Y., Chae, W., Cho, J. Y. An improved method to quantify short-chain fatty acids in biological samples using gas chromatography-mass spectrometry. Metabolites. 12 (6), 525(2022).
- Ueyama, J., et al. Freeze-drying enables homogeneous and stable sample preparation for determination of fecal short-chain fatty acids. Anal Biochem. 589, 113508(2020).
- Papanicolas, L. E., et al. Bacterial viability in faecal transplants: which bacteria survive. EBioMedicine. 41, 509-516 (2019).
- Yao, L., et al. Quantitative analysis of short-chain fatty acids in human plasma and serum by GC-MS. Anal Bioanal Chem. 414 (15), 4391-4399 (2022).
- Zhang, C., Liu, A., Zhang, T., Li, Y., Zhao, H. Gas chromatography detection protocol of short-chain fatty acids in mice feces. Bio Protoc. 10 (13), e3672(2020).
- Zha, X., et al. Microbiota-derived lysophosphatidylcholine alleviates Alzheimer's disease pathology via suppressing ferroptosis. Cell Metab. 37 (1), 169-186.e9 (2025).
- Li, L. J., et al. Neuronal double-stranded DNA accumulation induced by DNase II deficiency drives tau phosphorylation and neurodegeneration. Transl Neurodegener. 13 (1), 39(2024).
- Zhou, H., et al. Glia-to-neuron conversion by CRISPR-CasRx alleviates symptoms of neurological disease in mice. Cell. 181 (3), 590-603.e16 (2020).
- Zhao, G., Nyman, M., Jönsson, J. A. Rapid determination of short-chain fatty acids in colonic contents and faeces of humans and rats by acidified water-extraction and direct-injection gas chromatography. Biomed Chromatogr. 20 (8), 674-682 (2006).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
