Methodenartikel

Functionele beoordeling van de muis-gingivale epitheliale barrière met behulp van fluorescerende tracers

DOI:

10.3791/70085

⸱

27 februari 2026

 ,  ,  , 
1Department of Physiology and Pathophysiology, Peking University School of Basic Medical Sciences, State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, 2State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, Peking University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van dit protocol is een gestandaardiseerde benadering te bieden voor het kwantitatief beoordelen van de integriteit van de muisachtige gingivale epitheliale barrière door topisch fluorescentie-gelabelde dextrans van verschillende molecuulgroottes op het gingivale oppervlak in vivo toe te passen, gevolgd door ex vivo beeldvorming met een enkelfotonmicroscopiesysteem.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De gingivale epitheelbarrière dient als een cruciale frontlinie verdediging bij mondimmuniteit en homeostase. Een intacte epitheelbarrière voorkomt effectief het binnendringen van schadelijke stoffen uit de mondomgeving, terwijl de verstoring ervan nauw samenhangt met de pathogenese van aandoeningen zoals parodontitis en orale lichen planus. Hier hebben we een op de topicale toepassing gebaseerde methode ontwikkeld om de integriteit van de gingivale epitheliale barrière bij muizen te beoordelen. Eerst werd een mengsel van fluorescerend gelabelde dextrans met verschillende molecuulgewichten (40 of 70 kDa) in een 2% natriumcarboxymethylcellulose topisch aangebracht op het labiale tandvleesoppervlak van het molaire gebied. Na een incubatieperiode van 30 minuten werd de maxilla ontleed en in een aangepaste houder geplaatst voor directe beeldvorming met een enkelfotonmicroscopiesysteem. Deze aanpak maakt visualisatie en kwantificering mogelijk van tracers van verschillende groottes over de epitheellagen, waardoor een functionele weergave van de integriteit van gingivale epitheliale barrières wordt geboden, toepasbaar op studies naar mondontsteking, wondgenezing en ziektemodellering.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De gingivale epitheelbarrière vormt een cruciale verdedigingsinterface in de mondholte, die weefselintegriteit behoudt door selectief het transport van stoffen te reguleren en microbiële invasiete voorkomen 1. Deze dynamische structuur, bestaande uit gelaagd plaveiselepitheel dat met elkaar verbonden is door tight junction-complexen, regelt nauwkeurig de paracellulaire permeabiliteit om de niet-selectieve penetratie van micro-organismen, macromoleculen en opgeloste stoffen te beperken2. Meerdere factoren kunnen de integriteit van de gingivale barrière aantasten. De mondholte herbergt de op één na meest diverse microbiële gemeenschap in het menselijk lichaam, met meer dan 700 bacteriesoorten die tandoppervlakken, gingivale spleten en mondslijmvlieskoloniseren. De epitheelcellen die het gingivale weefsel bekleden, worden voortdurend blootgesteld aan deze dichte microbiële omgeving5.

Virulentiefactoren die door parodontale pathogenen worden uitgescheiden (bijv. Porphyromonas gingivalis), waaronder lipopolysacchariden, zijn aangetoond de functie van de epitheliale barrière te verstoren, waardoor ontstekingsreacties in gingivale weefsels worden geactiveerd en pathologische progressie aandrijven 6,7. Ontstekingsmediatoren en mechanische stressoren verergeren de barrièredysfunctie verder, waardoor de vatbaarheid voor mondziekten toeneemt8. Orale probiotica kunnen helpen parodontale ziekte te voorkomen door de stabiliteit van de gingivale epitheliale barrière te bevorderen. Desalniettemin blijven de biologische interacties tussen micro-organismen en gingivale epitheelcellen bij het moduleren van de barrièrefunctie grotendeelsonduidelijk. Daarom is de ontwikkeling van betrouwbare methoden om de functie van epitheelbarrières te beoordelen van het grootste belang.

Single-photon laserscanning microscopie, bekend om zijn hoge resolutie en gevestigde detectiesysteem, is bijzonder waardevol gebleken voor het onderzoeken van ex vivo weefselmonsters10. Geavanceerde beeldvormingsmethoden verbeteren de beoordeling van de eigenschappen van gingivale barrières aanzienlijk. De oppervlakkige aard van gingivale weefsels, met epitheelcellen op ongeveer 100 μm van het oppervlak, maakt het ideaal geschikt voor dergelijke beeldvormingsmethoden. Ons onderzoek heeft een ex vivo beoordelingstechniek ontwikkeld waarbij fluorescentie-gelabelde dextrans van verschillende molecuulgewichten worden gebruikt als paracellulaire permeabiliteitstracers. In combinatie met single-photon laserscanning microscopie maakt deze methode een nauwkeurige kwantificering van de functie van gingivale epitheliale barrières mogelijk, wat inzicht geeft in de mechanismen van parodontale aandoeningen en mogelijke therapeutische interventies.

Het protocol dat in deze studie is vastgesteld, waarbij gelokaliseerde gel-gebaseerde tracerafgifte wordt gecombineerd met driedimensionale ex vivo beeldvorming, is specifiek geoptimaliseerd om de unieke uitdagingen van het beoordelen van de gingivale epitheliale barrière aan te pakken. Ten eerste zijn bestaande intraveneuze tracerinjectiemethoden (Tabel 1) niet in staat om de permeabiliteit van gelokaliseerde kleine epitheelplaatsen voor externe agentia11 nauwkeurig te beoordelen. Ten tweede vereisen traditionele histologische benaderingen decalcificatie en doorsnijden, wat de weefselarchitectuur verstoort en arbeidsintensief en tijdrovend is 12,13,14. Daarentegen gebruikt ons protocol een sterk hechtende gel om effectieve tracerretentie op het complexe lokale oppervlak te bereiken. Bovendien zorgt een 3D-afbeelding voor precieze, niet-destructieve kwantificering van de diepte en verspreiding van tracerpenetratie binnen het gingivale epitheel, waardoor de ruimtelijke architectuur van het weefsel volledig behouden blijft. Daarom is deze methode bijzonder geschikt voor hoogresolutie ruimte-temporele beoordeling van de functie van gingivale epitheliale barrières binnen de complexe en afgesloten orale omgeving.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de Ethische Commissie voor Dieronderzoek, Peking University Health Science Center, en voldeden aan de Gids voor de Verzorging en het Gebruik van Laboratoriumdieren (NIH Publicatie Nr. 85-23, herzien 1996). Tijdens het proces werden de proefdieren zorgvuldig behandeld om hun pijn en ongemak te minimaliseren.

De details van elke werkstap voor de permeabiliteitsbeoordeling in muisgingival epitheel worden hieronder beschreven (Figuur 1A). Hier hebben we een voorbeeld gegeven van het detecteren van epitheliale barrièrefunctie in zowel ligatie- als door Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis)-geïnduceerde muisparodontitismodellen. Alle medewerkers kregen uitgebreide training in laboratoriumdierenwelzijn en aseptische techniek.

1. Dierenbehandeling

  1. Gedurende de studie werden huisdieren onder standaard specifieke, pathogeenvrije (SPF) omstandigheden met een 12-uur licht/donkercyclus verzorgd en voedsel en water voorzien van voedsel en water ad libitum.
  2. Bereiding en toediening van anesthetica en tracers
    1. Houd steriele omstandigheden gedurende het hele protocol en gebruik gereedschap dat is gereinigd met 75% ethanol.
    2. Gebruik mannelijke wildtype (WT) C57BL/6J muizen in de volwassen volwassen leeftijdsgroep van 8-10 weken voor het experiment. Verdeel de muizen in drie groepen: een controlegroep (onbehandeld) en twee experimentele groepen (ligatie- en P. gingivalis-geïnduceerde muisparodontitismodellen).
      OPMERKING: In de groepering moeten muizen met vergelijkbaar lichaamsgewicht en vergelijkbare weekleeftijd worden geselecteerd om de invloed van leeftijd en gewicht op gingivale epitheliale permeabiliteit te verminderen. Door ligatie geïnduceerde en door P. gingivilis-geïnduceerde modellen van muisparodontitis vertegenwoordigen veelgebruikte muismodellen van parodontitis. Voor gedetailleerde modelleringsprotocollen raadpleegt u de literatuur over door ligatie geïnduceerde15 - en P. gingivalis-geïnduceerde 16 muisparodontitismodellen.
    3. Selecteer fluorescerende tracers met niet-overlappende spectra, zoals FITC-gelabelde dextran (40 kDa; FD40) en rhodamine B-gelabelde dextran (70 kDa; RD70), om een onderscheidende signaaldetectie te waarborgen met behulp van bijbehorende FITC- en rhodaminefilters.
    4. Verdun de tracers. Om dit protocol te volgen, meng je FD40 (1 g/L) en RD70 (1 g/L) in een 2% carboxymethylcellulose gel en bewaar je het bij 4 °C.
    5. Injecteer intraperitoneal 1,25% tribromoethanol (200 mg/kg lichaamsgewicht, 15-17 μL/g lichaamsgewicht) om de muizen te verdoven.
      OPMERKING: Tribromoethanoloplossingen zijn lichtgevoelig. Tert-amylalcohol is een brandbaar, vluchtig en irriterend organisch oplosmiddel. Alle procedures met voorbereiding, hantering en toediening moeten worden uitgevoerd in een chemische dampkap of een zeer goed geventileerde ruimte, strikt verwijderd van ontstekingsbronnen. Personeel moet passende persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) dragen, waaronder handschoenen, chemische splash-bril en een labjas. Afvalvermeding: Afvaltribromoethanoloplossing, tert-amylalcohol en alle besmette materialen (bijv. spuiten, pipettoppen, handschoenen) moeten worden verzameld en afgevoerd als gevaarlijk chemisch afval strikt volgens de Environmental Health and Safety (EHS)-voorschriften en protocollen van uw instelling voor brandbare en giftige chemicaliën.
  3. Houd tijdens de narcose de kerntemperatuur van het lichaam op 37 ± 0,5 °C met behulp van een door feedback gecontroleerde warmtemat. Breng erythromycine oogzalf aan om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
    OPMERKING: Verleen gedurende het onderzoek passende zorg voor alle dieren.
  4. Na chirurgische ingrepen zorg ervoor dat de dieren afzonderlijk op zacht beddengoed in een warme, stille herstelkooi worden gehuisvest totdat ze volledig lopen. Houd de dieren tweemaal daags 48 uur in de gaten en introduceer ze pas na volledige herstel opnieuw in hun thuiskooi, beoordeeld aan de hand van normale houding, activiteit en voedgedrag.
  5. Houd de mondholte open met een mondprop en breng een mengsel van 5 μL tot 50 μL aan van twee of meer paracellulaire permeabiliteitstracers met verschillende moleculaire gewichten topisch op het labiale tandvleesoppervlak van het molaire gebied (Figuur 1B). Laat het 30 minuten gaan. Als het dier het mengsel doorslikt, breng het dan opnieuw aan.
  6. Isolatie van maxilla
    1. Na 30 minuten aanbrengen van permeabiliteitstracers bevestig je de muizen op karton, plaats je ze in een rugligging en plak je hun ledematen vast.
    2. Na fixatie open je de mondholte om de maxilla te isoleren. Verwijder voorzichtig het omliggende weefsel en spoel het monster grondig af met PBS.
    3. Plaats de maxilla op een glazen glijbaan, met modelleerklei aan beide zijden om een dekmantel veilig over het monster te monteren.

2. Enkelfotonmicroscoopopstelling

  1. Plaats de gedissectiede muismaxilla zorgvuldig op de speciaal ontworpen monsterhouder, zodat je een stabiele plaatsing voor beeldvorming waarborgt.
  2. Neem beelden met een rechtopstaande enkelfotonmicroscoop uitgerust met een 25×/NA 1.0 wateronderdompelingsobjectief, met de focus op het gemonteerde ondersteuningsgebied onder de maxilla.
    OPMERKING: Fluorescentiesignalen moeten direct zichtbaar zijn na het verwijderen van de tracergel.

3. Maxillabeeldvorming

  1. Begin direct met beeldvorming nadat je het interessegebied op het buccale oppervlak van de tweede kies in de maxilla hebt geselecteerd.
  2. Neem Z-stackbeelden met een stapgrootte van 1 μm, beginnend vanaf het maxilla-gingivale oppervlak tot een diepte van 100-200 μm, voor driedimensionale (3D) reconstructie.
  3. Voer Z-serie beeldvorming uit om de permeabiliteit van de epitheliale barrière in de maxilla te evalueren. Configureer de softwareparameters in de genoemde software als volgt:
    1. Maak in het Bestandsmenu een nieuwe map aan en ken deze een beschrijvende naam toe aan de dataset.
    2. Onder het tabblad Acquisitie stelt u het XY-formaat in op 512 × 512 met een resolutie van 0,99 μm/pixel.
    3. Stel de zoomfactor in op 1.
    4. Stel excitatiegolflengten in op 488 nm (FD40) en 561 nm (RD70), met emissievensters van respectievelijk 500-550 nm en 570-620 nm.
      OPMERKING: De versterkingswaarden werden respectievelijk ingesteld op 50 (488 nm) en 60 (561 nm).
    5. Voor Z-serie en 3D-beeldvorming, selecteer de ND Acquisitiemodus. Stel de Z-stap in op 1 μm (pas aan indien nodig).
  4. Zodra de parameters zijn geconfigureerd, kies je de Live-modus om het gingivale gebied in zowel individuele als samengevoegde fluorescentiekanalen binnen het beeldvenster te visualiseren.
  5. Klik op Nu uitvoeren om de acquisitie na parameterconfiguratie te starten.

4. Permeabiliteitsmeting

  1. Verdeel de fluorescentieintensiteit van FD40 en RD70 in verschillende kanalen. Achtergrondaftrekking is niet nodig; voeg de Z-as sneden samen. Gebruik vervolgens de ImageJ-software om de fluorescentieintensiteit te berekenen om de permeabiliteit te evalueren en de epitheliale barrièrefunctie aan te geven.
    1. Klik op Bestand en selecteer Open om de maxillafoto te openen die onder de enkelfotonmicroscoop is genomen.
    2. Ga naar het afbeeldingsmenu en verander het afbeeldingstype naar 8-bits formaat voor analyse.
      OPMERKING: Beelden die worden vastgelegd met fluorescentiemicroscopen en confocale systemen zijn over het algemeen in RGB-formaat en kunnen niet direct worden gebruikt voor fluorescentieintensiteitsmeting. Ze moeten worden opgesplitst in afzonderlijke kanalen of monochrome afbeeldingen moeten direct worden geïmporteerd.
    3. Open het menu Analyseren , kies Metingen instellen en vink Gebied, Gemiddelde en IntDen aan. Bevestig door op OK te klikken.
    4. Selecteer het te analyseren kanaal en pas de drempel aan: Ga naar Afbeelding | Aanpassen | Drempel. Het systeem zal automatisch een standaardwaarde en algoritme toepassen, waarbij meestal Rood wordt gebruikt om geselecteerde regio's aan te geven.
      OPMERKING: Omdat fluorescerende beelden meestal zwarte achtergronden hebben, kies ook de optie Donkere Achtergrond .
    5. Stel meetparameters in: Ga naar Analyseren en selecteer Metingen instellen. Vink in het dialoogvenster de gemiddelde grijswaarde en de limiet aan de drempel aan. Klik tenslotte op OK.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om het weergavelabel aan te vinken zodat de afbeeldingsnaam in de resultaattabel verschijnt, wat het makkelijker maakt de experimentele groep te identificeren.
    6. Voer metingen uit: Selecteer het gereedschap Vrijhandselecties . Gebruik de cursor om handmatig en precies de omtrek van het fluorescerende signaalgebied aan de kant van het tandvleesweefsel te volgen. Klik op Analyseren | Meet. De resultaattabel verschijnt, waarbij IntDen de fluorescentieintensiteit weergeeft.
  2. Kopieer de resultaten naar een spreadsheet voor berekeningen en importeer voor grafieken.
  3. Berekening van relatieve fluorescentieintensiteit: Eerst bereken je de gemiddelde fluorescentieintensiteit van de controlegroep. Vervolgens deel men de fluorescentieintensiteitswaarde van elke experimentele groep door het gemiddelde van de controlegroep om de relatieve fluorescentieintensiteit te verkrijgen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volgens het gestandaardiseerde protocol werd de muismaxilla met het gingivale weefsel gemonteerd op een speciaal ontworpen houder (Figuur 1C). Microscopisch onderzoek toonde groene (FD40) en rode (FD70) fluorescentiesignalen in het gingiva, wat tracerpermeatie over de epitheelbarrière aantoonde. Na het identificeren van het interessegebied onder de ooglens, werden beelden gemaakt met de software. In de controlegroep waren beide fluorescerende tracers grotend...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gingivale epitheel dient als een essentiële fysieke barrière tegen bacteriële invasie, terwijl orale micro-organismen een dubbele regulerende capaciteit vertonen door ofwel de integriteit van barrières met virulentiefactoren te verstoren of het behoud ervan te bevorderen. Deze biologische interacties bepalen uiteindelijk de weefselhomeostase of ziekteprogressie 17,18. Voortbouwend op deze basis ontwikkelden we een innovatieve...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (subsidies 32030010, 31972908, 81991500, 81991502).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
40 kDa FITC-labeled dextranSigma Aldrich78331
70 kDa rhodamine B-labeled dextranSigma AldrichR9379
Blunt tissue separation nickelBejinghuabo CompanyNZW28
carboxymethylcelluloseMREDAM049898
Disposable sterile syringeZhiyu Company1 mL
ImageJ softwareNational Institutes of Health
MicrotubesAxygenMCT-150-C1,5 mL
NIS-Elements AR Image SoftwareNikon
Phosphate buffered saline 1xServicebioG4207-500
Single photon microscope Nikon A1 MP+Nikon
Tissue scissorsBejinghuabo CompanyM286-05

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, C., et al. Study on the protection of gingival epithelial barrier by interleukin-22 through regulating microbiota and E-cadherin expression. Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi. 59 (7), 653-662 (2024).
  2. Presland, R. B., Jurevic, R. J. Making sense of the epithelial barrier: what molecular biology and genetics tell us about the functions of oral mucosal and epidermal tissues. J Dent Educ. 66 (4), 564-574 (2002).
  3. Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
  4. Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J Clin Microbiol. 43 (11), 5721-5732 (2005).
  5. Meyle, J., Chapple, I. Molecular aspects of the pathogenesis of periodontitis. Periodontol 2000. 69 (1), 7-17 (2015).
  6. Oriuchi, M., et al. Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide damages mucosal barrier to promote gastritis-associated carcinogenesis. Dig Dis Sci. 69 (1), 95-111 (2024).
  7. Takeuchi, H., Nakamura, E., Yamaga, S., Amano, A. Porphyromonas gingivalis infection induces lipopolysaccharide and peptidoglycan penetration through gingival epithelium. Front Oral Health. 3, 845002(2022).
  8. Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. J Immunol Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
  9. Chatterjee, A., Bhattacharya, H., Kandwal, A. Probiotics in periodontal health and disease. J Indian Soc Periodontol. 15 (1), 23-28 (2011).
  10. Shin, D., et al. Photon-efficient imaging with a single-photon camera. Nat Commun. 7, 12046(2016).
  11. Yang, X., et al. Targeting endothelial tight junctions to predict and protect thoracic aortic aneurysm and dissection. Eur Heart J. 44 (14), 1248-1261 (2023).
  12. Cai, Y., et al. Foxf1 maintains endothelial barrier function and prevents edema after lung injury. Sci Signal. 9 (424), ra40(2016).
  13. Hou, A., Mohamed Ali, S., Png, E., Hunziker, W., Tong, L. Transglutaminase-2 is critical for corneal epithelial barrier function via positive regulation of claudin-1. Ocul Surf. 28, 155-164 (2023).
  14. Kitsuki, T., et al. Enhanced junctional epithelial permeability in trpv4-deficient mice. J Periodontal Res. 55 (1), 51-60 (2020).
  15. Chen, W., et al. Porphyromonas gingivalis impairs oral epithelial barrier through targeting grhl2. J Dent Res. 98 (10), 1150-1158 (2019).
  16. Lemaitre, M., et al. Periodontal tissue regeneration using syngeneic adipose-derived stromal cells in a mouse model. Stem Cells Transl Med. 6 (2), 656-665 (2017).
  17. Takahashi, N., et al. Gingival epithelial barrier: regulation by beneficial and harmful microbes. Tissue Barriers. 7 (3), e1651158(2019).
  18. Ye, P., Chapple, C. C., Kumar, R. K., Hunter, N. Expression patterns of E-cadherin, involucrin, and connexin gap junction proteins in the lining epithelia of inflamed gingiva. J Pathol. 192 (1), 58-66 (2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Gingival Epithelial BarrierFluorescent TracersOral ImmunityBarrier IntegrityMouse GingivaSingle Photon MicroscopyDextran TracersOral InflammationWound HealingDisease Modeling

Gerelateerde artikelen