Deze studie toont aan dat Tanshinone IIA (Tan IIA) post-myocardinfarct fibrose vermindert, waarschijnlijk via IL-33/ST2-modulatie, zoals aangetoond in diermodellen en moleculaire docking, en gevalideerd door ELISA en Western blot.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
* These authors contributed equally
Deze studie toont aan dat Tanshinone IIA (Tan IIA) post-myocardinfarct fibrose vermindert, waarschijnlijk via IL-33/ST2-modulatie, zoals aangetoond in diermodellen en moleculaire docking, en gevalideerd door ELISA en Western blot.
Myocardinfarct (MI), een ernstige vorm van coronaire hartziekte, leidt vaak tot myocardfibrose, een belangrijke oorzaak van hartstoornissen en hartfalen. Epicardiaal vetweefsel (EAT) wordt steeds vaker betrokken bij cardiovasculaire pathologie door cytokine-gemedieerde modulatie van de hartfunctie. Tanshinon IIA (TanIIA), een lipofiele verbinding afkomstig van Salvia miltiorrhiza, vertoont ontstekingsremmende, antioxiderende en antifibrotische eigenschappen. Deze studie had als doel het therapeutisch potentieel van TanIIA te evalueren bij het verzwakken van post-MI myocardfibrose en de onderliggende mechanismen te onderzoeken met een integratieve benadering die in vivo-experimenten en in silico-analyses combineert. Er werd een muis-MI-model ontwikkeld en moleculaire koppeling werd toegepast om TanIIA-binding aan belangrijke componenten van de interleukine-33/groeistimulatie expressieve gen 2 (IL-33/ST2) signaalroute te beoordelen. Onze resultaten toonden aan dat de behandeling met TanIIA de hartfunctie significant verbeterde, histologische schade verminderde en myocardfibrose verminderde, naast een verlaagd serumgehalte van N-terminale pro-hersennatriuretische peptide (NT-proBNP) en hooggevoelig harttroponine I (hs-cTnI). TanIIA verzwakte ook ontstekingsreacties en oxidatieve stress in het serum, het myocarde en EAT. Mechanistisch verlaagde TanIIA de expressie van IL-33 en ST2, onderdrukte het myeloïde differentiatiefactor 88 (MyD88)/nucleaire factor kappa-B (NF-κB) pad en verlaagde het transformatiegroeifactor-β1 (TGF-β1) niveau. In silico-analyses toonden verder aan dat TanIIA sterke bindingsaffiniteiten vertoonde voor IL-33, ST2, MyD88 en NF-κB p65, met de meest stabiele interactie voorspeld voor ST2. Gezamenlijk geven deze bevindingen aan dat TanIIA MI-geïnduceerde myocardfibrose verlicht door EAT-geassocieerde ontsteking en oxidatieve stress te moduleren, mogelijk via multi-target inhibitie van de IL-33/ST2-as. Deze resultaten ondersteunen TanIIA als een veelbelovende therapeutische kandidaat voor de behandeling van post-infarct myocardfibrose.
Myocardinfarct, pathologisch gedefinieerd als cardiomyocytdood door langdurige ischemie, blijft een levensbedreigend cardiovasculair incident1. Ondanks aanzienlijke vooruitgang in reperfusiestrategieën en farmacotherapie blijft MI wereldwijd een toonaangevende oorzaak van morbiditeit en mortaliteit 2,3,4,5,6. Een belangrijk pathofysiologisch gevolg van MI is myocardfibrose, de overmatige afzetting van extracellulaire matrixeiwitten, wat een belangrijke factor is van latere nadelige klinische uitkomsten7. Deze fibrotische littekenvorming, hoewel essentieel voor het voorkomen van een scheuring van de ventrikelwand, wordt vaak een maladaptief herstelproces dat wordt geïnitieerd door complexe ontstekings- en intercellulaire signaalroutes 5,7,8,9,10. Door functioneel myocarde te vervangen door niet-contractiel littekenweefsel leidt maladaptieve fibrose tot verhoogde ventrikelstijfheid, progressieve hartstoornissen en uiteindelijk hartfalen 9,11. Daarom is het onderzoeken van nieuwe farmacologische behandelingen die specifiek gericht zijn op en verzachten van post-infarct fibrose een cruciaal therapeutisch doel om de morbiditeit en mortaliteit van patiënten op de lange termijn te verbeteren.
Salvia miltiorrhiza (Danshen), een traditioneel Chinees medicijn, en de verschillende preparaten worden veel gebruikt voor de behandeling van hart- en vaatziekten. Tanshinon IIA, het belangrijkste lipofiele bestanddeel, wordt toegeschreven aan meerdere cardioprotectieve eigenschappen, waaronder anti-atherosclerotische, anti-myocardiale ischemische en antioxidante effecten 12,13,14,15. Mechanistisch oefent TanIIA zijn ontstekingsremmende en fibrotische effecten uit door diverse signaalroutes te moduleren 13,14,15,16,17. Opmerkelijk is dat TanIIA direct adipocyten aanspreekt, hun ontstekingsreacties onderdrukt en zo cellulaire disfunctie18 verlicht. Of deze beschermende effecten van TanIIA zich uitstrekken tot het epicardiale vetweefsel, moet echter nog worden opgehelderd.
Epicardiale vetweefsel, een uniek visceraal vetdepot, is sterk betrokken bij de pathogenese van coronaire hartziekte (CAD), boezemfibrilleren (AF) en hartfalen. EAT bevindt zich anatomisch tussen het myocard en de viscerale laag van het epicard zonder een tussenliggende fasciale laag en faciliteert directe paracriene communicatie met de aangrenzende hartstructuren 19,20,21,22. In zijn fysiologische toestand is EAT cardiobeschermend, biedt het metabole ondersteuning en geven ontstekingsremmende en antioxidante adipokines vrij. Omgekeerd wordt EAT tijdens pathologische aandoeningen een bron van pro-inflammatoire, pro-oxidatieve en pro-fibrotische mediatoren die nadelige hartremodellering aanwakkeren 27,28,29,30. Daarom werd de hypothese geformuleerd dat TanIIA myocardfibrose kan remmen door ontstekingsreacties en oxidatieve stress in epicardvet te verminderen, mogelijk via een nieuw signaalpad.
Interleukine-33, een lid van de IL-1 familie van cytokines31, staat bekend om zijn krachtige anti-hypertrofische en anti-fibrotische eigenschappen in het cardiovasculaire systeem25. De biologische effecten worden gemedieerd door een onderscheidend receptorcomplex, ST2, dat bestaat uit twee isoformen: een transmembrane receptor (ST2L) die signalering initieert, en een oplosbare lokreceptor (sST2) die IL-3332 vastlegt. Klinisch zijn de serum sST2-niveaus acuut verhoogd na een myocardinfarct (MI) en dienen ze als een robuuste prognostische marker voor bijwerkingen bij hartfalen en myocarditis 33,34,35,36. De canonieke IL-33/ST2L signaalcascade omvat de rekrutering van het adaptorproteïne MyD88 en de daaropvolgende activatie van TRAF6, wat leidt tot de fosforylering en degradatie van de NF-κB-remmer (IκB) en de daaropvolgende nucleaire translocatie van NF-κB37,38. Dit pad is nauw verbonden met andere belangrijke ontstekingscytokines; zo kan IL-33/MyD88-signalering de secretie van het ontstekingsremmende cytokine IL-1039 bevorderen, terwijl het pro-inflammatoire cytokine TNF-α op zijn beurt de ontstekingsreactie kan versterken door NF-κB te activeren om IL-33-expressie 40,41 te induceren. Belangrijk is dat zowel IL-33 als ST2 tot expressie komen in vetweefsel, waar men denkt dat ze lokale ontstekingsremmende effecten hebben 31,42,43. Of de cardioprotectieve effecten van TanIIA betrekking hebben op de modulatie van de IL-33/ST2-as, blijft echter ononderzocht.
Daarom is deze studie ontworpen om de centrale hypothese te testen dat TanIIA myocardfibrose voorkomt door ontsteking en oxidatieve stress die ontstaan uit epicardiale vetweefsel te verminderen via modulatie van het IL-33/ST2-pad. Specifiek stelden we de hypothese op dat deze therapeutische werking wordt aangedreven door de directe, multi-target betrokkenheid van TanIIA met belangrijke eiwitten in deze signaalcascade. Om dit te bevestigen, hebben we een dubbele aanpak gevolgd. Eerst werd een rattenmodel van myocardinfarct gebruikt om de in vivo effectiviteit van TanIIA bij het verzwakken van nadelige hartremodellering te bevestigen. Ten tweede werd, om een directe moleculaire basis voor deze waarnemingen te bieden, computationele koppeling gebruikt om de potentiële binding van TanIIA aan vier belangrijke knooppunten van de route te karakteriseren—IL-33, ST2, MyD88 en NF-κB p65. Door het mechanisme te onderzoeken van het weefselniveau tot aan specifieke moleculaire bindingsgebeurtenissen, wil deze studie een nieuw mechanistisch kader opstellen voor de cardioprotectieve effecten van TanIIA.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Alle experimentele procedures en dierenwelzijnspraktijken werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de Ethische Regels voor de Zorg en het Gebruik van Proefdieren van het Ethisch Dierencomité van de Jiangxi Universiteit voor Chinese Geneeskunde (nr. JZLLSC2023-0702), China.
Moleculaire koppelingssimulaties
Een in silico moleculaire dockingbenadering werd toegepast om directe interacties tussen TanIIA en IL-33, ST2L, MyD88 en NF-κB p65 te onderzoeken. De 3D-coördinaten van TanIIA werden verkregen uit de PubChem-database, en het oorspronkelijke SDF-bestand werd vervolgens omgezet naar een PDB-formaat. De kristalstructuur van IL-33 (PDB ID: 4KC3), ST2L (PDB ID: 4KC3), MyD88 (PDB ID: 7L6W) en NF-κB p65 (PDB ID: 1NFI) werd afkomstig uit de eiwitdatabank. De initiële verwerking van de receptor vond plaats in PyMOL (v2.3.4), waarbij watermoleculen en oorspronkelijke liganden werden verwijderd, gevolgd door verdere voorbereiding in AutoDockTools voor waterstoftoevoeging en ladingstoewijzing. Beide moleculen werden uiteindelijk omgezet naar het PDBQT-formaat. AutoDock Vina (v1.1.2) werd gebruikt om de dockingsimulatie uit te voeren binnen een gedefinieerd rasterbox gecentreerd op de actieve locatie. De optimale bindingshouding werd gekozen op basis van de laagste bindingsenergie, en gedetailleerde interacties werden geïdentificeerd met behulp van de PLIP webtool. De definitieve gekoppelde conformatie werd gevisualiseerd met PyMOL (v2.3.4).
Dieren
Mannelijke Sprague-Dawley (SD) ratten, SPF-klasse, 6 weken oud en weegt 200 ± 20g (certificaat nr. SCXK(Su)2023-0009). De ratten werden onder gestandaardiseerde omstandigheden onderhouden, waaronder een licht/donkercyclus van 12 uur en een temperatuur van 22 °C ± 2 °C. De dieren kregen tijdens het experiment onbeperkte toegang tot zowel voedsel als water.
Experimenteel protocol
Een rattenmodel van myocardinfarct werd ontwikkeld door de linker voorste dalende (LAD) kransslagader te ligeren. Ratten die door schijn werden geopereerd, ondergingen dezelfde chirurgische ingrepen zonder LAD-ligatie. Kort gezegd werden ratten verdoofd via intraperitoneale injectie van 1% natriumpentobarbital (50 mg/kg), gevolgd door endotracheale intubatie en beademing. Er werd een linker thoracotomie uitgevoerd om het hart bloot te leggen. De LAD werd vervolgens geligeerd met een 4-0 niet-absorberbare hechting. Succesvolle inductie van de MI werd bevestigd door ST-segment elevatie op een continu elektrocardiogram en zichtbare blanchering van de voorwand van de linker ventrikel. Na de operatie kregen ratten cefoxitine natrium (200 mg/kg/dag, i.p.) gedurende drie dagen. Vierentwintig uur na de operatie werden de overlevende ratten willekeurig ingedeeld in zes groepen (n = 10 per groep):
Schijngroep: kreeg intraperitoneale injecties van zoutoplossing (1 mL·kg-1·dag-1).
MI-groep: kreeg intraperitoneale injecties van zoutoplossing (1 mL·kg-1·dag-1).
TanIIA-L groep (lage dosis): kreeg intraperitoneale injecties van TanIIA (7,5 mg·kg-1·dag-1).
TanIIA-M groep (middelmatige dosis): kreeg intraperitoneale injecties van TanIIA (15 mg·kg-1·dag-1).
TanIIA-H groep (hoge dosis): kreeg intraperitoneale injecties van TanIIA (30 mg·kg-1·dag-1).
XST-groep (positieve controle): kreeg orale gavage van valsartan (30 mg·kg-1·dag-1).
Alle behandelingen werden dagelijks toegediend gedurende 28 opeenvolgende dagen. De doses van TanIIA en XST zijn geselecteerd op basis van eerdere studies en onze voorlopige niet-gepubliceerde gegevens44,45.
Elektrocardiogram (ECG) en echocardiografie
Na 28 dagen behandeling werd de hartfunctie geëvalueerd met transthoracale echocardiografie. Onder 2% isoflurane anesthesie (bewegingsmodus) werden M-beelden gemaakt om de einddiastolische/systolische diameters van de linkerventrikel (LVIDd/s) te bepalen. Linkerventrikel ejectiefractie (LVEF) en fractionele verkorting (LVFS) werden vervolgens berekend uit gemiddeld drie opeenvolgende hartcycli. Daarnaast werden elektrocardiogrammen geregistreerd vóór de operatie, 15 minuten na ligatie en aan het experimentele eindpunt om de elektrische activiteit van het hart te monitoren.
Bemonstering en 2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride (TTC) kleuring
Bloed uit de abdominale aorta werd 15 minuten gecentrifugeerd op 1370 × g om serum te isoleren, dat werd opgeslagen bij -80 °C. Het hart- en epicardvetweefsel werden snel verwijderd en weggewogen. Voor moleculaire analyses werden EAT- en infarct-grenszoneweefsels ingevroren in vloeibare stikstof en opgeslagen bij -80 °C. Andere weefselmonsters werden vastgesteld in 4% paraformaldehyde voor histologisch onderzoek. Daarnaast werden geselecteerde harten ingevroren bij -20 °C, in secties geplaatst en gekleurd met TTC om de grootte van de infarct te beoordelen. Materialen en dierlijk weefsel worden gebruikt en behandeld in overeenstemming met de veiligheidsvoorschriften van laboratoriums.
Histologisch onderzoek
Voor histopathologische evaluatie werden paraffinesecties onderworpen aan hematoxyline- en eosinekleuring (H&E) om de myocardmorfologie te observeren. Masson's tricroomkleuring werd gebruikt om de omvang van myocardfibrose en de grootte van epicardiale adipocyten te beoordelen, waarbij de collageenvolumefractie (CVF) werd gekwantificeerd. Daarnaast werd de verhouding van type I tot type III collageen in het niet-geïnfarcte gebied bepaald door picrosirius red (PSR) kleuring. Alle secties werden digitaal gescand voor kwantitatieve analyse.
Immunohistochemie
Paraffine-ingebedde myocardiale secties werden gedeparaffiniseerd en gerehydrateerd. Antigeenpunctie werd uitgevoerd met behulp van een citratbuffer (pH 6,0). Secties werden geblokkeerd met 3% BSA, waarna ze 's nachts werden geïncubeerd bij 4 °C met primaire antilichamen tegen collageen I, collageen III, IL-33, ST2, MyD88, NF-κB p65 en TGF-β1. Vervolgens werden secties geïncubeerd met een HRP-gelabeld secundair antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. De kleuring werd zichtbaar gemaakt met DAB en de kernen werden tegengekleurd met hematoxyline. Beelden werden vastgelegd met een digitale scanner en geanalyseerd met beeldanalysesoftware om de geïntegreerde optische dichtheid (IOD) van positieve kleuring te kwantificeren.
Enzym-gekoppelde immunosorbent-assay
De concentraties van hs-cTnI, NT-proBNP, IL-33 en ST2 werden gekwantificeerd in serummonsters. Daarnaast werden IL-10- en TNF-α-niveaus gemeten in serum-, myocardhomogenaten en epicardiale vetweefsellysaten. Alle assays werden uitgevoerd met commercieel verkrijgbare enzym-gekoppelde immunosorbent-assay (ELISA) kits volgens de protocollen van de fabrikant.
Westelijke verplettering
Het totale eiwit werd geëxtraheerd uit weefselhomogenaten en de concentraties werden bepaald door een bicinchoninezuur (BCA) assay. Gelijke hoeveelheden eiwit werden gescheiden door natriumdodecylsulfaat–polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) en overgedragen aan polyvinylidienfluoride (PVDF) membranen. Na blokkering met 5% magere melk werden membranen 's nachts geïncubeerd bij 4 °C met primaire antilichamen tegen IL-10, tumornecrose factor-α (TNF-α), IL-33, ST2, NF-κB p65, TGF-β1 en GAPDH (1:1000). Vervolgens werden membranen geïncubeerd met een HRP-geconjugeerd secundair antilichaam (1:5000) en gevisualiseerd met een ECL-reagentia. Bandintensiteiten werden gekwantificeerd met software en eiwitniveaus werden genormaliseerd naar GAPDH als interne controle.
Statistische analyse
Alle statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van medische statistieksoftware. De gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde. Voor vergelijkingen tussen twee onafhankelijke groepen werd een t-test toegepast. In het geval van meerdere groepen werd een eenrichtings- of tweerichtings-ANOVA gevolgd door een Tukey post hoc-test toegepast. Voor alle analyses werd een P < 0,05 als statistisch significant beschouwd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Effecten van TanIIA op de hartfunctie bij ratten met een myocardinfarct (Figuur 1)
Gezondheidstoestand en veranderingen in lichaamsgewicht: Ratten in de MI-groep vertoonden een slechte algemene conditie met buikuitzetting, terwijl ratten in de TanIIA-groepen een verbeterde gezondheidstoestand vertoonden, een verhoogde voedsel- en waterinname en meer activiteit. Na 4 weken werd een significante toename van...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De huidige studie onderzoekt de effecten van TanIIA op myocardfibrose na een myocardinfarct, samen met de onderliggende mechanismen die hierbij betrokken zijn. De belangrijkste bevindingen zijn als volgt: (1) TanIIA vermindert nadelige hartremodellering en verbetert de hartfunctie door het remmen van hartfibrose. (2) TanIIA is gevonden dat het myocardfibrose remt door ontstekingsreacties en oxidatieve stress in epicardvet te verminderen. (3) TanIIA mediaert antifibrotische effecten via d...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs geven aan dat zij geen bekende concurrerende financiële belangen of persoonlijke relaties hebben die invloed hadden kunnen hebben op het werk dat in dit artikel wordt gerapporteerd.
Het onderzoek werd ondersteund door de Topdiscipline van de provincie Jiangxi, de discipline Chinese en Westerse Integratieve Geneeskunde, Jiangxi Universiteit voor Chinese Geneeskunde (zxyylxk20220103). Verdere financiering werd verkregen uit meerdere initiatieven die door Xiaomin Wang werden ondersteund, waaronder het Science and Technology Research Project van het Jiangxi Provincial Department of Education (GJJ2200940), het Jiangxi High-level Undergraduate Teaching Team Project (2020008), het Jiangxi Postgraduate Teaching Reform Project (JXYJG2019117), Quality Courses for Graduate Students in Jiangxi Province (2020041), en het Undergraduate Students' Innovation Project van de Jiangxi University of Chinese Medicine (2023091). De financier nam deel aan het studieontwerp, de publicatiebeslissing en de voorbereiding van het manuscript.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| BCA Protein Quantification Kit | Thermo Fisher Corporation | PICPI23223 | |
| CAT kit | Shanghai Enzyme Link Biotechnology | 202211202 | |
| Collagen I antibody | Wuhan Servicebio Biotechnology Co., Ltd | GB114197 | |
| Collagen III antibody | Shenyang Wanleibio Biotechnology Co., Ltd | WL03186 | |
| GAPDH antibody | Cell Signaling Technology Corporation | #5174 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software Corporation | versie 9.0 | |
| GSH kit | Shanghai Enzyme Link Biotechnology | 202211131 | |
| H&E staining solution | Beijing Solarbio Technology Co., Ltd | H8070;G1100 | |
| HRP-labeled goat anti-rabbit IgG antibody | Beijing Solarbio Technology Co., Ltd | SE134 | |
| Hs-cTnI kit | Shanghai Yuanjie Biotechnology Co., Ltd | 20220808 | |
| IL-10 antibody | Shenyang Wanleibio Biotechnology Co., Ltd | WL03088 | |
| IL-10 kit | Shanghai Yuanjie Biotechnology Co., Ltd | 202211172 | |
| IL-33 kit | Shanghai Yuanjie Biotechnology Co., Ltd | 202211192 | |
| IL-33 antibody | Shenyang Wanleibio Biotechnology Co., Ltd | WL04438 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | versie Fiji | |
| Image-Pro | Media Cybernetics, USA | versie 6.0 | |
| Male Sprague-Dawley (SD) rats | Jiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co., Ltd | SCXK(Su)2023-0009 | |
| Masson staining kit | Wuhan Bolf Biotechnology Co., Ltd | 20221218 | |
| MDA kit | Shanghai Enzyme Link Biotechnology | 202211171 | |
| MyD88 antibody | Shenyang Wanleibio Biotechnology Co., Ltd | WL02494 | |
| NT-proBNP kit | Shanghai Yuanjie Biotechnology Co., Ltd | 20220805 | |
| Nuclear factor kappa-B(NF-κB)(p65) antibody | Abmart Corporation | TP56372 | |
| Open Babel | Open-source cheminformatics toolkit project | versie 2.3.2 | |
| Polyvinylidene fluoride (PVDF) membranes | Merck Millipore | R9M2784 | |
| PSR solution | Beijing Solarbio Technology Co., Ltd | G1472 | |
| SOD kit | Shanghai Enzyme Link Biotechnology | 202211201 | |
| ST2 antibody | Proteintech Group Corporation | 11920-1-AP | |
| ST2 kit | Shanghai Yuanjie Biotechnology Co., Ltd | 202211183 | |
| Statistical Product and Service Solutions (SPSS) | IBM Corporation | versie 26.0 | |
| Sulfotanshinone Sodium Injection | Shanghai Pharmaceutical First Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd | 2012303 | |
| Super sensitive ECL luminescence reagent | Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd | MA0186 | |
| TGF-β1 antibody | ABclonal Corporation | A2124 | |
| Titanvin Valsartan Capsule | Hunan Qianjin Xiangjiang Pharmaceutical Co., Ltd | 211120 | |
| TNF-α kit | Shanghai Yuanjie Biotechnology Co., Ltd | 202211202 | |
| TNF-α antibody | Shenyang Wanleibio Biotechnology Co., Ltd | WL01581 | |
| TTC solution | Fuzhou Phygene Biotechnology Co., Ltd | 20210620 | |
| Ultra-high resolution small animal ultrasound imaging system | VEVOcompany | Vevo 2100 |