Protocol voor het bestuderen van Honokiol-regulatie van transformerende groeifactor beta 1/smad-signalering in ultraviolet A-geïnduceerde huidfotoverouderingsmodellen

Samenvatting

Dit protocol onderzoekt of honokiol UVA-geïnduceerde fotoveroudering in menselijke dermale fibroblasten en muizenhuid verbetert door de TGF-β1/Smad-route te activeren en de MMP-expressie te verminderen.

Samenvatting

Honokiol (HNK), een belangrijk bestanddeel afkomstig van Magnolia officinalis, heeft het potentieel om huidziekten te behandelen. Op dit moment zijn de impact en het werkingsmechanisme van HNK op door ultraviolet A (UVA) veroorzaakte fotoschade in de huid onduidelijk. Een fotoverouderingsschademodel van HDF-cellen en haarloze muizenhuid werd geconstrueerd door UVA-inductie. De impact van HNK op de levensvatbaarheid van normale HDF-cellen en UVA-geïnduceerde HDF-cellen werd onderzocht via de cellevensvatbaarheidstest. SOD, GSH, CAT en MDA-niveaus in HDF-cellen werden gemeten met verschillende kits, en ROS-niveaus werden gemeten met DCFH-DA en Dihydroethidium. SA-β-galactosidase en TUNEL-kleuring detecteerden senescentie en apoptose in HDF-cellen, en flowcytometrie beoordeelde de celcyclusprogressie. Histopathologische schade aan de huid werd beoordeeld door pathologische kleuring. Daarnaast werden immunofluorescentie en Western blot gebruikt om de eiwitniveaus van Ki67, collageen, matrix metalloproteinase (MMP) en TGF-β1/Smad route-geassocieerde eiwitniveaus te beoordelen. De behandeling van HNK (2,5-10 μM) had geen nadelig effect op de normale levensvatbaarheid van HDF-cellen, maar verminderde door UVA geïnduceerde HDF-celschade, waardoor oxidatieve stress en apoptose werden verminderd. UVA induceerde de senescentie van HDF-cellen, induceerde S-fase arrest, verlaagde Ki67, verlaagde het collageengehalte en verhoogde MMP-expressie, terwijl HNK deze door UVA veroorzaakte afwijkingen effectief verzwakte. Daarnaast veroorzaakte UVA diepere rimpels, een lager water- en collageengehalte, en een toename van de epitheeldikte in de huid van de muis, terwijl subcutane injectie van HNK pathologische schade aan huidweefsel verminderde en het water- en collageengehalte verhoogde. Bovendien activeerde HNK de TGF-β1/Smad-route, en de TGF-β1-remmer SB431542 het beschermende effect van HNK tegen fotoverouderingsschade in HDF-cellen verzwakt. Samenvattend heeft HNK het potentieel om een medicijn te zijn om fotoverouderingsschade te verlichten door MMP-expressie te verminderen via activatie van de TGF-β1/Smad-route, waardoor UVA-geïnduceerde fotoveroudering in HDF-cellen en muishuid wordt geremd.

Inleiding

Het proces van huidveroudering is ingewikkeld en verdeeld in twee hoofdvormen: natuurlijke veroudering en fotoveroudering¹. Studies tonen aan dat tot wel 80% tot 90% van de huidveroudering wordt veroorzaakt door exogene factoren in het milieu (bijv. ultraviolette straling, luchtvervuiling), waarvan langdurige door ultraviolette straling veroorzaakte fotoveroudering de ernstigste effecten heeft ^2,3. Ultraviolette straling wordt onderverdeeld in UVC, UVB en UVA. Omdat UVC de ozonlaag niet kan doordringen, richt het huidige onderzoek naar fotoveroudering zich op UVA (320-400 nm) en UVB (280-320 nm)^4,5,6. In vergelijking met UVB heeft UVA minder energie, maar is het meer doordringend, dringt door de epidermis en reikt diep in de huid, wat een belangrijke oorzaak is van ernstige huidveroudering^{van 7} jaar. Eerdere studies hebben aangetoond dat de schade veroorzaakt door 57 mJ/cm² UVB en 20 J/cm² UVA-bestraling aan HaCaT-cellen vergelijkbaar is^{met 8}. Huidfotoveroudering veroorzaakt veranderingen in de functie en structuur van de huid, specifiek geuit in het doorhangen van huidoppervlakweefsel, diepere rimpels, verlies van collageen en het verschijnen van een grijze huidkleur die met het blote oog zichtbaar is; In ernstige gevallen kunnen verschillende goedaardige, voorstadia van kanker laesies en tumoren^optreden. Samen met de toename van onderzoek naar veroudering en anti-veroudering zijn de gezondheidsrisico's van fotoveroudering een van de belangrijkste gezondheidszorgen wereldwijd geworden. Daarom is het cruciaal om de pathofysiologische processen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan door UVA veroorzaakte fotoverouderingsschade, met het oog op het ontwikkelen van nieuwe therapeutische opties voor de behandeling.

Gewonnen uit Magnolia officinalis, een traditioneel Chinees medicinaal kruid, is Honokiol (HNK) een belangrijke bioactieve verbinding met de chemische formule C₁₈H₁₈O₂¹¹. HNK vertoont verschillende farmacologische activiteiten, en de fenolhydroxylgroep is zeer gevoelig voor oxidatie en heeft sterke antioxidanten en vrije radicalen afzuigende effecten¹². Daarnaast heeft HNK antibacteriële, ontstekingsremmende, antivirale, antitumor-, antidepressiva-, neuroprotectieve en anti-voortijdige eierstokfalen farmacologische effecten 13,14,15,16. Orale HNK is in dierstudies en klinische studies als vrijwel veilig vastgesteld, en er zijn geen significante bijwerkingen vastgesteld 17,18,19. Recente studies hebben aangetoond dat HNK door UVB veroorzaakte huidkanker²⁰ voorkomt en de door UVB veroorzaakte ontstekingsreactie en DNA-hypermethylatie²¹ remt, wat wijst op het mogelijke gebruik bij de behandeling van huidaandoeningen. In vergelijking met veelgebruikte anti-fotoverouderingsmiddelen, waaronder vitamine C en resveratrol, heeft HNK onderscheidende en superieure eigenschappen: de lipofiele structuur zorgt voor een betere transdermale permeabiliteit dan hydrofiele vitamine C²²; en het vertoont een hogere fotostabiliteit en biobeschikbaarheid in vivo dan resveratrol²³. Deze preklinische bevindingen ondersteunen het idee dat HNK veelbelovend translationeel potentieel heeft als een veilige en effectieve kandidaat voor huidverzorgingsproducten en klinische interventies tegen door ultraviolet veroorzaakte huidbeschadiging. De impact van HNK-behandeling op huidfotoverouderingsschade veroorzaakt door UVA is echter nog niet gerapporteerd.

Transformerende groeifactor-β1 (TGF-β1) is een multifunctionele cytokine die cruciaal is voor celgroei en -ontwikkeling, weefselherstel en regeneratie, en de groei en ontwikkeling van cellen, weefsels en organen^24,25. Er is aangetoond dat TGF-β1 voornamelijk signalen naar de cel stuurt via leden van de Smad-eiwitfamilie, wat leidt tot de specifieke regulatie van transcriptie van downstream doelgenen. Wanneer TGF-β1-signalering wordt geactiveerd, resulteert dit in fosforylering van Smad2 en Smad3^26,27. Recente studies hebben een sterk verband aangetoond tussen het TGF-β1/Smad-pad en huidfibrose en fotoveroudering^28,29. Er is gerapporteerd dat het zoogdierdoelwit van rapamycine de TGF-β1/Smad-route in rattenhuidweefsels activeert, wat op zijn beurt de synthese van ceramiden bevordert, die belangrijk zijn voor het vasthouden van huidvocht en het handhaven van de huidbarrière³⁰. Opmerkelijk is dat er is gerapporteerd dat HNK de TGF-β1/Smad-route in lever-stellate cellen heeft gemoduleerd, wat op zijn beurt leverfibrose³¹ heeft verlicht. Daarom werden cellulaire en muismodellen van door UVA veroorzaakte fotoverouderingsschade opgezet, met 2,5–10 μM HNK-behandeling in HDF-cellen en 5 mg/kg of 10 mg/kg HNK-interventie bij haarloze muizen, om de effecten van HNK op fotoverouderingsschade en de mogelijke rol ervan bij het moduleren van de TGF-β1/Smad-route te onderzoeken. Deze studie had als doel nieuwe therapeutische strategieën te ontwikkelen voor door UVA veroorzaakte huidfotoschade.

Protocol

Alle celkweekexperimenten werden uitgevoerd volgens de institutionele bioveiligheidsrichtlijnen en uitgevoerd onder Biosafety Level 2 (BSL-2) laboratoriumomstandigheden. Dierproeven werden uitgevoerd na goedkeuring van de Animal Ethics Committee van het 988e Ziekenhuis van de Gezamenlijke Logistieke Ondersteuningsmacht van het Chinese Volksbevrijdingsleger (goedkeuringsnummer: 2023-089).

Alle experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de institutionele en nationale richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Aan het einde van het experiment werden muizen geëuthanaseerd via een overdosis natriumpentobarbital (100 mg/kg, intraperitoneale injectie). Alle inspanningen werden geleverd om het lijden van dieren tijdens huisvesting, behandeling en bemonstering te minimaliseren. De reagentia, chemicaliën, apparatuur en software die in het protocol worden gebruikt, staan vermeld in de Materiaaltabel.

1. Celkweek en verwerking

1. Kweek menselijke dermale fibroblasten (HDF) in een fibroblastkweekmedium. Houd de kweek op 37 °C in een omgeving met een verzadigde luchtvochtigheid en 5%_CO2.
2. Vervang het kweekmedium elke 3 dagen en doe HDF door in een verhouding van 1:3 wanneer het confluent is.
3. Bestral HDF met UVA-lampen (emissiespectrum: 320-400 nm) bij een dosis van 5 J/^cm2.
4. Vul direct na 30 minuten UVA-bestraling aan met vers medium. Herhaal UVA-bestraling eenmaal per dag gedurende 8 opeenvolgende dagen^{en 32} jaar.
5. Behandel HDF met 2,5, 5, 10, 20 of 40 μM HNK gedurende 24 uur of 48 uur in de dosisscreeningsexperimenten³³. Behandel HDF met 2,5, 5 of 10 μM HNK gedurende 24 uur, gevolgd door UVA-bestraling (5 J/cm²) in latere experimenten.
6. Blootstel HDF aan 10 μM HNK gedurende 4 uur, incubeer vervolgens met 10 μM TGF-β1 inhibitor SB431542 gedurende 24 uur, en bestral tenslotte met UVA (5 J/cm²) in de HNK+SB431542 groep.

2. Beoordeling van cellevensvatbaarheid

1. Inoculeer HDF in 96-put celkweekplaten met een dichtheid van 1×10⁴ cellen per put.
2. Voeg na verschillende behandelingen 10 μL van 10% wateroplosbaar tetrazoliumzoutreagens toe aan elke put tot een eindvolume van 100 μL per put, en incubeer de cellen bij 37°C gedurende 1,5 uur in het donker.
3. Meet de OD450-waarden van de cellen met behulp van een microplaatlezer.

3. Bepaling van superoxidedismutase (SOD), malondialdehyde (MDA), catalase (CAT) en glutathion (GSH) niveaus

1. Was HDF met 1 mL voorgekoelde PBS (0,01 M, pH 7,4), voeg 200 μL SOD-monstervoorbereidingsoplossing toe (uit SOD Assay Kit) om cellen 15 minuten op ijs te laten lyseren.
2. Centrifugeer het lysaat op 8000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en verzamel het supernatant als proefmonster.
3. Gebruik een BCA (Bicinchoninezuur) eiwittestkit om de eiwitconcentratie van het supernatant te bepalen en pas het monster aan op 50 μg totaal eiwit in een volume van 50 μL.
4. Meng het 50 μg eiwitmonster met de SOD-assaybuffer tot een eindreactievolume van 200 μL, en incubeer het mengsel bij 37 °C gedurende 30 minuten in het donker, waarna je de OD450-waarde meet.
5. Neem hetzelfde cellysaatsupernatant dat voor de SOD-assay wordt gebruikt, meet de CAT-, GSH- en MDA-niveaus met behulp van de respectievelijke assay-kits.

4. Meting van cellulaire ROS-niveaus

1. Behandel HDF-cellen met verschillende omstandigheden, spoel twee keer met 500 μL PBS en meng goed met 500 μL fluorescerende sonde van 10 μM reactieve zuurstofsoorten en incubeer bij 37 °C gedurende 20 minuten uit de buurt van licht.
2. Centrifugeer op 1000 × g gedurende 5 minuten op kamertemperatuur om de cellen te verzamelen, en spoel daarna twee keer met 500 μL PBS.
3. Susseer de cellen opnieuw in een 500 μL celkweekmedium en analyseer vervolgens de kleuring met flowcytometrie.
4. Registreer de fluorescentieintensiteit met behulp van flowcytometrie-analysesoftware en bereken vervolgens ROS-niveaus op basis van de fluorescentieintensiteit waarbij een hogere ROS overeenkomt met sterkere groene fluorescentie.

5. Senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-galactosidase) kleuring

1. Zaad HDF in 6-put celkweekplaten met een dichtheid van 1×10^{6 cellen} per put en kweek volgens therapie. Na verschillende behandelingen was je HDF één keer met 2 ml PBS.
2. Voeg 1 ml β-galactosidase kleurfixatiemiddel toe aan elke put en incubeer de cellen op kamertemperatuur met fixatief gedurende 15 minuten.
3. Was de cellen drie keer met 2 mL PBS, voeg 1 mL kleuringswerkoplossing toe aan elke put en incubeer dan 's nachts in het donker bij 37°C.
4. Observeer en fotografeer de cellen met een lichtmicroscoop (senescente cellen lijken blauw).

6. Celcyclus-assay

1. Zaad HDF in 6-wellplaten bij 1×10⁶ cellen per put; na verschillende behandelingen, spoel je cellen twee keer met 2 mL PBS.
2. Centrifugeer op 1000 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om cellen te verzamelen, voeg 1 mL 70% ethanol (celfixatief) toe en meng voorzichtig door te pipetteren. Plaats de vaste cellen 12 uur in een koelkast van 4°C.
3. Bereid 500 μL per monster van celkleuringsoplossing voor door propidiumjodide (PI, eindconcentratie 50 μg/mL) en RNaseA (eindconcentratie 200 μg/mL) te mengen in PBS. Blootstel cellen aan 500 μL kleuringsoplossing, en incubeer in het donker bij 37°C gedurende 30 minuten.
4. Beoordeel de fluorescentieintensiteit met behulp van flowcytometrie. Voer celcyclusanalyse uit met een flowcytometer.

7. TUNEL-vlekken

1. Blootstel HDF-cellen van verschillende behandelgroepen aan 1 mL 4% paraformaldehyde en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
2. Voeg 1 ml PBS met 0,3% Triton X-100 toe aan de cellen en incubeer 5 minuten op kamertemperatuur.
3. Was de cellen twee keer met PBS en voeg dan 500 μL TUNEL assayoplossing druppelgewijs toe om de cellen gelijkmatig te bedekken. Incubeer 1,5 uur in het donker op 37°C.
4. Voeg 200 μL DAPI-kleuringsoplossing toe om de cellen te bedekken en incubeer 10 minuten buiten het licht bij 25 °C.
5. Sluit de cellen af met een fluorescentiesignaalconserveringsmedium, waarna je ze observeert en fotografeer met een fluorescentiemicroscoop (TUNEL-positieve cellen tonen groene fluorescentie).

8. Immunofluorescentiekleuring

1. Zaad HDF-cellen uit verschillende behandelgroepen in 12-wellplaten. Zodra de celdichtheid 50%-60% bereikt, stel je de cellen bloot aan 1 mL 4% paraformaldehyde en incubeer je ze 25 minuten op kamertemperatuur.
2. Voeg 1 ml 5% runderserumalbumine (BSA) druppelwijs toe om het celoppervlak te blokkeren, en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
3. Voeg 500 μL primaire antilichamen Ki67 (1:300), collageen I (1:100), matrixmetalloproteïnase (MMP)-1 (1:50) of MMP-3 (1:100) dropwise toe en incubeer bij 4°C gedurende de nacht.
4. De volgende dag incubeer je de cellen met 500 μL fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-gelabeld secundair antilichaam (1:100) bij 37°C buiten het licht gedurende 1 uur.
5. Voeg 200 μL DAPI-kleuringsoplossing toe om de cellen te bedekken, incubeer 10 minuten weg van licht, observeer met een fluorescentiemicroscoop en analyseer met beeldanalysesoftware (collageen I en MMP-1 positieve cellen tonen rode fluorescentie, Ki67- en MMP-3-positieve cellen vertonen groene fluorescentie).

9. ELISA

1. Voeg 100 μL HDF-celkweeksupernatant toe aan putten met MMP-1 of MMP-3 ELISA kitplaten, en incubeer bij 37°C gedurende 2 uur.
2. Was de putten drie keer met 200 μL PBS, voeg vervolgens 100 μL van het bijbehorende antilichaam toe aan elke put en incubeer 1 uur in het donker bij 37 °C.
3. Spoel de putten 3 keer met 200 μL waspadding (inbegrepen in de kit), schud overtollige oplossing eraf en incubeer de monsters met 100 μL streptavidin-HRP gedurende 30 minuten bij 37°C in het donker.
4. Na het spoelen met PBS voeg je 100 μL substraat A en B toe volgens de instructies van de kit en breng je 10 minuten in het donker op 37°C incubatie.
5. Voeg 50 μL afsluitoplossing toe, meng goed, beoordeel de OD_450-waarde met een microplaatlezer en bereken de concentratie.

10. Beeldverouderingsschade bij muismodelconstructie

1. Huisdieren SPF-kwaliteit vrouwelijke SKH1 haarloze muizen (15-20 g, 4-5 weken oud) bij 22 °C met 55%-60% luchtvochtigheid en bieden autonome toegang tot voedsel en water. Desinfecteer regelmatig faciliteiten, waaronder voedselcontainers, waterflessen en drinktuiten.
2. Wijs muizen willekeurig toe aan de controlegroep (n=6) en de modelgroep (n=18). Bestralen modelgroepmuizen met UVA bij 0,35 J/cm² gedurende 8 weken³⁴; House Control Group muizen in dezelfde omgeving zonder UVA-straling.
3. Verdeel de modelgroep muizen gelijk in 3 subgroepen (n=6 elk).
4. Geef subcutane injecties van HNK van 5 mg/kg of 10 mg/kg in 100 μL volume twee keer per week aan twee subgroepen tijdens UVA-bestraling (geregistreerd als respectievelijk de 5 mg/kg HNK-groep en 10 mg/kg HNK-groep). Geef twee keer per week subcutane injecties van 100 μL zoutoplossing aan de derde subgroep tijdens UVA-bestraling (record als UVA-groep).
5. Evalueer de huidrimpelvorming en het watergehalte na succesvolle modellering³⁵.
6. Euthanaseer muizen met natriumpentobarbital (100 mg/kg) intraperitoneaal en verzamel vervolgens dorsale huidweefsels voor verdere experimenten.

11. Meting van huidcollageen I-inhoud

1. Verzamel 50 mg dorsale huidweefsels van de muis, maal ze grondig in vloeibare stikstof en lys ze met 500 μL voorgekoelde RIPA-lysisbuffer gedurende 30 minuten op ijs.
2. Centrifugeer het lysaat op 8000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C, verzamel het supernatant en meet het collageengehalte met een pro-collageen I C peptide-assay kit volgens de instructies van de fabrikant.

12. Hematoxyline- en eosinekleuring (HE)

1. Hecht muishuidweefsels in 10 mL 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 24 uur, droog in gradiënt ethanol (50%, 75%, 95%, 100%, elk gedurende 5 minuten), leg in paraffine en snijd in plakjes van 4 μm.
2. Bak de plakjes 8 uur op 65°C, deparaffiniseer twee keer in xyleen gedurende 10 minuten en hydrateer ze in gradiëntethanol bij kamertemperatuur.
3. Beits de plakjes 8 minuten met een hematoxyline-oplossing, spoel 1 minuut met stromend kraanwater, differentieer met differentiatieoplossing 30 seconden en kleur 1 minuut met eosine op kamertemperatuur.
4. Dehydrateer de gekleurde plakjes in gradiëntethanol, zuiver in xyleen, sluit af met montagemedium en bekijk onder een microscoop (De celkern lijkt blauwpaars, terwijl het cytoplasma, de collageenvezels en erytrocyten in verschillende mate roze lijken).

13. Masson-kleuring

1. Kleur paraffinedelen van muizenhuidweefsels met Masson trichrome kleurkit³⁶. Deparaffine-secties in xyleen twee keer gedurende 10 minuten, voeg Weigert ijzerhematoxyline kleuroplossing toe en kleur 10 minuten.
2. Differentieer met een zuur ethanoldifferentiatie-oplossing gedurende 30 seconden, spoel 5 minuten met stromend kraanwater, en kleur dan druppels met een Ponceau-fuchsin kleuroplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Doe reverse blueing met Masson's blue solution en spoel daarna 1 minuut met gedestilleerd water.
3. Bereid een zwakke zuurwerkoplossing voor in een verhouding van gedestilleerd water: zwakke zuuroplossing (geleverd in de kit) = 2:1; Voeg 1 ml zwakke zuurwerkoplossing druppelgewijs toe en was het 30 seconden op kamertemperatuur.
4. Giet overtollige vloeistof eraf, voeg druppelgewijs 1 ml fosfomolybdische zuuroplossing toe en behandel het 2 minuten op kamertemperatuur. Voeg 1 ml van de zwakke zuurwerkoplossing toe druppels, en was dan 30 seconden af.
5. Giet overtollige vloeistof eraf, voeg 1 ml anilineblauwe kleuroplossing druppelgewijs toe en beits 1 minuut. Voeg 1 ml zwakke zuurwerkoplossing druppelloos toe en was het 30 seconden.
6. Dehydrateer snel in 95% ethanol gedurende 2 seconden. Dehydrateer twee keer in absolute ethanol, elke keer 10 seconden.
7. Na het drogen maak je de delen los met xyleen en monteer je ze met neutrale lijm. Observeer de verdeling van collageenvezels in elke groep onder een microscoop (collageenvezels zijn blauw, terwijl spiervezels, cytoplasma en erytrocyten felrood zijn en celkernen duidelijk blauwzwart).

14. Meting van huidweefsel ROS-niveaus

1. Neem bevroren stukken muizenhuidweefsel (bereid binnen 1 uur na excisie), breng 1 ml reinigingsoplossing druppelwijs over het hele oppervlak van de sectie en laat het 10 minuten op kamertemperatuur staan.
2. Schud de wasoplossing eraf en voeg vervolgens 1 mL 10 μM reactieve zuurstofprobe drop-wise toe om de secties gelijkmatig te bedekken; Incubeer 30 minuten op 37 °C weg van licht.
3. Spoel de secties twee keer af met PBS, voeg dekkingsdoeken toe en observeer met een fluorescentiemicroscoop (ROS-positieve gebieden vertonen rode fluorescentie; hoe lager het ROS-niveau, hoe zwakker het rode fluorescentiesignaal).

15. Testen van biochemische indicatoren

1. Verzamel muizenserum en bereid detectiereagentia voor volgens de instructies van de bijbehorende assaykits.
2. Meet de activiteiten van aspartaattransaminase (AST) en alaninetransaminase (ALT) in muizenserum met behulp van de respectievelijke kits.
3. Bepaal de niveaus van ureumstikstof (BUN) en creatinine (CRE) in het muizenserum met behulp van de respectievelijke kits.

16. Western blot

1. Verzamel 50 mg weefsel of 1×10^{à 6} cellen, lys de monsters op ijs gedurende 30 minuten met 200 μL RIPA-lysisbuffer om eiwitten te verkrijgen.
2. Centrifugeer op 8000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en verzamel het supernatant. Beoordeel het eiwitgehalte in cellen en weefsels met behulp van de BCA eiwitconcentratie-assaykit.
3. Voer elektroforese uit van monsterproteïnen op 12% SDS-PAGE gel en breng gescheiden eiwitten over naar PVDF-membranen bij 4 °C.
4. Blokkeer PVDF-membranen met 5% BSA gedurende 3 uur bij kamertemperatuur. Spoel de membranen 3 keer met TBST (bevat 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl en 0,1% Tween-20), en incubeer dan de nacht bij 4°C met primaire antilichamen: P53 (1:1000), P21 (1:1000), P16 (1:100), collageen I (1:1000), Cycline A2 (1:500), cycline-afhankelijke kinase 2 (CDK2, 1:1000), MMP-1 (1:500), MMP-3 (1:1000), TGF-β1 (1:1000), Smad2 (1:100), Smad3 (1:1000), p-Smad2 (1:1000) of p-Smad3 (1:1000).
5. Op de tweede dag was je de membranen 3 keer met TBST en broed je dan uit met 1 mL geitenanti-konijn IgG (1:10000) op kamertemperatuur gedurende 2 uur. Breng 500 μL van het enhanced chemiluminescence (ECL) reagens gelijkmatig aan op de membranen en scan ze vervolgens met een gelbeeldvormingssysteem.
6. Voer grijswaardenanalyse uit met beeldanalysesoftware. Druk het relatieve expressieniveau uit als de verhouding van de grijze waarde tot die van GAPDH.

17. Statistische analyse

1. Voor in vitro celgebaseerde assays worden alle experimenten onafhankelijk drie keer herhaald (n=3, biologische replica's).
2. Voor in vivo dierproeven worden 6 muizen per groep opgenomen (n=6), wat voldoet aan de 3R-principes voor laboratoriumdierenwelzijn en ethiek.
3. Alle resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie. Voer statistische analyses uit met behulp van statistische analysesoftware. De normaliteit van de gegevens werd getest met de Shapiro-Wilk-test.
4. Voor normaal verdeelde data gebruik je eenrichtings-ANOVA voor multigroepsvergelijking, gevolgd door Tukey's post-hoc test voor paargewijze vergelijkingen tussen groepen. Voor niet-normaal verdeelde data past u de niet-parametrische Kruskal-Wallis-test toe. P< 0,05 duidt op een significant verschil.
5. Genereer grafieken met behulp van grafische software.

Resultaten

HNK verlicht oxidatieve stressschade in HDF-cellen veroorzaakt door UVA
De effecten van verschillende concentraties van HNK-behandeling gedurende 24 of 48 uur op de levensvatbaarheid van HDF-cellen werden onderzocht met een cellevensvatbaarheidstest om te screenen op de juiste concentratie en behandelingsduur. De resultaten toonden aan dat 2,5, 5 en 10 μM HNK de levensvatbaarheid van normale HDF-cellen na 24 uur of 48 uur behandeling niet significant beïnvloedden, wat...

Discussie

Ultraviolet licht is een omgevingsfactor die cellen en organismen schaadt. Eerdere studies hebben gerapporteerd dat UVA, met zijn hoge penetratievermogen, het belangrijkste type ultraviolet licht is dat het aardoppervlak³⁸ bereikt. Fibroblasten zijn belangrijke functionele cellen in de dermis, en hun veroudering kan direct of indirect de huidveroudering^veroorzaken. UVA-geïnduceerde fotoverouderingsschade in het ^HDF-celmodel en he...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
ALT activity assay kit	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	P2711M	alanine transaminase activity detection kit
Amplex Red CRE assay kit	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	S0291S	creatinine detection kit
AntiFade mounting medium	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	P0126	fluorescence signal preservation mounting medium
AST activity assay kit	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	P2715S	aspartate transaminase activity detection kit
BCA protein assay kit	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	P0012	protein concentration determination kit
BSA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	V900933	blocking reagent for non-specific binding
BUN Assay kit	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	S0574S	blood urea nitrogen detection kit
CAT Assay kit	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	S0051	catalase activity detection kit
CCK-8 reagent	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	96992	cell viability assay solution which is a water-soluble tetrazolium salt
CDK2 antibody	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA5-79024	primary antibody for CDK2 detection
Chemiluminescent agent ECL	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA	HY-K1005	enhanced chemiluminescence detection reagent
Collagen I antibody	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA1-26204	primary antibody for collagen I detection
Cyclin A2 antibody	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA5-34682	primary antibody for Cyclin A2 detection
DAPI staining solution	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D9542	nuclear staining dye
DCFH-DA fluorescent probe	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA	HY-D0940	reactive oxygen species fluorescent probe
Differentiation solution	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	C0161s	reagent for hematoxylin differentiation step
Dihydroethidium probe	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	S0063	reactive oxygen species probe
Fibroblast culture medium	Sunncell Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, Hubei, China	SNPM-H342	complete culture medium for fibroblast growth
FITC-labeled goat anti-rabbit IgG	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F-2765	fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled secondary antibody
Flow cytometry	BD biosciences, San Jose, CA, USA	BD FACSCaliburTM	flow cytometer
FlowJo software	BD biosciences, San Jose, CA, USA	v10.8	flow cytometry analysis software
Fluorescence microscope	Leica, Heidelberg, Germany	DM IL LED	microscope for fluorescence imaging
GAPDH antibody	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA1-987	internal control antibody for protein normalization
gel imaging system	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	iBright CL1500	imaging system for protein detection
goat anti-rabbit IgG	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	31460	secondary antibody for immunodetection
Graphpad Prism 9.0 software	GraphPad Software, San Diego, CA, USA	Prism 9.0	graphing software
GSH Assay kit	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	S0053	glutathione content detection kit
HE staining kit	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	C0105S	histological staining kit for tissue morphology analysis
HNK	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA	HY-N0003	honokiol, bioactive compound
Human dermal fibroblasts	Sunncell Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, Hubei, China	SNP-H342	primary human skin fibroblast cells
IBM SPSS Statistics 26.0 software	IBM Corporation, Armonk, NY, USA	IBM SPSS Statistics 26.0	statistical analysis software
ImageJ software	Wayne Rasband, National Institute of Mental Health, USA	version 1.54h	image analysis software
Ki67 antibody	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	MA5-14520	primary antibody for cell proliferation marker detection
Light microscope	Leica, Heidelberg, Germany	DM3000	optical microscope for brightfield imaging
Masson trichrome staining kit	Solarbio, Beijing, China	G1340	collagen and connective tissue staining kit
MDA Assay kit	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	S0131S	malondialdehyde level detection kit (lipid peroxidation marker)
Microplate Reader	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	1410101	absorbance measurement instrument for cell-based assays
MMP-1 antibody	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA5-27210	primary antibody for matrix metalloproteinase-1 detection
MMP-1 ELISA kit	Enzyme-linked Biotechnology, Shanghai, China	ml038199	quantitative detection of MMP-1 in biological samples
MMP-3 antibody	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab52915	primary antibody for matrix metalloproteinase-3 detection
MMP-3 ELISA kit	Enzyme-linked Biotechnology, Shanghai, China	ml105322	quantitative detection of MMP-3 in biological samples
Neutral gum	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	C0173	mounting medium
P16 antibody	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA5-20379	primary antibody for p16 protein detection
P21 antibody	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	MA5-14949	primary antibody for p21 protein detection
P53 antibody	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab131442	primary antibody for p53 protein detection
paraformaldehyde	Solarbio, Beijing, China	P1110	cell and tissue fixation reagent
PI	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	ST512	propidium iodide for DNA staining in cell cycle analysis
Pro-collagen I C peptide assay kit	TAKARA, Tokyo, Japan	MK101	collagen synthesis detection kit
p-Smad2 antibody	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	44-244G	primary antibody for phosphorylated Smad2 detection
p-Smad3 antibody	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	44-246G	primary antibody for phosphorylated Smad3 detection
PVDF membranes	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	88520	protein transfer membrane for western blotting
RIPA lysis buffer	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	P0013B	protein extraction buffer for cell and tissue lysates
RNaseA	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	ST579	ribonuclease for RNA removal during DNA staining
SA-β-galactosidase staining kit	Beyotime Biotechnology, Shanghai, China	C0602	cellular senescence detection kit
SB431542	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA	HY-10431	TGF-β1 signaling pathway inhibitor
SDS-PAGE gels	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	WG1403