Methodenartikel

Colorimetrische beoordeling van deiodinase 1-activiteit in menselijke levermicrosomen met behulp van de Sandell-Kolthoff-reactie

678 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70104

⸱

10 april 2026

 ,  ,  ,  , 
1Experimental Toxicology and Ecology, BASF SE, 2Pharmacy, Pharmacology and Toxicology, Free University of Berlin, 3German Federal Institute for Risk Assessment (BfR), German Centre for the Protection of Laboratory Animals (Bf3R)

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een colorimetrische methode om betrouwbaar de invloed van chemicaliën op de Deiodinase 1 (DIO1)-activiteit in menselijke levermicrosomen te beoordelen met behulp van de Sandell-Kolthoff-reactie. Het bevat vooraf gedefinieerde acceptatiecriteria en statistische prestatie-indicatoren en ondersteunt lopende inspanningen richting opname van OESO-testrichtlijnen.

Samenvatting

Deze methode maakt het mogelijk om testmiddelen te identificeren die de DIO1-activiteit remmen en daardoor de homeostase van het schildklierhormoon kunnen verstoren. Het gepresenteerde protocol beschrijft een niet-radioactieve, colorimetrische methode om de effecten van teststoffen op de enzymatische activiteit van Deiodinase 1 (DIO1) in menselijke levermicrosomen te beoordelen. De test is gebaseerd op de Sandell-Kolthoff (SK) reactie, die jodide kwantificeert die vrijkomt tijdens de dejodinering van reverse triiodothyronine (rT3) naar diiodothyronine (T2). Het gele cerium (IV) wordt gereduceerd tot kleurloos cerium (III) in aanwezigheid van jodide, waardoor fotometrische detectie mogelijk is bij 415 nm. In deze gestandaardiseerde opstelling wordt de ceriumconcentratie (IV) ingesteld op 40 mM om de signaalstabiliteit en robuustheid onder de beschreven omstandigheden te verbeteren. Om de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van de assay te waarborgen, is een uitgebreide controle-opstelling inbegrepen: 6-propyl-2-thiouracil (referentiepunt), aurothioglucose (positieve controle), 1-thio-β-D-glucose natriumzout (negatieve controle) en 1% dimethylsulfoxide (oplosmiddelcontrole). Het protocol omvat een bereikbepalingstest om geschikte testconcentraties te bepalen, standaardisatie van microsoombatch-specifieke jodide-afgifte en gestructureerde chemische interferentietests bij afwezigheid van microsomen, met een optionele vervolgbeoordeling zonder dithiothreitol (DTT) om DTT-afhankelijke artefacten te identificeren. De DIO1-SK assay is geschikt voor screening met medium tot hoge doorvoer en mechanistische toxicologiestudies. De robuustheid, schaalbaarheid en toepasbaarheid op menselijke microsomen maken het tot een waardevol hulpmiddel voor het onderzoeken van endocriene verstoringen. Dit protocol ondersteunt regulatoire validatie-inspanningen.

Inleiding

Hormoonverstoorders (ED's) zijn chemicaliën die hormonale regulatie verstoren en daardoor bijwerkingen veroorzaken bij mensen 1,2. Deiodinasen (DIO) zijn membraan-geassocieerde enzymen, waarbij selenocysteïne een belangrijk residu is in hun actieve sites. Deze enzymfamilie bestaat uit drie verschillende isoformen (DIO1, DIO2 en DIO3), die gezamenlijk de concentraties van circulerende schildklierhormoon (TH) moduleren en hun weefselspecifieke beschikbaarheid binnen cellen3 regelen. Thyroxine (T4), dat als prohormoon fungeert, en triiodothyronine (T3), de actieve vorm, spelen essentiële rollen bij het reguleren van energieverbruik, groei, ontwikkelingsprocessen en thermoregulatie in het lichaam4. De DIO-isoformen verschillen in de eigenschappen van hun dejodinatieplaatsspecificiteit, kinetische eigenschappen en substraatvoorkeuren3. DIO1 is de belangrijkste dejodinase-isoform in volwassen lever en vertoont een sterke substraataffiniteit voor omgekeerde triiodothyronine (rT3) en gesulfateerde jodothyroninen, terwijl DIO2 bij voorkeur gebruikmaakt van T4 en rT3, en DIO3 voornamelijk werkt op T4 en T3. Het gebruik van menselijke levermicrosomen en rT3 als substraat maakt selectieve detectie van DIO1-activiteit mogelijk, waardoor interferentie door andere isoformen wordt geminimaliseerd. Hoewel de precieze gevolgen van door middelen veroorzaakte DIO1-remming nog volledig moeten worden opgehelderd, toont bewijs uit menselijke genmutaties die DIO1 beïnvloeden duidelijk aan dat DIO1 het schildklierhormoonsysteem kan verstoren5. Daarom is er een cruciale behoefte aan robuuste en reproduceerbare methoden om de remming van DIO1 te onderzoeken.

Het doel van de gepresenteerde methode is om DIO1-activiteit in vitro te kwantificeren met behulp van een niet-radioactieve, colorimetrische benadering gebaseerd op de Sandell-Kolthoff (SK) reactie. DIO1 katalyseert de omzetting van omgekeerd rT3 naar T2, een proces dat resulteert in de afgifte van jodide-ionen. De SK-reactie maakt een gevoelige detectie van het vrijgekomen jodide mogelijk, waardoor de jodideafgifteactiviteit (IRA) als directe maat voor DIO1-activiteit kan worden bepaald. Deze test maakt het mogelijk om remmende effecten van teststoffen op DIO1 te detecteren, wat mechanistische toxicologie, screening of regelgevende besluitvorming ondersteunt. Het is vooral relevant voor het onderzoeken van DIO1-inhibitie als een moleculair initiatief van nadelige uitkomstroutes die leiden tot schildklierverstoring, zoals uiteengezet door internationale validatie-inspanningen zoals die gecoördineerd door EURL ECVAM 6,7. De methode werd oorspronkelijk ontwikkeld in 2012 8,9 en verder geoptimaliseerdmet 6,7 als reactie op de groeiende behoefte aan robuuste, reproduceerbare en schaalbare in vitro assays die kunnen worden geïntegreerd in testbatterijen voor endocriene screening, vooral in de context van schildklierhormoonmetabolisme. Onlangs werd de toepassing van analoge SK-gebaseerde opstellingen voor screening11 van medium-10 tot high-throughput gepubliceerd, waarmee de brede toepasbaarheid van de SK-gebaseerde aanpak wordt aangetoond.

Hoewel de DIO1-SK assay indirect DIO1-activiteit meet door IRA te kwantificeren in plaats van TH-producten, biedt het verschillende voordelen ten opzichte van alternatieve technieken. In tegenstelling tot methoden die vertrouwen op radiogelabelde substraten12 of massaspectrometrie-gebaseerde kwantificering van uitgeput of gevormd schildklierhormoon13, biedt de SK-reactie een eenvoudige, schaalbare en kosteneffectieve meting door jodideafgifte te meten bij 415 nm14. Hoewel LC-MS/MS-methoden met vaste-fase extractie (SPE-LC-MS/MS) hoge specificiteit en gevoeligheid bieden voor het kwantificeren van rT3 en T2, vereisen ze dure instrumentatie en zijn ze minder geschikt voor screening met hogere doorvoer. Daarentegen kan de DIO1-SK assay worden uitgevoerd in standaard laboratoriumomgevingen en is deze vooraf gevalideerd voor gebruik met menselijke levermicrosomen, met een hoge reproduceerbaarheid en voorspelbaarheid 6,7. In een vergelijkende studie werden de resultaten van de SK-reactie, specifiek jodideafgifte, direct vergeleken met de kwantificatie van schildklierhormoonmetabolieten (rT3 en T2) met SPE-LC-MS/MS 15. De bevindingen toonden een sterke overeenstemming aan tussen de twee benaderingen over een reeks teststoffen en remmingspotenties. Voor alle geteste stoffen weerspiegelden veranderingen in jodide-afgifteactiviteit (IRA) gemeten door de SK-reactie nauw veranderingen in rT3- en T2-niveaus bepaald door massaspectrometrie. Dit ondersteunde verder de geldigheid van de SK-uitlezing als vervanging voor DIO1-activiteiten. Deze vergelijkende analyses bevestigen dat de SK-assay een robuust en betrouwbaar alternatief biedt voor complexere analysetechnieken, en dat jodideafgifte met vertrouwen kan worden gemeten om DIO1-remming in vitro te beoordelen.

De SK-methode kent echter bepaalde beperkingen die in overweging moeten worden genomen: deze is gevoelig voor interferentie door stoffen die ofwel vrij jodide als onzuiverheid bevatten, jodide niet-enzymatisch afgeven, of reageren met assaycomponenten zoals dithiothreitol (DTT). DTT wordt opgenomen als een reducerende cofactor om de deiodinase-katalytische competentie te behouden door de regeneratie van de actieve plaats selenocysteïne in de verminderde toestand tijdens de omzet te ondersteunen. Omdat DTT een sterk reductant is, kunnen bepaalde teststoffen (of onzuiverheden) redoxreacties ondergaan die de colorimetrische uitlezing kunnen beïnvloeden en in sommige gevallen kunnen leiden tot DTT-afhankelijke assay-artefacten die niet gerelateerd zijn aan enzymatische jodideafgifte. Dergelijke interferenties kunnen leiden tot vals-negatieve resultaten voor DIO1-remming, omdat het gemeten jodide mogelijk niet afkomstig is van de enzymatische omzetting van rT3. Dus hoewel de SK-assay geschikt is voor routinematige screening en de meeste teststoffen, kan LC-MS/MS worden gebruikt voor bevestiging wanneer assay-interferentie wordt vermoed of voor stoffen met complexe chemische eigenschappen.

De DIO1-SK assay wordt momenteel voorbereid voor opname als OESO-testrichtlijn in een internationaal PEPPER (Public-private platform for the validation of endocrine disruptors characterization methods) project, dat het groeiende belang ervan voor regelgevende toepassingen en de internationale harmonisatie van strategieën voor endocrine disruptortesten benadrukt. De assay kan worden geïntegreerd in uitgebreide in vitro testbatterijen, ter ondersteuning van zowel chemische veiligheidsbeoordeling als mechanistische onderzoeken naar endocriene verstoring16. In combinatie met assays die aanvullende belangrijke gebeurtenissen langs het schildkliernadelige uitkomstpad behandelen, draagt het bij aan een vollediger begrip van de mechanismen van schildklierhormoonverstoring.

Daarnaast maken de schaalbaarheid en hoge reproduceerbaarheid van het protocol het zeer geschikt voor screening met een gemiddelde tot hoge doorvoersnelheid. Dit is essentieel voor het evalueren van grote aantallen stoffen tijdens geneesmiddelontwikkeling en in academische omgevingen, zoals onlangs aangetoond11. Onderzoekers die geïnteresseerd zijn in DIO1-inhibitie, of dat nu voor screening, mechanistische toxicologie of regelgevende besluitvorming is, zullen profiteren van een robuuste, toegankelijke en veelzijdige assay. De validatie van deze methode maakt het een standaardinstrument voor onderzoek naar verstoring van het schildklierhormoonsysteem en voor het evalueren van chemische veiligheid.

Protocol

OPMERKING: Voordat de hoofdtest wordt uitgevoerd, is een reeks voorbereidende stappen essentieel om de nauwkeurigheid, reproduceerbaarheid en geldigheid van de DIO1-SK test te waarborgen. Deze preassay-activiteiten omvatten het gieten van ionenuitwisselings, met hars gevulde filterplaten, die cruciaal zijn voor effectieve scheiding en het minimaliseren van achtergrondinterferentie in de SK-reactie. De Sandell-Kolthoff-reactie wordt regelmatig gestandaardiseerd met behulp van jodidestandaardcurves om systematische veranderingen te monitoren en de assaykwaliteit te behouden. De activiteit van menselijke levermicrosomen wordt gemeten om batch-specifieke jodideafgiftecapaciteit te bepalen, waardoor consistente enzymatische prestaties over experimenten heen worden gegarandeerd. Samen vormen deze stappen een solide basis voor het daaropvolgende hoofdonderzoek en data-evaluatie, wat de ontwikkeling van reproduceerbare en interpreteerbare resultaten ondersteunt.

1. Preassay-werk

  1. Bereiding van buffers en reagentia
    1. Bereid alle buffers en voorraadoplossingen vooraf voor zoals beschreven in Tabel 1. Sla aliquots op zoals aangegeven om stabiliteit en reproduceerbaarheid te waarborgen.
    2. Bereid op de dag van de test het substraatmengsel vers voor elke plaat met 96 bronnen. Voor één 96-put plaat combineer 5,75 mL HEPES/EDTA-buffer (50 mM HEPES, 2,16 mM EDTA, pH 7,0), 0,5 mL ontdooide 1 M DTT en 10 μL 6 mM rT3 (opgelost in DMSO). Meng voorzichtig en laat het substraatmengsel op ijs liggen tot gebruik.
  2. Voorbereiding van referentie
    1. Bereid op de dag van de assay een 10-1 M voorraadoplossing van referentiecontrole 6-PTU voor in een geschikt oplosmiddel (bijv. DMSO).
    2. Maak een verdunning van 1:10 van deze voorraad in diH2O (RI-C8) om een DMSO-concentratie van 10% te bereiken en bereid een reeks verdunningen van deze voorraad in 10% DMSO in diH2O zoals beschreven in Tabel 2.
  3. Voorbereiding van de positieve controle
    1. Bereid een 10-2 M voorraadoplossing van de positieve controle Aurothioglucose in een geschikt oplosmiddel (bijv. DMSO) en bewaar deze tot 6 maanden bij 4 °C.
    2. Verdun op de dag van de test de voorraad tot 10-3 M in diH2O om een DMSO-concentratie van 10% DMSO te bereiken.
  4. Voorbereiding van de negatieve controle
    1. Maak op de dag van de test een 10-2 M voorraadoplossing van de negatieve controle 1-Thio-β-D-glucose natriumzout vers klaar.
    2. Verdun op de dag van de test de voorraad tot 10-3 M in diH2O om een DMSO-concentratie van 10% DMSO te bereiken.
      OPMERKING: Gebruik altijd de juiste veiligheidsmaatregelen, vooral bij het omgaan met gevaarlijke chemicaliën zoals natriumarseniet en zwavelzuur. Alle reagentia moeten worden bereid met gedeïoniseerd water en worden bewaard volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Het substraatmengsel is, eenmaal bereid, en de ontdooide DTT aliquot bedoeld voor eenmalig gebruik op de dag van de assay en mogen niet opnieuw worden ingevroren.
  5. Gieten van ionenwisselaarhars
    1. Gebruik een geschikte rechthoekige, transparante container voor de voorbereiding.
    2. Voeg ongeveer 250 g (of de gewenste hoeveelheid) ionenwisselhars toe aan een grote container en was. Spoel door 10% azijnzuur toe te voegen; Laat de resin-ophanging 10 minuten rusten.
    3. Na 10 minuten de vering te hebben laten zakken, kantel en aspireer je het supernatant lichtjes. Was in totaal minstens 5 keer of totdat er geen kleur meer in het oplosmiddel lekt.
    4. Voeg na de laatste wasbeurt 10% azijnzuur toe zodat het ongeveer 50% van het totale volume uitmaakt.
    5. Kantel de container zodat de hars naar één kant beweegt en stabiliseer de container in de gekantelde positie. Wacht ~10 minuten tot de fasen uit elkaar gaan.
    6. Plaats een filterplaat met 96 putten bovenop een 96-diep putplaat en voeg 100 μL 10% azijnzuur toe aan elke put van de filterplaat met 96 putten.
    7. Snijd de punten die voor het gieten van hars worden gebruikt op een hoogte van ~1 cm om de opening aan het uiteinde te verbreden en giet 300 μL ionenwisselhars in elke put van de 96-put filterplaat.
      OPMERKING: De tips die in ons werk worden gebruikt, hebben een maximaal volume van 1.200 μL en kunnen worden bevestigd aan multikanaalpipetten.
    8. Eluteer het azijnzuur door te centrifugeren in een 96-diepe putplaat met 100–200 × g in een centrifuge met een uitschuifrotor voor microtiterplaten gedurende 1 minuut. Controleer of de hars gelijkmatig over de plaat is verdeeld.
    9. Sluit de plaat af met een ondoordringbaar plastic vel en bewaar maximaal 6 maanden bij 4 °C.
      OPMERKING: Ionenwisselaarharsbestanddelen staan erom bekend de SK-reactie te beïnvloeden als ze niet goed worden uitgespoeld. Het verwijderde supernatant kan direct worden gebruikt in de SK-reactie (gebruik 50 μL supernatant monster, voeg 50 μL cerium toe en tenslotte 50 μL arsenietoplossing) en kan worden vergeleken met een 10% azijnzuurmonster (blanke controle) om volledige uitspoeling van de componenten te garanderen.
  6. Standaardisatie van de Sandell-Kolthoff-reactie
    1. Bereid jodiedverdunningen voor van een respectievelijke jodidebron (bijv. iodide standaardoplossing) met aanbevolen concentraties van 1.500, 1.000, 750, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 25, 10, 5 en 1 nM jodide met behulp van een respectievelijke jodidestandaard in diH2O.
    2. Voeg 50 μL pure diH2O toe als controle en 50 μL van de voorbereide jodiedverdunningen aan een 96-wellplaat in drievoud zoals beschreven in de indeling in Figuur 1.
    3. Voeg 50 μL 40 mM ceriumoplossing toe aan alle putten en start de reactie door 50 μL 25 mM arsenietoplossing aan alle putten toe te voegen.
    4. Zo snel mogelijk na toevoeging van de arsenietoplossing meet je de absorptie met een plaatmeter op 415 nm (±2 nm) door elke minuut de optische dichtheid (OD) gedurende 21 minuten op te nemen, evenals de initiële OD te registreren.
    5. Evalueer de resultaten zoals beschreven in sectie 4.
      OPMERKING: Meestal vereist een achtergrond van ΔOD21 min > 0,3 in de pure diH2O-controle aandacht en verder onderzoek naar onderliggende oorzaken (bijv. verontreiniging in de A- of Ce-batch, lage waterkwaliteit).
  7. Beoordeling van microsoomactiviteit
    1. Bereid de hoogste concentratie (RI-C8) van het referentieitem (6-PTU) voor zoals beschreven in stap 1.2.
    2. Bereid de zes microsoomverdunningen voor zoals beschreven in Tabel 3 en de substraatmix zoals beschreven in Tabel 1.
    3. Voeg 10 μL van een 10% (v/v) oplosmiddelverdunning toe in diH2O (bijv. 10% DMSO in diH2O) en 10 μL van 10-2 M 6-PTU (RI-C8) aan een 96-put plaat in drievoud zoals beschreven in de plaatindeling in Figuur 2.
    4. Voeg 40 μL microsoomverdunning toe in diH2O (wat resulteert in 20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,68 en 0 μg microsomaal eiwit per put) aan de 96-wellplaat zoals weergegeven in de plaatindeling.
      OPMERKING: Leveranciers leveren doorgaans de voorraadconcentratie microsomaal eiwit. Zo niet, dan kunnen standaard eiwitkwantificatiemethoden worden gebruikt, hoewel we deze in deze studie niet hebben toegepast.
    5. Voeg 50 μL vers bereide substraatmengsel toe aan elke put en sluit de plaat af met een ondoordringbaar plastic plaatje.
    6. Plaats de 96-well plaat op een shaker in een broedmachine (37 °C bij 850 rpm) en incubeer gedurende 2 uur.
    7. Na de incubatietijd leg je de plaat op ijs om de reactie te stoppen.
    8. Voer de ionenuitwisseling uit analoog aan stap 2.2.
    9. Breng geschikte hoeveelheden monster over van de diepe put verkregen in de ionenuitwisselingsstap naar een verse plaat met 96 putten om onverdund (50 μL monster), 1:2 (25 μL monster + 25 μL 10% azijnzuur) en 1:4 (12,5 μL monster + 37,5 μL 10% azijnzuur) verdunningen te meten, waarbij de plaatindeling ongewijzigd blijft.
    10. Evalueer de resultaten zoals beschreven in sectie 4 en bepaal de verdunningsfactor voor de monsters in 10% azijnzuur, evenals de microsomale eiwitconcentratie die nog steeds leidt tot de hoogst mogelijke ΔOD21min -BG-waarden in de Sandell-Kolthoff-reactie zonder het verzadigingsplateau te bereiken.
      OPMERKING: Meestal is een jodideafgifte van ΔOD21 minuten > 0,5 gemakkelijk te bereiken in de 1:4 of 1:2 azijnzuurverdunning van de 20 μg microsomaal eiwit per putmonster en ligt meestal rond een ΔOD21 minuten van 1. Hogere concentraties microsomale eiwitten worden niet aanbevolen, omdat ze de achtergrond- en niet-specifieke binding tijdens de assay verhogen. Het wordt aanbevolen om de meting van een 6-PTU verdunningsreeks te herhalen met behulp van de bepaalde microsoomconcentratie en verdunningsfactor om het resultaat te bevestigen.
  8. Oplosbaarheidsbeoordeling van testitems
    1. Los het testitem op bij 100 mM of 200 mg/mL in een geschikt oplosmiddel (bijv. DMSO) bij kamertemperatuur. Meng of vortex en controleer de oplossing visueel (microscoop).
    2. Als het niet is opgelost, sonicateer dan tot 5 minuten en controleer opnieuw. Als het nog steeds niet is opgelost, verhit tot 60 minuten op 37 °C en controleer het opnieuw.
    3. Als het onoplosbaar is, verdunn je verder of bereid je een nieuwe bouillon voor bij een lagere concentratie en herhaal je de procedure. Als DMSO niet geschikt is, probeer dan water of ethanol als alternatieve oplosmiddelen.
    4. Na het oplossen bereid je een verdunning van 1:10 voor in diH2O (10% oplosmiddel) en herhaal je de beoordeling (mengen, sonicatie, verhitting indien nodig).
    5. Om assaycondities te simuleren, bereid je een testitemverdunning van 1% voor in de assaybuffer en herhaal je de oplossing van de controle.
  9. Voorbereiding van testitems en afstandsbepaling
    1. Bereid de testitemvoorraadoplossing voor bij de hoogste oplosbare concentratie in een geschikt oplosmiddel (bij voorkeur DMSO), zoals bepaald tijdens oplosbaarheidsbeoordeling in stap 1.8.
    2. Voor de afstandsbepalingstest bereid acht testitemverdunningen voor door opeenvolgende 1:10 (v/v) verdunningsstappen met behulp van de standaardoplossing en 10% DMSO in diH2O.
    3. Voer de bereikbepalingsassay uit om het inhibitieprofiel van het testitem te schatten door de stappen uit te voeren die in sectie 2 zijn beschreven. Als het testitem ≥25% remming toont bij een concentratie, pas dan het concentratiebereik voor de laatste assay-runs aan zodat er ten minste drie concentraties in het lineaire inhibitiebereik en twee concentraties onder 10% IRA worden opgenomen, indien van toepassing.
    4. Als het testitem <25% remming toont in alle geteste concentraties, hergebruik dan dezelfde verdunningsreeks voor de laatste assay-runs. In dit geval kan de afstandsbepalingstest tellen als een van de drie vereiste onafhankelijke assay-runs.
      OPMERKING: Voer voor elk testitem minstens twee, idealiter drie, onafhankelijke experimenten uit om reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van de resultaten te waarborgen. Als een andere verdunning wordt gekozen om het activiteitsbereik beter te dekken, is een afwijking van de 1:10 verdunningsverhouding toegestaan. De 25% grens in deze teststrategie (zie stappen 1.9.3 en 1.9.4) onderscheidt testitemeffecten van negatieve controles, waarbij rekening wordt gehouden met de variabiliteit in de basislijn en een extra veiligheidsmarge wordt geboden. Deze drempel zorgt voor betrouwbare classificatie van inhibitieprofielen.

figure-protocol-1
Figuur 1: Plaatindeling voor iodide standaardkromme. Deze figuur toont de 96-put plaatindeling die wordt gebruikt om de jodidestandaardcurve te genereren. Wells bevatten seriële verdunningen van jodide variërend van 1 nM tot 1.500 nM, evenals diH2O-only controles.  Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-2
Figuur 2: Plaatopstelling voor microsomale eiwittitratie en referentie-itemtest. Deze figuur toont de 96-well-plaatindeling voor microsomale eiwittitratie en referentieremmer (6-PTU) testen. Rijen bevatten toenemende hoeveelheden microsomaal eiwit per put, met en zonder 6-PTU.  Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Het uitvoeren van de DIO1–SK-assay

  1. Microsoom-incubatie met testitem
    1. Bereid het referentieitem voor zoals beschreven in stap 1.2, evenals de positieve en negatieve controle, zoals beschreven in stappen 1.3 en 1.4. Bereid de testitems voor met geschikte concentraties volgens het protocol beschreven in stappen 1.8 en 1.9.
    2. Bereid de substraatmix voor zoals beschreven in Tabel 1 en bereid een microsoom-suspensie in de vooraf gedefinieerde eiwitconcentratie volgens stap 1.7 door zorgvuldig ontdooide, gealiquoteerde microsoomoplossing te verdunnen in diH2O. Houd de microsoom-suspensie op ijs tot ze nodig is voor incubatie.
    3. Volgend op de plaatindelingen in Figuur 3 en Figuur 4 (als meer dan twee testitems gelijktijdig worden geëvalueerd) voeg 10 μL referentie-itemconcentraties, positieve en negatieve controle, oplosmiddelcontrole (10% (v/v) oplosmiddel in diH2O) en testitems-concentraties toe aan de putten.
    4. Voeg 40 μL microsoom-suspensatie toe aan alle putten. Voeg 50 μL van het vers bereide substraatmengsel toe aan de monsters.
    5. Sluit de plaat af met een ondoordringbaar plastic vel en plaats deze op een shaker in een broedmachine (37 °C bij 850 tpm) gedurende 2 uur; Plaats de plaat na de incubatie op ijs om de reactie te stoppen.
    6. Plaats de plaat na het incuberen op ijs om de reactie te stoppen.
      OPMERKING: De plaat kan op ijs worden bewaard tot de meting om de integriteit van het monster te behouden. De eerste testplaat bevat acht concentraties van het referentie-item, terwijl elke extra plaat op dezelfde dag alleen de hoogste concentratie van het referentie-item bevat, waardoor er meer ruimte overblijft voor extra testitems indien nodig.
  2. Scheiding via ionenuitwisselingshars-gevulde 96-well-filterplaten
    1. Plaats een voorbereide ionenuitwisselingshars-gevulde 96-put filterplaat, zoals bereid in stap 1.5, bovenop een 96-diepe putplaat en voeg 150 μL 10% azijnzuur toe aan elke put van de ionenwisselaar harsgevulde 96-put filterplaat om de hars in de kolommen nat te maken.
    2. Eluteer het azijnzuur door te centrifugeren in de gebruikte 96-diepe putplaat met 100–200 × g in een centrifuge met een uitschuifrotor voor microtiterplaten gedurende 1 minuut.
    3. Vervang de gebruikte 96-diep putplaat door een nieuwe 96-diep putplaat.
    4. Voeg 133 μL 10% azijnzuur toe aan elke put van de geïncubeerde 96-put plaat vanaf stap 2.1.6 en schud de plaat kort om de oplossingen te mengen.
    5. Breng 175 μL van de monsters die in de vorige stap zijn voorbereid over op de ionenwisselaarhars-gevulde 96-put filterplaat, waarbij de initiële plaatindeling behouden blijft.
    6. Laat de monsters door de hars en in de 96-diepe putplaat gaan door te centrifugeren (100–200 × g) in een centrifuge met een uitschuifbare rotor voor microtiterplaten gedurende 1 minuut. Verwijder de ionenwisselaarhars-gevulde 96-put filterplaat.
      OPMERKING: De 96-diepe putplaat met monsters kan worden afgesloten met een ondoordringbaar plastic vel en minimaal 3 maanden bij 4 °C worden bewaard. Dit maakt extra metingen mogelijk in geval van handmatige/technische fouten of veranderingen van de verdunningsfactor in de Sandell-Kolthoff-reactie of meting in de daaropvolgende dagen.
  3. Sandell-Kolthoff-reactie
    1. Afhankelijk van de bepaalde verdunningsfactor van de monsters in 10% azijnzuur voor de gebruikte microsoombatch (zie stap 1.7), voeg 50 μL van het onverdund of passend verdund monster toe aan een nieuwe 96-wellplaat.
    2. Voeg 50 μL 40 mM ceriumoplossing (bereid zoals beschreven in Tabel 1) toe aan alle putten en start de reactie door 50 μL 25 mM arsenietoplossing (bereid zoals beschreven in Tabel 1) aan alle putten toe te voegen.
    3. Meet zo snel mogelijk na toevoeging van de arsenietoplossing de absorptie met een plaatlezer op 415 nm (±2 nm) door elke minuut de optische dichtheid (OD) gedurende 21 minuten op te nemen, evenals de initiële OD.

figure-protocol-3
Figuur 3: Plaatindeling voor parallel testen van twee testitems. 96-put plaatindeling voor het testen van twee testitems in drievoud over meerdere concentraties, samen met replica's van negatieve, positieve, oplosmiddelcontroles en het referentieitem. Gebruikt als de eerste assayplaat van de dag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-4
Figuur 4: Plaatindeling voor parallel testen van drie testitems. 96-put plaatindeling voor het testen van drie testitems in drievoudige vorm over meerdere concentraties, met replica's van negatieve, positieve en oplosmiddelcontroles. Het referentie-item wordt alleen opgenomen in de hoogste concentratie, omdat het volledig wordt getest op de eerste plaat (zie Figuur 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Testen op interferentie (± microsomen en ± DTT)

  1. Bereid de hoogste concentratie (RI C8) van het referentieitem voor (6 PTU) zoals beschreven in stap 1.2 en bereid de voorraadoplossing en verdunningen van het testitem voor (inclusief de hoogste testitemconcentratie).
  2. Bereid de microsoom-suspensie voor op de gedefinieerde concentratie per put (zie stap 1.7) door zorgvuldig ontdooide, gealiquoteerde microsomen in diH2O te verdunnen. Houd de microsoom-suspensie op ijs tot gebruik.
  3. Bereid twee substraatmixen: de standaard substraatmix met DTT zoals beschreven in Tabel 1, en een verder identieke substraatmix zonder DTT (alleen DTT weglaten).
  4. Doseer in de aangewezen putten van een 96-put plaat volgens Figuur 5: 10 μL RI C8, 10 μL van 10% (v/v) DMSO in diH2O (oplosmiddelcontrole), en 10 μL van elke testitemverdunning.
  5. Voeg 40 μL microsoom-suspensie toe aan putten die aangeduid zijn met "met microsomen" en 40 μL diH2O aan putten die aangeduid zijn als "zonder microsomen", volgens Figuur 5.
  6. Voeg op ijs 50 μL substraatmengsel met DTT toe aan de putten aangeduid als "met DTT" en 50 μL substraatmengsel zonder DTT aan de putten aangeduid als "zonder DTT" (Figuur 5).
  7. Sluit de plaat af met een ondoordringbaar plastic vel en incubeer op een shaker in een broedmachine (37 °C, 850 tpm) gedurende 2 uur.
  8. Na de incubatie plaats je de plaat op ijs om de reactie te stoppen.
  9. Voer ionenuitwisselingsscheiding en jodidekwantificatie uit via de SK-reactie zoals beschreven in stappen 2.2 en 2.3, en evalueer de resultaten zoals beschreven in sectie 4.
    OPMERKING: Deze opstelling met één plaat (Figuur 5) test de hoogste concentratie van testitems parallel met versus zonder microsomen en met versus zonder DTT om enzymatische DIO1-activiteit te onderscheiden van assay-artefacten. Een verhoging van de IRA ≥20% in putten zonder microsomen duidt op SK-interferentie (jodideafgifte/-uitlezing onafhankelijk van DIO1), en de stof wordt geclassificeerd als "niet toepasbaar in de DIO1 SK-assay" en uitgesloten van analyse. Verschillen tussen met DTT en zonder DTT helpen DTT-afhankelijke jodideafgifte als een extra interferentiemechanisme te identificeren.

figure-protocol-5
Figuur 5: Plaatindeling voor interferentietesten. Deze figuur toont de 96-put plaatindeling voor interferentietesten, waarbij testitems, referentieitems en oplosmiddelcontrole zowel met als zonder microsomen worden getest in aanwezigheid van DTT en zonder microsomen en zonder DTT. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Data-evaluatie

  1. Evaluatie van DIO1-activiteiten
    1. Bepaal de ΔOD21-minutenwaarden door de 21-minutenwaarden van alle monsters af te trekken van de initiële gemeten (0 min) waarden:
      figure-protocol-6
    2. Bepaal de ΔOD-BG-waarden door het gemiddelde van de ΔOD21min-waarden van de geremde 10 3 M 6-PTU (RI)-controles af te trekken van de ΔOD21min-waarden van alle monsters:
      figure-protocol-7
    3. Normaliseer de waarden van het testitem aan de respectievelijke oplosmiddelcontrolewaarden door te delen van het testitem(en) (TI) ΔOD21min-BG TI-waarden door het gemiddelde van de ΔOD21min -BGSC-waarden van de respectievelijke oplosmiddelcontrole (SC), en genereer jodide release activity (IRA) waarden in %.
      figure-protocol-8
    4. Plot de IRA-waarden van de verschillende concentraties van de testitems in een statistisch softwarepakket, met de IRA-waarden op de y-as (lineair) en de testitemconcentraties op de x-as (logaritmisch).
    5. Gebruik een curve-fit algoritme om een concentratie-responsrelatie te visualiseren (bijv. "[Inhibitor] versus respons -- Variabele helling (vier parameters)" in de statistische software van keuze. "Top" staat voor de maximale respons, "Bottom" voor de laagste respons, en "HillSlope" beschrijft de steilheid van de curve:
      figure-protocol-9
    6. Bepaal de IC50 van het referentiepunt en, indien van toepassing, van het testitem.
    7. Bereken de variantiecoëfficiënt (CV) van de log IC 50-schatting van het referentieitem in %:
      figure-protocol-10
    8. Bereken de IRA van de negatieve regeling genormaliseerd naar de oplosmiddelregeling in %:
      figure-protocol-11
    9. Bereken de IRA van de positieve regeling genormaliseerd naar de oplosmiddelregeling in %:
      figure-protocol-12
    10. Bereken de z'-factor:
      figure-protocol-13
    11. Om de geldigheid van het experiment te controleren, vergelijk de berekende waarden met de acceptatiecriteria in Tabel 4.
      OPMERKING: Aan alle criteria moet voldaan zijn om een geldige assay-run te verkrijgen.
    12. Classificeer de testitems als volledige remmers, gedeeltelijke remmers of niet-remmers op basis van hun maximale remming en IC50-waarden , zoals samengevat in Tabel 5.

Resultaten

Figuur 6 geeft een overzicht van de DIO1-SK assayworkflow en de belangrijkste standaardisatiestappen die nodig zijn om de methode succesvol in een laboratorium vast te stellen. De workflow (Figuur 6A) vat de opeenvolgende fasen van de assay samen, waaronder het gebruik van menselijke levermicrosomen, incubatie met testitems en controles, jodide-extractie via ionenuitwisselingsscheiding, en de colorimetrische jodidekwantificatie met de Sandell–Kolthoff (SK) reactie. Figuur 6B benadrukt de standaardisatiestrategie die ten grondslag ligt aan robuuste prestaties en valide resultaten, waaronder (i) standaardisatie van de SK-reactie, (ii) batch-specifieke microsoomactiviteitstest, (iii) oplosbaarheidsbeoordeling en interferentietesten, (iv) een bereikbepalingsassay, en (v) aanpassing van testitemconcentraties op basis van de eerste geldige assay-uitvoering.

Een centraal element van deze strategie is batch-specifieke microsomale activiteitstesten, omdat menselijke levermicrosoombatches aanzienlijk kunnen verschillen in hun rT3-dejodinatieactiviteit, waardoor voor elke nieuwe batch een geschikte enzymconcentratie moet worden bepaald vóór routinematige stoftests.

Deze gefaseerde teststrategie is cruciaal voor de implementatie: pas nadat de basisprestaties van de assay (controles, SK-reactiegedrag en microsoomactiviteit) zijn geverifieerd en de assaycondities gestandaardiseerd, kan worden verwacht dat substantietesten valide, interpreteerbare inhibitieprofielen opleveren.

figure-results-1
Figuur 6: DIO1 SK assay workflow en standaardisatiestappen. (A) De workflow illustreert het gebruik van menselijke levermicrosomen, de opstelling van de 96-wellplaat, incubatie met testitems en controles, jodide-extractie en colorimetrische kwantificatie via de SK-reactie. Elke stap wordt opeenvolgend weergegeven om de hoofdfasen van de test te markeren. (B) De standaardisatiestappen omvatten standaardisatie van de Sandell-Kolthoff-reactie, batch-specifieke microsoomactiviteitstesten, oplosbaarheids- en interferentietesten, bereikbepalingstest en aanpassing van testitemconcentraties op basis van de eerste geldige assay-uitvoering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Voortbouwend op het workflow- en standaardisatiekader zoals weergegeven in Figuur 6, illustreert Figuur 7 hoe laboratoria een geschikte microsomale eiwitconcentratie bepalen (en post-ionenuitwisselingsverdunning) om een voldoende dynamisch bereik te bereiken, terwijl een sigmoïdale inhibitierespons voor de referentie-remmer behouden blijft. In Figuur 7A neemt ΔOD21min-BG toe met toenemende microsomale eiwitten en hangt het af van de post-ionenuitwisselingsverdunning (onverdund, 1:2, 1:4). De verdunning die de hoogste ΔOD21min-BG oplevert terwijl een sigmoïdale respons behouden blijft, wordt geselecteerd voor latere experimenten (voorbeeld getoond: 1:2 verdunning). In Figuur 7B worden 6-PTU inhibitiecurves vergeleken over microsomale eiwithoeveelheden om de laagste eiwitconcentratie te identificeren die nog steeds een sigmoïdale curve oplevert (voorbeeld getoond: 5 μg eiwit/put), waardoor gevoeligheid en achtergrond in balans worden gebracht.

Belangrijk is dat deze optimalisatiestap door elk laboratorium moet worden uitgevoerd bij de implementatie van de methode, omdat de vereiste eiwitconcentratie afhangt van de activiteit van de gebruikte microsoombatch, wat batch-specifieke standaardisatie van enzymconcentratie noodzakelijk maakt.

figure-results-2
Figuur 7: Microsomale activiteit en remming door 6-PTU. (A) De grafiek toont de toename in activiteit als het achtergrond (BG)-gecorrigeerde Sandell-Kolthoff-signaal (ΔOD21 min n-BG) met toenemende hoeveelheden microsomaal eiwit per put (log10[μg eiwit/put]), getest bij onverdund, 1:2 en 1:4 verdunningen. De hoogste verdunning met de hoogste ΔOD21 min– BG-waarde, evenals met een sigmoïdale vorm, zal voor toekomstige experimenten worden gebruikt. In dit geval is het de 1:2 verdunning. (B) Concentratie-responscurve van de referentieremmer 6-propyl-2-thiouracil (6-PTU) die jodideafgifteactiviteit (IRA in %) laat zien, uitgezet tegen log10[concentratie (M)] bij verschillende microsomale eiwitbelastingen (5, 7,5 en 10 μg eiwit/put). IRA-waarden worden genormaliseerd naar de oplosmiddelcontrole. Gegevenspunten van beide grafieken vertegenwoordigen het gemiddelde ± SD van drie technische replicaten (putten) per conditie uit één representatieve microsoomactiviteitstest. Krommen werden aangepast door niet-lineaire regressie met behulp van een logistisch model met vier parameters ("variabele helling") (inhibitor versus respons). De kleinste eiwitconcentratie met een sigmoïdale kromme zal voor toekomstige experimenten worden gebruikt; In dit geval 5 μg/put. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Zodra de workflow en standaardisatiestappen (Figuur 6) zijn afgerond en een geschikte microsomale eiwitconcentratie is vastgesteld voor de geselecteerde microsoombatch (Figuur 7), zijn de kernparameters van de assay aanwezig om door te gaan met routinematige stoftesten. In deze fase kunnen testitems samen met de plaatcontroleset (referentieitem, oplosmiddelcontrole en positieve/negatieve controles) worden geëvalueerd in het gestandaardiseerde plaatformaat, wat robuuste normalisatie en consistente interpretatie van inhibitieprofielen mogelijk maakt.

Figuur 8 toont assay-discriminatie op basis van concentratie-responsgedrag bij jodidevrijlatingsactiviteit (IRA). De referentie-remmer 6-PTU (Figuur 8A) toont een concentratieafhankelijke afname van IRA, wat het verwachte sigmodale inhibitieprofiel geeft, zoals verwacht voor assayprestatie-verificatie. Tanninezuur (Figuur 8B) vertoont een remmend profiel dat vergelijkbaar is met de referentieremmer (maximale remming > 90%) onder de getoonde omstandigheden. De drie hoogste concentraties van de teststof vertoonden negatieve IRA-waarden. IRA-waarden <0% weerspiegelen geen biologisch betekenisvolle 'negatieve jodideafgifte', maar ontstaan uit de berekeningsprocedure (achtergrondaftrekking en normalisatie naar de oplosmiddelregeling), die kleine fluctuaties in de oplosmiddelregeling kan voortplanten tot negatieve genormaliseerde waarden. Dienovereenkomstig worden IRA-waarden onder 0% als gelijk aan 0% (basislijn) beschouwd voor de interpretatie van de resultaten. Dibutylftalaat (Figuur 8C) vertoont geen remming (maximaal remming onder 25%) over het geteste concentratiebereik, wat een niet-remmerprofiel vertegenwoordigt. Samen illustreren deze profielen dat de test remmend en niet-remmend gedrag kan onderscheiden onder gestandaardiseerde omstandigheden. Het testsysteem kan ook partiële remmers identificeren, die maximale remmingsniveaus tussen 25% en 90% vertonen (gegevens niet getoond). Meer details over hoe deze worden gecategoriseerd zijn te vinden in Tabel 5.

figure-results-3
Figuur 8: Het dosis-responsgedrag van de DIO1–SK assay onderscheidt remmers van niet-remmers. Dosis-responscurves tonen jodideafgifteactiviteit (IRA in %) uitgezet tegen log10-concentratie (M) voor (A) de referentie-remmer 6-PTU, (B) een representatieve remmer (tanninezuur), en (C) een representatieve niet-remmer (dibutylftalaat). IRA-waarden werden berekend na achtergrondaftrekking en genormaliseerd naar de oplosmiddelcontrole. Symbolen vertegenwoordigen gemiddelde ± SD (n = 3) van één onafhankelijk experiment, elk uitgevoerd met drie technische replicaties (putten) per concentratie. Krommen werden aangepast door niet-lineaire regressie met behulp van een logistisch model met vier parameters ("variabele helling") (inhibitor versus respons). IRA-waarden onder 0% worden beschouwd als gelijkwaardig aan 0% (basislijn) voor de interpretatie van de resultaten. Deze gegevens tonen aan dat de assay een sigmoïdale inhibitieprofiel voor de referentie-remmer oplevert en kan bevestigen of een concentratie-responscurve remmend of niet-remmend is onder gestandaardiseerde omstandigheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Bij een geldige assay-run tonen oplosmiddelcontroles (SC) een duidelijke ΔOD21 minuten signaalafstand van de volledig geïnhibeerde referentieconditie (6-PTU, RI-C8). In een voorbeelddataset (10 onafhankelijke runs) bevatte elke plaat n = 9 technische replica's voor SC en de volledig geïnhibeerde referentie (6-PTU op 10−3 M). Over platen varieerden de plaatgemiddelde SC ΔOD21 minuten waarden van 1,383 tot 1,819 (gemiddelde ± SD: 1,565 ± 0,114), terwijl de plaatgemiddelde ΔOD21 minuten waarden voor de geïnhibeerde 6-PTU-conditie varieerden van 0,258 tot 0,771 (gemiddelde ± SD: 0,473 ± 0,087). De berekening van ΔOD in deze test is gebaseerd op het verschil tussen OD0min en OD21min, en de geldigheid van de assay wordt vaak ondersteund door een z′-factor drempel van >0,5.

Over 10 onafhankelijke assay-runs produceerde 6-PTU een sigmoïdale concentratie-responscurve met IC50-waarden variërend van 1,20E-06 M tot 5,02E-06 M (gemiddelde ± SD: 2,74E-06 M ± 1,13E-06 M). De acceptatiecriteria voor de IC50-waarden in het referentiebereik van 1.00E-06 tot 1.00E-05 zijn gebaseerd op gegevens uit eerdere validatiestudies. De IC50-waarden worden echter aanzienlijk beïnvloed door de specifieke microsoombatch die wordt gebruikt en kunnen aanzienlijke variabiliteit vertonen. Desalniettemin wordt verwacht dat deze variaties binnen dezelfde orde van grootte blijven.

De assaykwaliteit kan worden samengevat met behulp van de z′-factor, die zowel het signaalvenster als de variabiliteit van de controles weerspiegelt. In de beschreven dataset waren zes referentiecurves gekoppeld aan z′-factoren variërend van 0,544 tot 0,774 (gemiddelde ± SD: 0,658 ± 0,062), wat overeenkomt met het veelgebruikte acceptatiedoel van z′ > 0,5.

In de praktijk kunnen suboptimale runs worden geïdentificeerd door afwijkingen in de achtergrond van de assay en/of het niet voldoen aan vooraf gedefinieerde acceptatiecriteria. Zo wordt een hoge achtergrond in de Sandell-Kolthoff-reactie aangegeven wanneer de zuivere diH₂O-blank ΔOD > 0,3 vertoont, wat onderzoek rechtvaardigt (bijvoorbeeld reagentiaverontreiniging of waterkwaliteitsproblemen). Dergelijke achtergrondverhogingen kunnen het dynamisch bereik van de assay verkleinen en de variabiliteit in de controle verhogen, wat bijdraagt aan mislukte acceptatiecriteria, waaronder een z′-factor onder 0,5. Putten die duidelijke technische artefacten vertonen (bijv. neerslag of abnormale verkleuring) worden als uitschieters uitgesloten van de evaluatie. Uitschieters die via boxplot-uitschieters worden vastgesteld, worden ook uitgesloten. Als aan de acceptatiecriteria niet wordt voldaan na het verwijderen van de uitschieters, wordt de assay-run als ongeldig beschouwd en moet deze worden herhaald.

Reagens/bufferInformatie over de voorbereiding
Zure ammoniumceriumoplossing (40 mM (NH4)4Ce(SO4)4*2H2O, 0,5 M H2SO4) (250 mL)Voeg 6,32 g (NH4)4Ce(SO4)4*2H2O en 125 mL diH2O toe aan een volumetrische kolf van 250 mL. Voeg 125 mL 1 M H2SO4 toe om een eindvolume van 250 mL te bereiken. Bewaar tot 6 maanden op kamertemperatuur.
DTT (Aliquots van 1 M)Aliquot is een bereide of geleverde 1 M DTT-oplossing in H2O als 0,5 mL aliquots in 1,5 mL microcentrifugebuizen en opgeslagen bij -20°C gedurende maximaal 6 maanden.
HEPES (50 mM) / EDTA (2,16 mM) buffer (pH 7,0)Voeg met een 250 mL volumetrische kolf 12,5 mL 1 M HEPES-oplossing toe, 201 mg Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) en vul tot 250 mL met diH2O. Bewaar tot 3 maanden op 4°C.
rT3-oplossing ("substraatmixbuizen")Los rT3 op in DMSO tot een uiteindelijke concentratie van 6 mM, aliquot ze in 10 μL porties in 15 mL centrifugebuizen en bewaar ze tot 6 maanden bij -20°C.
Natriumarsenietoplossing (25 mM NaAsO2, 0,8 M NaCl, 0,5 M H2SO4) (250 ml)Voeg 0,81 g NaAsO2, 11,7 g NaCl en 125 ml diH2O toe aan een volumetrische kolf van 250 mL. Voeg 125 mL 1 M H2SO4 toe om een eindvolume van 250 mL te bereiken. Bewaar tot 6 maanden op kamertemperatuur.

Tabel 1: Voorbereiding van buffers en reagentia. Deze tabel beschrijft de voorbereidingsstappen en opslaginstructies voor alle buffers en stockoplossingen die in de DIO1 SK-assay worden gebruikt, waaronder HEPES/EDTA-buffer, DTT, rT3-oplossing, zuur ammoniumceriumoplossing en natriumarsenietoplossing.

Naam van de referentie-itemverdunningReferentie-item verdunningsconcentratie [M]10% DMSO [μL]Referentie-itemEindconcentratie van referentie-item in de assay [M]
RI-C81.00E-0245050 μL van 10-1 M referentie-item voorraadoplossing1.00E-03
RI-C71.00E-0345050 μL RI-C81.00E-04
RI-C61.00E-0445050 μL RI-C71.00E-05
RI-C53.16E-05342158 μL RI-C63.16E-06
RI-C41.00E-0545050 μL RI-C61.00E-06
RI-C33.16E-0645050 μL RI-C53.16E-07
RI-C21.00E-0645050 μL RI-C41.00E-07
RI-C11.00E-0745050 μL RI-C21.00E-08

Tabel 2: Voorbereiding van referentieitemverdunningen. Deze tabel vat de voorbereiding van seriële verdunningen voor het referentieitem (6-PTU) samen, inclusief concentraties, volumes DMSO en de uiteindelijke concentraties die in de assay zijn gebruikt.

Microsoom per put [μg]diH2O [μL]Microsoomverdunning [μL]Eindconcentratie van enzymen in de assay [μg/mL]
2078020 μL 20 mg/mL microsoomvoorraadoplossing200
10400400 μL van 20 μg microsoom per put verdunning100
5400400 μL van 10 μg microsoom per put verdunning50
2.5400400 μL van 5 μg microsoom per putverdunning25
1.25400400 μL van 2,5 μg microsoom per put verdunning12.5
0.68400400 μL van 1,25 μg microsoom per putverdunning6.8

Tabel 3: Bereiding van microsoomverdunningen. Deze tabel geeft het verdunningsschema voor microsomale eiwitten per put, inclusief de benodigde volumes diH₂O en microsoomvoorraadoplossing om de uiteindelijke microsomale eiwitconcentraties voor de assay te bereiken.

AcceptatiecriteriaVoorgestelde cut-off waarde
Numeriek
IC50 van referentiepunt [M]1*10-05 - 1*10-06
CV van log IC50 schatting van referentie-item [%]< 3
IRA negatieve controle [%]80 - 120
IRA positieve controle [%]< 20
z'-factor> 0,5
Binair
Vorm van referentie-item (sigmoidaal?)ja
De uiteindelijke concentratie-responscurve van het referentie-item bestaat uit minimaal zes concentraties uit drie replicatiesja
De uiteindelijke concentratie-responscurve van het testitem bestaat uit minimaal zes concentraties uit drie replicatiesja

Tabel 4: Acceptatiecriteria voor de DIO1 SK-assay. Deze tabel geeft de acceptatiecriteria voor assayvaliditeit weer, zoals IC₅₀-bereik, variatiecoëfficiënt, IRA-waarden voor controles, z'-factor en eisen voor concentratie-responscurves. De acceptatievensters waren afgeleid van eerder gerapporteerde DIO1-SK validatiestudies6, inclusief een reproduceerbaarheidsbeoordeling gebaseerd op vijf onafhankelijke runs die het referentievenster IC₅₀ vormden. In een voorbeelddataset van 10 onafhankelijke runs varieerde de z′-factor prestatie van 0,544 tot 0,774 (gemiddelde ± SD: 0,658 ± 0,062), wat de z′-acceptatiedrempel ondersteunt die hier wordt gebruikt.

Categorie (op werkzaamheid)Subcategorie (naar potentie)RemmingsactiviteitDrempel
Categorie 1: volledige remmerA: Krachtige volledige remmerRemt volledig de DIO1-activiteit bij een concentratie vergelijkbaar met het referentie-item 6-PTUMax. remming groter 90% en IC50 op of onder het hogere bereik van IC50 van 6-PTU
B: Zwakke volledige remmerRemt volledig de activiteit van DIO1 bij hogere concentraties dan het referentie-item 6-PTUMax. remming groter 90% en IC50 boven het hogere IC50-bereik van 6-PTU
Categorie 2: gedeeltelijke remmer-Geen volledige remming, maar wel meer dan negatieve en oplosmiddelcontrole.Max. remming tussen 25% en 90%
Categorie 3: geen remmer-Remt DIO1 niet (hetzelfde als negatieve en oplosmiddelcontrole)Maximale remming onder de 25%

Tabel 5: Classificatie van testitems op basis van de potentie en effectiviteit van de remming van DIO1. Testitems worden ingedeeld in drie effectiviteitsgroepen (volledig, gedeeltelijk of niet-remmer) op basis van hun maximale remming van DIO1-activiteit. Volledige remmers worden verder ondergecategoriseerd naar potentie, afhankelijk van hun IC₅₀ ten opzichte van het referentie-item 6-PTU.

Discussie

De DIO1-SK assay biedt een niet-radioactief, kosteneffectief en schaalbaar alternatief voor traditionele methoden voor het beoordelen van DIO1-activiteit, zoals radio-gelabelde assays of massaspectrometrie. De prevalidatie voor menselijke levermicrosomen en sterke overeenstemming met SPE-LC-MS/MS-metingen van schildklierhormoonniveaus bevestigen de betrouwbaarheid en de regulatoire relevantie, zoals blijkt uit de opname in het OESO-testrichtlijnwerkplan. De eenvoud van de Sandell-Kolthoff (SK) reactie maakt de assay toegankelijk voor laboratoria zonder geavanceerde instrumentatie.

In het huidige protocol zijn verschillende praktische aspecten gespecificeerd in meer detail dan eerder gepubliceerde DIO1-SK-procedures om robuustheid en reproduceerbaarheid in een routinematig 96-well-formaat verder te ondersteunen. Deze verduidelijkingen richten zich op de motivatie achter het controleconcept (oplosmiddel, negatieve en positieve controles), de beslissing om vers voorbereide ionenuitwisselingsharsplaten te gebruiken in plaats van eerder gegoten platen opnieuw te gebruiken, en SK-reactiecondities die de robuustheid van de hantering bij multi-well plaatmetingen verbeteren, terwijl de biologische interpretatie consistent blijft met eerdere standaardisatie 6,7.

Ondanks zijn sterke punten moeten verschillende cruciale stappen worden aangepakt om het jodide dat vrijkomt tijdens de DIO1-gemedieerde omzetting van rT3 naar T2 nauwkeurig te kwantificeren. Dit wordt bereikt via de Sandell-Kolthoff-reactie, die nauwkeurige timing en consistente hantering van reagens vereist om reproduceerbaarheid te waarborgen. De SK-reactie is een snel katalytisch proces waarbij jodide de reductie van geel cerium (IV) tot kleurloos cerium (III) door arseniet versnelt; De kleurverandering is recht evenredig met de jodideconcentratie. Omdat de reactie snel verloopt zodra de arseenoplossing is toegevoegd, is het essentieel dat de meting zonder vertraging wordt gestart. In een plaatformaat met 96 putten kan langzame of inconsistente toevoeging van arseenoplossing aanzienlijke variabiliteit tussen putten veroorzaken. Daarom wordt het gebruik van een multikanaals pipet of een geautomatiseerde dispenser sterk aanbevolen om een uniforme en snelle toevoeging van reagens over alle putten te waarborgen.

Om de vergelijkbaarheid tussen putten en tussen platen te maximaliseren, moet de volgorde van reagenstoevoeging in de SK-reactie consistent worden gehouden met de beschreven workflow: Cerium is aanwezig als het chromogene substraat, en de reactie wordt geïnitieerd door arseniettoevoeging, wat de starttijd bepaalt en daarom snelle, gesynchroniseerde dosering vereist. Alternatieve reagenstoevoegingsorders werden in deze opstelling niet geëvalueerd; daarom wordt het wijzigen van de volgorde niet aanbevolen bij het reproduceren van het protocol. Daarnaast kan de ceriumconcentratie invloed hebben op de praktische prestatiekenmerken van de SK-uitlezing (bijv. signaalvenster en robuustheid). Hoewel 25 mM cerium tijdens eerdere assay-standaardisatie als een gevalideerde standaardconditie werd gedefinieerd, bleken hogere concentraties zoals 40 mM het signaalvenster en de z′-factor te vergroten zonder de IC50-waarden of biologische interpretatie te beïnvloeden, zoals reeds beschreven in eerder werk6. In dit protocol wordt 40 mM cerium gebruikt om volledige en snelle jodidecomplexisatie onder de assayomstandigheden te waarborgen en om robuustheid en signaalstabiliteit bij routinematige plaatmetingen te verbeteren. De acceptatiecriteria (bijv. z′-factor, IC50-waarden van de referentieremmer) zijn gebaseerd op historische prestaties waargenomen in eerdere validatiestudies en zijn bedoeld als een routinematige assay-prestatiecontrole.

Het gebruik van menselijke levermicrosomen introduceert biologische variabiliteit, waardoor de standaardisatie van microsoombatch-specifieke jodide-afgifte essentieel is. Zorgvuldige voorbereiding van ionenwisselaars-harsgevulde filterplaten is noodzakelijk om ongelijkmatige harsverdeling over de filterplaat te voorkomen en om volledige scheiding van jodide van mogelijk storende stoffen te waarborgen. Met betrekking tot de harsworkflow werd gekozen voor vers gegoten ionenwisselaars gevulde harsfilterplaten om het potentiële risico op extra variabiliteit door harsverzadiging, jodide- of eiwitoverdracht en mogelijk verlies van bindingsefficiëntie bij hergebruik te minimaliseren. Hergebruik van hars- en filterplaten is technisch mogelijk, maar kan enkele risico's met zich meebrengen die in deze studie niet systematisch zijn geëvalueerd. Het kan batch-tot-batch drift veroorzaken als de bindingscapaciteit van hars wordt verminderd of als resterende matrixcomponenten na eerdere runs in het harsbed achterblijven. Voor laboratoria die recycling overwegen, is een pragmatische aanbeveling om de prestaties van hars na hergebruik te valideren (bijvoorbeeld door achtergrond- en standaardcurvegedrag te monitoren en consistente jodidevangst te waarborgen) en hergebruik te stoppen als er meer achtergrond, verminderd dynamisch bereik of inconsistente scheiding wordt waargenomen. Het wordt aanbevolen om harsgevulde filterplaten voor eenmalig gebruik te gebruiken, aangezien dit protocol specifiek is ontwikkeld op basis van die methodologie.

Daarnaast moet de oplosbaarheid van elk testitem worden bepaald in een geschikt voertuig, aangezien de maximale geteste concentratie wordt beperkt door oplosbaarheid (meestal tot 1 mM met 1% DMSO). Omdat alle testverbindingen in DMSO als oplosmiddel worden toegepast, definieert de oplosmiddelcontrole de basisactiviteit van DIO1 onder assay-relevante omstandigheden en dient als de meest geschikte referentievoorwaarde voor normalisatie en vergelijking. Daarentegen werd 1-thio-β-D-glucose natriumzout als negatieve controle opgenomen omdat het structureel vergelijkbaar is met de positieve controle aurothioglucose (ATG), maar chemisch inert ten opzichte van jodothyroninedejodinatie en niet interfereert met microsomale redoxsystemen of DIO1-katalytische activiteit. De opname ervan helpt echte DIO1-specifieke effecten te onderscheiden van niet-specifieke effecten met betrekking tot toevoeging, behandeling of assaymatrixinteracties. Een controle zonder behandeling/zonder voertuig werd niet als primaire referentievoorwaarde gebruikt omdat deze niet de daadwerkelijke assayomgeving weerspiegelde waarin DMSO aanwezig is in alle met compound behandelde putten; Daarom is de oplosmiddelcontrole de relevante basislijn voor de interpretatie van de assay.

Troubleshooting richt zich op het identificeren van interferenties in de SK-reactie. Jodiumhoudende, chelaterende of sterk oxiderende stoffen kunnen kunstmatig de colorimetrische uitlezingbeïnvloeden 14,17,18. Om dit aan te pakken, omvat het protocol interferentietesten zonder microsomen. Bovendien kan het gebruik van dithiothreitol (DTT) als cofactor ook leiden tot de afgifte van niet-enzymatische jodiden uit bepaalde teststoffen. In dergelijke gevallen worden orthogonale methoden zoals SPE-LC-MS/MS aanbevolen om de remming van DIO1 te bevestigen. Niet-specifieke interferentie via algemene denatureringseffecten (bijv. oppervlakteactieve stoffen) kan vals-positieven opleveren, dus een algemene strategie om frequente aanvallers te identificeren, met behulp van in silico-instrumenten of geïntegreerde testmethoden, kan waardevol zijn.

De test kent verschillende beperkingen. Het is gevoelig voor interferentie door teststoffen die reageren met assaycomponenten of jodide vrijgeven onafhankelijk van DIO1-activiteit. De test maakt geen onderscheid tussen specifieke inhibitie van DIO1 en onspecifieke interferentie met enzymfunctie of structurele integriteit. Om de specificiteit te verbeteren, kan remming van extra microsomale enzymen parallel worden geanalyseerd, en het vergelijken van remmende potenties tussen verschillende enzymassays kan verder bewijs leveren.

Een verdere strategie om mogelijke artefacten te identificeren is het opnemen van integriteits- of levensvatbaarheidstesten, zoals vaak uitgevoerd bij celgebaseerde, in vitro assays, om de maximale testconcentratie te bepalen. Hoewel een directe integriteitstest ontbreekt voor de DIO1-SK assay, maakt het gebruik ervan binnen een in vitro testbatterij integratie van cytotoxiciteitsgegevens uit andere celgebaseerde assays mogelijk om concentratiekeuze te ondersteunen. Als dergelijke kruisassay-informatie niet beschikbaar is, wordt de bovenste concentratie in de DIO1-SK assay beperkt door oplosbaarheid, die mogelijk geen relevante in vivo blootstellingen weerspiegelt. Toxicokinetische benaderingen kunnen echter worden gebruikt om in vitro testconcentraties beter te definiëren en te interpreteren.

De DIO1-SK assay is bijzonder waardevol voor toxicologische screening en mechanistische studies van endocriene verstoring. Het behandelt een belangrijk onderdeel van de homeostase van schildklierhormoon en kan worden geïntegreerd in in vitro testbatterijen. De robuustheid, reproduceerbaarheid en aanpassingsvermogen aan verschillende laboratoriumomgevingen en doorvoerbehoeften maken het tot een waardevol instrument voor chemische veiligheidsbeoordeling en regelgevende validatie. De assay biedt een robuuste in vitro meting van DIO1-inhibitie onder gestandaardiseerde omstandigheden en ondersteunt classificatie van teststoffen ten opzichte van een goed gekarakteriseerde referentie-inhibitor (6-PTU). Echter, in vivo gegevens over DIO1-remming zijn schaars, en directe correlatie tussen in vitro DIO1-remmingsuitkomsten en in vivo-effecten is daarom momenteel niet toepasbaar voor het schatten van de voorspelbaarheid in vivo. Dan ook moeten assayresultaten worden geïnterpreteerd als mechanistisch bewijs voor interferentie met één belangrijke gebeurtenis in het metabolisme van schildklierhormoon en geïntegreerd met aanvullende bewijzenlijnen (bijv. andere schildklier-MoA-assays en orthogonale metingen waar nodig). Belangrijk is dat de DIO1–SK-assay is geëvalueerd in meerdere validatiegerichte studies (optimalisatie/standaardisatie, voorspellingsbeoordeling en robuustheid/nauwkeurigheidsanalyse)6,7,15, en naarmate de methode vordert richting OESO-implementatie, biedt het huidige artikel een niveau van stapsgewijze procedurele details die bedoeld zijn om overdracht en consistente implementatie tussen aanvullende laboratoria te vergemakkelijken.

Openbaarmakingen

De auteurs K.S., N.H, D.F.-W. en R.L. zijn werknemers van BASF SE, een chemisch bedrijf dat in de toekomst mogelijk de DIO1-assay gebruikt om commerciële producten te ontwikkelen en te registreren.

Dankbetuigingen

De auteurs willen Dr. Andreas Weber bedanken voor zijn werk tijdens de eerste oprichting van de DIO1-SK assay.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1-Thio-β-D-glucose sodium saltSigma-AldrichT6375-1GCAS 10593-29-0
3,3’,5’-triiodothyronine (rT3) Santa Cruz Biotechnologysc-209692CAS 5817-39-0
6-Propyl-2-thiouracil (6PTU)SupelcoP3755-10GCAS 51-52-5
AzijnzuurThermo Fisher9526-33CAS 64-19-7
Analytische weegschaalNANAin staat om nauwkeurig te wegen tot 30 g met 0,1 mg leesbaarheid
Arseen natriumoxide (NaAsO2)Thermo Fisher041533.APCAS 7784-46-5
Testplaten (96-well formaat)MerckZ707902-108EAbijv. weefselkweek platen, 96-well plate, platte bodem, polystyreen, 0,34 cm2, steriele, 108/cs, TPP
Aurothioglucose (ATG)Sigma-AldrichA0606-5MGCAS 12192-57-3
Centrifugebuizen 15 en 50 mLMerckZ707724-800EA, Z707716-320EAbijv. TPP centrifugebuizen, volume 15 en 50 mL, polypropyleen, 
Centrifuge met uitklapbare rotor voor microtiter platenNANAMoet hoog genoeg zijn om een 96-deep well plate met 96-well filter plate erop te passen (minstens ongeveer 6 cm hoog)
Cerium (IV) ammoniumsulfaat (Ce(NH4)4(SO4)4)Sigma-Aldrich22269-100G-FCAS 10378-47-9
CO2 IncubatorNANAin staat om temperaturen van 37°C, 5% CO2 en ≥90% luchtvochtigheid te handhaven
Deep well platen (96-well formaat)Supelco575653-Ubijv. SPE 96-Deep Square Well Collection Plate, well volume 2 mL, polypropyleen
Dimethylsulfoxide (DMSO)AppliChemA3672,0250CAS 67-68-5
Dithiothreitol (DTT)Sigma-AldrichD9779-1GCAS 3483-12-3
Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) Sigma-AldrichAPO456787707-500GCAS 6381-92-6
Filter platen (96-well formaat)MerckWHA77002810bijv. Micro-Plates, 96-well, helder polystyreen, 800 µL, DNA Binding, Whatman
Gasdicht afdichtende platenThermo Fisher232698bijv. Afdichtingstape, polyester, steriele, Sealing tape, polyester, steriele, Nunc
HEPESPan BiotechP05-01100CAS 7365-45-9
Menselijke lever microsomenBiovitX008070bijv. INVITROCYP 150-Donor Pooled Human Liver Liver Microsomes
Jodide (IC standaard)Supelco41271-100MLbijv. Jodide standaard voor IC, 1000 mg/L in water, Sigma-Aldrich
Ionenwisselaarhars zoals Dowex 50WX2Roth334.4CAS 12612-37-2; Mesh 100-200
Microcentrifugebuizen 1,5 mLMerckEP0030120086-1PAKbijv. Eppendorf® Safe-Lock microcentrifugebuizen, volume 1,5 mL, natuurlijk
Multikanaals dispenser in staat om 50 tot 300 µL per stap te leverenNANANA
Multikanaals pipet in staat om 10 tot 100 µL per stap te leverenNANANA
pH meter met elektrode en kalibratie buffersNANAin staat om +/- 0,1 pH eenheden te lezen
Fotometer voor absorptiemetingTecan Trading AGNAbijv. Sunrise Absorbance Reader, INSTSUN-3
Pipetten in staat om 1 tot 10 µL te leverenNANANA
Pipetten in staat om 10 tot 100 µL te leverenNANANA
Pipetten in staat om 100 tot 1000 µL te leverenNANANA
Pipetten voor hogere volumesNANAserologische pipetten, bijv. 10, 25, 50 mL
Plate shakerThermo FisherNAbijv. Thermo Scientific H+P MONOSHAKE VORTEXER microtiter plate, direct bediend
RepeaterpipetNANANA
Natriumchloride (NaCl)Sigma-AldrichS9888-25GCAS: 7647-14-5, bijv. natriumchloride, ACS reagent, ≥99,0 %
Statistiek softwareNANAIn staat om regressieanalyse uit te voeren die de testkenmerken weerspiegelen en in staat om remmingsconcentraties te berekenen, bijv. GraphPad Prims 8, GraphPad
Zwavelzuur (H2SO4) Supelco1007311000CAS 7664-93-9
Volumetrische kolfNANAgecertificeerd met gedefinieerd volume

Referenties

  1. Kabir, E. R., Rahman, M. S., Rahman, I. A review on endocrine disruptors and their possible impacts on human health. Environ Toxicol Pharmacol. 40 (1), 241-258 (2015).
  2. Yue, B., et al. Human exposure to a mixture of endocrine disruptors and serum levels of thyroid hormones: a cross-sectional study. J Environ Sci. 125, 641-649 (2023).
  3. Köhrle, J. The deiodinase family: selenoenzymes regulating thyroid hormone availability and action. Cell Mol Life Sci. 57 (13), 1853-1863 (2000).
  4. Zhang, J., Lazar, M. A. The mechanism of action of thyroid hormones. Annu Rev Physiol. 62 (1), 439-466 (2000).
  5. França, M. M., et al. Human type 1 iodothyronine deiodinase (DIO1) mutations cause abnormal thyroid hormone metabolism. Thyroid. 31 (2), 202-207 (2020).
  6. Weber, A. G., et al. Assessment of the predictivity of the DIO1-SK assay to investigate DIO1 inhibition in human liver microsomes. Appl Vitro Toxicol. 9 (2), 44-59 (2023).
  7. Weber, A. G., et al. A new approach method to study thyroid hormone disruption: optimization and standardization of an assay to assess the inhibition of DIO1 enzyme in human liver microsomes. Appl Vitro Toxicol. 8 (3), 67-82 (2022).
  8. Renko, K., Hoefig, C. S., Hiller, F., Schomburg, L., Köhrle, J. Identification of iopanoic acid as substrate of type 1 deiodinase by a novel nonradioactive iodide-release assay. Endocrinology. 153 (5), 2506-2513 (2012).
  9. Renko, K., et al. An improved nonradioactive screening method identifies genistein and xanthohumol as potent inhibitors of iodothyronine deiodinases. Thyroid. 25 (8), 962-968 (2015).
  10. Olker, J. H., et al. Screening the ToxCast phase 1, phase 2, and e1k chemical libraries for inhibitors of iodothyronine deiodinases. Toxicol Sci. 168 (2), 430-442 (2019).
  11. Sane, R., et al. Identification and characterization of highly potent and isoenzyme-selective inhibitors of deiodinase type I via a nonradioactive high-throughput screening method. Thyroid. 35 (5), 576-589 (2025).
  12. Visser, T. J., Van Overmeeren, E. Binding of radioiodinated propylthiouracil to rat liver microsomal fractions: stimulation by substrates for iodothyronine 5′-deiodinase. Biochem J. 183 (1), 167-169 (1979).
  13. Hindrichs, C., et al. A novel and fast online SPE-LC-MS/MS method to quantify thyroid hormone metabolites in rat plasma. Chem Res Toxicol. 37 (1), 33-41 (2024).
  14. Kolthoff, I. M., Sandell, E. B., Lingane, J. J. A modified persulfate-arsenite method for manganese. Anal Chem. 8 (1), 73-73 (1936).
  15. Stefanidis, K., et al. Assessment of the robustness and accuracy of the deiodinase 1 Sandell–Kolthoff assay: a comparative analysis. Appl Vitro Toxicol. 10 (4), 80-90 (2024).
  16. Satya, S., et al. Guidance document on standardised test guidelines for evaluating chemicals for endocrine disruption. OECD Environ Health Saf Publ. 150, (2012).
  17. Joseph, O., Eberle, M., Lieberman, M. Metabolites in urine that interfere with the Sandell–Kolthoff assay for urinary iodine. Biol Trace Elem Res. 202 (2), 466-472 (2024).
  18. May, W., Wu, D., Eastman, C., Bourdoux, P., Maberly, G. Evaluation of automated urinary iodine methods: problems of interfering substances identified. Clin Chem. 36 (6), 865-869 (1990).

Herprints en machtigingen

Tags

Colorimetrische assayjodidevrijgavehomeostase van schildklierhormonenmechanistische toxicologiescreening van enzymremmingplaatlezerionenwisselingshars
Colorimetrische beoordeling van deiodinase 1-activiteit in menselijke levermicrosomen met behulp van de Sandell-Kolthoff-reactie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.