Methodenartikel

Isolatie en identificatie van primaire fibroblastachtige synoviale cellen van patiënten met reumatoïde artritis

533 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70116

⸱

24 februari 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate School, Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of TCM Rheumatology, China-Japan Friendship Hospital, 3Beijing Key Lab for Immune-Mediated Inflammatory Diseases, China-Japan Friendship Hospital

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de methode voor het isoleren en identificeren van hoogzuivere primaire fibroblastachtige synoviocyten (FLS) uit synoviaal weefsel van patiënten met reumatoïde artritis voor betrouwbare ziektemodellering en geneesmiddelscreening.

Samenvatting

Reumatoïde artritis (RA) is een chronische auto-immuun ontstekingsziekte die wordt gekenmerkt door synoviale hyperplasie en progressieve gewrichtsvernietiging als primaire pathologische eigenschap. Fibroblast-achtige synoviocyten (FLS) worden erkend als cruciale cellulaire componenten in de RA-pathogenese, gekenmerkt door hun agressieve, tumorachtige gedrag, dat kraakbeen en bot afbreekt. De isolatie en zuivering van reumatoïde artritis fibroblast-achtige synoviocyten (RA-FLS) is een cruciaal instrument voor het onderzoeken van ziektemechanismen en het evalueren van potentiële therapeutische geneesmiddelen. Hier presenteren we een uitgebreid protocol voor het isoleren, cultiveren en functioneel valideren van primaire menselijke RA-FLS uit geremde synoviaale weefselmonsters die zijn verkregen tijdens knieprotheseoperaties bij RA-patiënten. Deze methode maakt gebruik van vers synoviaal weefsel en maakt gebruik van een sequentieel enzymatisch verteringsproces met trypsine en collagenase type II om de isolatie van RA-FLS uit de weefselmatrix te maximaliseren. Ten slotte wordt celidentificatie bereikt door Vimentine-immunofluorescentie en flowcytometrie, aangevuld met functionele beoordeling van door TNF-α geïnduceerde proliferatie. Dit protocol maakt het mogelijk om RA-FLS-culturen met hoge zuiverheid te verkrijgen met specifieke fenotypische kenmerken en ontstekingsgevoeligheid, waardoor onderzoekers een betrouwbare methode hebben om kortdurend gekweekte, patiëntafgeleide RA-FLS te verkrijgen die geschikt is voor geneesmiddelenscreening, mechanistische studies en toepassingen van weefseltechnologie.

Inleiding

Reumatoïde artritis (RA) is een chronische auto-immuun ontstekingsziekte die wordt gekenmerkt door symmetrische polyartritis van perifere gewrichten, met een geschatte wereldwijde prevalentie van 0,5%-1% en het potentieel om diverse systemische en extra-articulaire complicaties te veroorzaken 1,2,3,4,5. Het kernpathologische kenmerk van RA is chronische synovitis die wordt gemedieerd door auto-immuunreacties, wat verder leidt tot de vorming van invasief pannusweefsel dat het gewrichtskraakbeen en het subchondrale boterodeert. Onder deze aandoeningen is synovitis het vroegste en meest centrale pathologische kenmerk van RA. Fibroblast-achtige synoviocyten (FLS), die de overheersende residente cellen van het synovium vormen, zijn cruciaal in het orkestreren van zowel synoviale ontsteking als botdestructie 8,9. Tijdens de synoviale ontstekingsrespons bij RA verliezen reumatoïde artritis Fibroblast-achtige synoviocyten (RA-FLS) hun normale "regulerende" fenotype en vertonen in plaats daarvan een "pro-inflammatoir" profiel10. Deze verschuiving leidt tot de massale productie van inflammatoire cytokinen, die gerelateerde energiemetabole routes kunnen activeren, wat leidt tot een verhoogde celproliferatie en het synoviale inflammatoire cascade 11,12,13 verder versterkt. Tegelijkertijd werkt RA-FLS samen met andere immuuncellen (zoals macrofagen, T-cellen en B-cellen) om een aanhoudende chronische ontstekingstoestand14,15 in stand te houden. Bovendien vertonen RA-FLS kankerachtige kenmerken, waaronder een verhoogde migratiecapaciteit, invasieve invasie, ongecontroleerde proliferatie en weerstand tegen apoptose, en zijn ze actief betrokken bij de processen van kraakbeen en boterosie16.

In de afgelopen jaren is FLS veelvuldig gebruikt als in vitro modellen voor het bestuderen van gewrichtsontstekingsziekten zoals RA, een trend die mede wordt veroorzaakt door de beperkingen van huidige eerstelijns farmacotherapieën. Ze worden ingezet in 2D-culturen, 3D-modellen en orgaan-op-een-chip-systemen om ziektemechanismen te onderzoeken, therapeutische doelen te valideren en drugsscreening uit te voeren 20,21,22,23. Bovendien dienen RAFLS als basis voor geavanceerde toepassingen, waaronder patiëntafgeleide synoviale organoïden voor het voorspellen van de DMARD-respons; genetische bewerking via CRISPR/Cas9 om genfunctie bij RA-progressie te bestuderen; en als celbron voor het ontwerpen van functionele synoviale weefseltransplantaten 24,25,26.

Het verkrijgen van kortdurend gekweekte RA-FLS uit het synoviaal weefsel van patiënten met reumatoïde artritis dient als de eerste stap voor veel experimenten. In vergelijking met FLS-cellijnen behouden kortdurend gekweekte, door patiënten afgeleide RA-FLS interpatiënt heterogeniteit en ziektespecifieke kenmerken, waardoor een authentiekere representatie van ziektegerelateerde transcriptiefactoren en pathway-regulatorische verschillen mogelijk is. Bijgevolg kunnen celopbrengst, groeisnelheid en functionele prestaties worden beïnvloed door patiëntspecifieke factoren zoals leeftijd, ziekteduur, medicatiegeschiedenis en ziekteactiviteit, wat leidt tot een zekere mate van variabiliteit tussen batches. Onderzoekers moeten daarom de klinische achtergrond van de weefselbron evalueren voordat ze het gebruiken en experimenten uitvoeren binnen vroege passages (P3-P7) om de fenotypische stabiliteit van de cellen te behouden.

Deze studie beschrijft een gestroomlijnd protocol voor het extraheren en identificeren van RA-FLS uit kniesynoviaal weefsel. De methode maakt gebruik van sequentiële enzymatische vertering (trypsine gevolgd door type II collagenase) gecombineerd met zachte mechanische dissociatie. Bewijs suggereert dat dergelijke geoptimaliseerde, meerstaps enzymatische strategieën doorgaans beter presteren dan behandelingen met één enzym of niet-sequentiële gemengde enzymen, wat de cellevensvatbaarheid en fenotype 27,28,29,30 kan aantasten. Ter vergelijking: het gepresenteerde protocol maakt efficiëntere en zachtere isolatie van RA-FLS met hoge levensvatbaarheid en hoge zuiverheid mogelijk, waardoor cellulaire schade en fenotypisch verlies worden geminimaliseerd om geschiktheid voor latere functionele assays te waarborgen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Deze studie verzamelde synoviaal weefsel van patiënten met reumatoïde artritis die een gewrichtsvervangingsoperatie ondergingen in het China-Japan Friendship Hospital. Alle patiënten gaven schriftelijke, geïnformeerde toestemming voorafgaand aan de operatie. De verzamelde informatie en biologische monsters werden behandeld met strikte maatregelen om de privacy en gegevensbeveiliging van de patiënt te waarborgen. Alle resterende monsters van synoviaal weefsel werden afgevoerd volgens de bioveiligheidsvoorschriften. Het gebruik van synoviaal weefsel van het kniegewricht van patiënten met reumatoïde artritis in deze studie werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van het China-Japan Friendship Hospital (goedkeuringsnummer: 2025-KY-223). De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Acquisitie en voorbereiding van synoviaal weefsel

OPMERKING: Plaats het tijdens de operatie verkregen synoviale weefsel in een steriele container gevuld met 0,9% zoutoplossing of PBS om besmetting tijdens de overdracht van de operatiekamer naar de bioveiligheidskast te voorkomen. Gebruik ethanolonderdompeling gevolgd door wassen met een penicilline-streptomycineoplossing als cruciale stappen om bacteriële of schimmelinfectie te voorkomen, zodat het succes van latere experimenten wordt gegarandeerd.

  1. Dompel vers synoviaal weefsel onder in een 50 mL centrifugebuis met PBS en breng deze over in een bioveiligheidskast.
  2. Breng het synoviale weefsel over in een petrischaal met 75% ethanol en dompel het 30 seconden onder voor desinfectie.
  3. Verwijder vet- en botweefsel uit het synoviale weefsel met behulp van steriele chirurgische schaar en pincet, en breng het resterende weefsel vervolgens over in een nieuwe kweekschaal.
  4. Was het verkregen synoviale weefsel drie keer met PBS dat 10% penicilline/streptomycine bevat.

2. Vertering van synoviaal weefsel

OPMERKING: Gebruik trypsine om celverbindingen en de extracellulaire matrix binnen het synoviaal weefsel te verstoren voor latere isolatie. Pas type II collagenase toe om selectief de structuur van de extracellulaire matrix af te breken, waardoor celdissociatie van de matrix mogelijk wordt. Steriliseer alle chirurgische schaar, pincetten en celstrainers die nodig zijn voor het dissectie van synoviaal weefsel door autoclaving vóór gebruik. Na de vertering zouden de weefselfragmenten losgemaakt moeten lijken, met rafelige randen, en kan het medium licht troebel worden. Onverteerd weefsel blijft compact en ondoorzichtig.

  1. Snijd het weefsel herhaaldelijk met een schaar in fragmenten van 1 mm × 1 mm.
  2. Voeg 0,25% trypsine toe aan het weefsel en verteert het bij 37 °C in een shaker met constante temperatuur (bij 100-150 rpm) of in een celincubator gedurende 30 minuten.
  3. Bereid een 10% foetaal rundserum (FBS) oplossing voor met fosfaatgepufferde zoutoplossing (PBS).
  4. Breng het weefsel over in 15 mL of 50 mL centrifugebuizen afhankelijk van de hoeveelheid weefsel, neutraliseer en verteert het met PBS dat 10% foetaal rundserum bevat (FBS).
  5. Centrifugeer (4 °C, 500 × g, 5 min), gooi vervolgens het supernatant weg en bewaar de pellet.
  6. Suss de pellet opnieuw in PBS.
  7. Centrifugeer (4 °C, 500 × g, 5 min), gooi vervolgens het supernatant weg en houd de pellet vast.
  8. Voeg 100 mg type II collagenase toe aan 50 mL DMEM-medium om een 2 mg/mL type II collagenase-oplossing te bereiden.
  9. Filter de bereide type II collagenase-oplossing door een membraan van 0,22 μm voor sterilisatie.
  10. Voeg 2 mg/mL type II collagenase toe en verteert het in een 37 °C constante temperatuur shaker (bij 100-150 rpm) of celincubator gedurende 4 uur.

3. Isolatie en kweek van fibroblast-achtige synoviocyten

OPMERKING: Voer alle celkweekprocedures uit op een bioveiligheidskast onder steriele omstandigheden en draag steriele handschoenen om besmetting te voorkomen.

  1. Bereid het volledige DMEM-medium voor door DMEM basaal medium aan te vullen met 10% foetaal rundvleesserum, 100 U/mL penicilline en 100 μg/mL streptomycine.
  2. Plaats een zeef van 100 maas op een steriele petrischaal en giet het verteerde synoviale weefsel en vocht op de zeef.
  3. Breng de celzeef met restweefsel over naar een andere steriele petrischaal.
  4. Maal het resterende weefsel op de zeef met het uiteinde van een 20 mL steriele spuit en zuigerstaaf totdat alleen witte, vezelige resten overblijven en er geen verdere celsuspensie kan worden geproduceerd.
  5. Spoel de zeef af met een passende hoeveelheid volledig DMEM-medium.
  6. Verzamel alle filtraten, centrifugeer (4 °C, 500 × g, 5 min) en gooi het supernatant weg.
  7. Susser de pellet opnieuw in PBS, centrifugeer (4 °C, 500 × g, 5 min) en gooi het supernatant weg.
  8. Suspendeer de cellen opnieuw in een volledig DMEM-medium.
  9. Voer celtelling uit en breng de cellen over in een kweekfles.
  10. Incubeer de fles in een celkweekincubator (37 °C, 5% CO₂).
  11. Vervang het medium na 48 uur.
  12. Verteer de cellen met trypsine en laat de cellen passeren in een verhouding van 1:3 wanneer ze volledig samenkomen.

4. Identificeer RA-FLS met behulp van vimentine immunofluorescentiekleuring

OPMERKING: Verwarm de PBS-oplossing die wordt gebruikt voor celwashing in een waterbad op 37 °C voor. Alle reagensvolumes die in deze sectie zijn gespecificeerd, zijn gestandaardiseerd voor een 48-put plaatformaat. Volumes moeten proportioneel worden geschaald op basis van het groeioppervlak bij gebruik van platen van een ander formaat.

  1. Digesteer cellen met trypsine, sussie de geoogste cellen opnieuw en verdun tot 1 × 104 cellen /L met een volledig DMEM-medium.
  2. Zaad RA-FLS in een 48-wellplaat met 200 μL per put.
  3. Plaats het in een celkweekincubator (37 °C, 5% CO₂) en incubeer 24 uur.
  4. Verwijder het medium en was de cellen drie keer met voorverwarmde PBS.
  5. Voeg 4% paraformaldehyde toe om cellen te fixeren gedurende 10 minuten, gooi het fixatiemiddel weg en was drie keer met PBS.
  6. Bereid 150 μL 0,1% Triton X-100 oplossing voor in PBS per put. Zorg voor volledige menging door vortex of zachte inversie voor gebruik.
  7. Voeg 0,1% Triton X-100 oplossing toe aan de wells en incubeer 10 minuten om de cellen te permeabiliseren.
  8. Gooi de 0,1% Triton X-100 oplossing weg en was drie keer met PBS.
  9. Voeg per put 150 μL diervrije blokkeringsoplossing toe en incubeer op kamertemperatuur gedurende 1 uur.
  10. Gooi de blokkerende oplossing weg. Voeg 150 μL vimentine primaire antilichaamwerkoplossing (verdund 1:200 in antistofverdunning) toe aan elke put.
  11. Incubeer met een primair antilichaam bij 4 °C gedurende de nacht.
  12. Verwijder het primaire antilichaam en spoel de cellen vijf keer met PBS.
  13. Voeg 150 μL Alexa Fluor 488-geconjugeerd anti-konijn IgG secundair antilichaam toe (verdund 1:50 in universele antistofverdunning) per put, en incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur beschermd tegen licht.
  14. Verwijder het secundaire antilichaam en spoel de cellen drie keer met PBS.
  15. Voeg per put één druppel DAPI-bevattend antifade montagemedium toe en droog 10 minuten in het donker.
  16. Observeer en maak beelden met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop uitgerust met een 20× objectief en geschikte filtersets voor DAPI en FITC/GFP.
    OPMERKING: Was cellen met PBS door de holen volledig te vullen met PBS, 5 minuten te incuberen en daarna de PBS te verwijderen. Deze procedure omvat één wascyclus.

5. Kwantificeer RA-FLS en beoordeel zuiverheid met behulp van flowcytometrie

OPMERKING: Gebruik Vimentine en CD90 als positieve markers om RA-FLS te identificeren, terwijl CD68, CD14 en CD11b als negatieve controles worden toegepast om immuuncelbesmetting uit te sluiten. Vimentine dient als een intracellulair-specifiek intermediair filamentproteïne, voornamelijk gelokaliseerd in het cytoplasma van RA-FLS. CD90 functioneert als een kritische oppervlaktemarker die sterk tot expressie komt op RA-FLS, waardoor ze zich onderscheiden van immuuncellen. Hoewel CD68, CD14 en CD11b specifiek tot expressie komen in macrofagen, monocyten en myeloïde cellen, worden ze als negatieve markers gebruikt om immuncellenbesmetting uit te sluiten. Ken fluorochromen toe aan celoppervlaktemarkers op basis van hun bindingsspecificiteit en zorg ervoor dat er geen overlap is in fluorescentiekanalen. In dit experiment delen bijvoorbeeld CD90 en CD68 hetzelfde fluorochroom; Voeg ze daarom niet toe aan dezelfde centrifugebuis. Voeg vóór het incuberen met vimentine-antilichaam fixatie- en permeabilisatiemiddelen toe om het celmembraan te verstoren. Als de flowcytometer voldoende fluorescentiekanalen heeft, kunnen markers zoals CD90 en CD68 aan verschillende kanalen worden toegewezen voor meerkleurige gelijktijdige analyse om de detectie-efficiëntie en informatie-inhoud verder te verbeteren.

  1. Verteer de derde generatie RA-FLS met EDTA-vrije trypsine.
  2. Beëindig de vertering met een volledig DMEM-medium, centrifugeer (4 °C, 500 × g, 5 min) en gooi het supernatant weg.
  3. Sussen de pellet opnieuw in PBS, voer celtelling uit en pas de celconcentratie aan op 1 × 10⁶ cellen/mL met PBS.
  4. Verdeel de cellen over drie centrifugebuizen, waarbij je 200 μL celsuspensie aan elke buis toevoegt.
  5. Voeg CD11b-antilichaam (verdund 1:100 in universeel antilichaamverdunner) toe bij een eindvolume van 100 μL aan buis 1. Vortex om te mengen.
    1. Na 15 minuten incubatie voeg je 1 mL fixatie-/permeabilisatiemiddel toe aan buis 1, vortex om te mengen, en breng je 30 minuten uit te broeden, beschermd tegen licht.
    2. Voeg 1 mL fixatie-/permeabilisatiebuffer toe aan buis 1 om de permeabilisatie te beëindigen, vortex om te mengen, centrifugeer (4 °C, 500 × g, 5 min) en gooi het supernatant weg.
    3. Maak 100 μL vimentine en CD68 antilichaamcocktail (elk verdund 1:100 in universele antistofverdunner), voeg het toe aan buis 1, vortex om te mengen, en incubeer beschermd tegen licht gedurende 30 minuten.
    4. Voeg 1 mL fixatie-/permeabilisatiebuffer toe aan buis 1, vortex om te mengen, centrifugeer (4 °C, 500 × g, 5 min) en gooi het supernatant weg.
    5. Voeg 100 μL Alexa Fluor 488-geconjugeerd anti-konijn IgG secundair antilichaam toe (verdund 1:50 in universele antistofverdunning) aan buis 1. Vortex om te mengen en te broeden, beschermd tegen licht gedurende 30 minuten.
    6. Voeg 1 ml buffer toe aan buis 1, vortex om te mengen, centrifugeer (4 °C, 500 × g, 5 min) en gooi het supernatant weg.
    7. Voeg 300 μL Buffer toe aan buis 1, en vortex om te mengen voor het laadmonster.
  6. Voeg CD90- en CD14-antilichamen toe (elk verdund 1:100 in universele antistofverdunning) aan buis 2 tot een eindvolume van 100 μL. Laat buis 3 zonder antilichamen als negatieve controle.
    1. Na 15 minuten incubatie voeg je 1 mL PBS toe aan buis 2 en 3.
    2. Centrifugebuizen 2 en 3 (4 °C, 500 × g, 5 min), gooien het supernatant weg, voegen 300 μL buffer toe en vortexen om te mengen voor het laadmonster.
  7. Voer flowcytometrie-opnames uit van de voorbereide monsters.
  8. Analyseer de flowcytometriegegevens en voer statistieken uit met compatibele software.

6. Meting van TNF-α-geïnduceerde RA-FLS-proliferatie met behulp van de MTS-assay

  1. Verteer de derde generatie RA-FLS met EDTA-vrije trypsine.
  2. Beëindig de vertering met een volledig DMEM-medium, centrifugeer (4 °C, 500 × g, 5 min) en gooi het supernatant weg.
  3. Suspensie de pellet opnieuw in een volledig DMEM-medium, voer celtelling uit en verdun tot 1 × 10⁵ cellen/L.
  4. Zaad de resuspendeerde cellen in een 96-wellplaat met 100 μL per put.
  5. Incubeer de plaat in een celkweekincubator totdat celadhesie optreedt, en verdeel dan in blanco controle- en interventiegroepen.
  6. Voeg 10 ng/mL TNF-α toe aan de interventiegroep en een gelijke hoeveelheid PBS aan de blanke controlegroep.
  7. Na 24 uur interventie voeg je 10 μL MTS-reagens toe aan elke put en ga je door met incubatie in de celkweekincubator.
  8. Na 1 uur incubatie meet u de absorptie (OD) bij 490 nm met een microplaatlezer.
  9. Bereken de levensvatbaarheid van celproliferatie op basis van de OD-waarde van elke put.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Met het protocol hebben we met succes kortdurend gekweekte, patiëntafgeleide RA-FLS geïsoleerd. Een schematisch diagram van de procedurele workflow wordt geleverd (Figuur 1). Onder lichtmicroscopie vertoonde de RA-FLS een overheersend morfologisch fenotype van spoelvormige en onregelmatige veelhoekige cellen. De cellen vertoonden uitgebreide cytoplasmatische verspreiding met verlengde uitsteeksels. Celgrenzen leken licht onduidelijk in gebieden met cel-tot-c...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol stelt een reproduceerbare methode vast voor de isolatie en kortetermijnkweek van RA-FLS bij RA-patiënten, met succes dat blijkt uit een hoge cellevensvatbaarheid, een karakteristiek fenotype, expressie van specifieke markers en functionele respons op inflammatoire prikkels.

Kritieke stappen en technische overwegingen
De betrouwbaarheid van deze methode hangt af van verschillende kritieke stappen. Ten eerste moet vers synoviaal ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs melden geen belangenconflicten in dit werk en bevestigen dat het gebruik van Figdraw voor het genereren van Figuur 1 voldoet aan de licentievoorwaarden van het platform.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 82074223 en 8207141673) en het sleutelproject op centraal overheidsniveau: De vestiging van duurzaam gebruik van waardevolle Chinese geneesmiddelenbronnen (nr. 2060302).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Alexa Fluor 488-geconjugeerd anti-konijn IgGZhongshan Jingqiao BiotechnologyZF-0511
0,25% Trypsine-EDTA (1X)Gibco25200-072
4% ParaformaldehydeSolarbioP1110
Alexa Flour674 anti-menselijk CD68biolegend562111
Diervrijs Blocking SolutionCell Signaling Technology15019
APC anti-menselijk CD90biolegend559869
BD FACSDiva Software 8.0.2BD Biosciences657925
BD LSRFortessaBD Biosciences647177
BV605 anti-menselijk CD11bbidegend563015
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)PromegaG358A
Collagenase IISolarbioC8150
DAPI-bevattend Fluorescent Mounting MediumZhongshan Jingqiao BiotechnologyZLI-9556
DAPI-bevattend Fluorescent Mounting MediumZhongshan Jingqiao BiotechnologyZLI-9556
Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM), Hoge GlucoseHyCloneSH30022.01
Foetaal bovien serum-Superfine (FBS)Shanghai Zhongqiao Xindan Biotechnology Co., Ltd.ZQ0500
FITC anti-menselijk CD14biolegend325604
PBS, 1× (pH 7,4) Fosfaat Buffered SalineServicebioG4202
Penicilline-Streptomycine Mixtuur Oplossing (Dubbele Antibiotica) 100×Shanghai Zhongqiao Xindan Biotechnology Co., Ltd.CSP006
QuickBlock Universele Eiwit Blocking en Antilichaam Dilutie BufferBeyotimeP0270-500ml
Recombinant Menselijk TNF-αPeprotech300-01A
Transcription Factor Staining BuffeeBioscience00-5523-00
Triton X-100SolarbioT8200
Trypsine Oplossing (EDTA-vrij)Beijing Labgic Technology Co., Ltd.BL526A

Referenties

  1. Di Matteo, A., Bathon, J. M., Emery, P. Rheumatoid arthritis. Lancet. 402 (10416), 2019-2033 (2023).
  2. Uke, P., Maharaj, A., Adebajo, A. A review on the epidemiology of rheumatoid arthritis: An update and trends from current literature. Best Pract Res Clin Rheumatol. 39 (1), 9(2025).
  3. Wu, D., et al. Systemic complications of rheumatoid arthritis: Focus on pathogenesis and treatment. Front Immunol. 13, 13(2022).
  4. Chen, G., Yan, Z., Wang, Y., Tao, Q. Rheumatoid arthritis and fibromyalgia syndrome: A bibliometric and bioinformatics perspective on comorbidity research. J Multidiscip Healthc. 18, 6811-6827 (2025).
  5. Zhao, Y., Chen, G. Y., Fang, M. Research trends of rheumatoid arthritis and depression from 2019 to 2023: A bibliometric analysis. J Multidiscip Healthc. 17, 4465-4474 (2024).
  6. Komatsu, N., Takayanagi, H. Mechanisms of joint destruction in rheumatoid arthritis - immune cell-fibroblast-bone interactions. Nat Rev Rheumatol. 18 (7), 415-429 (2022).
  7. Zhang, Y. Y., Gao, Z. J., Chao, S. S., Lu, W. J., Zhang, P. P. Transdermal delivery of inflammatory factor-regulated drugs for rheumatoid arthritis. Drug Deliv. 29 (1), 1934-1950 (2022).
  8. Bottini, N., Firestein, G. S. Duality of fibroblast-like synoviocytes in RA: Passive responders and imprinted aggressors. Nat Rev Rheumatol. 9 (1), 24-33 (2013).
  9. Smolen, J. S., et al. Rheumatoid arthritis. Nat Rev Dis Primers. 4, 23(2018).
  10. Liu, Y., et al. Regulatory fibroblast-like synoviocytes cell membrane-coated nanoparticles: A novel targeted therapy for rheumatoid arthritis. Adv Sci. 10 (4), 15(2023).
  11. Li, C. L., et al. A transformable nanoplatform precisely positions fibroblast-like synoviocytes via FAP-α for improved rheumatoid arthritis therapy. Adv Healthc Mater. 15 (2), e03277(2026).
  12. Meng, Q. L., Wei, K., Shan, Y. E3 ubiquitin ligase gene BIRC3 modulates TNF-induced cell death pathways and promotes aberrant proliferation in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes. Front Immunol. 15, 10(2024).
  13. Chen, L., et al. AMPK signaling in osteoarthritis: From mechanisms to targeted therapeutics. Front Pharmacol. 16, 1681610(2025).
  14. Bakinowska, E., et al. The role of mesenchymal stromal cells in the treatment of rheumatoid arthritis. Cells. 13 (11), 17(2024).
  15. Filer, A. The fibroblast as a therapeutic target in rheumatoid arthritis. Curr Opin Pharmacol. 13 (3), 413-419 (2013).
  16. Promila, L., et al. Mitochondrial calcium uniporter regulates human fibroblast-like synoviocytes invasion via altering mitochondrial dynamics and dictates rheumatoid arthritis pathogenesis. Free Radic Biol Med. 234, 55-71 (2025).
  17. Wang, X. C., He, J. X., Zhang, Q., He, J., Wang, Q. W. Constructing a 3D co-culture in vitro synovial tissue model for rheumatoid arthritis research. Mater Today Bio. 31, 16(2025).
  18. Shi, R. Y., et al. Monocyte membrane-coated drug nanocrystals for enhanced targeted therapy of rheumatoid arthritis. J Control Release. 384, 14(2025).
  19. Smolen, J. S., et al. EULAR recommendations for the management of rheumatoid arthritis with synthetic and biological disease-modifying antirheumatic drugs: 2019 update. Ann Rheum Dis. 79 (6), 685-699 (2020).
  20. Chen, G. Y., et al. Mechanisms of total glucosides of paeony in alleviating methotrexate-induced liver injury. Drug Des Devel Ther. 19, 3407-3423 (2025).
  21. Philippon, E. M. L., et al. A novel 3D spheroid model of rheumatoid arthritis synovial tissue incorporating fibroblasts, endothelial cells, and macrophages. Front Immunol. 14, 11(2023).
  22. Lin, X., et al. Sesamol serves as a p53 stabilizer to relieve rheumatoid arthritis progression and inhibits the growth of synovial organoids. Phytomedicine. 121, 14(2023).
  23. Lee, M. S., Kim, S., Lee, J. H., Bae, Y. S., Lee, S. K. Synovium-on-a-chip reveals fibroblast-macrophage crosstalk underpinning joint homeostasis and evaluation of gout therapies. Adv Healthc Mater. 14 (18), 16(2025).
  24. Kim, D., et al. 3D in vitro synovial hyperplasia model on polycaprolactone-micropatterned nanofibrous microwells for screening disease-modifying anti-rheumatic drugs. Mater Today Bio. 26, 10(2024).
  25. Murakami, A., et al. Human CD4(+) T cells regulate peripheral immune responses in rheumatoid arthritis via insulin-like growth factor-like family member 2. Sci Immunol. 10 (110), eadr3838(2025).
  26. Yue, S., et al. Unveiling the therapeutic potential: Targeting fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis. Expert Rev Mol Med. 27, e18(2025).
  27. Clister, T., et al. Optimization of tissue digestion methods for characterization of photoaged skin by single-cell RNA sequencing reveals preferential enrichment of T cell subsets. Cells. 13 (3), (2024).
  28. Hu, Z., et al. Novel strategy for primary epithelial cell isolation: Combination of hyaluronidase and collagenase I. Cell Prolif. 56 (1), e13320(2023).
  29. Sueters, J., Schipperheijn, R., Huirne, J., Smit, T., Guler, Z. Reproducibility and consistency of isolation protocols for fibroblasts, smooth muscle cells, and epithelial cells from the human vagina. Cells. 14 (2), 76(2025).
  30. Jiang, D. X., et al. Primary isolation, culture, and phenotypic verification of rat knee articular chondrocytes. J Vis Exp. (225), e69509(2025).
  31. Donlin, L. T., et al. Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue. Arthritis Res Ther. 20 (1), 139(2018).
  32. Zhang, F., et al. Deconstruction of rheumatoid arthritis synovium defines inflammatory subtypes. Nature. 623 (7987), 616(2023).
  33. Li, P. F., et al. Comparative proteomic analysis of polarized human THP-1 and mouse RAW264.7 macrophages. Front Immunol. 12, 13(2021).
  34. Zhu, E. B., et al. Biomimetic cell stimulation with a graphene oxide antigen-presenting platform for developing T cell-based therapies. Nat Nanotechnol. 19 (12), 1914-1922 (2024).
  35. Sato, N., Bamford, R. N., Bryant, B. R., Tagaya, Y., Waldmann, T. A. Accessory cells precondition naive T cells and regulatory T cells for cytokine-mediated proliferation. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (15), 13(2023).
  36. Krishnaswamy, J. K., Alsén, S., Yrlid, U., Eisenbarth, S. C., Williams, A. Determination of T follicular helper cell fate by dendritic cells. Front Immunol. 9, 16(2018).
  37. Ndeupen, S., et al. Langerhans cells and cDC1s play redundant roles in mRNA-LNP-induced protective anti-influenza and anti-SARS-CoV-2 immune responses. PLoS Pathog. 18 (1), 18(2022).
  38. Walsh, M. C., et al. Osteoimmunology: Interplay between the immune system and bone metabolism. Annu Rev Immunol. 24, 33-63 (2006).
  39. Koenderman, L., Tesselaar, K., Vrisekoop, N. Human neutrophil kinetics: A call to revisit old evidence. Trends Immunol. 43 (11), 868-876 (2022).
  40. Montero, R. B., et al. bFGF-containing electrospun gelatin scaffolds with controlled nano-architectural features for directed angiogenesis. Acta Biomater. 8 (5), 1778-1791 (2012).
  41. Yang, C. Y., Yuan, W. W., Liao, G. X., Yu, Q. Q., Wang, L. G. Construction of bFGF/heparin and Fe3O4 nanoparticles functionalized scaffolds aiming at vascular repair and magnetic resonance imaging monitoring. Int J Biol Macromol. 286, 15(2025).
  42. Rim, Y. A., Park, N., Nam, Y., Ju, J. H. Generation of induced-pluripotent stem cells using fibroblast-like synoviocytes isolated from joints of rheumatoid arthritis patients. J Vis Exp. (116), e54072(2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

fibroblast achtige synoviocytencelisolatiesynoviaal weefselenzymatische digestiecollagenase digestieflowcytometrievimentine immunofluorescentieTNF alfastimulatie
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen