Reviewartikel

Methoden om ziektemechanismen bij neuro-ontwikkelingsstoornissen te verduidelijken

DOI:

10.3791/70127

⸱

6 februari 2026

 , 
1Department of Neurology, University of Maryland School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ziekte-modificerende behandelingsopties voor mensen met neuro-ontwikkelingsstoornissen zijn beperkt en er zijn geen genezingen. Om dit aan te pakken, zijn inspanningen nodig om ziektemechanismen en nieuwe therapeutische doelwitten te definiëren. In deze review beschrijven we verschillende technieken die de weg wijzen in deze inspanningen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuro-ontwikkelingsstoornissen (NDD's) treffen wereldwijd 317 miljoen kinderen en jongeren. Hoewel NDD's een diverse groep stoornissen zijn die meerdere orgaansystemen beïnvloeden, zijn epilepsie, autismespectrumstoornis (ASS) en/of verstandelijke beperking (ID) veelvoorkomende uitkomsten. Helaas zijn er weinig ziekte-modificerende therapieën en geen genezingen voor NDD's. Recentelijk zijn echter genbewerking, cellulaire/moleculaire assays en stamcelmodellen naar voren gekomen als veelbelovende technieken om de oorzaken van NDD diepgaand te begrijpen, genetische varianten te categoriseren en menselijke ziekteprocessen preciezer te modelleren. Daarnaast hebben verschillende technieken, met name genbewerking, al klinisch succes gehad. In deze review beschrijven we verschillende nieuwe methoden voor functionele validatie van genetische varianten, stamcelmodellen van NDD's en nieuwe genbewerkingsmethoden. Het begrijpen en toepassen van deze methoden is cruciaal om nieuwe ziektemechanismen en therapeutische doelstellingen voor NDD's te ontdekken, evenals voor het bevorderen van technische benaderingen van de laboratorium naar de kliniek.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuro-ontwikkelingsstoornissen (NDD's) treffen wereldwijd 317 miljoen kinderen en jongeren1. Deze aandoeningen kunnen onder andere cerebrale parese, het fragiele X-syndroom, het Angelman-syndroom en tubereuze sclerosecomplex omvatten. Hoewel NDD's een diverse groep stoornissen zijn die meerdere orgaansystemen beïnvloeden, zijn epilepsie, autismespectrumstoornis (ASS) en/of verstandelijke beperking (ID) veelvoorkomende uitkomsten2. Een studie meldde zelfs dat kinderen in Kenia met epilepsie en cognitieve, zicht-, gehoor- of motorische beperkingen drie tot vier keer zo vaak stierven als degenen in groep1 zonder NDD.

Een paradigmaverschuiving in de studie van NDD's vond plaats met de voltooiing van het Human Genome Project in 2003. Verdere vooruitgang werd geboekt door de polygene risicoscores te definiëren via GWAS, en de karakterisering van "neuroontwikkelingsstoornissen" door de DSM-5 in 20134. Hoewel er aanzienlijke vooruitgang is in het begrijpen van de genetische oorzaken van NDD's, bestaan er weinig gerichte therapieën voor specifieke NDD's, en zijn er geen ziekte-modificerende therapieën voor de ASD en/of ID die ermee geassocieerd zijn.

De genbewerking, elektrofysiologische en cellulaire/moleculaire assays en methoden die in deze review worden beschreven, staan centraal in het NDD-onderzoek. Hoewel we niet alle assays volledig hebben behandeld, vertegenwoordigen deze methoden geavanceerde benaderingen om ziekte-modificerende therapieën te identificeren. Een voorbeeld, deubiquitylerende enzymen (DUB's), is een groep enzymen die ubiquitine uit eiwitten verwijderen. Omdat mutaties binnen DUBs gekoppeld zijn aan NDD's, zou het richten op hun modificatie een potentiële therapie voor NDDs 5,6 kunnen zijn. Verder worden circuit-niveau routes, zoals die met de GABA A-receptorsubunit, en andere channelopathieën onderzocht om ziektemechanismen te definiëren die geassocieerd zijn met epilepsie, ASS en ID7. Een andere opvallende methode, CRISPR/Cas genoombewerking (Figuur 1), is een krachtig hulpmiddel dat wordt gebruikt om het genoom direct te veranderen om nieuwe experimentele modellen te creëren en recentelijk zeldzame genetische aandoeningen te behandelen 8,9,10. De CRISPR-toolkit blijft uitbreiden en vier benaderingen, waaronder CRISPRi (CRISPR Interference/Inhibition), CRISPRa (CRISPR Activation), prime editing en base editing, zijn opgedoken als impactvolle onderzoeks- en klinische innovaties. Tot slot beschrijft dit artikel de vooruitgang in het gebruik van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). iPSC's en cellulaire afleidingen daarvan hebben onderzoekers in staat gesteld veel NDD's nauwkeuriger te modelleren met patiëntafgeleide cellen 9,11,12. Belangrijk is dat de ontwikkeling van organoïden uit iPSC's de studie van het ontwikkelingsproces dat veel NDD's onderbouwt op een manier mogelijk heeft gemaakt die veel relevanter is voor menselijke ziekten dan knaagdiermodellen13,14.

Deze korte review beschrijft en breidt de hierboven geïntroduceerde technieken uit. Daarnaast worden verschillende recente studies besproken waarin deze technieken worden gebruikt om meer inzicht te krijgen in NDD's, hiaten in de huidige literatuur en toekomstige richtingen.

Review en perspectief

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geïnduceerde pluripotente stamcellen en bijbehorende experimentele paradigma's

Geïnduceerde pluripotente stamcellen zijn uitgegroeid tot een krachtig systeem om NDD's te modelleren. Inderdaad, veel ontwikkelingsprocessen vinden plaats in iPSC-modellen die lijken op die waargenomen tijdens de menselijke hersenontwikkeling en die niet voorkomen tijdens de ontwikkeling van de knaagdierenin de hersenen 15. Daarom hebben onderzoekers stamcelmodellen, waaronder 2D-culturen, organoïden en assembloïden, gekoppeld aan andere experimentele methoden om de ziektemechanismen in NDD's 11,13,14,16 beter te begrijpen.

Onlangs werden assembloïden gebruikt om een belangrijk kenmerk van het syndroom van Down (DS) te modelleren - verstoorde neurogenese tijdens de foetale ontwikkeling16. Met zowel DS hiPSC's als isogene euploïde hiPSC's werd neurogenese geïnduceerd, gevolgd door differentiatie naar neuronen. Na 85 dagen werden immunocytochemie en beeldvorming gebruikt om de celcyclus te observeren. Zij observeerden dat DS-neurale voorlopercellen de celcyclus niet verlieten en niet konden differentiëren tot volwassen neuronen, en ontdekten ook dat celcyclusdefecten de neurogene fase veranderen, wat leidt tot een verstoorde neurogenese in DS16.

Hoewel veel stamcelmodellen zich op neuronen hebben gericht, spelen andere celtypen, waaronder gliale cellen, een belangrijke rol in NDD-pathologie17. Een recent rapport richtte zich op de rol van gliogenese en astrocyten bij het fragiele X-syndroom (FXS). Met behulp van hiPSC's werden astrocyten-voorlopercellen gekweekt en gedifferentieerd tot voorhersen-specifieke astrocyten die geen fragiel X-boodschapper ribonucleair eiwit11 hadden. Zij observeerden dat deze astrocyten een ontregelde glycolytische en mitochondriale stofwisseling hadden. Eerder werk van hetzelfde team toonde ook aan dat een juiste mitochondriënfunctie noodzakelijk is om het actiepotentiaal te sturen in neuronen afkomstig van patiënten met FXS11,18. Hoewel er meer werk nodig is om het mechanisme te begrijpen waarmee astrocytenmetabolisme en neuronvuur in FXS worden veranderd, tonen deze studies aan dat astrocyten zowel ziektepathologie kunnen aansturen als een therapeutisch doelwit kunnen zijn.

Genoombewerking

Francisco Mojica legde de basis voor genoombewerking met de ontdekking van CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), een adaptief immuunsysteem voor prokaryoten,begin jaren negentig. Hierop voortbouwend ontwikkelden Jennifer Doudna en Emmanuelle Charpentier een methode genaamd CRISPR/Cas9, waarbij CRISPR gekoppeld is aan Cas9-endonuclease selectief geïsoleerd en veranderd in genen20. Niet lang na de publicatie van de eerste CRISPR/Cas9-genbewerkingsstudies begonnen onderzoekers het CRISPR/Cas-systeem te manipuleren om nieuwe genomische informatie te onthullen of genen op een unieke manier te bewerken. Een nieuwe methode is CRISPRi - een manier om een gen van belang te dempen21,22. Door gebruik te maken van een katalytisch inactieve Cas9-nuclease in combinatie met cr- en tracr-RNA's, wordt de toegang van RNA-polymerase tot de promotor belemmerd, waardoor genexpressie voor een specifiek gen of set genen 22,23 wordt uitgeschakeld. CRISPRi-screenings zijn gebruikt om verschillende risicogenen voor NDD's te identificeren en om de functionele veranderingen die samenhangen met functieverlies in die genen te identificeren. Zo heeft een recente CRISPRi-screen in iPSC-afgeleide assembloïden 425 NDD-genen getest op hun impact op interneuronontwikkeling en aangetoond dat het verlies van verschillende kandidaatgenen de cytoskelet- en endoplasmatische reticulumstructuur24 beïnvloedde. Bovendien toonde een CRISPRi-screen aan dat verlies van ADNP, een ASS-risicogen, resulteerde in veranderingen in microgliale snoei van synapsen25. Zo hebben CRISPRi-screeningen verschillende convergente en divergente ziektemechanismen bij NDD aan het licht gebracht.

Complementair aan CRISPRi is CRISPRa een hulpmiddel dat wordt gebruikt om genexpressie te vergroten. Deze techniek koppelt een katalytisch inactieve Cas9 aan transcriptieactivatoren en wordt gericht op een gids-RNA. CRISPRa is ook gebruikt om te begrijpen hoe activatie van ASD- en NDD-risicogenen ziektefenotypes kan veranderen. Hoewel er weinig studies zijn die CRISPRa gebruiken om NDD-fenotypes te redden, kan CRISPRa een groot therapeutisch potentieel hebben. Zo toonde een recente studie aan dat activatie van ITGB3 (waarvan haploinsufficiëntie geassocieerd is met ASS) de netwerkfunctie en ASD-fenotypes bij knaagdieren redde. Inderdaad, veel NDD-genvarianten veroorzaken ziekte door haploinsufficiëntie, wat de mogelijkheid oproept dat CRISPRa gebruikt kan worden om de expressie van het niet-aangetaste allel op een ziekte-modificerende manier te verhogen.

Basisbewerking en prime bewerking zijn precieze methoden binnen de CRISPR-toolbox om specifieke nucleotiden binnen het genoom te bewerken. Beide splijten een enkele streng DNA in plaats van een dubbelstrengbreuk (DSB) zoals CRISPR/Cas910,26. Hoewel basisbewerking specifieker is dan standaard CRISPR/Cas9-bewerking, is het minder aanpasbaar en daardoor minder relevant voor vertaling dan prime-bewerking. De efficiëntie van basisbewerking ligt in het vermogen om puntmutaties te corrigeren door cytosine in plaats van thymine of adenine in plaats van guanine en omgekeerd10. Hierdoor is basisbewerking beperkt in de soorten mutaties die het kan veroorzaken. Dus, hoewel nuttig, kunnen alleen overgangsmutaties worden uitgevoerd, niet inserties of deleties10. Prime editing is echter een zeer aanpasbare vorm van genoombewerking met veel mogelijke toepassingen. Prime editing maakt gebruik van een prime editing guide RNA (pegRNA) en een Cas9-nickase gekoppeld aan reverse transcriptase, die inserties, deleties of veranderingen in enkele nucleotiden10 kan faciliteren. Helaas kan prime-editing minder efficiënt zijn dan basisbewerking, omdat het technisch complexer is en grotere genveranderingen kan uitvoeren. Daarom kunnen beide als complementaire hulpmiddelen worden gebruikt en zijn ze nuttig bij genomische bewerking voor neuro-ontwikkelingsstoornissen. Prime editing is al ingezet om een patiënt met een zeldzame genetische aandoening te behandelen27 en heeft veelbelovend getoond in het redden van ziektefenotypes in een knaagdiermodel van alternerende hemiplegie in de kindertijd28.

Cellulaire en moleculaire assays

NDD's worden veroorzaakt door genetische varianten die de celfunctie op verschillende manieren beïnvloeden 29,30,31. Een grote uitdaging voor degenen die NDD's bestuderen, is hoe te bepalen of een specifieke patiëntvariant een schadelijke functionele verandering in de cel veroorzaakt. Daarom is er een grote behoefte aan assays die snel en nauwkeurig kunnen bepalen of een specifieke genetische variant ziekteveroorzakend of goedaardig is. Een veelbelovende nieuwe assay is de ubiquitine cleavage assay32. Deuquiquitylerende enzymen (DUB) zijn een groep enzymen die ubiquitine uit eiwitten verwijderen en zo afbraak voorkomen. DUB's zijn zowel mogelijke behandelingen als oorzaken van NDD's. Tot nu toe zijn mutaties in 12 DUB's geïdentificeerd als causaal gelinkt aan NDD's, waaronder het Hao-Fountain-syndroom, pseudo-TORCH-syndroom, microcefalie-capillaire malformatie-syndroom en andere5. Om te bepalen of specifieke patiëntvarianten ziekte veroorzaken, zijn in vitro ubiquitine-splitsingsassays de gouden standaard geworden om de enzymatische activiteit van DUB te meten en mutaties functioneel te valideren. Deze methode kan worden gebruikt om het effect van genvarianten op DUB's te beoordelen. Een recente studie richtte zich op een DUB die gemuteerd is in X-linked intellectuele beperking 105, DUB Ubiquitin Specific Protease 27 (USP27X). De onderzoekers demonstreerden met succes een methode voor de expressie en zuivering van recombinant USP27X en een in vitro ubiquitine-kettingslictingassay. Deze benadering maakt het mogelijk enzymatische activiteit vast te stellen die de eiwitomzet in neuronen reguleert en kan daarom belangrijk zijn bij het begrijpen van mechanismen achter veranderde synaptische snoei, neuro-ontwikkelingskritische periodes en eiwitfunctie32. Opmerkelijk is dat er een gebrek is aan gepubliceerde artikelen over DUB's en hun rol in ziekten, waardoor de volledige toepasbaarheid van deze assay nog niet getest is en open voor verder onderzoek.

Omdat veel NDD's ook als zeldzame aandoeningen worden geclassificeerd, identificeert klinische genetische vaststelling van varianten vaak genveranderingen als 'varianten van onbekende significantie' (VUS) vanwege een gebrek aan eerder gepubliceerde klinische of functionele studies over die varianten 7,33,34. Daarom zijn assays om snel vast te stellen of een VUS pathogeen is cruciaal om de genetische oorzaken van NDD's vast te stellen. Een voorbeeld zijn varianten inGABA-A-receptoren. Genetische varianten in deGABA-A-receptor zijn een belangrijke oorzaak van genetische epilepsie en zijn geassocieerd met veel soorten epileptische aanvallen en ontwikkelings-epileptische encefalopathieën 7,35. Een recente studie onderzocht de subunits van de GABAA-receptor en probeerde vast te stellen of de varianten functionele veranderingen binnen de cel veroorzaakten met een multimodale aanpak. In silico-tests werden gebruikt om VUS te identificeren en pathogene γ2 GABA A-subeenheidvariaties te voorspellen. De moleculaire gevolgen van de varianten werden vervolgens gedefinieerd en omvatten structurele, fysisch-chemische en biofysische markers7. Elk van deze domeinen werd gedefinieerd met behulp van literatuuranalyse, in silico-modellering en patch-clamp elektrofysiologie. Zodra een referentiegebied was geselecteerd, werd piramidale neuronale modellering gebruikt om de effecten van door de GABAA-receptor gemedieerde inhibitie te testen. Zij observeerden dat twee γ subeenheidmutaties (μ3N110D en �3T288N) en twee γ2 subeenheidsmutaties de GABAerge remming7 verstoorden. Dit protocol toont aan dat een multimodale benadering vaak nuttig is bij het bepalen van de pathogeniciteit van VUS. Hoewel deze methode niet hoog-doorvoert, kan deze aanpak ook nuttig zijn voor andere NDD-geassocieerde VU's die geen specifieke test hebben om varianten functioneel te valideren (bijv. DUB's) - vooral als ze geassocieerd zijn met elektrofysiologische veranderingen.

Hoewel het geen nieuwe aanpak is, blijft patch-clamp elektrofysiologie de gouden standaard voor het begrijpen van de elektrische eigenschappen van neuronen, en dus ook hoe genetische veranderingen de basiseigenschappen van neuronen beïnvloeden. Van belang voor NDD's zijn channelopathieën36. Hoewel er veel soorten channelopathieën zijn, zijn varianten in SCN1A goed bestudeerd en zijn ze de primaire oorzaak van het Dravet-syndroom - een bijzonder verwoestende ontwikkelings-epileptische encefalopathie36. Functionele validatie van SCN1A-varianten is bereikt met een combinatorische benadering van geautomatiseerde patch-clamp en in silico-simulaties. Met deze aanpak konden onderzoekers verschillende VU's oplossen en genotype-fenotype correlaties maken op basis van functionele veranderingen in neuronen37. In een aparte studie met een vergelijkbare aanpak werden iPSC-modellen gebruikt met geautomatiseerde patch-clamp elektrofysiologie en in silico-modellen om genvarianten in T-type calciumkanalen38 te classificeren. Met de focus op CACNA1G, een gen dat codeert voor Cav3.1 in verschillende soorten neuronen, werd CACNA1G gemuteerd om 18 varianten van Cav3.1 te maken die vervolgens tijdelijk in neuronen werden getransfecteerd. Hierna werden geautomatiseerde patch-clamp opnames gemaakt, gevolgd door handmatige patch-clamp en computationele benaderingen. Zij observeerden dat geautomatiseerde patch-clamp en handmatige patch-clamp vergelijkbare resultaten opleverden en dat computationele benaderingen in staat waren de functionele veranderingen te bepalen die door specifieke genetische varianten werden geïnduceerd38. Hoewel computationele modellen een relatief snelle manier bieden om de functionele gevolgen van genvarianten te voorspellen, blijven elektrofysiologische benaderingen tijdrovend en vereisen ze zeer gespecialiseerde vaardigheden die het nut van deze benaderingen beperken bij het valideren van grote aantallen varianten.

Multi-elektrode arrays (MEA's) worden gebruikt om elektrische activiteit rond kleine groepen of over grote netwerken van cellen te meten. Deze methode verschilt van patch-clamp elektrofysiologie doordat deze zich richt op meercellige modellen, terwijl patch-clamp gecentreerd is op één kanaal of cel 39,40. Hierdoor kunnen MEA's inzicht geven in hoe verschillende hersengebieden met elkaar interageren en kunnen ze worden gebruikt om ziekten op netwerkschaal te bestuderen. Veel studies hebben MEA's gebruikt om experimentele modellen van epilepsie en ASD 14,39 te onderzoeken. Een belangrijk kenmerk van MEA's is dat ze in staat zijn de manieren te bepalen waarop verschillende typen neuronale cellen met elkaar interageren (bijv. glutamaterge neuronen, GABAerge interneuronen, voorlopers en gliale cellen)14. Dit maakt MEA's een uitstekende methode voor het bestuderen van hersenassembloïden. Een studie, uitgevoerd door Pan et al., gebruikte deze methode om de ontwikkeling van neuronale netwerken te bestuderen. De auteurs gebruikten humane pluripotente stamcellen (hPSC) uit voorhuidfibroblasten14, die eerst viraal werden gelabeld en vervolgens werden gekweekt om assembloïden te genereren. Daarna werden de assembloïden op MEA-platen geplakt en14 geregistreerd. Belangrijk is dat, omdat de assembloïden gestabiliseerd, geregistreerd en ongeveer 50 dagen farmacologische experimenten konden ondergaan, dit paradigma gebruikt kon worden voor het analyseren van therapeutische geneesmiddelen voor de behandeling van epilepsie geassocieerd met NDD's. Deze benadering zou inderdaad gebruikt kunnen worden om NDD's te onderzoeken waarbij wijzigingen in de netwerkeigenschappen van neuronen bekend zijn of vermoedworden 14.

Conclusies

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NDD's kunnen verwoestende aandoeningen zijn en hebben weinig gerichte behandelingen en geen genezingen. Inderdaad, de meeste therapieën zijn gericht op het beheersen van ziektesymptomen (bijvoorbeeld anti-epileptische medicatie voor epilepsie). Recente technologische vooruitgang heeft echter geleid tot nieuwe genbewerkingstechnieken, assays en modelsystemen waarmee wetenschappers de onderliggende oorzaken van NDD's kunnen onderzoeken  (Figuur 1). Deze review heeft enkele van de benaderingen beschreven die vooroplopen in de inspanningen om nieuwe behandelingen voor NDD's en aanverwante pathologieën te vinden. Genbewerkingstechnieken stellen onderzoekers in staat mutaties direct te targeten om de ziektemechanismen beter te begrijpen en mogelijk patiënten te behandelen met precisie-gentherapie. Nieuwe assays maken de snelle functionele classificatie van genetische varianten mogelijk, en stamcelmodellen stellen wetenschappers in staat de vroege ontwikkelingsmechanismen die NDD's aandrijven te begrijpen en nieuwe therapieën te testen. De technieken die in deze review worden beschreven, vormen de basis waarop toekomstige studies kunnen worden uitgevoerd met als doel een dieper begrip van NDD-mechanismen te verkrijgen en te leiden tot nieuwe klinische benaderingen om deze te behandelen. Naarmate het vakgebied zich blijft ontwikkelen, moeten toekomstige studies technieken zoals prenatale testen, foetale therapieën, high-content imaging en farmacogenomica integreren met die in deze review beschreven.

figure-results-1
Figuur 1: Samenvatting van de belangrijkste sterke en zwakke punten van technische benaderingen. Methoden die in het artikel worden beschreven en in de bijbehorende methodencollecties worden samengevat. Voor elke techniek worden een belangrijke sterke en zwakke punten beschreven. Een belangrijke referentie voor elke techniek wordt gegeven onder de kolom methode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De financiering werd verstrekt door NIH NINDS RO1NS131223 aan PHI. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Global report on children with developmental disabilities. , https://www.unicef.org/media/145016/file/Global-report-on-children-with-developmental-disabilities-2023.pdf (2023).
  2. Martínez De Lagrán, M., Bascón-Cardozo, K., Dierssen, M. Neurodevelopmental disorders: 2024 update. Free Neuropathol. 20, (2024).
  3. International Human Genome Sequencing Consortium. Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature. 431, 931-945 (2004).
  4. Diagnostic and statistical manual of mental disorders. , 5th ed, American Psychiatric Association. (2013).
  5. Jolly, L. A., Kumar, R., Penzes, P., Piper, M., Gecz, J. The DUB club: Deubiquitinating enzymes and neurodevelopmental disorders. Biol Psychiatry. 92, 614-625 (2022).
  6. Clague, M. J., Urbé, S., Komander, D. Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function. Nat Rev Mol Cell Biol. 20, 338-352 (2019).
  7. Arslan, A., Öz, P. Identification and classification of position-specific GABAA receptor subunit missense variants for their role in hippocampal pyramidal neurons. J Vis Exp. , e67833(2025).
  8. Cabré-Romans, J. J., Cuella-Martin, R. CRISPR-dependent base editing as a therapeutic strategy for rare monogenic disorders. Front Genome Ed. , 7(2025).
  9. Zhang, F., Wen, Y., Guo, X. CRISPR/Cas9 for genome editing: Progress, implications and challenges. Hum Mol Genet. 23, R40-R46 (2014).
  10. Matuszek, Z., Brown, B. L., Yrigollen, C. M., Keiser, M. S., Davidson, B. L. Current trends in gene therapy to treat inherited disorders of the brain. Mol Ther. 33, 1988-2014 (2025).
  11. Reddy, B. K., Annaiyappa, N., Bhattacharya, A., Chattarji, S., Pal, R. Generation and characterization of human induced pluripotent stem cell-derived astrocytes lacking fragile X messenger ribonucleoprotein. J Vis Exp. (220), e68081(2025).
  12. Ren, B., Dunaevsky, A. Modeling neurodevelopmental and neuropsychiatric diseases with astrocytes derived from human-induced pluripotent stem cells. Int J Mol Sci. 22 (4), 1692(2021).
  13. Meng, X., et al. Assembloid CRISPR screens reveal impact of disease genes in human neurodevelopment. Nature. 622, 359-366 (2023).
  14. Pan, T., et al. A multi-electrode array platform for modeling epilepsy using human pluripotent stem cell-derived brain assembloids. J Vis Exp. (211), e67396(2024).
  15. Wu, S. R., Nowakowski, T. J. Exploring human brain development and disease using assembloids. Neuron. 113 (8), 1133-1150 (2025).
  16. Sharma, V., Chhawari, H., Joshi, P., Nehra, S., Singhal, N. In vitro modeling of Down syndrome neurogenesis using human-induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (217), e67382(2025).
  17. Lee, K. M., et al. The application of human pluripotent stem cells to model the neuronal and glial components of neurodevelopmental disorders. Mol Psychiatry. 25, 368-378 (2020).
  18. Sharma, S. D., et al. Astrocytes mediate cell non-autonomous correction of aberrant firing in human FXS neurons. Cell Rep. 42, 112344(2023).
  19. Mojica, F. J. M., Garrett, R. A. Discovery and seminal developments in the CRISPR field. CRISPR-Cas systems: RNA-mediated adaptive immunity in bacteria and archaea. Barrangou, R., van der Oost, J. , 1-31 (2013).
  20. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096(2014).
  21. Enright, A. L., Heelan, W. J., Ward, R. D., Peters, J. M. CRISPRi functional genomics in bacteria and its application to medical and industrial research. Microbiol Mol Biol Rev. 88 (2), e00170-e00222 (2024).
  22. Kristof, A., et al. Engineering novel CRISPRi repressors for highly efficient mammalian gene regulation. Genome Biol. 26, 164(2025).
  23. Jaudon, F., Thalhammer, A., Zentilin, L., Cingolani, L. A. CRISPR-mediated activation of autism gene Itgb3 restores cortical network excitability via mGluR5 signaling. Mol Ther Nucleic Acids. 29, 462-480 (2022).
  24. Meng, X., et al. Assembloid CRISPR screens reveal impact of disease genes in human neurodevelopment. Nature. 622, 359-366 (2023).
  25. Teter, O. M., et al. CRISPRi-based screen of autism spectrum disorder risk genes in microglia uncovers roles of ADNP in microglia endocytosis and synaptic pruning. Mol Psychiatry. 30, 4176-4193 (2025).
  26. Liang, R., et al. Prime editing using CRISPR-Cas12a and circular RNAs in human cells. Nat Biotechnol. 42, 1867-1875 (2024).
  27. Musunuru, K., et al. Patient-specific in vivo gene editing to treat a rare genetic disease. N Engl J Med. 392 (22), 2235-2243 (2025).
  28. Benezra, D., et al. Bilateral optic nerve abnormalities associated with a 4-10 chromosomal translocation. Ophthalmic Paed Gen. 5 (3), 151-154 (1985).
  29. Prasad, D., Shukla, P. A comprehensive review on neurodevelopmental disorders. 12, 5(2025).
  30. Pinheiro, J., Honavar, M. F. Focal cortical dysplasia: updates. Indian J Pathol Microbiol. 65, S189-S197 (2022).
  31. Pejhan, S., Rastegar, M. Role of DNA methyl-CpG-binding protein MeCP2 in Rett syndrome pathobiology and mechanism of disease. Biomolecules. 11 (1), 75(2021).
  32. Koch, I., et al. Measuring enzymatic activity of neurodevelopmental disorder-associated deubiquitylating enzymes via an in vitro ubiquitin chain cleavage assay. J Vis Exp. (211), e67367(2024).
  33. Chen, E., et al. Rates and classification of variants of uncertain significance in hereditary disease genetic testing. JAMA Netw Open. 6, e2339571(2023).
  34. Al Eissa,, et al. Reclassifying variations of unknown significance in diseases affecting Saudi Arabia's population reveal new associations. Front Genet. 14, 1250317(2023).
  35. Maljevic, S., et al. Spectrum of GABAA receptor variants in epilepsy. Curr Opin Neurol. 32 (2), 183-190 (2019).
  36. Brunklaus, A., et al. Gene variant effects across sodium channelopathies predict function and guide precision therapy. Brain. 145 (12), 4275-4286 (2022).
  37. Knox, A. T., et al. Genotype-function-phenotype correlations for SCN1A variants identified by clinical genetic testing. Ann Clin Transl Neurol. 12 (3), 499-511 (2025).
  38. Davakan, A., et al. Electrophysiological classification of CACNA1G gene variants associated with neurodevelopmental and neurological disorders. Front Pharmacol. 16, 1613072(2025).
  39. McCready, F. P., et al. Multielectrode arrays for functional phenotyping of neurons from induced pluripotent stem cell models of neurodevelopmental disorders. Biology. 11, 316(2022).
  40. The practice of patch clamping. Patch clamping. , 95-114 (2002).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Genbewerkingstamcelmodellenvalidatie van genetische variantenmoleculaire assayscellulaire assaysautismespectrumstoornisintellectuele beperkingepilepsie

Gerelateerde artikelen