Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Beoordeling van de coronaire stroomreserve in een muismodel van hartfalen met geconserveerde ejectiefractie met behulp van Dopplerechocardiografie

383 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70135

⸱

24 maart 2026

 ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Nanjing Drum Tower Hospital, Nanjing Drum Tower Hospital Clinical College of Nanjing Medical University, 2Department of Cardiology, Nanjing Drum Tower Hospital, The Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School, MOE Key Laboratory of Model Animal for Disease Study, Nanjing University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een snelle, niet-invasieve benadering om coronaire microvasculaire dysfunctie te beoordelen in een muismodel van hartfalen met behouden ejectiefractie (HFpEF). De coronaire stroomreserve (CFR) wordt bepaald door Doppler-echografie geleide lokalisatie van de linker kransslagader, berekend als de verhouding tussen hyperemische en basislijn coronaire stroomsnelheid.

Samenvatting

Hartfalen met geconserveerde ejectiefractie (HFpEF) vormt een aanzienlijke wereldwijde gezondheidslast en een grote klinische uitdaging vanwege het ontbreken van effectieve therapieën, en de onderliggende pathofysiologie blijft ongrijpbaar. Coronaire microvasculaire disfunctie (CMD), die zeer vaak voorkomt bij patiënten met HFpEF, veroorzaakt myocardiale ischemie die zowel de diastolische als systolische functie van het linkerventrikel aantast. Aangezien microvasculaire disfunctie een centraal kenmerk is van HFpEF, wordt CMD nu beschouwd als een belangrijke factor in de pathogenese ervan. Coronaire flowreserve (CFR), gedefinieerd als de verhouding tussen maximale hyperemische en rustbloedstroomsnelheid, is een zeer waardevolle marker voor myocardischemie. Daarnaast dient het als een uitgebreide indicator van coronaire vasomotorische dysfunctie, waarbij de gecombineerde hemodynamische effecten van zowel epicardiale als microvasculaire kransslagaders op myocardperfusie worden gemeten. Dit protocol richtte zich op het beoordelen van veranderingen in CFR in een muismodel van HFpEF met behulp van Doppler-echocardiografie. In deze studie vertoonden controlemuizen een meer dan twee keer zoveel toename in de maximale coronaire bloedstroomsnelheid bij isoflurane-geïnduceerde vasodilatatie vergeleken met rustwaarden, terwijl deze respons significant afgezwakt was bij HFpEF-muizen. Bij HFpEF voorspelt een verlaagde CFR nadelige uitkomsten en weerspiegelt het onderliggende microvasculaire disfunctie, waardoor het een belangrijk instrument is voor het bestuderen van ziekteprogressie en het sturen van patiëntselectie.

Inleiding

Hartfalen (HF) met geconserveerde ejectiefractie (HFpEF) is de dominante vorm van HF en wordt geassocieerd met een slechte prognose. Er is echter geen bewezen behandeling om de bijbehorende morbiditeit en mortaliteit te verminderen 1,2. De aanwezigheid van meerdere risicofactoren, waaronder hoge leeftijd, hypertensie, diabetes, dyslipidemie en obesitas, ligt ten grondslag aan de complexiteit en heterogeniteit van HFpEF3. In de afgelopen jaren heeft steeds meer bewijs aangetoond dat coronaire microvasculaire disfunctie (CMD) een onafhankelijke en directe risicofactor is voor HFpEF, in plaats van een comorbiditeit 4,5,6. Coronaire microvasculaire disfunctie met zowel functionele als structurele afwijkingen ligt ten grondslag aan subendocardiskeichemie, diffuse interstitiële fibrose en linkerventrikeldisfunctie bij HFpEF 7,8. Er is uitgebreid onderzoek gedaan naar de pathologische rol van CMD bij hart- en vaatziekten 9,10. Een klinische studie toonde aan dat microvasculaire disfunctie (aangetoond door een verminderde CFR <2,0) direct geassocieerd is met een slechtere linkerventrikel diastolische functie en mogelijk een veelbelovend therapeutisch doelwit is bij HFpEF11. Echocardiografische beoordeling van de prevalentie van microvasculaire disfunctie bij hartfalen met preserved ejection fraction (PROMIS-HFpEF) studie toonde aan dat 75% van de patiënten met HFpEF CMD had, gebaseerd op CFR-metingen in de linker kransslagader12. Bovendien correleerde de abnormale CMD met een verhoogd risico op nadelige uitkomsten, waaronder een significant verhoogd sterfterisico13,14. Daarom vergemakkelijkt het gebruik van CMD als belangrijke biomarker in diermodellen het onderzoek naar HFpEF-pathofysiologie aanzienlijk en helpt het bij het valideren van de succesvolle replicatie van het ziektefenotype.

Momenteel zijn methoden voor het beoordelen van de coronaire microvasculaire functie, zoals positronemissietomografie (PET), cardiovasculaire magnetische resonantie (CMR), fractionele flowreserve (FFR) en index van microcirculatieresistentie (IMR), moeilijk toe te passen in knaagdierstudies vanwege de kleine omvang van de dieren en de beperkte beschikbaarheid van speciale beeldvormingsapparatuur. Coronaire stroomreserve (CFR) wordt aanbevolen door internationale richtlijnen als hulpmiddel voor het onderzoeken van coronaire fysiologie15,16. Bovendien dient CFR als een betrouwbare marker voor hartischemie, een meter voor coronaire vasculaire dysfunctie en een waardevolle prognostische indicator van cardiovasculair risico17. Dopplerechocardiografie voor CFR-beoordeling is een gevalideerde en reproduceerbare methode voor het evalueren van de wereldwijde coronaire vaatfunctie in preklinische knaagdiermodellen. Hoewel eerdere studies het gebruik van CFR hebben gerapporteerd in muis/ratmodellen van myocardischemie-reperfusieletsel18,19, is het nooit toegepast in diermodellen van HFpEF. Bovendien kan de CFR-beoordelingsmethode die in deze studie wordt beschreven, waarbij de LCA snel wordt gelokaliseerd met behulp van kleurdopplerechocardiocardiografie, worden uitgebreid naar een reeks diermodellen, waaronder diabetische cardiomyopathie, hypertensieve hartziekten en chronische ontstekings- of auto-immuunziekten. In de huidige studie, gezien de afwezigheid van epicardiale coronaire stenose in het muismodel, weerspiegelt de vermindering van de coronaire flowreserve (CFR) voornamelijk coronaire microvasculaire disfunctie in plaats van gecombineerde epicardiale en microvasculaire bijdragen. CFR dient dus als een betrouwbare vervangingsmarker voor CMD in dit HFpEF-model.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures voldeden aan de protocollen goedgekeurd door de Institutionele Ethiek Commissie van het Nanjing Drum Tower Ziekenhuis (Goedkeuring nr. 20011141) en volgden de richtlijnen20 voor Dieronderzoek: Rapportage van In Vivo Experimenten (ARRIVE). In deze studie werd het HFpEF-model vastgesteld bij zes tot acht weken oude mannelijke C57BL/6J-muizen (BW, ~25 g). Gedurende de experimentele duur werden muizen gehuisvest in een ruimte zonder specifieke ziekteverwekkers (SPF) onder gecontroleerde omstandigheden van temperatuur (23 ± 1 °C), luchtvochtigheid (65%–70%) en een licht/donker cyclus van 12 uur. Alle dieren hadden ad libitum toegang tot voedsel en water. Na het onderzoek werden de muizen verdoofd met 1,5% isoflurane en geëuthanaseerd door een cervicale dislocatie. De gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de Materiaaltabel.

1. Oprichting van het HFpEF-muismodel

  1. Verdeel muizen willekeurig in twee groepen: een controlegroep (CTRL) en een HFpEF-groep, met elk acht muizen.
  2. Gebruik een vastgesteld protocol 21,22,23,24,25 om het HFpEF-muismodel als volgt te induceren:
    1. Geef muizen van zes tot acht weken een vetrijk dieet (HFD, 60% vet) en geef 0,5 g/L N-nitro-L-arginine methylester (L-NAME) opgelost in drinkwater gedurende 8 weken.
      OPMERKING: Bereid L-NAME drinkwater in bruine flessen om lichtblootstelling te vermijden en vernieuw elke 2–3 dagen.
  3. Geef leeftijdsgematchte muizen een standaard normaal dieet en zorg voor regelmatig drinkwater gedurende dezelfde duur als de controlegroep.

2. Beoordeling van de coronaire stroomreserve door echocardiografie

  1. Ga vooraf aan echocardiografische beoordeling door de muis te verdoven via inademing van 1,5% verdampte isoflurane, toegediend met 1,5–2,0 L/min en 100% O₂-stroom in een anesthesiekamer.
    VOORZICHTIG: Isoflurane is een vluchtig verdovingsmiddel. Zorg voor voldoende ventilatie tijdens de operatie. Draag nitril handschoenen wanneer je vloeibare isoflurane aan de vaporizer toevoegt om huidcontact te voorkomen.
  2. Controleer de afwezigheid van reactie op huidknijpen en stimulatie van de teen of staart, en plaats het dier vervolgens op rugligging op het beeldvormingsplatform.
  3. Schakel de gasanesthesiemachine van kamer naar masker en houd een constante concentratie van 1,5% anesthesieconcentratie gedurende de procedure.
  4. Verkrijg fysiologische gegevens (ECG en ademhaling) door geleidende gel aan te brengen op de koperen plaat (ECG-elektroden) van het beeldvormingsplatform en de vier poten daarop vast te plakken.
    OPMERKING: Houd isofluraan op 1,5% voor onderhoud en houd de kerntemperatuur rond de 37 °C met behulp van het ingebouwde verwarmingsplatform. Houd een beoogde ademhalingsfrequentie van 100–140 ademhalingen per minuut aan om fysiologische stabiliteit tijdens beeldvorming te waarborgen.
  5. Verwijder borsthaar door ontharingscrème aan te brengen met een watten applicator.
  6. Veeg overtollige crème en losse vacht weg met met water doordrenkt gaas om je voor te bereiden op beeldvorming.
    OPMERKING: Verwijder de resterende ontharingscrème volledig om huidirritatie of toxiciteit te voorkomen.
  7. Breng steriele smeerende oogzalf aan op beide ogen om sclerale uitdroging te voorkomen.
  8. Breng ultrageluidstransmissiegel aan op het voorste hartgebied en plaats het beeldplatform op ongeveer 30°–45° ten opzichte van de horizontale lijn.
    OPMERKING: Vermijd luchtbellen in de echogel.
  9. Plaats de hoogfrequente ultrageluidstransducer langzaam op de parasternale lijn en lijn deze parallel aan de thorax uit om het aangepaste parasternale langasbeeld (PLAX) van de linkerventrikel te krijgen (Figuur 1A).
  10. Draai de sonde zo dat je licht contact hebt met de borstwand, zodat compressie wordt voorkomen.
  11. Druk op de Bright Mode-knop om over te schakelen naar helderheidsmodus-beeldvorming.
  12. Pas de hoek van de sonde en het beeldplatform aan om de linker kransslagader (LCA) te lokaliseren.
    OPMERKING: Identificeer de linkerventrikel (LV), linker atrium (LA), linker ventrikel voorwand (LVAW), linker ventrikel achterwand (LVPW), interventriculair septum (IVS), aorta (AO), longslagader (PA), longader (PV), mitralisklep (MV) en papillaire spier binnen het akoestische venster.
  13. Activeer de kleur-dopplermodus door op de Kleur-Doppler-knop op het touchscreen te drukken. In realtime display verschijnt de stroming weg van de aortaklep (richting de sonde) rood.
  14. Pas de hoek en positie van de sonde aan om de volledige LCA van de aortasinus naar de distale tak te visualiseren, terwijl interferentie door de longader wordt geminimaliseerd.
  15. Activeer pulse-wave doppler (PW) modus. Plaats het PW-meetvenster parallel aan de LCA-bloedstroomrichting (Figuur 1B,C).
    OPMERKING: Houd de insonatiehoek onder de 60° en pas realtime hoekcorrectie toe door de Dopplercursor parallel aan de coronaire stroming uit te lijnen.
  16. Selecteer Save Clip om de basislijn LCA flow velocity golfvorm vast te leggen.
  17. Verhoog de isofluranconcentratie tot 3% en observeer de geleidelijke toename van de coronaire stroomsnelheid.
  18. Na 45 seconden continue blootstelling aan 3% isofluran, selecteer je Save Clip om de hyperemische coronaire stroomsnelheid vast te leggen.
    OPMERKING: Monitor continu de bloedstroom van LCA. Als het PW-monstervolume afdwaalt door ademhalings- of hartbewegingen, pauzeer dan de acquisitie, keer terug naar Color Doppler-modus om de LCA opnieuw te identificeren, herpositioneer de PW-poort en hervat de PW-modus.
  19. Na afloop stop je met het inhaleren van isofluaan en verwijder je de ultrageluidsgel. Plaats de muis op een verwarmingsmat totdat hij volledig hersteld is, en zet hem dan terug in de kooi.

3. Statistische analyse

  1. Gemiddelde metingen van drie opeenvolgende hartcycli worden gevolgd in de analysesoftware om de basis- en piek LCA-stroomsnelheden te verkrijgen. Bereken de CFR als de verhouding van hyperemische piek diastolie stroomsnelheid tot baseline piek diastolie coronaire stroomsnelheid (CFV).
  2. Implementeer een dubbelblind ontwerp tussen de experimentator en data-analist. Beoordeel de normaliteit met behulp van de Shapiro–Wilk-test. Normaal verdeelde data analyseren met een tweezijdige, ongepaarde Student's t-test. Analyseer niet-normaal verdeelde gegevens met behulp van de Mann–Whitney U-test.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In deze studie waren 16 muizen (HFpEF, n = 8; CTRL, n = 8) werden gebruikt. De linker kransslagader werd geïdentificeerd onder kleur-Dopplerbegeleiding in het parasternale long-axis (PLAX) perspectief, en de coronaire stroomsnelheid werd gemeten met behulp van gepulseerde golf (PW) Doppler. Na het verkrijgen van voldoende en reproduceerbare beelden van elke muis bij zowel 1,5% (baseline) als 3% (hyperemische) isofluranconcentraties werd26 CFR bepaald door gemiddel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Deze studie presenteert een protocol dat een niet-invasieve, eenvoudige en reproduceerbare methode gebruikt om macro- en microvasculaire disfunctie in HFpEF-diermodellen te beoordelen. Doppler-echocardiografie voor het beoordelen van de coronaire stroomreserve wordt erkend door de European Society of Cardiology als een gevalideerde en reproduceerbare methode15. Onder normale fysiologische omstandigheden bij C57BL/6J-muizen wordt verwacht dat de coronaire stroomres...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs stellen dat er geen concurrerende financiële of commerciële belangen zijn.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Funds for Distinguished Young Scientists in Nanjing - Key Project ondersteund door de Medical Science and Technology Development Foundation, Nanjing Department of Health (JQX22001); China Postdoctoral Science Foundation (2023M731631); Financiering voor klinische proeven van het Affiliate Drum Tower Hospital, Medische Faculteit van de Nanjing Universiteit (2024-LCYJ-PY-29); Onderzoeksstichting van de provinciale commissie voor gezondheid en gezinsplanning (MQ2024049).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Dierfysiologie monitorFujifilmVEVO 3100Hartslag, ademhalingssnelheid en lichaamstemperatuur controleren
C57 muizenGemPharmatech Co., Ltd
CameraCanon, JapanEOS R50De posities van het beeldvormingsplatform en de echografie-sonde vastleggen
OntharingscremeVeet, FransHaarverwijdering
GaasCurityCAR-6339-PKSteriele
IsofluraanREWARDR510-22-10Anesthesie
N-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)Sigma-AldrichN5751Introductie van HFpEF-muizenmodel
Research Diets, 60% vet  Research Diets, Inc.  D12492Dieet met hoog vetgehalte
Chirurgische thermostatische verwarmingsmatGlobalebio, ChinaGE0-20WTemperatuurregeling
Echografie-gelParker LaboratoriesW60698LUltrasoon transmissiegel
Vevo 3100 preklinische beeldvormingsplatformFujifilmVEVO 3100Echocardiografie
VevoLAB-softwareFujifilmVevoLAB 3.2.6Echocardiografie-gegevensanalyse

Referenties

  1. Redfield, M. M., Borlaug, B. A. Heart Failure With Preserved Ejection Fraction: A Review. JAMA. 329 (10), 827-838 (2023).
  2. Withaar, C., Lam, C. S. P., Schiattarella, G. G., de Boer, R. A., Meems, L. M. G. Heart failure with preserved ejection fraction in humans and mice: embracing clinical complexity in mouse models. Eur Heart J. 42 (43), 4420-4430 (2021).
  3. Borlaug, B. A. Evaluation and management of heart failure with preserved ejection fraction. Nat Rev Cardiol. 17 (9), 559-573 (2020).
  4. Paulus, W. J., Tschope, C. A novel paradigm for heart failure with preserved ejection fraction: comorbidities drive myocardial dysfunction and remodeling through coronary microvascular endothelial inflammation. J Am Coll Cardiol. 62 (4), 263-271 (2013).
  5. Shah, S. J., et al. Prevalence and correlates of coronary microvascular dysfunction in heart failure with preserved ejection fraction: PROMIS-HFpEF. Eur Heart J. 39 (37), 3439-3450 (2018).
  6. Lee, J. F., et al. Evidence of microvascular dysfunction in heart failure with preserved ejection fraction. Heart. 102 (4), 278-284 (2016).
  7. Freed, B. H., et al. Prognostic Utility and Clinical Significance of Cardiac Mechanics in Heart Failure With Preserved Ejection Fraction: Importance of Left Atrial Strain. Circ Cardiovasc Imaging. 9 (3), 191-200 (2016).
  8. Taqueti, V. R., et al. Coronary Flow Reserve, Inflammation, and Myocardial Strain: The CIRT-CFR Trial. JACC Basic Transl Sci. 8 (2), 141-151 (2023).
  9. Zhao, J., et al. Heart-gut microbiota communication determines the severity of cardiac injury after myocardial ischaemia/reperfusion. Cardiovasc Res. 119 (6), 1390-1402 (2023).
  10. Zhao, J., et al. Excessive accumulation of epicardial adipose tissue promotes microvascular obstruction formation after myocardial ischemia/reperfusion through modulating macrophages polarization. Cardiovasc Diabetol. 23 (1), 236(2024).
  11. Rush, C. J., et al. Prevalence of coronary artery disease and coronary microvascular dysfunction in patients with heart failure with preserved ejection fraction. JAMA Cardiol. 6 (10), 1130-1143 (2021).
  12. Hage, C., et al. Association of coronary microvascular dysfunction with heart failure hospitalizations and mortality in heart failure with preserved ejection fraction: a follow-up in the PROMIS-HFpEF study. J Card Fail. 26 (11), 1016-1021 (2020).
  13. Allan, T., Dryer, K., Fearon, W. F., Shah, S. J., Blair, J. E. A. Coronary microvascular dysfunction and clinical outcomes in patients with heart failure with preserved ejection fraction. J Card Fail. 25 (10), 843-845 (2019).
  14. Kelshiker, M. A., et al. Coronary flow reserve and cardiovascular outcomes: a systematic review and meta-analysis. Eur Heart J. 43 (16), 1582-1593 (2022).
  15. Knuuti, J., et al. 2019 ESC Guidelines for the diagnosis and management of chronic coronary syndromes. Eur Heart J. 41 (3), 407-477 (2020).
  16. Vancheri, F., Longo, G., Vancheri, S., Henein, M. Coronary microvascular dysfunction. J Clin Med. 9 (9), 2880(2020).
  17. Zacchigna, S., et al. Towards standardization of echocardiography for the evaluation of left ventricular function in adult rodents: a position paper of the ESC Working Group on Myocardial Function. Cardiovasc Res. 117 (1), 43-59 (2021).
  18. Guo, Z., et al. Dynamic assessments of coronary flow reserve after myocardial ischemia reperfusion in mice. J Vis Exp. (198), e65492(2023).
  19. Kelm, N. Q., Beare, J. E., LeBlanc, A. J. Evaluation of coronary flow reserve after myocardial ischemia reperfusion in rats. J Vis Exp. (148), e59675(2019).
  20. Percie du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 18 (7), e3000410(2020).
  21. Schiattarella, G. G., et al. Nitrosative stress drives heart failure with preserved ejection fraction. Nature. 568 (7752), 351-356 (2019).
  22. Guo, Y., et al. iNOS contributes to heart failure with preserved ejection fraction through mitochondrial dysfunction and Akt S-nitrosylation. J Adv Res. 43, 175-186 (2023).
  23. Xiong, Y., et al. Inhibition of ferroptosis reverses heart failure with preserved ejection fraction in mice. J Transl Med. 22 (1), 199(2024).
  24. Chen, J., et al. Nitazoxanide protects against heart failure with preserved ejection and metabolic syndrome induced by high-fat diet (HFD) plus L-NAME "two-hit" in mice. Acta Pharm Sin B. 15 (3), 1397-1414 (2025).
  25. Lanzer, J. D., et al. Single-cell transcriptomics reveal distinctive patterns of fibroblast activation in heart failure with preserved ejection fraction. Basic Res Cardiol. 119 (6), 1001-1028 (2024).
  26. Lenzarini, F., Di Lascio, N., Stea, F., Kusmic, C., Faita, F. Time course of isoflurane-induced vasodilation: a Doppler ultrasound study of the left coronary artery in mice. Ultrasound Med Biol. 42 (4), 999-1009 (2016).
  27. Yang, J. H., et al. Endothelium-dependent and independent coronary microvascular dysfunction in patients with heart failure with preserved ejection fraction. Eur J Heart Fail. 22 (3), 432-441 (2020).
  28. Silvani, A., et al. Physiological mechanisms mediating the coupling between heart period and arterial pressure in response to postural changes in humans. Front Physiol. 8, 163(2017).
  29. Mohan, M., Anandh, B., Thombre, D. P., Surange, S. G., Chakrabarty, A. S. Effect of posture on heart rate and cardiac axis of mice. Indian J Physiol Pharmacol. 31 (3), 211-217 (1987).
  30. Franssen, C., et al. Myocardial microvascular inflammatory endothelial activation in heart failure with preserved ejection fraction. JACC Heart Fail. 4 (4), 312-324 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Coronaire microvasculaire dysfunctiemyocardiale ischemievasomotorische dysfunctiecoronaire bloedstroomisofluraan vasodilatatie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.