Superresolutie beeldvorming en gedeeld beheer: een protocol voor confocale microscopie met multiplexdetectie

Summary

Dit protocol beschrijft de geavanceerde beeldvormingstoepassingen en het beheer van gedeelde middelen van een laser-scannend confocaal microscoopsysteem, geïntegreerd met een multiplexed arraydetector voor hoogresolutie cellulaire en subcellulaire beeldvorming. De workflow maakt multimodale beeldvorming mogelijk van confocaal tot superresolutie (~120 nm) binnen één platform, waardoor visualisatie op nanoschaal toegankelijker wordt.

Abstract

Superresolutiemicroscopie (SRM) overwint de diffractielimiet van conventionele lichtmicroscopie, waardoor nanoschaalvisualisatie van subcellulaire structuren mogelijk is. De brede toepassing van technieken zoals gestimuleerde emissiedepletion (STED) microscopie, fotogeactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM) / stochastische optische reconstructiemicroscopie (STORM) en structured illumination microscopy (SIM) kan echter worden belemmerd door factoren zoals hoge fototoxiciteit, gespecialiseerde monstervoorbereiding of complexe werking. Hier presenteren we een uitgebreid protocol dat gebruikmaakt van een laser-scannend confocale platform geïntegreerd met een gemultiplexeerde superresolutie-detector. Dit systeem, gecombineerd met computationele verwerking, maakt een eenvoudige overgang mogelijk tussen confocale en superresolutiebeeldvorming binnen dezelfde workflow. Het protocol biedt een gebruiksvriendelijke aanpak voor snelle, hoogresolutie- en fototoxiciteitsbeeldvorming. De gedetailleerde methode omvat multimodale beeldvormingsmogelijkheden, waaronder meerkleurige fluorescentie, differentiële interferentiecontrast (DIC), driedimensionale Z-stack reconstructie, time-lapse live-cell beeldvorming, grote-oppervlak tegeling en diverse superresolutiemodi die door de gemultiplexeerde arraydetector worden aangeboden. Systematische vergelijkingen tonen aan dat de superresolutiemodi een laterale resolutie van ongeveer 120 nm bereiken, wat ongeveer een tweevoudige verbetering betekent ten opzichte van de diffractielimiet van conventionele grootveldmicroscopie en een significante verbetering in zowel resolutie als signaal-ruisverhouding (4-8 keer) vergeleken met standaard confocale werking op hetzelfde platform. De discussie behandelt ook belangrijke punten van een model van gedeeld resource management dat essentieel is voor het ondersteunen van de duurzame werking van deze technologie. Deze geïntegreerde gids dient als een waardevolle bron voor zowel nieuwe als ervaren onderzoekers en facilitaire managers die het potentieel van deze toegankelijke vorm van geavanceerde beeldvorming in life sciences onderzoek willen overnemen en maximaliseren.

Introduction

De visualisatie van dynamische subcellulaire structuren is fundamenteel voor het bevorderen van onderzoek in de levenswetenschappen. De resolutie van traditionele optische microscopie is echter door diffractie beperkt tot ongeveer 200 nm lateraal, waardoor het vermogen om dynamische subcellulaire processen te onderscheiden wordt beperkt. Om deze barrière te overwinnen, zijn verschillende superresolutietechnieken ontwikkeld. Technieken zoals STED-microscopie, PALM/STORM en SIM vormen echter vaak barrières voor brede adoptie in multi-user omgevingen, waaronder hoge fototoxiciteit, de noodzaak van gespecialiseerde fluoroforen of monstervoorbereiding, complexe uitlijningsprocedures of intensieve computationele verwerking ^1,2,3.

In deze context bieden confocale microscoopsystemen uitgerust met een gemultiplexeerde arraydetector een overtuigend alternatief door superresolutiebeeldvorming mogelijk te maken via multipixeldetectie en rekenkundige hertoewijzing, waardoor de technische drempel^{van 4} aanzienlijk wordt verlaagd. Deze benadering maakt gebruik van een 32-elementens galliumarsenidefosfide (GaAsP) detectorarray om meer fotonen van elk scanpunt te verzamelen. Latere intelligente deconvolutie-algoritmen wijzen deze informatie opnieuw toe, waardoor het detectievolume effectief wordt verminderd. Dit proces bereikt ruimtelijke resoluties van ongeveer 120 nm lateraal en 350 nm axial, wat een ongeveer 2x verbetering ten opzichte van de diffractielimiet van grootveldmicroscopie betekent en een 4-8x toename van de signaal-ruisverhouding oplevert vergeleken met standaard confocale modus op hetzelfde instrument ^4,5,6. Deze unieke combinatie van verbeterde resolutie, superieure signaalkwaliteit en compatibiliteit met veelgebruikte fluorescerende labels en protocollen vormt het belangrijkste voordeel voor brede toepassingen.

Daardoor heeft deze vorm van toegankelijke superresolutie-microscopie brede toepassing gevonden in life sciences-onderzoek, waardoor gedetailleerde studies mogelijk zijn van organelmorfologie, cytoskeletdynamiek, virus-gastheerinteracties en moleculaire colokalisatie in zowel vaste als levende cellen ^7,8. De relatieve zachtheid maakt het bijzonder geschikt voor langdurige time-lapse waarnemingen van levende monsters.

De integratie van dergelijke geavanceerde systemen in kernfaciliteiten is cruciaal voor het democratiseren van toegang, maar hun duurzame en effectieve werking brengt duidelijke uitdagingen met zich mee. In institutionele kernfaciliteiten, zoals aan de Zhejiang University School of Medicine, hangen optimale prestaties en impact kritisch af van drie pijlers: (1) gestandaardiseerde en reproduceerbare beeldvormingsprotocollen, (2) rigoureus routinematig onderhoud en (3) een effectief beheerkader voor gedeelde toegang. Hoewel er waardevolle bronnen bestaan voor specifieke aspecten, zoals beeldvormingsmethoden voor eerdere systemen⁹of algemene principes van facilitair beheer^10,11, ontbreekt er momenteel een uitgebreide gids die gedetailleerde, reproduceerbare protocollen voor moderne multiplexed arraydetectorplatforms integreert met een bewezen shared-resource managementmodel. Dit protocolartikel probeert deze kloof te overbruggen.

Het overkoepelende doel is om een uitgebreide, stapsgewijze gids te bieden voor het effectief implementeren en gebruiken van een confocaal systeem met een gemultiplexeerde arraydetector voor superresolutiebeeldvorming binnen een gedeelde bronomgeving. It is designed for two primary audiences: researchers requiring resolution beyond conventional confocal limits (~250‬-300 nm) but for whom live-cell compatibility, ease of use, and throughput are also critical; en facilitaire managers die zo'n dienst opzetten of optimaliseren. Hierin beschrijven we systematisch de systeemconfiguratie, multimodale beeldvormingsprotocollen (waaronder multicolor, 3D, live-cell, tegeling en superresolutie-modi), en een bewezen shared managementmodel. Deze geïntegreerde gids dient als een bron om het potentieel en de toegankelijkheid van deze krachtige beeldvormingsmethode te maximaliseren.

Protocol

Alle experimenten met biologische monsters werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften van de Core Facilities, Zhejiang University School of Medicine, en werden goedgekeurd door het Institutioneel Bioveiligheidscomité (Goedkeuringscertificaat nr. BSL20235710079).

OPMERKING: Alle procedures waarbij celkweken worden uitgevoerd, moeten onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast van klasse II, tenzij anders vermeld. Dit protocol gaat ervan uit dat het microscoopsysteem is geïnstalleerd en de laservermogens zijn gekalibreerd. Gedetailleerde specificaties en aanbevolen leveranciers voor belangrijke reagentia, verbruiksartikelen en apparatuur (bijv. beeldvormende schotels, afdekglas, montagemateriaal) staan vermeld in de Materiaaltabel.

1. Monstervoorbereiding

OPMERKING: Succesvolle superresolutiebeeldvorming begint met optimale monstervoorbereiding. Het gebruik van hoogwaardige, 1,5 dikte (0,17 mm) glasgebaseerde beeldschotels is essentieel om de correctiekraag van high-NA olie-onderdompelingsobjectieven te matchen en bolvormige aberratie te voorkomen. Alle centrifugatiestappen moeten worden uitgevoerd op 300 × g gedurende 5 minuten, tenzij anders vermeld.

1. Vaste celmonstervoorbereiding voor multicolor superresolutie beeldvorming (bijv. COS7-cellen)
   OPMERKING: Dit protocol beschrijft immunokleuring voor microtubuli (Alexa Fluor 568) en mitochondriën (Alexa Fluor 488), met 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) nucleaire tegenkleuring, zoals weergegeven in Figuur 1.
   1. Kweek COS7-cellen in Dulbecco's gemodificeerde Eagle-medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal rundserum (FBS) bij 37°C in een 5% CO2-bevochtigde broedmachine.
   2. Plaatcellen op 35 mm glazen bodem beeldschotels met een dichtheid van 1,0 × 10⁵ cellen per schotel. Laat cellen hechten en groeien tot 60-70% confluentie (meestal 24 uur).
   3. Aspireer het kweekmedium en was de cellen voorzichtig met voorverwarmde (37°C) fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Fixeer de cellen door 1 mL 4% paraformaldehyde (PFA) toe te voegen in PBS en incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur (RT).
   4. Aspireer de PFA-oplossing (behandel als gevaarlijk afval). Was de cellen drie keer met 2 ml PBS, en incubeer 5 minuten per wasbeurt met zacht wiegen.
   5. Permeabilisatie en blokkering: Incubeer de cellen met 1 mL permeabilisatie-/blokkeringsbuffer (0,1% v/v) Triton X-100, 1% (w/v) rundereserumalbumine (BSA) in PBS) gedurende 30 minuten bij RT.
   6. Primaire antilichaamincubatie: Incubeer cellen met een mengsel van primaire antilichamen tegen α-tubuline (muis monoklonaal) en TOMM20 (konijn polyklonaal) in een antilichaamverdunningsbuffer (1% BSA in PBS) bij 4°C 's nachts (of 1-2 uur bij RT). Gebruik 300 μL per schotel om het glasoppervlak te bedekken.
   7. Wassen: Aspireer voorzichtig de primaire antistofoplossing. Was de cellen drie keer met 2 ml PBS met 0,05% Tween-20 (PBST), 5 minuten per was.
   8. Secundaire antilichaam- en nucleaire kleuring: bereid een mengsel van fluorescerende secundaire antilichamen en DAPI voor in een antilichaamverdunningsbuffer (1% BSA/PBS), beschermd tegen licht.
      1. Gebruik ezel anti-muis IgG geconjugeerd met Alexa Fluor 568 (1:500) en ezel anti-konijn IgG geconjugeerd met Alexa Fluor 488 (1:500).
      2. Neem DAPI toe bij een uiteindelijke concentratie van 1 μg/mL voor nucleaire kleuring. Breng 300 μL van dit mengsel toe op de cellen en incubeer 1 uur bij RT in het donker.
   9. Laatste was: Aspireer de kleuringsoplossing en was de cellen drie keer met 2 ml PBS, 5 minuten per was.
   10. Breng het montagemedium aan: Aspireer voorzichtig de PBS uit de beeldvormende schaal, waarbij het monster licht vochtig blijft. Breng onmiddellijk een kleine druppel (~20 μL) van gehard antifade montagemedium (bijv. ProLong Gold) direct aan op het glasbodemgebied.
   11. Bedekken en uitharden: Laat voorzichtig een #1,5 hoog-precisie dekselglas op de druppel zakken, zodat je belletjes vermijdt. Laat de mountant 's nachts uitharden bij RT in het donker, of 2-4 uur bij 37°C als sneller uitharden nodig is.
2. Levenscelmonstervoorbereiding voor time-lapse imaging (bijvoorbeeld Hep3B-cellen die een fluorescerend eiwitlabel tot expressie brengen).
   OPMERKING: Dit protocol beschrijft beeldvorming van Hep3B-cellen die stabiel een fluorescerend eiwit (bijv. EGFP) tot expressie brengen dat gericht is op mitochondriën.
   1. Hep3B-cellen kweek in minimaal essentieel medium (MEM) aangevuld met 10% FBS. Plaatcellen op 35 mm glasbodem beeldschotels (1,5 afdekglas) met een dichtheid van 0,8 × 10⁵cellen/schotel. Laat cellen groeien tot ongeveer 70-80% confluentie voor optimale gezondheid en beelddichtheid (meestal 18-24 uur).
   2. Voorbereiding op beeldvorming: Vervang op de dag van beeldvorming voorzichtig het standaard kweekmedium door 2 mL voorgeëwalibreerd (37°C, 5%_CO2 voor minstens 30 minuten), fenolroodvrij, laagfluorescentie-beeldvormingsmedium, aangevuld met 10% FBS en, indien nodig, 25 mM HEPES-buffer voor pH-stabilisatie buiten een CO2-incubator. Dit minimaliseert achtergrondfluorescentie en handhaaft de fysiologische pH tijdens beeldvorming.
      OPMERKING: Laat de schotel minstens 30-45 minuten acclimatiseren op het voorverwarmde microscooppodium in de omgevingskamer voordat wordt gestart met time-lapse opname om temperatuur, focus en stabilisatie van celgezondheid te waarborgen.

2. Opstart, initialisatie en basisuitlijning van het microscoopsysteem

1. Stroom op de hoofdunit van de microscoop, de laserlanceermodule (met solid-state lasers op 405, 488, 561 en 640 nm), de LED-lichtbron en de besturingscomputer.
   1. Laat de lasers minstens 15-20 minuten opwarmen en stabiliseren. Dit is cruciaal voor stabiele laservermogensoutput, vooral voor kwantitatieve of time-lapse experimenten.
2. Start de microscoop-besturingssoftware.
3. Selecteer vanaf de hoofdinterface 'Microscoop' > 'Initialiseren' of volg de opstartwizard van de software.
4. Navigeer in de software naar het paneel 'Acquisitie'. Selecteer in het objectieflens-dropdownmenu 'Plan-Apochromat 63 x/ 1.40 Oil ' of het juiste objectief voor je experiment.
5. Breng een druppel dompelolie (brekingsindex = 1,518) direct aan op de voorlens van het objectief. Vermijd het introduceren van bellen.
6. Voor live-cel beeldvorming activeer je de omgevingskamer en het actieve focusstabilisatiesysteem (bijv. 'Definite Focus' >) minstens 45-60 minuten voor de beeldvorming. Stel de temperatuur in op 37°C, CO₂ op 5%, en de luchtvochtigheid op >60%. Laat het systeem stabiliseren. Controleer de stabiliteit met behulp van de kamersensoren.
7. Het systeem is nu klaar voor het laden van samples en het instellen van beeldparameters.

3. Multikleurige fluorescentiebeeldvorming

1. Plaats het voorbereide monster op het microscooppodium. Tilt voorzichtig het podium op totdat het dekselglas de dompelolie raakt.
2. In de acquisitiesoftware navigeer je door het tabblad 'Acquisitie' en selecteer je een nieuw experiment aanmaken.
3. Voeg meerdere beeldvormingskanalen (kanalen) toe die overeenkomen met de gebruikte fluoroforen. Voor het voorbeeld in Figuur 1, configureer je:
   1. Spoor 1 (DAPI): Excitatie 405 nm, detectie 410-480 nm.
   2. Track 2 (Alexa Fluor 488): Excitatie 488 nm, detectie 495-550 nm.
   3. Spoor 3 (Alexa Fluor 568): Excitatie 561 nm, detectie 570-620 nm.
4. Voor elke spoor stel je de confocale gaatdiameter in op 1 Airy-eenheid (1 AU).
5. Optimaliseer het laservermogen en de detectorversterking voor elk kanaal met het volgende iteratieve proces:
   1. Selecteer het eerste kanaal (bijv. DAPI). Schakel over naar 'Live' scanmodus.
   2. Stel het initiële laservermogen in op een lage waarde (bijv. 0,1-0,5%). Stel de detectorversterking in op een matig niveau binnen het lineaire bereik (bijvoorbeeld 700 V voor een GaAsP PMT).
   3. Verhoog geleidelijk het laservermogen totdat de doelstructuren duidelijk zichtbaar zijn boven de achtergrond in het livebeeld.
   4. Open het histogramdisplay . Zorg ervoor dat er geen pixelverzadiging is (histogram niet opgestapeld aan de rechterrand). Verminder het laservermogen indien nodig.
   5. Pas de detectorversterking aan om een helder, ruisarm beeld te bereiken. Vermijd versterkingen boven 850 V om overmatige ruis te voorkomen.
   6. Herhaal stappen 3.5.1-3.5.5 voor alle overige fluorescentiekanalen.
      OPMERKING: Balanceer laservermogen, versterking en pixel-dwelltijd om de signaal-ruisverhouding te maximaliseren en fotoschade te minimaliseren. Voor live cellen geef je prioriteit aan minder vermogen en kortere verblijfstijden.
6. Stel het afbeeldingsformaat in (aantal pixels) en de verblijftijd van de pixels.
   1. Stel de pixelgrootte in om te voldoen aan het Nyquist-criterium: pixelgrootte ≤(resolutie / 2,3). Voor standaard confocale beeldvorming (laterale resolutie ~250 nm) stel je pixelgrootte in ≤108 nm.
   2. Gebruik de 'Nyquist '-samplerknop van de software om dit automatisch te berekenen indien beschikbaar.
   3. Stel de pixel-verblijftijd in. Gebruik een langere dwell-tijd (bijv. 1,0-2,0 μs) voor een hogere signaal-ruisverhouding, of een kortere dwell-tijd (bijv. 0,5-1,0 μs) voor snellere beeldvorming.
7. Zorg ervoor dat de modus 'Sequential Scan' tussen de sporen is geselecteerd om overpraat te minimaliseren.
8. Klik op 'Start' om één afbeelding te verkrijgen. Sla de afbeelding op met relevante metadata.

4. Differentiële interferentiecontrast (DIC) beeldvorming

1. Selecteer in het tabblad 'Acquisitie' van de acquisitiesoftware 'Voeg een nieuw kanaal toe' en configureer dit voor detectie van doorgezonden licht.
2. Selecteer de juiste doorgezonden lichtdetector (vaak T-PMT (transmitted-light photomultiplier tube) of ESID (external system interface detector) genoemd in de software).
3. DIC-prisma- en polarisatieconfiguratie:
   1. Selecteer vanuit het hardwareconfiguratiescherm of softwareinterface het DIC-prisma dat is afgestemd op jouw objectief (bijvoorbeeld 'DIC III' voor een 63x objectief).
   2. Plaats het geselecteerde prisma in het lichtpad.
4. Stel de polarisator en DIC-schuifregelaar aan voor optimaal contrast:
   1. Draai de analyzer (polarisator) totdat de achtergrond in de 'Live'-afbeelding donker of zeer zwak lijkt.
   2. Pas tijdens het bekijken van het livebeeld langzaam de positie van de DIC-schuifregelaar in kleine stappen aan.
   3. Optimaliseer totdat cellulaire kenmerken (bijv. membranen, kernen) verschijnen met een duidelijk schaduwwerpend, pseudo-driedimensionaal reliëf tegen een neutraal grijze achtergrond.
5. Stel de verlichtingsgolflengte voor DIC in op een waarde in het zichtbare bereik (bijv. 488 nm of 546 nm).
6. Pas de transmissieintensiteit (laser- of lampvermogen) en de detectorversterking voor het doorgezonden lichtkanaal aan om een helder beeld zonder verzadiging te bereiken.
7. Verkrijg de DIC-afbeelding.

5. Z-stack acquisitie voor driedimensionale reconstructie

OPMERKING: Voordat je de Z-stack definieert, configureer je alle beeldparameters (laservermogen, versterking, gaatje, pixelgrootte) op één enkel, optimaal brandpuntsvlak zoals beschreven in Sectie 3. Dit zorgt voor consistente instellingen in alle optische secties.

1. Selecteer in het tabblad 'Acquisitie' de 'Z-stack'-modus.
2. Definieer het volume van belang:
   1. Met een snelle live scan richt je op de bovenste structuur van interesse.
   2. Klik op 'Eerst instellen' (of 'Top').
   3. Focus zorgvuldig naar de onderste structuur van interesse.
   4. Klik op 'Set Last Set' (of 'Bottom'). De software toont de totale diepte.
3. Stel de Z-stapgrootte in om te voldoen aan het Nyquist-bemonsteringscriterium in axiale richting. (typisch d_r/2.3, waarbij d_r de axiale resolutie is). Voor een 63x/1,4 NA olieobjectief gebruik 0,3-0,4 μm.
4. Alternatief kun je de knop 'Optimal' of 'Nyquist' van de software gebruiken om de stapgrootte automatisch te berekenen.
5. Configureer beeldparameters (laservermogen, versterking, gaatje = 1 AE) voor elk kanaal zoals beschreven in sectie 3. Voor zwakke signalen kun je overwegen het laservermogen of -versterking iets te verhogen ten opzichte van een enkele 2D-afbeelding.
6. Begin met de acquisitie om de volledige beeldstack te verzamelen.
   OPMERKING: Totale verwervingstijd = (Frametijd van een enkele slice) × (Aantal slices)
   Plan dienovereenkomstig, vooral voor live monsters.
7. 3D-reconstructie en visualisatie:
   1. Gebruik de 'Processing'-module van de software (bijvoorbeeld de 3D-projectiefunctie) of open de image stack in speciale software zoals ImageJ/Fiji.
   2. Genereer maximale intensiteitsprojecties (MIP) om alle in-focus signalen in één 2D-afbeelding te bekijken.
   3. Voor een echte 3D-weergave pas je volume rendering toe. Pas de helderheid, dekking en verlichting aan waar nodig.
   4. Genereer orthogonale aanzichten (XZ- en YZ-doorsneden) om de axiale omvang en registratie te inspecteren.

6. Time-lapse beeldvorming voor levende cellen

1. Bereid levende cellen voor zoals beschreven in Sectie 1.2. en plaats de schotel op het voorverwarmde microscooppodium binnen de milieukamer.
2. Laat het monster minstens 45-60 minuten acclimatisera zoals beschreven in sectie 2.6 om stabilisatie te waarborgen.
3. Navigeer naar een gezichtsveld met gezonde, goed gespreide cellen en verkrijg één hoogwaardige snapshot met parameters geoptimaliseerd volgens Sectie 3.5.
4. Activeer het actieve focus stabilisatiesysteem (bijv. Definite focus of iets dergelijks). Dit is niet onderhandelbaar voor langetermijnexperimenten om thermische drift te compenseren.
5. Selecteer in het tabblad 'Verwerving' de modus 'Tijdreeks'.
6. Selecteer de juiste beeldvormingsmodus op basis van de vereiste balans tussen snelheid, resolutie en fototoxiciteit:
   1. Voor maximale ruimtelijke resolutie in minder dynamische processen, kies de modus 'SR' (SuperResolution).
   2. Voor een balans die geschikt is voor veel organeldynamiek, kies 'SR 2 Y ' of 'SR 4 Y ' (versnelde superresolutiemodi).
   3. Voor zeer snelle beeldvorming zonder superresolutie kies je 'Confocal' of 'Co 2 Y'-modus.
7. Definieer de experimentele tijdlijn: Stel de totale duur van het experiment en het tijdsinterval (Δt) tussen opeenvolgende frames in. (bijv. 5-30 s voor mitochondriale motiliteit)
8. Optimaliseer beeldparameters om fotoschade te minimaliseren:
   1. Begin met het laagste laservermogen dat een detecteerbaar signaal oplevert.
   2. Pas de detectorversterking aan binnen het lineaire bereik (600-850 V) om een werkbaar signaalniveau te bereiken, waarbij versterking wordt verkiezen boven laservermogensverhogingen.
   3. Gebruik de snelste scansnelheid (kortste pixel-dwelltijd) die compatibel is met de beeldkwaliteitseisen.
9. Begin met de time-lapse acquisitie. Houd de eerste paar frames in de gaten op focusstabiliteit en celgezondheid.

7. Grote-oppervlak tegelscanbeeldvorming

1. Selecteer in het tabblad 'Verwerving' de modus 'Tegelscan'.
2. Definieer de tegelregio met een van twee methoden:
   1. Lay-out-gebaseerd: Specificeer het aantal tegels in de X- en Y-richting (bijv. 3 x 3).
   2. ROI-gebaseerd: Teken handmatig een rechthoek over de 'Live'-afbeelding om het interessegebied te definiëren. De software berekent automatisch het aantal benodigde tegels.
3. Stel de overlap tussen aangrenzende tegels in op 10-15%.
   OPMERKING: Deze overlap levert voldoende informatie voor het stitching-algoritme van de software om een naadloos samengesteld beeld te creëren.
4. Configureer beeldparameters (laservermogen, versterking, resolutie) voor één tegel zoals je zou doen voor een statisch beeld.
   OPMERKING: Voor zeer grote betegelde gebieden kun je overwegen een snellere scanmodus te gebruiken (bijvoorbeeld 'Co 2 Y') om de totale verwervingstijd praktisch te houden en fotobleaching te minimaliseren.
5. Begin met het betegelen verwerven. De software zal de tegels automatisch verzamelen en samenvoegen.
6. Na het verkrijgen inspecteer je het geborduurde beeld zorgvuldig, vooral bij tegelranden, op eventuele artefacten. Gebruik indien nodig de handmatige aanpassingstools van de software.

8. Superresolutiebeeldvorming met behulp van de multiplexed arraydetector

1. Navigeer in het tabblad 'Acquisitie' naar de modusselector, klik op 'Smart Setup' en selecteer 'Airyscan'-modus. Kies vervolgens 'SuperResolution' als bedrijfsmodus voor de multiplexed arraydetector.
2. Kies de specifieke verwervingsmethode op basis van experimentele prioriteiten:
   1. 'SR'-modus: Voor de hoogst mogelijke ruimtelijke resolutie (~120 nm lateraal). Gebruik voor vaste samples.
   2. 'SR 2 Y'-modus: Biedt een balans tussen resolutie en snelheid.
   3. 'SR 4 Y'-modus: Snelste superresolutiemodus (theoretisch tot ~25 fps lijnsnelheid), geoptimaliseerd voor live-cell imaging om lichtdosis te minimaliseren.
   4. 'Co 2 Y'-modus: Biedt confocaalachtige beeldsnelheid met een verbeterde signaal-ruisverhouding, wanneer superresolutie niet vereist is.
      OPMERKING: De resolutiewaarden (bijv. 120 nm) zijn systeemspecificaties onder ideale omstandigheden¹². De daadwerkelijke resolutie hangt af van samplevoorbereiding, signaal-ruisverhouding en correcte verwerking.
3. Configureer beeldparameters (laservermogen, detectorversterking).
   1. Voor livecelbeeldvorming begin je met een lagere laserkracht dan in confocale modus om fotoschade te verminderen.
   2. Voor zwakke, vaste samples kan een hogere lasersterkte en/of versterking nodig zijn om een voldoende signaal-ruisverhouding te bereiken.
   3. Vind het minimale laservermogen dat een schoon, hoogcontrast beeld oplevert in 'Live'-modus.
4. Stel de pixelgrootte en de dwell-tijd in.
   1. Om de verbeterde resolutie vast te leggen, stel je de pixelgrootte in die voldoet aan het Nyquist-criterium: pixelgrootte ≤(gewenste resolutie / 2,3). Voor SR-modus (doel 120 nm) stel je pixelgrootte in ≤~52 nm.
   2. Gebruik de 'Optimal'- of 'Nyquist'-knop van de software om dit automatisch te berekenen indien beschikbaar.
5. Haal het beeld op. De ruwe data bevat gemultiplexte signalen en is nog niet superresolved.
6. Verwerk de verkregen data om superresolutie te bereiken:
   1. Navigeer naar de verwerkingsmodule van de software.
   2. Selecteer de dataset en kies de functie 'SuperResolution Processing'.
   3. Begin met de 'Auto'-instellingen. Voor lowSNR-gegevens kun je handmatig 'Sterkte' en 'Ruisfilter' aanpassen om de scherpte te verbeteren zonder artefacten te introduceren.
   4. (Optioneel) Voor de hoogste nauwkeurigheid, vooral in 3D-stacks, pas je een extra joint deconvolution (jDCV) stap toe.
   5. Voer verwerking uit. Vergelijk verwerkte en onverwerkte weergaven om de verbetering van echte details te verifiëren.
7. (Optioneel) Voor kwantitatieve vergelijking van de signaal-ruisverhouding (SNR) tussen modi:
   1. Neem beelden van hetzelfde monster in verschillende modi.
   2. In analysesoftware definieer je een interessegebied (ROI) op een uniforme structuur en meet je de gemiddelde signaalintensiteit.
   3. Definieer een achtergrond-ROI en meet de standaardafwijking van de achtergrondintensiteit.
   4. Bereken SNR = (Gemiddelde Signaal) / (Standaardafwijking van de achtergrond).
8. (Optioneel) Voor empirische systeemresolutiemeting met behulp van fluorescerende kralen:
   1. Maak een monster van 100 nm fluorescerende kralen klaar.
   2. Verkrijg een Zstack van een geïsoleerde bead in SR-modus met Nyquist-sampling.
   3. Verwerk de stack met superresolutie en (optioneel) jDCV.
   4. Gebruik de software 'PSF Measurement' -tool om een 3D Gaussian te plaatsen en registreer de volledige breedte bij halfmaximum (FWHM) waarden.

Results

Multikleurige fluorescentiebeeldvorming
Multicolor fluorescentiebeeldvorming van vaste COS7-cellen werd uitgevoerd zoals beschreven in Sectie 3. Antilichamen tegen α-tubulin (microtubuli) en TOMM20 (mitochondriën) werden gebruikt met DAPI nucleaire tegenkleuring. Zoals weergegeven in Figuur 1, werden kernen (blauw), mitochondriën (groen, Alexa Fluor 488) en microtubuli (rood, Alexa Fluor 568) duidelijk afgebakend met hoge specificiteit en...

Discussion

Het hier geïntegreerde protocol biedt een uitgebreide routekaart voor het implementeren van de geavanceerde beeldvormingsmogelijkheden van een modern confocaal microscoopsysteem uitgerust met een multiplexed array superresolutiedetector, binnen een duurzaam gedeeld bronkader. Deze sectie synthesiseert de kritieke aspecten van de methode, de praktische implementatie en de positie ervan binnen het bioimagingveld. Succesvolle uitvoering van dit protocol hangt af van verschillende cruciale s...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
COS7 cellen	ATCC (of vergelijkbaar)	CRL-1651	Afrikaanse groene aapje nier fibroblast cellijn. Gebruikt voor de bereiding van vaste cel monsters voor multicolor super-resolutie beeldvorming
Ezel anti-muis IgG, Alexa Fluor 568-conjugaat	Invitrogen (of vergelijkbaar)	A10037	Secundaire antilichaam voor microtubuluskleuring. Gebruikt bij een verdunning van 1:500
Dulbecco‘s aangepast arendsmiddel (DMEM), hoge glucose	Gibco (of vergelijkbaar)	11965092	Standaard kweekmedium voor COS7 cellen, aangevuld met 10% FBS.
Foetaal bovien serum (FBS), hitte-inactiveerd	Gibco (of vergelijkbaar)	10082147	Serumsupplement gebruikt bij 10% (v/v) in alle celkweekmedia.
Glazen bodem beeldvormingsschaal (35 mm, µ-Schaal, #1.5 polymeer deksel, 0,17 mm dikte)	ibidi (of vergelijkbaar)	81156	Substraat voor celbeplating en beeldvorming. Cruciaal voor compatibiliteit met hoog-NA olie-immersie objectieven.
Beeldverwerking & analysesoftware (ZEN modules)	Carl Zeiss AG	ZEN 3.5 (blauw)	Gebruikt voor 3D reconstructie, super-resolutie verwerking (bijv. Airyscan Processing), PSF meting en SNR analyse.
ImageJ / Fiji	Open Source	N/A	Gebruikt voor aanvullende 3D reconstructie, het genereren van orthogonale weergaven en algemene beeldanalyse.
Immersie-olie (brekingsindex = 1.518)	Carl Zeiss (of vergelijkbaar)	444960-0000-000	Voor gebruik met olie-immersie objectieven (bijv. 63x/1.4 NA).
Laser-scanning confocale microscoop systeem met multiplex array detector (bijv. ZEISS LSM 900 met Airyscan 2)	Carl Zeiss AG	LSM 900 (Airyscan 2)	De primaire beeldvormingsplatform gebruikt voor alle confocale en super-resolutie modi beschreven in het protocol.
Minimum Essentieel Medium (MEM) met Earle‘s Salts	Gibco (of vergelijkbaar)	11095080	Standaard kweekmedium voor Hep3B cellen, aangevuld met 10% FBS.
Muis anti-α-tubuline monoklonaal antilichaam (Clone DM1A)	Sigma-Aldrich (of vergelijkbaar)	T6199	Primair antilichaam voor het labelen van microtubuli. Gebruikt bij een verdunning van 1:500
Paraformaldehyde (PFA), 4% in PBS	Jinpan (of vergelijkbaar)	TBS5083	Fixatief voor cellen. Gebruik bij kamertemperatuur gedurende 15 min. Omgaan met passende voorzorgsmaatregelen.
Fenolroodleuvingsmedium	Gibco (of vergelijkbaar)	21063029	Laag-autofluorescentie medium gebruikt voor live-celbeeldvorming. Vooraf geëquilibreerd met 5% CO2 bij 37°C voor gebruik.
Fosfaat-gebufferd zout (PBS), 1X, pH 7.4	CellWorld (of vergelijkbaar)	C0162-311	Gebruikt als was- en verdunningsbuffer gedurende het hele protocol.
ProLong goud antifade-mountant	Invitrogen (of vergelijkbaar)	P36930	Verharde montage medium voor het behoud van fluorescentie in gefixeerde monsters.
Triton X-100	Sigma-Aldrich (of vergelijkbaar)	T8787	Gebruikt bij 0,1% (v/v) voor celpermeabilisatie
Tween-20	Sigma-Aldrich (of vergelijkbaar)	P9416	Gebruikt bij 0,05% (v/v) in PBS (PBST) voor wasstappen na antilichaam incubaties.
Bovien serum albumine (BSA), Fractie V	Sigma-Aldrich (of vergelijkbaar)	A7906	Gebruikt bij 1% (w/v) in PBS voor blokkering en als component van antilichaam verdunningsbuffer.
DAPI (4‘6-diamidino-2-fenylindol)	Sigma-Aldrich (of vergelijkbaar)	D9542	Kern counterstain. Gebruikt bij een eindconcentratie van 1 µg/mL.
Ezel anti-konijn IgG, Alexa Fluor 488-conjugaat	Invitrogen (of vergelijkbaar)	A21206	Secundaire antilichaam voor mitochondriale kleuring. Gebruikt bij een verdunning van 1:500
Fluorescente microspheren (Kooltjes), 100 nm diameter	Invitrogen (bijv. TetraSpeck™) of vergelijkbaar	T7279	Gebruikt voor empirische meting van de puntverspreidingsfunctie (PSF) en resolutie van het systeem.
Hep3B cellen die stabiel EGFP-mitochondria tot expressie brengen	IMMOCELL	IM-H367	Menselijke hepatoma cellijn gemodificeerd om stabiel EGFP tot expressie te brengen gericht op de mitochondriale matrix. Gebruikt voor live-cel time-lapse beeldvorming.
HEPES bufferoplossing, 1 M	Gibco (of vergelijkbaar)	15630080	Gebruikt bij een eindconcentratie van 25 mM in beeldvormingsmedium voor pH stabilisatie tijdens live beeldvorming buiten een CO2 incubator.
Hoog-precisie dekglaas (#1.5, 0,17 mm dikte)	Marienfeld (of vergelijkbaar)	107052	Gebruikt voor het monteren van gefixeerde monsters.
Microscoop bedieningssoftware (bijv. ZEN blauwe editie)	Carl Zeiss AG	ZEN 3.5 (blauw)	Gebruikt voor systeem controle, beeldverwerving en basisverwerking.
Objectieflens: Plan-apochromat 63x/1.40 NA Olie DIC	Carl Zeiss AG	421462-9900-000	Primair objectief gebruikt voor hoog-resolutie beeldvorming.
Konijn anti-TOMM20 polyklonaal antilichaam	Abcam (of vergelijkbaar)	ab186735	Primair antilichaam voor het labelen