Methodenartikel

Reproducerbare computationele workflow voor geneesmiddelenontdekking om netwerkfarmacologie en moleculaire dockinganalyses te standaardiseren

462 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70171

⸱

24 april 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Institute of TCM Constitution and Preventive Treatment of Disease, Wangqi Academy of Beijing University of Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, 2School of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, 3School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, 4Sunsimiao Hospital, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit gestandaardiseerde protocol verenigt netwerkfarmacologie en moleculaire koppeling met Molecular Dynamics (MD)-simulaties voor geneesmiddelenontdekking. Het stelt kwantitatieve screeningscriteria en reproduceerbare stappen vast, geschikt voor multi-target geneesmiddelscreening met behulp van openbare datasets en verbetert de betrouwbaarheid van resultaten.

Samenvatting

Netwerkfarmacologie en moleculaire docking worden veel toegepast bij geneesmiddelenontdekking, maar gefragmenteerde workflows en inconsistente operaties ondermijnen vaak de reproduceerbaarheid van resultaten. Hier wordt een gestandaardiseerd protocol beschreven dat deze benaderingen integreert in een reproduceerbaar kader voor geneesmiddelscreening en mechanismeonderzoek, waarbij de workflow is georganiseerd in drie opeenvolgende fasen: datavoorbereiding, computationele analyse en validatie. In de voorbereidingsfase worden verbindingsbibliotheken uit openbare databases gefilterd via Absorption, Distribution, Metabolism, Excrection, and Toxicity (ADMET)-criteria, waaronder orale biobeschikbaarheid, geneesmiddelgelijkheid en toxiciteitsvoorspelling, terwijl potentiële therapeutische doelen worden verkregen via doelwitvoorspelling en integratie van ziektegerelateerde databases om kandidaten voor geneesmiddel-ziekteinteractie volledig te identificeren. In de computationele analysefase ondergaan overlappende doelen topologische analyses van Gene Ontology (GO) en Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) verrijkingsanalyses en eiwit-eiwitinteractie netwerktopologische analyses om kerndoelwitten te identificeren; moleculaire docking is geconfigureerd met twee gestandaardiseerde optionele strategieën met duidelijke voordelen. De tweestaps-progressieve strategie gebruikt AutoDock Vina voor high-throughput voorlopige screening van de verbindingsbibliotheek, gevolgd door nauwkeurige re-docking met YASARA, die valse positieven uit high-throughput screening elimineert en eiwit-ligandencomplexen genereert die native compatibel zijn met latere YASARA molecular dynamics (MD) simulaties om structurele afwijkingen veroorzaakt door cross-software formatconversie te voorkomen. De éénstapsstrategie voltooit het volledige dockingproces uitsluitend via YASARA, wat de operationele workflow vereenvoudigt, de experimentele efficiëntie verbetert en volledig toepasbaar is voor specifieke onderzoeksdoelen. In de validatiefase evalueren gestandaardiseerde MD-simulaties de stabiliteit van ligand-eiwitcomplexen via kernmetrieken van root mean square deviation (RMSD) en root mean square fluctuation (RMSF). Deze uniforme, reproduceerbare pijplijn verbetert de betrouwbaarheid van netwerkfarmacologie en dockingstudies en faciliteert cross-study vergelijkingen in computationele geneesmiddelenontdekking.

Inleiding

Netwerkfarmacologie vertegenwoordigt een onderzoeksbenadering die de interactiepatronen tussen geneesmiddelen en het organisme ontcijfert vanuit een holistisch netwerkperspectief1. Door het interactienetwerk te construeren en te analyseren dat de geneesmiddelcomponent-doelziekte-biologische route omvat, identificeert het kwantitatief de belangrijkste moleculen, kernroutes en synergetische mechanismen waardoor geneesmiddelen hun effecten uitoefenen. Dit analytische kader sluit aan bij de internationale standaard voor netwerkfarmacologie, die de nadruk legt op multi-omics data-integratie en topologische netwerkanalyse, en uiteindelijk de algehele therapeutische effecten van geneesmiddelen verduidelijkt, mogelijke bijwerkingen voorspelt of systematische richtlijnen biedt voor de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen. Een dergelijke strategie is met succes toegepast in diverse vakgebieden, waaronder het ontcijferen van signaalroutes die geassocieerd zijn met doeleiwitten van niet-steroïde ontstekingsremmers (NSAID's) tegen COVID-19, en het onderzoeken van het werkingsmechanisme van de behandeling van ziekten zoals osteosarcoom en type 2 diabetesmellitus 2,3,4. Dit voordeel drijft de paradigmaverschuiving van enkelvoudige naar multidoelgerichte geneesmiddelenontdekking in de moderne farmacologie.

Moleculaire docking is een computationele simulatietechniek die gebruikmaakt van algoritmische modellering om de ruimtelijke compatibiliteit en interactiesterkte tussen kleine moleculeverbindingen en biologische macromoleculaire doelen te beoordelen, waardoor optimale bindingsconfiguraties 5,6 worden voorspeld. Morris et al. introduceerden AutoDock4 en AutoDockTools4, die geautomatiseerd docken met selectieve receptorflexibiliteit mogelijk maken; deze tools zijn gebaseerd op moleculaire dynamica en moleculaire geometrie, en evalueren bindingsstabiliteit en affiniteit door energieverschillen tussen moleculen7 te berekenen. Klassieke tools zoals AutoDock gebruiken semi-flexibele ligand-receptormodellering en zijn een gouden standaard geworden voor het evalueren van bindingsaffiniteit in dergelijke simulaties7.

In geneesmiddelenontdekking worden netwerkfarmacologische screeningstechnieken vaak gebruikt om belangrijke componenten te identificeren, die vervolgens worden gevalideerd via moleculaire docking om hun binding met doeleiwitten te beoordelen, wat uiteindelijk de relatie tussen het geneesmiddel en de ziektevaststelt. Huidige toepassingen hebben echter vaak last van inconsistent experimenteel ontwerp, niet-gestandaardiseerde operationele procedures en ontbrekende validatiestappen. Een systematische evaluatie van netwerkfarmacologiestudies gerelateerd aan kruidengeneeskunde heeft dit wijdverspreide probleem gedocumenteerd, waarbij wordt opgemerkt dat data-heterogeniteit tussen databases en onvoldoende experimentele validatie leiden tot onreproduceerbare resultaten9. Deze beperkingen ondermijnen niet alleen de reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van onderzoeksresultaten, maar belemmeren ook de vertaling van computationele voorspellingen naar experimentele validatie. In tegenstelling tot geïsoleerde netwerkfarmacologiestudies zonder experimentele validatie of gefragmenteerde dockingworkflows met willekeurige parameters, integreert dit protocol beide benaderingen met gestandaardiseerde drempels en stapsgewijze operaties. Dit kader elimineert subjectieve parameterselectie, waardoor de workflow door verschillende operators met consistente resultaten kan worden gerepliceerd.

Daarom kan het opzetten van gestandaardiseerde operationele procedures om potentiële geneesmiddeldoelen en -routes te identificeren via netwerkfarmacologische screening, gecombineerd met moleculaire koppeling om geneesmiddel-doelwitbindingsactiviteit te valideren, experimenteel bewijs leveren voor het bestuderen van geneesmiddelmechanismen en het screenen van kandidaatgeneesmiddelen10. Dit protocol is bijzonder geschikt voor multi-target geneesmiddelscreening van geneesmiddelcomponenten en synthetische kleine moleculen met behulp van publiek beschikbare omics, chemische en eiwitstructuurdatabases; het is niet toepasbaar op doelwitten zonder opgeloste kristalstructuren, of single-target weesgeneesmiddelscreening zonder bekende ziektegerelateerde interactienetwerken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol omvat uitsluitend computationele analyses van publiek beschikbare databases en maakt geen gebruik van menselijke proefpersonen, gewervelde dieren of biologisch weefsel. Alle samenvattende workflows die in deze sectie worden beschreven, zijn geïllustreerd in Figuur 1.

figure-protocol-1
Figuur 1: Samenvatting van de workflow. Groene rechthoeken stellen alternatieve geneesmiddelcomponenten voor, rode rechthoeken staan voor ziekten, gele ellips bevat de gebruikte websites en software, oranje rechthoeken bevatten de verkregen bestanden of gegevens, evenals belangrijke stappen, en paarse ruiten geven de uiteindelijke gewenste resultaten aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Verwerving van geneesmiddelcomponenten en doelwitten

  1. Doorzoek de PubChem-database (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) met chemische namen als trefwoorden om de bijbehorende SMILES (Simplified Molecular-Input Line-Entry System) strings te verkrijgen.
  2. Bezoek de ADMETlab 3.0-website (https://admetlab3.scbdd.com/), selecteer de optie ADMET Evaluatie onder het tabblad Services, voer de SMILS-strings in en klik op de VERZENDKNOP .
  3. Filter de ADMET-resultaten op indicatoren: Absorptie, Distributie, Metabolisme, Uitscheiding, Toxiciteit, Medicinale Chemie en Toxicoforregels. Behoud alleen verbindingen die voldoen aan alle vooraf gedefinieerde drempelcriteria voor elke indicator (Tabel 1).
  4. Bezoek de ProTox 3.0-website (https://tox.charite.de/protox3/index.php?site=home), voer de SMILES-reeksen van de gefilterde verbindingen in, selecteer de TOX PREDICTION-module , vink alle gewenste voorspellingsopties aan (bijv. orgaantoxiciteit, kankerverwekkendheid) en voer de voorspelling uit.
  5. Filter verbindingen met voorspelde toxiciteiten die de vooraf gedefinieerde veiligheidsdrempels overschrijden op basis van de ProTox 3.0-resultaten (Tabel 2).
  6. Verzamel de verbindingen die zowel ADMET- als ProTox 3.0-screening doorstaan in een gestructureerde geneesmiddelcomponentendatabase (bijvoorbeeld Excel- of CSV-formaat) met kolommen voor de naam van de verbinding, SMILES en screeningsstatus.
  7. Bezoek de website SwissTargetPrediction (https://swisstargetprediction.ch/), selecteer Homo sapiens in het keuzemenu voor organismen, voer de SMILS-strings van de componenten in in de database van geneesmiddelcomponenten, klik op de knop Doelwitten voorspellen en verzamel alle voorspelde doelen met een Probability score hoger dan 0.
  8. Bezoek de SEA (Similarity Ensemble Approach) website (https://sea.bkslab.org/) en voer dezelfde SMILS-strings in die hierboven voor doelvoorspelling zijn gebruikt en filter de resultaten zodat alleen vermeldingen in het Target Key-veld behouden blijven die eindigen op _Human en een p-waarde onder 0,05 hebben.
  9. Combineer de doelenlijsten verkregen van SwissTargetPrediction en SEA tot één enkele medicijn-actiedoelbibliotheek. Verwijder dubbele doelen en standaardiseer doelnamen met officiële gensymbolen (bijvoorbeeld volgens HGNC-richtlijnen) via Uniprot (https://www.uniprot.org/).
    OPMERKING: De drug-action target bibliotheek kan als CSV-bestand worden opgeslagen voor later gebruik.

Tabel 1: ADMETlab 3.0 drempelcriteria voor geneesmiddelveiligheidsscreening. De tabel vat de aanbevolen cutoffwaarden en classificatiebereiken samen voor belangrijke fysicochemische eigenschappen, ADME-parameters, metabolisme-interacties, toxiciteitseindpunten, toxiciteitsroutes en toxicoforregels. Voorspellingen zijn onderverdeeld in drie risiconiveaus (laag, gemiddeld en hoog) op basis van waarschijnlijkheidswaarden (< 0,3, 0,3 - 0,7, > 0,7) of kwantitatieve bereiken, waardoor systematische evaluatie van verbindingveiligheidsprofielen tijdens vroege geneesmiddelenontdekking mogelijk is. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: ProTox-3.0 drempelcriteria voor toxiciteitsvoorspelling bij geneesmiddelenontdekking. De tabel vat de belangrijkste toxiciteitseindpunten samen die door ProTox 3.0 zijn voorspeld, met focus op parameters die cruciaal zijn voor de beoordeling van geneesmiddelveiligheid tijdens vroege geneesmiddelontdekking. Elk eindpunt geeft een binaire classificatie (Actief of Inactief) terug, vergezeld van een kansscore (0-1), waarbij Actief het potentiële toxiciteitsrisico aangeeft. Prioriteit moet worden gegeven aan orgaantoxiciteiten (hepatotoxiciteit, cardiotoxiciteit), toxiciteitseindpunten (carcinogeniteit, mutageniciteit, immunotoxiciteit) en remming van het CYP-metabolisme, aangezien dit belangrijke oorzaken zijn van klinisch uitval. Meerdere actieve hits over eindpunten wijzen op een breed toxiciteitspotentieel en rechtvaardigen deprioritering van verbindingen. Acute toxiciteit wordt beoordeeld via voorspelde LD50- en GHS-klassen, waarbij klasse 1 - 3 (< 300 mg/kg) als zeer toxisch wordt beschouwd. Kansscores geven betrouwbaarheidsniveaus voor elke voorspelling. Klik hier om deze tabel te downloaden.

2. Verwerving van ziektedoelen

OPMERKING: Bij het screenen van databases moet je de benamingsconventies van doelgenen standaardiseren om weglatingen veroorzaakt door naamverschillen te voorkomen.

  1. Toegang tot vijf ziektegerelateerde databases: OMIM (https://www.omim.org/), Disgenet (https://disgenet.com/), TTD (https://ttd.idrblab.cn/), GeneCards (https://www.genecards.org/) en PharmGkb (https://www.pharmgkb.org/). Pas de volgende database-specifieke screeningscriteria toe: voor GeneCards, filter vermeldingen met een Relevantiescore ≥ 1,0; voor DisGeNET, selecteer vermeldingen die horen bij de doelziekte; voor PharmGKB beperk je resultaten tot gen-gerelateerde vermeldingen door de Gen-optie te kiezen; voor TTD bewaar je vermeldingen waarbij de kolom Ziekte overeenkomt met de doelziekte.
  2. Gebruik voor elke database de officiële naam van de doelziekte (bijv. de ziekte van Alzheimer) als zoekwoord om alle bijbehorende doelwitten op te halen.
  3. Verzamel de doellijsten uit alle vijf databases in één spreadsheet. Verwijder dubbele doelen door gensymbolen uit verschillende lijsten te vergelijken.
  4. Standaardiseer alle resterende doelnamen met officiële gensymbolen via Uniprot om nomenclatuurinconsistenties op te lossen. Sla de gestandaardiseerde, gededupliceerde lijst op als een ziekte-doelbibliotheek (CSV- of Excel-formaat).
    OPMERKING: De ziektedoelbibliotheek kan worden opgeslagen samen met de geneesmiddel-actiedoelbibliotheek (Stap 1.9) voor later gebruik in Stap 3.

3. Verwerving van gemeenschappelijke doelen voor geneesmiddelziekten

  1. Toegang tot de Venny 2.1.0 webtool (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/). Importeer de medicijn-actiedoelbibliotheek (Stap 1.9) en ziektedoelbibliotheek (Stap 2.4) in de twee invoervelden van Venny 2.1.0 om een Venn-diagram te maken dat de overlap tussen de twee doelsets toont.
  2. Haal de snijpunten uit de resultaten van het Venn-diagram. Label deze als veelvoorkomende geneesmiddel-ziektedoelen (potentiële interactiepunten) en sla ze op als een CSV-bestand.

4. Constructie van eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerken en kerndoelanalyse

  1. Toegang tot de STRING-database (https://cn.string-db.org/). Selecteer Homo sapiens als het Organisme in het dropdownmenu.
  2. Importeer de veelvoorkomende geneesmiddelen-ziektedoelen (Stap 3.2) in het invoerveld STRING. Stel de minimaal vereiste interactiescoreparameter in op hoog vertrouwen (0,700) en klik op Zoeken om PPI-gegevens te genereren. Exporteer de PPI-gegevens als een TSV (tab-separated values) bestand.
  3. Open de Cytoscape-software met de CytoNCA-plugin vooraf geïnstalleerd. Importeer het PPI TSV-bestand in Cytoscape met behulp van het Bestand > Importeren > netwerk vanuit het Bestandsmenu .
  4. Start de CytoNCA-plugin door te klikken op Apps > CytoNCA > Open. Selecteer vijf referentiemetrics voor core target screening: Betweenness, Closeness, Degree, Eigenvector en LAC.
    OPMERKING: Vijf belangrijke topologische metrics zijn namelijk Betweenness (betweenness-centraliteit, het meten van de frequentie van een doel dat op alle kortste paden in het netwerk voorkomt), Closeness (closeness-centraliteit, die de gemiddelde kortste padlengte van een doel naar alle andere doelen in het netwerk weerspiegelt), Degree (lokale verbindingsgraad, die het aantal directe interacties tussen een doel en andere doelen kwantificeert), Eigenvector (eigenvectorcentraliteit, waarbij zowel de eigen connectiviteit van het doel als het belang van zijn verbonden doelen worden weggegeven), en LAC (lokale gemiddelde connectiviteit, waarbij de verbindingsdichtheid tussen de direct aangrenzende knooppunten van een doel wordt beoordeeld).
  5. Start netwerkanalyse door op het menu Tools > Analyze Network te klikken en vervolgens op OK te klikken. Exporteer de analyseresultaten naar een CSV-tabel.
  6. Bereken de mediaanwaarde voor alle vijf de meetwaarden en behoud doelen die de mediaan overtreffen of overtreffen. Herhaal stap 4.5 meerdere keren totdat er nog 10 tot 20 doelen over zijn.
  7. Rangschik de overige doelen volgens de Degree-metriek (van hoog naar laagst) en selecteer voorlopig de top 10 doelen als kerngenen. Sla de kerngenenlijst op als een CSV-bestand.
    1. Om valse positieven te verminderen en ervoor te zorgen dat alleen structureel geschikte doelwitten doorgaan tot docking, voer verdere evaluaties uit op structurele haalbaarheid en drogbaarheid: controleer de PDB-database op beschikbare kristalstructuren met hoge resolutie (≤ 2,5 Å) of beoordeel of een betrouwbaar homologiemodel kan worden opgebouwd; gebruik pocketvoorspellingstools om de aanwezigheid van geschikte bindingsplaatsen te bevestigen; en kruisvergelijk met literatuur of functionele databases om gedocumenteerde relevantie voor het ziektepad te verifiëren.
    2. Verlaag prioriteit aan doelen die geen structurele beschikbaarheid, droge pockets of ziekterelevantie hebben voor dockingstudies. GO- en KEGG-verrijkingsanalyses kunnen nog steeds worden uitgevoerd met de volledige kerndoelenlijst uit deze stap, omdat deze geen structurele informatie vereist.
      OPMERKING: Het aantal genen in Stappen 4.6 en 4.7 kan indien nodig worden aangepast. Gewoonlijk blijven er na Stap 4.6 10 tot 20 doelen over, en het behouden van ten minste 10 kerngenen in Stap 4.7 wordt aanbevolen om voldoende datavolume te garanderen voor betrouwbare GO- en KEGG-verrijkingsanalyse en consistente visualisatietrends.

5. GO- en KEGG-verrijkingsanalyse en visualisatie

OPMERKING: Dit deel verduidelijkt genfuncties op het niveau van de cellulaire component, functionele en intracellulaire routes.

  1. Toegang tot de DAVID webtool (https://davidbioinformatics.nih.gov/home.jsp). Selecteer Gene List als invoertype en importeer de kerngenen in het invoerveld.
  2. Stel de Identifier in op OFFICIAL_GENE_SYMBOL en selecteer Homo sapiens in Selecteer soorten. Klik vervolgens op Lijst indienen om de kerngenen te uploaden.
  3. Selecteer voor GO-verrijkingsanalyse de categorieën GOTERM_BP_DIRECT, GOTERM_CC_DIRECT en GOTERM_MF_DIRECT .
  4. Voor KEGG-verrijkingsanalyse selecteert u de categorie KEGG_PATHWAY . Stel de significantiedrempel in op p < 0,05 voor zowel GO- als KEGG-analyses.
  5. Klik op de Functionele Annotatiegrafiek om verrijkingsresultaten te genereren. Exporteer de GO- en KEGG-resultaten als CSV-bestanden. Gebruik R Studio-software met ggplot2 om staafdiagrammen of bubbelgrafieken te maken voor de top 10 verrijkte termen/paden.
    OPMERKING: Het aantal weergegeven termen/paden kan worden aangepast volgens de vereisten.

6. Moleculaire koppeling met Autodock Vina

OPMERKING: Stap 6 en Stap 7 zijn beide moleculaire dockingstappen. Stap 6 gebruikt AutoDock Vina 1.1.2 software, terwijl stap 7 YASARA 10.3.16 gebruikt. Het gebruik van YASARA faciliteert de daaropvolgende YASARA moleculaire dynamica-simulatie. Als de dockingresultaten van AutoDock Vina nodig zijn, moeten de dockingresultaten in YASARA consistent zijn met die van AutoDock Vina. Dit voorkomt discrepanties veroorzaakt door softwareswitching en waarborgt ook de betrouwbaarheid van de validatieresultaten van de moleculaire dynamica-simulatie, met gedetailleerde methode: Open het resultaat "result.pdb" van stap 6.31 met LigPlot+ (Versie 2.3) om een 2D-interactiediagram te genereren, identificeer de sleutelresiduen die met de ligand interageren, selecteer vervolgens de sleutelresiduen in de dockingstap 7.18 van YASARA, en stel de boxgrootte in om de bindingspocket te bedekken, zodat de consistentie van de dockingplaatsen tussen Vina en YASARA wordt gemaximaliseerd. Vervolgens moet bij het selecteren van de optimale dockingresultaten in Stap 7.19 ervoor gezorgd worden dat de belangrijkste interactieresiduen tussen de ligand en de receptor consistent blijven met die geïdentificeerd uit de AutoDock Vina-resultaten. Deze consistentie-eis richt zich op het behoud van essentiële interactiepatronen in plaats van exacte atomaire correspondentie; kleine variaties in de conformaties van perifere residuen worden verwacht door verschillen in krachtveldparametrisatie en sidechain-flexibiliteit. Zolang de kritische interacties met belangrijke residuen van de actieve site behouden blijven, kunnen de dockingresultaten als consistent worden beschouwd voor kruisvalidatiedoeleinden. Als AutoDock Vina-docking (Stap 6) niet vereist is, kan Stap 7 direct worden uitgevoerd.

  1. Verkrijg de SDF (Structure Data File) van de geneesmiddelverbindingen genaamd ligand.sdf uit de PubChem-database door te zoeken naar de bijbehorende SMILES-strings (Stap 1.1).
  2. Open SDF-bestanden met Chem3D-software. Selecteer onder de optie Berekening MM2 en klik op Energie minimaliseren om vrije energie te minimaliseren van de samengestelde structuur.
  3. Sla de geminimaliseerde structuur op als een ligand.mol2-bestand via selectiebestand > Sla op als. Verkrijg het PDB (Protein Data Bank) formaat bestand van de eiwitreceptor van het kerngen uit de RCSB PDB-database (https://www.rcsb.org/; zoek op PDB ID of gennaam) genaamd receptor.pdb.
    1. Geef prioriteit aan structuren met een resolutie ≤ 2,5 Å en opgeloste bindingsplaatsen indien beschikbaar. Bij het selecteren van een structuur controleer je de invoer op volledigheid (bijv. aanwezigheid van alle verwachte domeinen, afwezigheid van grote onopgeloste lussen), mogelijke mutaties die de binding van liganden kunnen beïnvloeden, en of functioneel belangrijke cofactoren (bijv. heem, metaalionen) of co-gekristalliseerde liganden zijn opgenomen.
    2. Voor doelen met bekende oligomere assemblages, overweeg of de monomere of multimere vorm geschikt is voor de onderzoeksvraag; de biologische assemblage kan worden gedownload als dimere of hogere-orde interacties relevant zijn. De gekozen structuur zal in latere stappen verder worden voorbereid, zodat de eerste inspectie helpt complicaties stroomafwaarts te voorkomen.
  4. Open de receptor.pdb met de PyMOL-software. Typ remove organic in de opdrachtregel en druk Enter om kleine-molecuulliganden uit de eiwitstructuur te verwijderen.
    OPMERKING: Als je de co-gekristalliseerde ligand gebruikt om de bindingsplaats te definiëren, noteer dan eerst de 3D-centrumcoördinaten van de ligand, typ dan remove organic in de PyMOL-opdrachtregel en druk Enter om co-gekristalliseerde kleine moleculen te verwijderen; anders voer je direct het commando remove organic uit om co-gekristalliseerde kleine moleculen te verwijderen.
  5. Typ Remove solvent in de opdrachtregel en druk Enter om vrije watermoleculen uit de eiwitstructuur te verwijderen; gebruik het commando select metal_cofactor, resn [naam van het doelcofactorresidu] om functioneel kritische metaalionen of cofactoren (bijv. HEM, Zn2⁺, Mg2⁺) te identificeren en hun behoud in de structuur te bevestigen.
  6. Exporteer de schoongemaakte receptor uit PyMOL als receptor_clean.pdb door op Bestand te klikken > Molecule exporteren > opslaan.
  7. Open receptor_clean.pdb in UCSF Chimera 1.19. Toon de sequentie door te klikken op Tools > Sequence > Sequence om te inspecteren op ontbrekende lussen naast de bindingsplaats (ontbrekende gebieden worden aangegeven door rode omlijnvakjes). Als er ontbrekende lussen aanwezig zijn, bouw ze dan opnieuw op door Structure > Modeller (lussen/verfijning) te selecteren in het menu met het sequentievenster, niet-terminale ontbrekende structuur te selecteren, een passend aantal modellen in te stellen (bijv. 5) en door te gaan met de berekening. Na voltooiing selecteer je het meest redelijke model.
  8. Optimaliseer de structuur in Chimera. Gebruik de Rotamers-tool (Dunbrack-bibliotheek) op geselecteerde residuen om sidechains te optimaliseren, voeg Clashes en H-Bindingen toe via het Columns-menu voor evaluatie en selecteer conformaties met minimale clashes (0 - 1 prefereerd) en gunstige H-bindingen. Voeg vervolgens waterstof toe en wijs ladingen toe met Dock Prep (AMBER ff14SB). Voer tenslotte energieminimalisatie uit met het Minimize Structure-tool, waarbij backbone-atomen worden vastgezet door ze te selecteren (sel @ca, c,n,o), de selectie omgedraaid en Fixed atoms worden ingeschakeld. Sla de verwerkte structuur op als receptor_optimized.pdb door File > Save PDB te selecteren.
    OPMERKING: Sla sidechain-optimalisatie over voor goed geordende residuen. Dock Prep behandelt automatisch protonatie. Minimalisatie moet worden uitgevoerd met de backbone vast.
  9. Open receptor_optimized.pdb opnieuw in PyMOL en definieer de canonieke bindingsplaats. Als er een co-gekristalliseerde ligand aanwezig is, gebruik dan de coördinaten om het raster te centreren: registreer het centrum van de ligand en verwijder het vervolgens met remove organic. Als er geen co-gekristalliseerde ligand beschikbaar is, definieer dan de bindingsplaats op basis van bekende sleutelresiduen uit de literatuur (bijv. select binding_site, resi XXX-XXX) of door visueel de vermeende bindingspocket te identificeren met pocketvoorspellingstools om de visuele beoordeling te valideren. Noteer de 3D-centrumcoördinaten (x/y/z) van de gedefinieerde site voor gridbox-opzet.
    OPMERKING: De hier geregistreerde coördinaten worden gebruikt om het AutoDock Vina-raster te centreren. Voor een residu-gebaseerde definitie moet het geometrische centrum van de geselecteerde residuen worden berekend; voor een pocket die visueel of met voorspellingstools is geïdentificeerd, wordt het centrum van de caviteit gebruikt. Bij het definiëren van de bindingsplaats moet worden overwogen of de beoogde dockingstrategie zich richt op de orthosterische (actieve) site of een allosterische site. Voor orthosterische targeting moet de bindingsplaats worden gedefinieerd op basis van een co-gekristalliseerde ligand of geconserveerde actieve site-residuen die in de literatuur zijn gerapporteerd. Voor allosterische targeting kunnen pocketvoorspellingstools worden gebruikt om potentiële allosterische sites te identificeren, met name voor doelen met bekende allosterische regelgeving. Bij gebrek aan voorafgaande informatie kan globale koppeling gevolgd door clustering van voorspelde bindingshotspots helpen bij het identificeren van potentiële allosterische sites. Deze flexibiliteit stelt het protocol in staat zowel orthosterische als allosterische geneesmiddelontdekkingscampagnes te accommoderen.
  10. Exporteer de uiteindelijke geoptimaliseerde structuur van PyMOL als receptor.pdb door te klikken op Bestand > Molecule exporteren > opslaan.
  11. Open receptor.pdb in AutoDock Tools 4.2.6 door te klikken op Bestand > Lezen Molecuul. Definieer flexibele residuen. Klik op Bewerken > Flexibele Residuen > Selecteer Residuen en kies bindingsplaatsresiduen die conformationele veranderingen zullen ondergaan bij ligandbinding (selecteer ≤ 10 residuen).
    OPMERKING: Deze stap maakt het mogelijk dat geselecteerde zijkettingen bewegen tijdens het docken, rekening houdend met geïnduceerde fit-effecten.
  12. Sla de receptor op met flexibele residuen als een PDB-bestand. Klik op Bestand > Opslaan, selecteer PDB schrijven in het keuzemenu. In het venster Beschikbare PDB-records vink je ATOM en CONECT aan, klik op ADD en klik dan op OK. Sla het bestand op als receptor.pdb.
    OPMERKING: Dit PDB-bestand bevat informatie over flexibele residuen en zal worden gebruikt om het PDBQT-bestand te genereren.
  13. Maak het macromolecuul klaar voor docking. Klik op Raster > Macromolecuul > Select, selecteer het receptor.pdb-bestand en klik op Select Molecule. Sla de receptor op als PDBQT-bestand door te klikken op File > Save As en noem het receptor.pdbqt.
    OPMERKING: AutoDock Tools wijst ladingen en atoomtypes toe, waarbij de ontvanger wordt opgeslagen in het native PDBQT-formaat van AutoDock, klaar voor gridbox-generatie en dockingberekeningen.
  14. Klik op het Ligand-menu , selecteer Invoer en klik dan Open. Selecteer ligand.mol2 en klik op OK. Klik op het Ligand-menu , selecteer Torsies en vervolgens op Torsies detecteren. AutoDock Tools zal automatisch draaibare bindingen in de ligandstructuur identificeren (bijvoorbeeld enkele bindingen in alkylketens, amidebindingen exclusief peptidebindingen).
  15. Controleer in het Torsieselectievenster de gedetecteerde roteerbare bindingen (behoud alle geldige roteerbare bindingen, sluit starre bindingen zoals aromatische ringbindingen uit). Klik op Instellen om de torsiedefinities te bevestigen en klik vervolgens op Sluiten.
    OPMERKING: Het behouden van geldige roteerbare bindingen zorgt ervoor dat de ligand tijdens het koppelen verschillende conformaties kan aannemen (flexibele ligand), terwijl de receptor stijf blijft — dit is de kern van semi-flexibele docking in AutoDock Vina.
  16. Klik opnieuw op het Ligand-menu , selecteer Output, en klik dan op Sla als PDBQT. Noem het bestand ligand.pdbqt en sla het op in dezelfde map als receptor.pdbqt.
  17. Klik op het menu Weergave , selecteer Secundaire Structuur. Klik op Alleen weergeven, selecteer vervolgens Lijnen en klik op Ontmaskeren om het eiwitoverzicht te vereenvoudigen.
  18. Klik op het rastermenu en selecteer Grid Box. Pas de x-, y-, z-(centrumcoördinaten) en Spacing(Å)-waarden aan om het vakje boven de actieve plaats van het eiwit te positioneren.
    OPMERKING: Als de bindingsplaats onbekend is, gebruik dan pocketvoorspellingstools (bijv. CASTp, DoGSite) om veronderstelde bindingspockets te identificeren. Het bedekken van het hele eiwit verhoogt de vals-positieven en de rekenkosten aanzienlijk en wordt niet aanbevolen.
  19. Klik op Bestand > Sluit het huidige opslaan, klik dan op Grid > Output > Save GPF om de gridbox-instellingen als Grid.gpf op te slaan.
  20. Open Grid.gpf met een teksteditor en registreer de gridcentre (x, y, z-waarden) en npts (grootte x, y, z-waarden) uit het bestand.
  21. Maak een nieuw tekstbestand aan met de naam Config.txt en typ de volgende inhoud:
    receptor = receptor.pdbqt
    ligand = ligand.pdbqt
    center_x = [gridcentre x-waarde uit Grid.gpf]
    center_y = [gridcentre y-waarde van Grid.gpf]
    center_z = [gridcentre z-waarde uit Grid.gpf]
    size_x = [npts x waarde van Grid.gpf]
    size_y = [npts y-waarde van Grid.gpf]
    size_z = [npts z-waarde van Grid.gpf]
    energy_range = 5
    num_modes = 10
    Vervang de gehaakte tekst door waarden uit Grid.gpf (Stap 6.19).
    OPMERKING: De energy_range-parameter moet worden ingesteld als het maximaal toegestane energieverschil ten opzichte van het optimale gecombineerde model, met eenheden in kcal/mol. Bijvoorbeeld, als je deze op 5 zet, zal AutoDock Vina de berekeningen beëindigen zodra het energieverschil van het optimale model 5 kcal/mol bereikt. Daarnaast specificeert num_modes het aantal bindingsmodellen dat gegenereerd moet worden, wat doorgaans op 10 wordt gezet.
  22. Plaats de bestanden van vina_split.exe en vina.exe in dezelfde map als receptor.pdbqt, ligand.pdbqt en Config.txt.
  23. Open de Windows Systeemconsole, navigeer naar de map met het cd-commando (bijv. cd C:\DockingFiles).
  24. Typ het volgende commando en druk op Enter: vina.exe --config config.txt --log log.txt --out output.pdbqt
  25. Wacht tot het koppelen is voltooid (duur verschilt per systeem). Er verschijnen twee bestanden: log.txt (koppelingsresultaten) en output.pdbqt (laagste energie ligandstructuur). Om reproduceerbaarheid te waarborgen, worden drie onafhankelijke koppelruns uitgevoerd met verschillende willekeurige seeds. Een RMSD < 1,0 Å tussen de topposities bevestigt consistentie.
    OPMERKING: Als empirische referentie kunnen AutoDock Vina-bindingsenergieën (kcal/mol) worden geïnterpreteerd als: ≤ -7 (hoge affiniteit, potentiële actieve conformaties), -7 tot -5 (matige affiniteit), ≥ -5 (lage affiniteit). Deze drempels zijn systeemafhankelijk en moeten worden gevalideerd met experimentele gegevens.
    1. Om de dockingnauwkeurigheid en discriminatiecapaciteit voor een specifiek doel te beoordelen, worden twee complementaire validatiebenaderingen aanbevolen. Gebruik redockingvalidatie met kristallografische liganden om te evalueren of het protocol experimenteel waargenomen bindingsmodi kan reproduceren, waarbij RMSD < 2,0 Å het standaard acceptatiecriterium vormt.
    2. Gebruik verrijkingsanalyse met behulp van openbare benchmarkdatasets (bijv. DUD-E) om het vermogen van het protocol te beoordelen om echte actieve verbindingen te onderscheiden van property-matched decoys; dit omvat de berekening van ROC-curves (een globale maatstaf voor classificatieprestaties) en verrijkingsfactoren zoals EF1% (kwantificering van de verrijking van actieve stoffen in het hoogst gerangschikte aandeel). Samen helpen deze validatiestappen passende affiniteitscutoffs vast te stellen en zorgen ze voor betrouwbare screeningsprestaties voor de doelklasse van interesse.
  26. Open de PyMOL-software. Importeer output.pdbqt en receptor.pdbqt door op Bestand > Openen te klikken. Sla de gecombineerde structuur op als result.pdb door op Bestand > Opslaan als.
  27. Maak de PyMOL-werkruimte leeg door op Bestand > Nieuwe Sessie te klikken en open vervolgens result.pdb opnieuw om het ligand-eiwitcomplex te visualiseren.

7. Moleculaire koppeling met YASARA

OPMERKING: Deze stap dient als precieze herkoppeling en preprocessing voor latere moleculaire dynamica (MD) simulatie en is een progressieve verificatie van de high-throughput voorlopige screeningsresultaten uit stap 6. Stap 6 gebruikt AutoDock Vina, de goudstandaardtool voor high-throughput virtuele screening, om kandidaatmoleculen met uitstekende bindingsaffiniteit snel uit de verbindingsbibliotheek te screenen. Deze stap gebruikt YASARA voor docking, omdat de dockingmodule volledig compatibel is met het YASARA MD simulatieplatform, dat structurele afwijkingen door bestandsformatconversie en softwarewisseling kan vermijden en een gestandaardiseerde initiële complexe structuur biedt voor latere MD-simulatie. Voor alle kandidaatmoleculen die door AutoDock Vina in stap 6 zijn gescreend, moeten de dockingresultaten (inclusief bindingshouding in de actieve pocket en belangrijke aminozuurinteracties) in deze stap consistent zijn met die van AutoDock Vina, en moet de relatieve rangschikking van bindingsaffiniteit dezelfde trend behouden voordat overgegaan wordt naar MD-simulatie. De absolute dockingscores zijn niet direct vergelijkbaar tussen de twee software vanwege verschillende berekeningsalgoritmen. Deze consistentie-eis kan vals-positieve resultaten veroorzaakt door softwareverschillen elimineren, de stabiliteit van de bindingskenmerken van kandidaatmoleculen waarborgen en de betrouwbaarheid en logische continuïteit van daaropvolgende MD-simulatievalidatie waarborgen.

  1. Gebruik OpenBabel om het ligand.sdf-bestand om te zetten naar het ligand.pdb-bestand.
    OPMERKING: OpenBabel wordt hier alleen gebruikt voor formaatconversie. De daadwerkelijke parameterisatie van het ligand voor moleculaire dynamica zal automatisch door YASARA worden uitgevoerd in de volgende stappen.
  2. Open YASARA-software. Klik op Bestand > Laden en selecteer ligand.pdb om de ligand te importeren. Klik op Bewerken > Schoonmaken > Alles om structurele defecten van de ligand te verwijderen.
    OPMERKING: Deze stap voert een basisgeometrische schoonmaak uit. YASARA zal vervolgens automatisch krachtveldparameters toewijzen aan de ligand met behulp van zijn ingebouwde AutoSMILES-technologie, die de General AMBER Force Field (GAFF) en AM1-BCC ladingen toepast om compatibiliteit te waarborgen met het AMBER14 krachtveld dat voor het eiwit wordt gebruikt. Deze parameterisatie is essentieel voor nauwkeurige energieberekeningen in zowel docking- als MD-simulaties.
  3. Klik op Opties > Standaard pH, selecteer de juiste pH (bijv. 7,4 voor fysiologische aandoeningen) en klik op OK.
  4. Klik op Dock > krachtveld om het dockingkrachtveld in te stellen, zodat parameters consistent blijven met daaropvolgende MD-simulaties.
    OPMERKING: AMBER14 is het aanbevolen krachtveld voor deze geneesmiddelontdekkingsworkflow in YASARA 10.3.16, omdat het uitgebreide parameterdekking voor eiwitten biedt en volledig compatibel is met standaard MD-simulatieprotocollen. Voor standaard eiwitresiduen worden parameters automatisch toegewezen uit de ingebouwde sjablonen van het krachtveld. Voor liganden met kleine moleculen voert YASARA automatisch parameterisatie uit met behulp van zijn ingebouwde AutoSMILES-technologie, die GAFF (General AMBER Force Field) atoomtypes en AM1-BCC-ladingen toewijst. Dit zorgt voor compatibiliteit tussen eiwit- en ligandparameters, waardoor nauwkeurige energieberekeningen mogelijk zijn in zowel docking- als MD-simulaties. Een geschikter krachtveld kan worden geselecteerd op basis van de daadwerkelijk gebruikte YASARA-versie en de specifieke kenmerken van het systeem.
  5. Klik op Simulator > Definieer simulatiecel > rond alle atomen om de werkgrens vast te stellen. Klik op Simulator > Celgrenzen > Periodiek om periodieke randvoorwaarden mogelijk te maken.
  6. Klik op Opties > Kies experiment > Energieminimalisatie en klik vervolgens op Run om de energie van de ligand te minimaliseren.
  7. Klik op Bestand > Opgeslagen als, noem het bestand ligand.pdb en klik op OK om het originele ligand PDB-bestand over te schrijven. Klik op Bestand > Nieuw om de werkruimte te wissen, klik vervolgens op Bestand > Laden en selecteer het receptor.pdb-bestand.
  8. Herhaal stappen 7.2 tot 7.7 voor de eiwitreceptor, waarbij het verwerkte bestand wordt opgeslagen als een nieuw receptor.pdb-bestand.
  9. Klik op Bestand > Nieuw, klik vervolgens op Bestand > Laden en selecteer zowel ligand.pdb als receptor.pdb. Herhaal stappen 7.3 tot 7.5 om de pH in te stellen, de simulatiecel te definiëren en periodieke grenzen voor het complex in te schakelen.
  10. Klik op Processors > Set CPU en selecteer het aantal CPU-cores dat gebruikt moet worden. Klik op Processors > Set GPU en selecteer het GPU-apparaat om de berekeningen te versnellen.
  11. Klik op Bestand > Sla op als > YASARA-scène, noem het bestand sce\nesult.sce (maak de sce-map aan als die niet bestaat), en klik op OK.
  12. Klik op Opties > Macro&Movie > Stel doel in, selecteer sce\nesult.sce en klik op OK. Klik op Opties > macro & Movie > Play, selecteer het macrobestand dock_run.mcr en klik op OK.
  13. Klik op Simulator > Definieer simulatiecel > rond geselecteerde atomen en herhaal 7.5, klik vervolgens op Doorgaan om het koppelen te starten.
  14. Wacht op de voltooiing van het docken. Bestanden met het achtervoegsel yob worden gegenereerd; name.log bevat de bindingsenergie en contactreceptorresiduen.
    OPMERKING: Om de rationaliteit van validatie van moleculaire dynamica-simulatie te waarborgen, selecteer je het dockingresultaat in YASARA dat consistent is met het dockingresultaat van AutoDock Vina.

8. Moleculaire dynamica-simulatie

  1. Klik op Bestand > Nieuw om de werkruimte te wissen. Klik vervolgens op Bestand > Laad > YASARA-object en selecteer result.yob.
  2. In het SCENE INHOUD-paneel (rechterkant) vergroot je alle Mol-items. Klik op Bewerken > Splits > Object, selecteer alle Mol-inhoud in het Sequence-paneel en klik op OK.
  3. Klik op Bewerken > Join > Object, selecteer alle Mol-inhoud behalve de eerste en laatste vermelding (ligand), en klik op OK. Selecteer de eerste Mol-invoer en klik opnieuw op OK om het eiwit weer te verbinden.
  4. Ga verder met het hernummeren van de componenten. Selecteer Hernummeren onder Bewerken en klik op Objecten. Dit genereert twee delen: het eerste deel is het eiwitreceptorcomplex, en het tweede deel is het kleine-molecuul ligand.
  5. Klik op Bewerken > Overbrengen, en vervolgens op de optie Object in de dropdownlijst. Selecteer in het Sequence-paneel eerst de inhoud van de liganden met kleine moleculen door op de bijbehorende invoer te klikken. Selecteer vervolgens de eiwitreceptorinhoud door op de invoer te klikken en op OK te klikken om het selectiepaar te bevestigen.
  6. In het volgende pop-upvenster vink je de optie aan die begint met Atomen repareren op het scherm tijdens de overdracht, en klik op OK.
  7. Herhaal stappen 7.2 tot 7.5, klik dan op Simulator > Temperatuur en selecteer 298K. Klik op Bestand > Opslaan als > YASARA-scène, noem het bestand sce\nesultrun.sce en klik op OK.
  8. Klik op Bestand > Nieuw om de werkruimte te wissen. Klik vervolgens op Opties > Macro&Movie > Stel doel in, selecteer sce\nesultrun.sce en klik op OK.
  9. Zorg ervoor dat het krachtveld dat in stap 7.4 is geselecteerd ook wordt gebruikt voor de MD-simulatie; de macro md_run.mcr erft doorgaans de huidige krachtveldinstellingen. Klik op Opties > macro&Movie > Play macro, selecteer het macrobestand md_run.mcr en klik op OK om de Moleculaire Dynamica Simulatie te starten.
  10. Voer drie onafhankelijke MD-simulaties uit (3 x 100 ns) met verschillende beginsnelheden voor het eiwit-ligandencomplex en voer statistische analyses uit van de drie trajecten om de betrouwbaarheid van de resultaten te waarborgen. Tijdens de operatie worden bestanden in het simformaat gegenereerd. Als bijvoorbeeld de trajectoire elke 100 ps wordt opgeslagen, zal een 100 ns-simulatie 1000 bestanden met het sim-achtervoegsel genereren.
  11. Zodra stap 8.10 is voltooid, klik je op Opties > Macro&Movie > Set target, selecteer je het bestand sce\nesultrun.sce en klik je op OK.
  12. Klik op Opties > Macro&Movie > Play macro, selecteer md_analyze.mcr, md_analyzebindenergy.mcr en md_analyzeres.mcr en klik op OK.
  13. Nadat alle drie de analyses zijn afgerond, worden de bijbehorende databestanden result_run_analysis.tab, result_run_bindenergy.tab en result_run_analysisres.tab gegenereerd.
  14. Analyseer eerst result_run_analysis.tab, die 10 kernparameters geeft: Energie (totale systeemenergie), Binding (bindingsenergie), Hoek (bindingshoekenergie), Dihedral (dihedrale hoekenergie), Planariteit (vlakheidsenergie), Coulomb (elektrostatische energie), VdW (van der Waals-energie), CA (Cα RMSD van het eiwit RMSD), Backbone (eiwitruggengraat RMSD) en HeavyAtoms (zwaar atoom RMSD).
  15. Extraheer de kolom Tijd (ns) en de bijbehorende parameterkolommen om te beoordelen of het systeem een energetisch evenwicht bereikt. Bevestig systeemstabiliteit door de stabilisatie van potentiële energie binnen een smal fluctuatiebereik na de initiële 10 - 20 ns. Evalueer de conformationele stabiliteit door de root-mean-square-deviatie (RMSD) van Cα-atomen, eiwitruggengraat en zware atomen te monitoren. De simulatie werd als structureel stabiel beschouwd zodra deze RMSD-waarden een plateau bereikten.
  16. Als empirische referentiepunten voor eiwit-ligandencomplexen van typische grootte kunnen Cα- en ruggengraatwaarden van RMSD die onder 2,5 Å plateaueren, samen met zwaar-atoom RMSD onder 3,5 Å, worden beschouwd als ondersteunende indicatoren van conformationele stabiliteit. Cruciaal is het om het primaire en verplichte criterium en de aanwezigheid van een duidelijke plateaufase in het RMSD-traject te gebruiken, in plaats van strikt alleen deze numerieke waarden te volgen.
    OPMERKING: Deze drempelwaarden zijn empirisch en moeten worden geïnterpreteerd in de context van de specifieke eiwitgrootte en flexibiliteit. De beslissende indicator van convergentie is een aanhoudend plateau, wat aangeeft dat de structuur is gestabiliseerd rond een consistent conformationeel ensemble.
  17. Vervolgens analyseer je result_run_bindenergy.tab, die de bindingsenergie tussen ligand en doel over het simulatietraject geeft. Bereken de gemiddelde bindingsenergie over de gehele simulatieperiode. In YASARA's MM-PBSA-implementatie duiden meer positieve waarden op sterkere binding. Een matig sterke en stabiele interactie wordt doorgaans aangegeven door een gemiddelde bindingsenergie die positief en voldoende groot is (de specifieke numerieke waarde is systeemafhankelijk maar kan worden gekalibreerd aan bekende binders of experimentele gegevens), samen met een standaarddeviatie die klein is ten opzichte van het gemiddelde (bijv. variatiecoëfficiënt < 50 - 60%), wat beperkte fluctuatie tijdens de simulatie weerspiegelt.
    OPMERKING: De bindingsenergie die in deze stap wordt gerapporteerd, wordt berekend met de rigoureuze MM-PBSA-methode, in tegenstelling tot de standaard YASARA-bindingsenergiemacro die een snellere benadering (BoundaryFast) toepast. De standaardbenadering is geschikt voor snelle screening of relatieve vergelijkingen, terwijl de MM-PBSA-methode wordt aanbevolen om nauwkeurigere absolute bindingsvrije energieën te verkrijgen. Zoals expliciet door de auteur in de YASARA-macrokop wordt vermeld: Meer positieve energieën duiden op betere binding, negatieve energieën DUIDEN NIET op geen binding. Daarom moeten gebruikers positieve waarden interpreteren als een indicatie van sterkere binding, waarbij de numerieke grootte afhangt van het specifieke eiwit-ligandensysteem.
  18. Analyseer tenslotte het bestand result_run_analysisres.tab, dat per-residugegevens bevat, waaronder Residue ID, RMSD, Backbone RMSD, HeavyAtoms RMSD en RMSF. Focus de analyse op de geïdentificeerde stabiele productiefase. Identificeer eerst residuen binnen de actieve site van het doelwit (bijvoorbeeld die binnen 5 Å van de ligand). Gebruik vervolgens de data om de conformationele stabiliteit van deze individuele actieve site residuen tijdens de simulatie te beoordelen.
    OPMERKING: Als empirische referentiepunten voor stabiele actieve plaatsresiduen in eiwit-ligandencomplexen worden RMSF-waarden onder 1,0 Å en RMSD-fluctuaties binnen 1 - 1,5 Å tijdens de stabiele fase over het algemeen beschouwd als indicatief voor goed onderhouden lokale conformaties. Residuen met RMSF boven 2,0 Å kunnen wijzen op grotere flexibiliteit; dergelijke residuen moeten worden afgebeeld op de driedimensionale structuur om te bepalen of ze overeenkomen met functioneel relevante flexibele gebieden (bijv. lussen of oppervlakken) of wijzen op potentiële instabiliteit binnen de bindingspocket. Deze numerieke richtlijnen zijn geen absolute regels; het primaire criterium is de afwezigheid van grote conformationele drift, wat moet worden beoordeeld in combinatie met de vastgestelde systeemconvergentie.
  19. Zodra databestanden zijn georganiseerd, importeer je de georganiseerde data in Prism om bijbehorende plots te genereren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Na de netwerkfarmacologische analyse van loratadine tegen allergische rhinitis (AR) werd de interactie tussen loratadine en PTGS2 geselecteerd als een representatieve casestudy om de stapsgewijze toepassing van het moleculaire docking- en MD-simulatieprotocol te illustreren. Dit voorbeeld is bedoeld om workflowuitvoering en data-interpretatie te demonstreren, in plaats van biologische validatie van de specifieke interactie te bieden. Voor kwantitatieve beoordeling aan de hand van experim...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Betekenis en cruciale stappen
Dit protocol combineert netwerkfarmacologie, moleculaire docking en moleculaire dynamica-simulatie, wat duidelijke voordelen biedt ten opzichte van standalone methoden of dual-combination workflows, en kan helpen belangrijke inefficiënties en betrouwbaarheidsverschillen in de huidige geneesmiddelenontdekking aan te pakken. Het hele proces is afhankelijk van drie cruciale stappen die de betrouwbaarheid waarborgen, elk gericht op een kernui...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Alle auteurs geven aan dat zij geen belangenconflict hebben.

Dankbetuigingen

Nationaal Sleutel R&D-programma van China (2024YFC3506300, 2024YFC3506301), Hoog niveau Sleuteldiscipline van de Nationale Administratie van Traditionele Chinese Geneeskunde-Traditionele Chinese constitutionele geneeskunde (No.zyyzdxk-2023251), Algemeen programma van de Nationale Stichting Natuurwetenschappen van China (82204948), Doorbraakplan voor fundamentele en interdisciplinaire disciplines van het Ministerie van Onderwijs van China (JYB2025XDXM612), Grote Speciale Projecten voor Wetenschap en Technologie in de provincie Hubei (2023BCA005), het Hoofdwetenschapper Onderzoeksproject van het Hubei Shizhen Laboratorium (HSL2024SX0002)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ADMETlab 3.0Shanghai Institute of Materia Medica (SIMM), Chinese Academy of SciencesN/AOnline platform voor ADMET (Absorptie, Distributie, Metabolisme, Excretie, Toxiciteit) eigenschapsvoorspelling; gebruikt voor het evalueren van de farmacokinetische en toxicologische profielen van liganden (URL: https://admetlab3.scbdd.com/)
AutoDock Tools (AutoDock 4)The Scripps Research InstituteAutoDock 4.2.6Software suite voor moleculaire docking simulaties; bevat AutoDock 4 voor docking en AutoDockTools (ADT) voor het voorbereiden van eiwit- en ligandinvoerbestanden (het toevoegen van waterstofatomen, het toewijzen van ladingen, het instellen van roteerbare bindingen), het definiëren van docking grids, en het analyseren van docking resultaten.
AutoDock VinaThe Scripps Research InstituteAutoDock Vina 1.1.2Open-source moleculaire docking software; gebruikt voor het voorspellen van bindingsaffiniteiten en posities tussen kleine-molecuul liganden en eiwitreceptoren
Chem3DPerkinElmer InformaticsChem3D 2024Moleculair modelleringssoftware; gebruikt voor het construeren, optimaliseren en visualiseren van 3D structuren van kleine-molecuul liganden
CytoscapeCytoscape Consortium (Institute for Systems Biology)Cytoscape 3.10.3Open-source software voor het visualiseren en analyseren van biologische netwerken; gebruikt voor het construeren en bewerken van gen/eiwit interactie netwerken
DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), USAN/AOnline tool voor functionele annotatie en verrijkingsanalyse; gebruikt voor het uitvoeren van GO (Gene Ontology) en KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) paden verrijkingsanalyse van doelgenen (URL: https://david.ncifcrf.gov/)
DisGeNET DatabaseBarcelona Supercomputing Center (BSC)N/ADatabase van gen-ziekte associaties; gebruikt voor het identificeren van genen gekoppeld aan specifieke ziekten (URL: https://disgenet.com/)
GeneCards DatabaseWeizmann Institute of ScienceN/AIntegratieve database van menselijke genen; gebruikt voor het opvragen van uitgebreide gen informatie (bijv. expressie, functie, ziekte associaties) (URL: https://www.genecards.org/)
LigPlusEuropean Molecular Biology Laboratory-European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI)LigPlus 2.3Software voor het automatisch genereren van 2D eiwit-liganden interactie diagrammen uit 3D coördinaten bestanden. Het geeft schematisch waterstofbindingen, hydrofobe contacten en de bindingsplaats residuen weer. Beschikbaar na registratie met een academisch e-mailadres op https://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/software/LigPlus/ .
OMIM DatabaseJohns Hopkins University School of Medicine (in samenwerking met NCBI)N/AOnline Mendeliaanse Erfelijkheid bij de Mens; gebruikt voor het opvragen van informatie over genetische stoornissen en hun geassocieerde genen (URL: https://www.omim.org/)
OpenBabelOpenBabel Development TeamN/AOpen-source chemische toolbox; gebruikt voor het converteren van moleculaire bestandsformaten (bijv. van.mol2 naar.pdb) tussen verschillende software platforms
PharmGKB DatabaseStanford UniversityN/APharmacogenomics Kennisbasis; gebruikt voor het opvragen van informatie over gen-geneesmiddel interacties en farmacogenetische varianten (URL: https://www.pharmgkb.org/)
PrismGraphPad SoftwarePrism 9Gebaten voor wetenschappelijk grafische weergave, data-analyse (bijv. het plotten van bindingsenergie verdelingscurven, het analyseren van foutbalken) en het genereren van publicatiekwaliteit figuren.
ProTox 3.0Charité - Universitätsmedizin Berlin, GermanyN/AOnline tool voor het voorspellen van toxicologische eindpunten van kleine moleculen; gebruikt voor het beoordelen van potentiële toxiciteit van kandidaat-liganden (URL: https://tox.charite.de/protox3/index.php?site=home)
PubChem DatabaseNational Center for Biotechnology Information (NCBI), USAN/AOpenbare database van chemische informatie; gebruikt voor het opvragen van 2D/3D structuren en fysisch-chemische eigenschappen van kleine-molecuul liganden (URL: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)
PyMOLSchrödinger, LLCPyMOL 2.6.1Molecuul visualisatie software; gebruikt voor het bekijken, bewerken en genereren van hoge kwaliteit afbeeldingen van eiwit-ligand complexen
R StudioPosit, PBCRstudio 2025.09.1+401Geïntegreerde ontwikkelomgeving (IDE) voor R programmeren; gebruikt voor statistische analyse van biologische data en het genereren van GO/KEGG plots
RCSB PDB DatabaseResearch Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB)N/ADatabase van eiwit structuren; gebruikt voor het opvragen van 3D structuren van eiwitreceptoren in PDB formaat (URL: https://www.rcsb.org/)
SEA (Similarity Ensemble Approach)The Scripps Research InstituteN/AOnline tool voor doelwitvoorspelling gebaseerd op chemische gelijkenis; gebruikt voor het aanvullen van SwissTargetPrediction om ligand doelwitten te bevestigen (URL: https://sea.bkslab.org/)
STRINGSTRING Consortium (EBI, SIB, etc.)N/ADatabase van bekende en voorspelde eiwit-eiwit interacties; gebruikt voor het construeren van gen/eiwit interactie netwerken (URL: https://string-db.org/)
SwissTargetPredictionSwiss Institute of Bioinformatics (SIB)N/AOnline server voor het voorspellen van potentiële eiwitdoelwitten van kleine moleculen; gebruikt voor het identificeren van kandidaat-receptoren voor liganden (URL: http://swisstargetprediction.ch/)
TTD DatabaseInstitute of Drug Discovery and Development (IDRBL), Sun Yat-sen UniversityN/ATherapeutische Doelwit Database; gebruikt voor het opvragen van informatie over gevalideerde en potentiële geneesmiddeldoelwitten (URL: https://db.idrblab.net/ttd/)
UCSF ChimeraResource for Biocomputing, Visualization, and Informatics (RBVI), University of California, San FranciscoUCSF Chimera 1.19Molecuul visualisatie en analyse software; gebruikt voor eiwitstructuur voorbereiding inclusief reconstructie van ontbrekende lussen (via Modeller interface), zijketen optimalisatie (Dunbrack rotamer bibliotheek), protoneringstoestand aanpassing en energie minimalisatie met AM

Referenties

  1. Hopkins, A. L. Network pharmacology: The next paradigm in drug discovery. Nat Chem Biol. 4 (11), 682-690 (2008).
  2. An, W., et al. Mechanisms of rhizoma coptidis against type 2 diabetes mellitus explored by network pharmacology combined with molecular docking and experimental validation. Sci Rep. 11 (1), 20849(2021).
  3. Hu, M., et al. Use of network pharmacology and molecular docking to explore the mechanism of action of curcuma in the treatment of osteosarcoma. Sci Rep. 13 (1), 9569(2023).
  4. Oh, K. K., Adnan, M., Cho, D. H. Network pharmacology approach to decipher signaling pathways associated with target proteins of NSAIDs against COVID-19. Sci Rep. 11 (1), 9606(2021).
  5. Kuntz, I. D., Blaney, J. M., Oatley, S. J., Langridge, R., Ferrin, T. E. A geometric approach to macromolecule-ligand interactions. J Mol Biol. 161 (2), 269-288 (1982).
  6. Sahu, M. K., Nayak, A. K., Hailemeskel, B., Eyupoglu, O. E. Exploring recent updates on molecular docking: Types, method, application, limitation & future prospects. Int J Pharma Res Allied Sci. 13 (2), 24-40 (2024).
  7. Morris, G. M., et al. Autodock4 and autodocktools4: Automated docking with selective receptor flexibility. J Comput Chem. 30 (16), 2785-2791 (2009).
  8. Li, C., et al. Characterization of the molecular mechanisms underlying lurasidone-induced acute manic episodes in bipolar depression: A network pharmacology and molecular docking approach. CNS Neurosci Ther. 31 (4), e70383(2025).
  9. Lee, W. Y., et al. Evaluating current status of network pharmacology for herbal medicine focusing on identifying mechanisms and therapeutic effects. J Adv Res. 76, 799-815 (2025).
  10. Shahzadi, Z., et al. Network pharmacology and molecular docking: Combined computational approaches to explore the antihypertensive potential of Fabaceae species. Bioresour Bioprocess. 11 (1), 53(2024).
  11. Che, X., Zhang, L. Blind docking methods have been inappropriately used in most network pharmacology analysis. Front Pharmacol. 16, 1566772(2025).
  12. Ren, M., Ma, J., Qu, M. Network pharmacology integrated with molecular docking and molecular dynamics simulations to explore the mechanism of shaoyao gancao tang in the treatment of asthma and irritable bowel syndrome. Medicine .(Baltimore). 103 (50), e40929(2024).
  13. Jorgensen, W. L. The many roles of computation in drug discovery. Science. 303 (5665), 1813-1818 (2004).
  14. Gao, L., et al. Molecular dynamics simulation-driven focused virtual screening and experimental validation of fisetin as an inhibitor of Helicobacter pylori htra protease. Mol Divers. 29 (6), 6243-6258 (2025).
  15. Schaefer, M. H., Serrano, L., Andrade-Navarro, M. A. Correcting for the study bias associated with protein-protein interaction measurements reveals differences between protein degree distributions from different cancer types. Front Genet. 6, 260(2015).
  16. Richter, S., Fetzer, I., Thullner, M., Centler, F., Dittrich, P. Towards rule-based metabolic databases: A requirement analysis based on KEGG. Int J Data Min Bioinform. 13 (3), 289-319 (2015).
  17. Gu, S., et al. Benchmarking ai-powered docking methods from the perspective of virtual screening. Nat Machine Intell. 7 (3), 509-520 (2025).
  18. Zhang, P., et al. Network pharmacology: Towards the artificial intelligence-based precision traditional chinese medicine. Brief Bioinform. 25 (1), 1-12 (2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Computationele geneesmiddelenontwikkelingreproduceerbare workflowADMET screeningtargetvoorspellingeiwitinteractienetwerkGene Ontology analysemoleculaire dynamicasimulatieKEGG enrichment

Gerelateerde artikelen