In vitro Evaluatie van de versterkende effecten van plantaardige moleculen op conventionele biociden

Samenvatting

Dit protocol biedt een systematisch kader om te beoordelen hoe fytochemicaliën de bactericide effecten van traditionele biociden kunnen versterken met behulp van bactericide activiteitsmodellering en combinatorische interactie-assays, die gericht zijn op het identificeren van synergetische mengsels die de microbiële controle verbeteren en het totale biocidegebruik verminderen.

Samenvatting

Het ontwikkelen van innovatieve en efficiënte benaderingen om de antimicrobiële activiteit van conventionele biociden te vergroten, is een veelbelovende strategie om de microbiële controle voor desinfectiedoeleinden in de gezondheidszorg te verbeteren. In deze context beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het evalueren van de versterkende effecten van plantaardige fytochemicaliën op synthetische biociden. Deze plantaardige producten zijn aantrekkelijke kandidaten als biocide-adjuvanten vanwege hun structurele diversiteit, bioactiviteit en vaak lagere toxiciteit. De hier beschreven workflow maakt het mogelijk om minimale bactericidale concentraties (MBC's) te bepalen en systematisch zowel dosis-respons- als tijd-responscurves te genereren voor elk product dat afzonderlijk (biociden en fytochemicaliën) wordt getest, en voor hun dubbele of drievoudige combinaties. De resulterende gegevens maken geavanceerde wiskundige modellering mogelijk, waaronder het bepalen van de fractionele bactericidale concentratieindex (FBCI) en het beoordelen van de interacties tussen de geteste producten op synergetische, additieve of antagonistische effecten met behulp van de software Combenefit. In die zin is het mogelijk veelbelovende natuurlijke producten te identificeren als biocide-versterkers, de antimicrobiële effectiviteit te optimaliseren en duurzamere en veiligere desinfectiestrategieën te ontwerpen die de benodigde concentraties van synthetische biociden kunnen verminderen. Dit verbetert de microbiële controle en minimaliseert milieu- en volksgezondheidsrisico's die gepaard gaan met overmatig gebruik van biociden.

Inleiding

Gezondheidsgerelateerde infecties (HAI's) behoren tot de meest kritieke en zorgwekkende volksgezondheidsuitdagingen wereldwijd¹. Alarmerend genoeg worden ze sterk geassocieerd met de verspreiding van multidrugresistente (MDR) micro-organismen en het aanhouden van bacteriële biolast op ziekenhuisoppervlakken, vaak door onjuiste of ineffectieve desinfectiepraktijken ^2,3. Bovendien versterkt de kruisbesmetting tussen patiënten, zorgpersoneel en medische apparatuur dit probleem^{verder 4,5}. In Europa bijvoorbeeld wordt geschat dat bijna 80.000 opgenomen patiënten op een willekeurige dag minstens één HAI ondergaan, wat neerkomt op ongeveer 16 miljoen extra ziekenhuisdagen^{per jaar.} De COVID-19-pandemie heeft dit probleem verder bemoeilijkt, bijgedragen aan een toename van MDR-bacteriële infecties door het hoge gebruik van antimicrobiële middelen/desinfectiemiddelen en een toename van ziekenhuisopnames^{met 6,7}. De opkomst van antibioticaresistente bacteriën, waaronder extended-spectrum β-lactamase (ESBL)-producerende Escherichia coli en methicillineresistente Staphylococcus aureus (MRSA), heeft geleid tot een groeiende gezondheids- en economische last wereldwijd. Deze stammen benadrukken zelfs de urgentie van het ontwikkelen van innovatieve oplossingen voor infectiepreventie en -bestrijding ^1,8,9.

Met dat in gedachten werden biociden cruciale hulpmiddelen om de verspreiding van resistente bacteriën en bacteriële infecties te beheersen, en werden ze op grote schaal toegepast om ziekenhuisoppervlakken te desinfecteren, apparatuur te steriliseren, watersystemen te behandelen en besmetting van medische apparaten^{te voorkomen 10,11}. In tegenstelling tot antibiotica, die werken op specifieke microbiële doelen¹², verstoren biociden meerdere cellulaire structuren tegelijk, waaronder membranen, enzymen, ribosomaal RNA en metabole routes 13,14,15. Men dacht aanvankelijk dat deze breedspectrumactie het risico op weerstand verminderde. Bewijs toont echter aan dat micro-organismen zich kunnen aanpassen aan blootstelling aan biociden, wat leidt tot tolerantie, persistentie en zelfs kruisresistentie tegen antibiotica^10,16. Bijvoorbeeld, blootstelling van Pseudomonas aeruginosa aan benzalkoniumchloride geselecteerd voor varianten die resistent zijn tegen ciprofloxacine en novobiocine door de overexpressie van effluxpompen¹⁷. Evenzo is aangetoond dat triclosan effluxpompen activeert bij Stenotrophomonas maltophilia, terwijl blootstelling aan chloorhexidine in verband is gebracht met verhoogde antibioticaresistentie bij S. aureus¹⁸.

Bovendien zijn quaternaire ammoniumverbindingen (QAC's), chloorhexidine, diamidines, acridienen en triclosan geïdentificeerd als mogelijke oorzaken voor de selectie en persistentie van bacteriële resistentie tegen verschillende antibiotica^19,20. Resistentiegenen zoals qacA/B en smr staan erom bekend tolerantie voor QAC's te geven, en klinische mislukkingen zoals bacteremie gekoppeld aan katheters opgeslagen in besmette QAC-oplossingen en intrinsieke microbiële besmetting van jodoforen zijn ook gerapporteerd 16,17,21. Deze bevindingen benadrukken de dringende noodzaak van geoptimaliseerd biocidegebruik, ondersteund door mechanistische studies en rationele desinfectiestrategieën.

Biofilms, dat zijn bacteriegemeenschappen met een hoge celdichtheid en goed gestructureerde bacteriegemeenschappen ingebed in een extracellulaire matrix van polysacchariden, eiwitten en nucleïnezuren, vormen een extra en significant obstakel voor infectiebeheersing^22,23. Ze vertonen opmerkelijke tolerantie voor antibiotica en biociden, wat bijdraagt aan het aanhouden van infecties bij patiënten. Bovendien worden biofilms vaak ook in verband gebracht met de aanhoudende besmetting van medische apparaten, chirurgische instrumenten en ziekenhuisoppervlakken²⁴. Ondanks hun klinische belang zijn biofilms pas in de afgelopen decennia erkend als belangrijke bijdragers aan chronische infecties en antimicrobiële resistentie. Hun veerkracht is zodanig dat zelfs agressieve ontsmettingsmiddelen ze vaak niet kunnen uitroeien, waardoor persisterende cellen achterblijven die in staat zijn infectie^opnieuw te zaaien 20,25,26. Daarom is het vinden van effectieve antibiofilmstrategieën cruciaal om HAI's te beheersen en de volksgezondheid en economische last van MDR-pathogenen te verminderen^27,28.

Als veelbelovende oplossing vormen fytochemicaliën, die secundaire metabolieten zijn die uit planten worden geproduceerd en geëxtraheerd, een grotendeels onbenutte bron voor nieuwe antimicrobiële en antibiofilm-agentia²⁹. Er wordt echter geen fytochemische stof als antibioticum gebruikt, vanwege de bescheiden antimicrobiële werking vergeleken met conventionele antibiotica. Fytochemicaliën worden routinematig geclassificeerd als antimicrobiële middelen op basis van gevoeligheidstests die de minimale remmende concentratie (MIC) produceren in het bereik van 100 tot 1000 μg/mL, wat waarden zijn die veel hoger zijn dan die van conventionele antibiotica^30,31. Belangrijk is dat fytochemicaliën al antibiofilmactiviteit hebben aangetoond wanneer ze alleen of als potentiatoren van conventionele biociden worden gebruikt. Quercetine kan bijvoorbeeld de productie van alginaten remmen, wat leidt tot verminderde adhesie tijdens biofilmontwikkeling 32,33,34. Emodin remde de ontwikkeling van biofilms door P. aeruginosa, E. coli en S. aureus door de afname van de expressie van belangrijke genen die betrokken zijn bij biofilmvorming³⁵. Het combineren van fytochemicaliën met conventioneel gebruikte maar steeds minder effectieve biociden, als resistente modificerende middelen, vormt een veelbelovende strategie om de antimicrobiële effectiviteit^{te vergroten 36}. Dergelijke synergetische interacties kunnen interfereren met microbiële weerstandsmechanismen, waardoor de minimale effectieve concentraties biociden die nodig zijn om bevredigende desinfectie^{te bereiken verlaagt}. Deze aanpak optimaliseert de biocidale prestaties, vermindert selectiedruk voor resistentieontwikkeling en vermindert de ecologische en toxicologische effecten die gepaard gaan met overmatige biocidetoepassing^15,20. Fytochemicaliën zijn structureel divers 38,39,40, breed verkrijgbaar 38,39,41, goedkoop 38,39,42, en vaak minder giftig voor mensen en het milieu dan synthetische biociden ^38,39. Het zijn natuurlijke producten die vaak afkomstig zijn van hernieuwbare plantaardige bronnen en in sommige gevallen zijn gerapporteerd een lagere milieupersistentie en verminderde toxiciteitsprofielen te vertonen in vergelijking met bepaalde synthetische biociden 43,44,45. Hoewel hun kosten-, beschikbaarheids- en toxiciteitsprofielen variëren afhankelijk van de verbinding en het extractieproces, hebben verschillende fytochemicaliën gunstige veiligheids- en milieukenmerken aangetoond vergeleken met bepaalde conventionele biociden^46,47.

Dit protocol heeft als doel het potentieel van fytochemicaliën, individueel en in combinatie met conventionele biociden, voor desinfectie in de gezondheidszorg te evalueren. Kort gezegd evalueert het protocol biocide-fytochemische interacties over brede concentratiebereiken. Biociden werden aanvankelijk getest op 0,1–500 mg/L en fytochemicaliën op 50–10.000 mg/L om minimale bactericidale concentraties (MBC's) te bepalen (Tabel 1). Voor dubbele combinaties werden subbactericide concentraties als volgt geselecteerd: benzalkoniumchloride (BAC) bij 0,1, 0,5 en 0,75 mg/L; perazijnzuur (PAA) op 0,1, 0,3 en 0,5 mg/L; salicylzuur (SAL) op 50, 100 en 250 mg/L; en eugenol (EUG) op 100, 250 en 750 mg/L (Tabel 1). Drievoudige combinaties werden uitgevoerd met BAC (0,75 mg/L) of PAA (0,5 mg/L) gecombineerd met SAL (100 of 250 mg/L) en EUG (250 of 750 mg/L) (Tabel 1). Tijdrespons-assays werden uitgevoerd over 1–90 minuten, gevolgd door een bacteriële hergroeiingsbeoordeling van 24 uur. Antimicrobiële interacties worden gekwantificeerd met behulp van de fractionele bactericidale concentratieindex (FBCI) en geanalyseerd met Combenefit-software, terwijl desinfectiekinetiek wordt gemodelleerd met de Chick-Watson- en Weibull-modellen om concentratieafhankelijkheid en inactivatiedynamiek te karakteriseren.

De innovatie ligt in het rationele ontwerp van stabiele dubbele en drievoudige interacties tussen fytochemicaliën en biociden, waarbij de desinfectieactiviteit wordt geoptimaliseerd terwijl toxiciteit en milieueffecten door het verminderde gebruik van conventionele biociden worden geminimaliseerd. Wiskundige benaderingen zoals het berekenen van de FBCI en synergie-evaluatie werden ook gebruikt om fytochemische-biocide interacties in microbiële controle te kwantificeren. Terwijl FBCI een categorische interpretatie biedt van interactie (synergie, antagonisme of onverschilligheid) bij specifieke concentratiecombinaties, maakt Combenefit een meer uitgebreide, op responsoppervlak gebaseerde evaluatie van interactiepatronen over een breder concentratiebereik mogelijk. Dit maakt visualisatie en kwantificering mogelijk van concentratieafhankelijke interactie-effecten die mogelijk niet worden vastgelegd door single-point indices^48,49. Bovendien worden desinfectiekinetiek gemodelleerd met de Chick-Watson (voor dosis-respons) en Weibull (voor tijd-respons) modellen⁵⁰. Deze modellen bieden kinetische modellering van microbiële inactivatie, met kwantitatieve parameters die desinfectiepercentages en overlevingscurvegedrag^{beschrijven 50}. Ze helpen bepalen of doden log-lineaire of niet-lineaire dynamiek volgt en maken een meer mechanistische interpretatie van behandelingseffecten mogelijk, wat verder gaat dan de beschrijving van FBCI^51,52.

Dit protocol zorgt voor de systematische identificatie van veelbelovende fytochemicaliën-biocide combinaties en de ontwikkeling van een efficiënte, duurzame strategie voor desinfectie in de gezondheidszorg. In tegenstelling tot klassieke MIC- of schaakbord-assays die statische eindpuntmetingen bieden, integreert dit protocol dynamische bactericide modellering en interactie-analyses om de grootte en kinetiek van potentiatie vast te leggen. Hoewel klassieke checkerboard-assays waardevolle informatie bieden over remmende interacties op basis van MIC-eindpunten, zijn ze beperkt tot groeimetingen en enkele interactie-indices. Het hier beschreven protocol gaat verder dan dit kader door bactericidale activiteit te kwantificeren in plaats van groeiremming, het beoordelen van de na-behandeling hergroei om aanhoudende antimicrobiële effecten te evalueren, het evalueren van zowel dubbele als drievoudige biocide-fytochemicalië(n) combinaties, het modelleren van desinfectiekinetiek via Chick-Watson- en Weibull-benaderingen, en het toepassen van concentratie-responsoppervlakteanalyse met Combenefit. Deze multidimensionale strategie maakt een robuustere en voorspellendere beoordeling van biocide-fytochemische potentiatie mogelijk.

Protocol

OPMERKING: De voorgestelde methodologie is aangepast van de Europese norm EN 1276⁵³.

1. Kweekvoorbereiding

1. Cryoppreserve de geteste bacteriestammen, Escherichia coli CECT 434 en Staphylococcus aureus CECT 976, door ze op te slaan in cryovials met glycerol 30% (v/v) bij -80 °C.
2. Voor herstel kweek je bacteriën in plate count agar (PCA) platen en laat je ze 24 uur groeien bij 25 °C door de platen te incuberen.
3. Bereid nachtkweken van de onderzochte stammen voor door één bacteriekolonie te inoculeren uit een gestreepte plaat in tryptische sojabouillon (TSB) om de exponentiële groeifase te bereiken (volgens de kalibratiecurve verkregen uit de volgende stappen), en te incuberen op een schuddende broedmachine bij 100 rpm en 25 °C.
4. Met behulp van een spectrofotometer wordt een kalibratiecurve verzinst van de kolonievormende eenheden (CFU)/mL als functie van de optische dichtheid bij 600 nm (OD₆₀₀) voor elke bacteriële stam onder de eerder genoemde kweekomstandigheden.
   1. Kweek een nachtelijke bacteriële kweek in TSB bij 25 °C met beweging (100 rpm).
   2. Maak 10-voudige seriële verdunningen van de cultuur in steriele zoutoplossing (0,85% w/v NaCl).
   3. Meet de OD₆₀₀ van elke verdunning met een spectrofotometer.
   4. Plaats geschikte verdunningen op PCA. Broed platen uit bij 25 °C gedurende 24 uur.
   5. Selecteer platen met tussen de 10 en 100 kolonies en bepaal de bijbehorende CFU/mL-waarden.
   6. Plot CFU/mL-waarden tegen de overeenkomstige OD_600-waarden binnen het lineaire bereik (0,04–0,8).
   7. Voer ten minste twee onafhankelijke assays uit met ten minste twee replicatieën. Voer lineaire regressieanalyse uit om de kalibratievergelijking te verkrijgen.
   8. Gebruik de resulterende vergelijking om de concentraties bacteriën in latere experimenten te schatten.
5. Centrifugeer de inocula op 3772 x g gedurende 10 minuten, en was één keer met fosfaatbufferzoutoplossing (PBS) (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 1,44 g/L Na₂HPO₄ en 0,24 g/L KH₂PO₄).
6. Met een spectrofotometer stel je de OD₆₀₀ van de inocula in PBS aan naar 1 x 10⁸ kolonievormende eenheden (CFU)/mL.

2. Bereiding en controle van molecuuloplossingen.

1. Overweeg de selectie, studie en voorbereiding van geteste moleculen als volgt: gebruik twee biociden – BAC en PAA (15% (w/v) – en twee fytochemicaliën – SAL en EUG 99%.
   OPMERKING: BAC werd in deze studie gekozen omdat het een veelgebruikte QAC is, effectief tegen bacteriën via membraanverstoring^54,55. Peracticinezuur is een breedspectrumoxiderend desinfectiemiddel dat steeds vaker wordt gebruikt voor sterilisatie van medische instrumenten^56,57. Salicylzuur is een fenolische verbinding van belang omdat het antibacteriële en antibiofilmactiviteit vertoont en invloed heeft op bacteriële virulentie en antibioticaresistentiemechanismen, wat wijst op mogelijke rollen in desinfectie en microbiële controle^58,59. Eugenol is een natuurlijke terpenoïde/fenolische aromatische verbinding met erkende antimicrobiële eigenschappen die kan fungeren als een veiliger, milieuvriendelijker alternatief voor synthetische desinfectiemiddelen^60,61.
2. Maak BAC en PAA vers in ultrazuiver water.
3. Opgeloste EUG en SAL werden opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO), waardoor de cellen nooit werden blootgesteld aan een concentratie DMSO hoger dan 5%.
4. Bereid de geteste concentraties BAC, PAA, EUG en SAL voor volgens Tabel 1.
5. Bereid de geteste concentraties voor in 15 mL centrifugebuizen door de volumes van de voorraadoplossing en celsuspensie aan te passen om de gewenste eindmolecuulconcentratie en celdichtheid te verkrijgen.
6. Voor alle volgende assays worden twee negatieve controles opgenomen: (i) bacteriën zonder behandeling en (ii) bacteriën die zijn blootgesteld aan 5% DMSO (aangezien dit de maximale concentratie DMSO is waaraan de cellen gedurende de assays worden blootgesteld).

3. Bacteriële blootstelling aan biocide of fytochemische stoffen

1. Voeg 1 ml celsuspensie toe aan 1 ml ultrazuiver water en wacht 2 minuten.
2. Voeg vervolgens 8 ml biocide of fytochemische oplossing toe (in ultrazuiver water of 5% DMSO) en incubeer op een schudincubator bij 100 toeren per minuut en 25 °C, gedurende 30 minuten.
3. Meng de verbindingen met de cellen door te vortexen.

4. Neutralisatie, seriële verdunning en plating

1. Voer de neutralisatie uit van elke biocide of fytochemische stof bij elke geteste concentratie met behulp van de verdunnings-neutralisatiemethode en de universele neutralisator: 30 g/L polysorbaat 80, 30 g/L saponine, 1 g/L L-histidine, 3 g/L lecithin en 5 g/L natriumthiosulfaat in een 0,0025 M fosfaatbuffer.
2. Voeg 1 mL van het te neutraliseren monster toe aan 8 mL universele neutralisator en 1 mL ultrazuiver water⁵³.
3. Voer tienvoudige seriële verdunning uit door 100 μL van een specifieke verdunning toe te voegen aan 900 μL steriele zoutoplossing om de daaropvolgende verdunning te maken (herhaal dit van verdunning ^10-1 tot verdunning ^10-7), en bepaal de overgebleven cellen op de geneutraliseerde monsters door 10 μL van elke verdunning op PCA te verdunnen, volgens de drop plate-methode⁶².
4. Incubeer de platen bij 25 °C zonder onrust gedurende 24 uur voor celtellingen.
5. CFU werden visueel geteld voor platen met meer dan 10 en minder dan 100 kolonies, en de concentratie waarbij een volledige vermindering van de cultiveerbaarheid optreedt, wordt geregistreerd als de MBC. Volgens Vergelijking (1) bereken je de CFU/mL, waarbij n het aantal getelden CFU is, SV het geplateerde monstervolume (0,01 mL) is, en Dil de verdunning is waarbij de CFU zijn geteld.
   CFU/mL = n/(SV Dil) (1)
6. Beoordeel de logaritmische reductie, logaritmische reductie, volgens Vergelijking (2), waarbij X₀ en X respectievelijk de CFU/mL zijn voor de onbehandelde bacteriën (controle) en behandelde bacteriën.
   logreductie = log (X₀) - log (X) = log_{(X 0}/X) (2)

5. Beoordeling van dubbele en drievoudige combinaties

1. Pas de hierboven beschreven methodologie toe om de activiteit te beoordelen van alle mogelijke dubbele en drievoudige combinaties van één biocide en één fytochemische stof (voor dubbele combinaties) of twee fytochemicaliën (voor drievoudige combinaties) om te zoeken naar mogelijke potentiatie- of synergistische effecten.
2. Overweeg de volgende keuze van concentraties: voor de dubbele combinaties waren de geteste concentraties voor BAC 0,1, 0,5 en 0,75 mg/L; voor PAA waren 0,1, 0,3 en 0,5 mg/L; voor SAL waren 50, 100 en 250 mg/L; en voor EUG waren 100, 250 en 750 mg/L (Tabel 1). Wat betreft de drievoudige combinatie was de geteste concentratie voor BAC 0,75 mg/L; voor PAA was 0,5 mg/L; voor SAL waren 100 en 250 mg/L; en voor EUG waren 250 en 750 mg/L (Tabel 1).
3. Selecteer de concentraties en kies de concentraties die op de dosis-respons test voor individuele moleculen worden beoordeeld en die resulteerden in niet-bactericide effecten.

6. Beoordeling van bacteriële hergroei

1. Om het bacteriële hergroeivermogen te beoordelen, laat de microbiële cellen langer dan 24 uur groeien in vloeibaar medium, bij 25 °C en 100 rpm, na behandeling en neutralisatie.
2. Voer tienvoudige seriële verdunning uit, platering, incubatie van de PCA-platen en kwantificering van de CFU/mL met dezelfde technieken en omstandigheden.

7. Interpretatie van combinatorische resultaten – Fractionele bactericidale concentratieindex (FBCI)

1. Interpreteer de resultaten van combinatorische analyse als volgt:
   1. Voor duale combinaties geldt FBCI = FBC(A) + FBC(B), waarbij de fractionele bactericide concentratie van A, FBC(A), de verhouding is tussen de MBC van A in duale combinatie en de MBC van A alleen (MBC A-combinatie/MBC _A ^alleen), en FBC(B) de verhouding is tussen de MBC van B in duale combinatie en de MBC van B alleen (MBC_B-combinatie/MBC_B ^alleen) (Vergelijking 3).
   2. Voor drievoudige combinaties geldt dat FBCI = FBC(A) + FBC(B) + FBC(C), waarbij FBC(A) de verhouding is tussen de MBC van A in drievoudige combinatie en de MBC van A alleen (MBC ^A-combinatie/MBC _A ^alleen), FBC(B) de verhouding is tussen de MBC van B in drievoudige combinatie en de MBC van B alleen (MBC B-combinatie/MBC_B ^alleen), en FBC(C) is de verhouding van de MBC van C in drievoudige combinatie en de MBC van C alleen (MBC C-combinatie/MBC_C ^alleen) (Vergelijking 4).
   3. Met toepassing van de classificatie voorgesteld door Fernandes et ^al.50 komt FBCI ≤ 0,5 overeen met synergisme, 0,5 < FBCI ≤ 1 duidt op additatie, 1 < FBCI ≤ 4 wordt als onverschilligheid geclassificeerd, en FBCI > 4,00 wordt als antagonisme beschouwd.
      FBC(A) + FBC(B) = (MBC ^{duale combinatie}/MBC_A ^alleen) + (MBC_B ^{dubbele combinatie}/MBC_B ^alleen) (3)
      FBC(A) + FBC(B) + FBC(C) = (MBC_A ^{drievoudige combinatie}/MBC_A ^alleen) + (MBC_B ^{drievoudige combinatie}/MBC_B ^alleen) + (MBC_C ^{drievoudige combinatie}/MBC_C ^alleen) (4)

8. Procedure voor tijdrespons-assay

1. Bereid de nachtkweken van E. coli CECT 434 en S. aureus CECT 976 voor volgens de eerder beschreven groeiomstandigheden (sectie 1).
2. Voeg 1 ml celsuspensie toe aan 1 ml ultrazuiver water en wacht 2 minuten. Voeg op dit punt 8 mL biocidale/fytochemische oplossing toe (in ultrazuiver water of 5% DMSO) om de gewenste concentraties voor elk molecuul te bereiken: 1/4 x MBC en MBC, en voor de bacteriële suspensie (door de OD aan te passen), bij 100 rpm en 25 °C. Meng de moleculen met de cellen door te vortexen.
3. Evalueer de volgende belichtingstijden: 1, 3, 5, 15, 30, 45, 60 en 90 minuten.
4. Zoals beschreven in sectie 4, evalueer de antimicrobiële activiteit door de logitmatie (CFU/mL) te berekenen als logitmiek (X/X₀).
5. Voer de biocide of fytochemische neutralisatie uit voor elk paar concentratie/tijd die getest wordt met behulp van de verdunnings-neutralisatiemethode en de universele neutralisator, de seriële verdunning en plating, zoals eerder beschreven in sectie 4.

9. Analyse van combinatorische gegevens met de software Combenefit

1. Open het meegeleverde bestand 'REPLICATE_TEMPLATE.xls' op https://sourceforge.net/projects/combenefit/files/ , om de juiste structuur en opmaak te waarborgen.
2. Organiseer je gegevens in een matrix, volgens de Aanvullende Tabel 1, waarbij:
   1. Verhoog de concentraties van product A van boven naar beneden (van de laagste naar de hoogste genummerde rijen). Voeg ten minste drie verschillende concentraties voor product A op.
   2. Verhoog de concentraties van product B van links naar rechts (van de laagste naar de hoogste genummerde kolommen): Neem ten minste drie verschillende concentraties op voor product B.
   3. Vertegenwoordig de bovenste rij (0 mg/L product A) enkelvoudig product B.
   4. Geef de eerste kolom (0 mg/L product B) enkelvoudig agent A voor.
   5. Vertegenwoordig de cel (0,0) zoals de onbehandelde controle.
   6. Normaliseer voor elk geval de gebruikte waarden met behulp van Vergelijking (5), waarbij de treat_0h de logaritme (CFU/mL) is voor een specifieke behandeling, direct na blootstelling (0h); treat_24h is het logaritme (CFU/mL) voor een specifieke behandeling, 24 uur na de blootstelling (hergroei); control_0h is het logaritme (CFU/mL) voor de overeenkomstige controle (alleen cellen of cellen blootgesteld aan 5% DMSO), direct na blootstelling (0 uur); en control_24h is de logaritme (CFU/mL) voor de overeenkomstige controle (alleen cellen of cellen blootgesteld aan 5% DMSO), 24 uur na de blootstelling (hergroei).
   7. Voer in alle gevallen CFU-enumeratie uit na 24 uur incubatie van geplateerde monsters op PCA.
      (treat_0h - treat_24h)/(control_0h - control_24h) 100 (5)
      OPMERKING: Neem controles/onbehandelde aandoeningen op die 100% levensvatbaarheid definiëren en een positieve controle die maximale inhibitie definieert (optioneel); Gebruik alleen numerieke waarden, geen formules; Gebruik hetzelfde aantal rijen en kolommen over replicates; Gebruik '.' voor decimalen.
3. Sla het bestand op als .xls of .xlsx.
4. Maak voor elke replicatie een Excel-bestand, zoals eerder beschreven en zoals in Aanvullende Tabel 1, en voeg alle bestanden toe in dezelfde map.
5. Open de software Combenefit (Cancer Research UK Cambridge Institute, Cambridge, versie 2.021, beschikbaar op https://sourceforge.net/projects/combenefit/).
6. Upload die map naar Combenefit.
   1. Open de software Combenefit
   2. Druk op Projectmap selecteren en kies de juiste map.
   3. Het selecteren van het referentiemodel: Loewe-additatie die het exacte mechanisme voor beide producten aanneemt; Bliss-onafhankelijkheid die onafhankelijke actie aanneemt, of HAS, wat een conservatief model is (de combinatie vergelijkt met de beste enkele agent). De beste praktijk bestaat uit het draaien van minstens twee modellen en het kiezen van het beste.
   4. In dit geval werd het Bliss-model gekozen, gegeven de werkwijze van de geteste moleculen.
   5. Selecteer de gewenste grafische outputs, wetende dat je er minstens één extra moet selecteren voor de Synergy-distributie.
   6. Press Run-analyse (Aanvullende Figuur 1). Tip: Selecteer in het venster 'Opslaan tijdens analyse' Kies Alles om alle resulterende grafische uitvoer in de originele map op te slaan.

10. Toepassing van Chick-Watson- en Weibull-modellen op dosis- en tijdresponsgegevens

1. Bereid uw gegevens voor door de dataset in Excel of CSV te formatteren voordat u importeert: Voor dosis-respons komt kolom A overeen met de dosis (concentratie, mg/L) en kolom B met de logaritme (X/X₀); Voor de tijdresponsgegevens komt Kolom A overeen met de tijd (minuten) en Kolom B met de logaritme (X/X₀).
2. Sla je bestand op in '.csv' of kopieer en plak direct in Prism.
3. Open GraphPad Prism (gebruikte versie: 9.0 voor Windows 11; La Jolla, Californië, VS).
4. Selecteer in Nieuwe tabel en grafiek XY, en in Gegevenstabel selecteer Invoer of importeren van gegevens in een nieuwe tabel (Aanvullende Figuur 2).
5. In Opties selecteert u voor X Nummer, voor Y selecteert u replicatiewaarden in naast elkaar geplaatste subkolommen en drukt u op Aanmaken (Aanvullende Figuur 2).
6. Voer dosis/tijdgegevens in X en log overlevingsgegevens in Y.
7. Ga naar Analyseren, Niet-lineaire regressie (curve fit), selecteer de datasets die je wilt analyseren en druk op OK (Aanvullende Figuur 2).
8. Selecteer Nieuw en maak vervolgens een nieuwe vergelijking aan.
9. In Vergelijking, voor Vergelijkingstype, kies expliciete vergelijking: Y = een functie van X en parameters; voor de naam schrijf je Chick-Watson Model/Weibull Model; en schrijf in Definitie Y = -a*x^(n)*30 Chick-Watson-model (Aanvullende Figuur 3) en Y = -1/(2,303)*(x/a)^(b) voor het Weibull-model (Aanvullende Figuur 4).
   OPMERKING: Het Chick-Watson-model wordt uitgedrukt door Vergelijking 6, waarbij X₀ en X de CFU/mL zijn voor de onbehandelde bacteriën (controle) en behandelde bacteriën, C de concentratie (dosis), k_dis de inactivatiesnelheid coëfficiënt, C de concentratie (dosis), n de concentratieexponent en t de blootstellingstijd (in dit geval, 30 min)⁵⁰. Het Chick-Watson-model werd toegepast om de dosis-respons te observeren en om de relatie tussen desinfectiemiddelconcentratie en microbiële reductie te karakteriseren.
   log (X/X₀) = -k_dis · Cⁿ · t (6)
   OPMERKING: Het Weibull-model wordt uitgedrukt door Vergelijking 7, waarbij X₀ en X de CFU/mL zijn voor de onbehandelde bacteriën (controle) en behandelde bacteriën, t de tijd, α de schaalparameter (karakteristieke tijd) en β de vormparameter⁵⁰. Het Weibull-model werd toegepast om de tijdsrespons te observeren en de vorm van overlevingscurves te karakteriseren. De schaalparameter geeft de karakteristieke inactivatietijd weer terwijl de vormparameter afwijkingen van log-lineair gedrag beschrijft (β = 1 log-lineair; β < 1 tailing; β > 1 schouder).
   log (X/X₀) = -1/2,303 (t/α)^β (7)
10. In Rollen voor Beginwaarden kies 0 als Beginwaarde voor elke parameter en (Beginwaarde, passend) als Regel (Aanvullende Figuur 5).
11. Houd de rest van de instellingen standaard en druk op OK.
12. Voer de passing uit en inspecteer de geschatte parameters.

11. Biologische replicatie

1. Voer voor alle assays minstens twee onafhankelijke experimenten uit met ten minste twee replicata.

Resultaten

Deze studie evalueerde de bactericide activiteit van alle vier de geteste verbindingen — BAC, PAA, SAL en EUG — aan de hand van E. coli CECT 434 en S. aureus CECT 976. Zoals weergegeven in Figuur 1 en Figuur 2, vertoonden BAC, PAA, SAL en EUG een duidelijk concentratieafhankelijk effect op de cultivatie. Tabel 2 toont de MBC-waarden voor de geteste moleculen na blootstelling en 24 uur na bloots...

Discussie

Het protocol dat in deze studie wordt gepresenteerd, biedt een geïntegreerd kader voor het beoordelen van de bactericide activiteit van twee veelgebruikte biociden – BAC en PAA – en twee veelbelovende fytochemicaliën – EUG en SAL – afzonderlijk en in combinatie (dubbele en drievoudige combinaties), tegenover E. coli en S. aureus. Verschillende stappen binnen dit protocol zijn bijzonder cruciaal om reproduceerbaarheid en nauwkeurige interpretatie van antimicrobiële interacties te waarborg...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Benzalkonium Chloride	Merck, Spain	8.14363.0100	Biocide
Centrifuged Mega Star 600R	VWR, USA	VWR Mega Star 600R	-
Combenefit - Version 2.021	Cancer Research UK Cambridge Institute, Cambridge, United kingdom	-	Software voor synergiebeoordeling
Cuvettes	VWR, Germany	VWRI634-0678	1,5 mL cuvettes voor optische dichtheidsaanpassing
Destilatted water	-	-	Voor media-bereiding
Dimethyl Sulphoxide (DMSO)	VWR, France	23500.322	Organische oplosmiddel
Disposable inoculation loops	VWR, Italy	VWRI612-9357	10 μL inoculatielussen
Eppendorf tubes	VWR, China	VWRI525-1164	1,5 mL eppendorf safe-lock tubes
Escherichia coli	Spanish Type Culture Collection (CECT)	434	Referentiestam gebruikt in dit onderzoek
Ethanol	VWR, France	83813.36	Voor ontsmetting van werkplek, materiaal en handen
Eugenol 99%	Sigma-Aldrich, USA	163333	Fytochemisch
Falcon tubes	VWR, USA	VWRI525-1085	15 mL falcon tubes
Falcon tubes	VWR, Belgium	VWRI525-1109	50 mL falcon tubes
GraphPad Prism 9.0 for Windows 11	La Jolla, California, USA	-	Software voor wiskundige en statistische analyse
Lecithin	Alfa Aesar, Germany	Q04A010	-
L-histidine	Merck, USA	1.04351.0025	-
Orbital Incubator	VWR, USA	VWR 5000I Incubating shaker 230V	-
Peracetic acid 15%	AppliChem, Germany	143495-1211	Biocide
Petri dishes	VWR, Italy	VWRI391-0582	-
Pipette 1 - 10 mL	VWR, USA		-
Pipette 100 - 1000 μL	VWR, USA		-
Pipette tips 100 - 1000 μL	Frilabo, Portugal	1-202-50-0	-
Pippette 20 - 200 μL	VWR, USA		-
Pippette tips 1 - 10 mL	VWR, Belgium	vwri613-7094	-
Pippette tips 2 - 200 μL	VWR, Mexico	vwri613-6418	-
Plate Count Agar	VWR, Belgium	84608-0500	Isolatie en cultivatie van micro-organismen
Polysorbate 80	VWR, USA	20E2756726	-
Potassium Chloride - KCl	VWR, Belgium	11D110008	-
Potassium Dihydrogen Phosphate - KH2PO4	VWR, Germany	26931.263	-
Sacilicic acid	Sigma-Aldrich, USA	84210-500G	Fytochemisch
Saponin	VWR, Germany	21A124103	-
Sodium Chloride - NaCl	VWR, Belgium	27788.297	-
Sodium Hydrogen Phosphate - Na2HPO4	VWR, Belgium	28026.26	-
Sodium Thiosulphate - Na2S2O3	VWR, USA	18D2056589	-
Spectrophotometer	VWR, USA	UV-1600PC Spectrophotometer	Opticale dichtheidsaanpassing
Staphylococcus aureus	Spanish Type Culture Collection (CECT)	976	Referentiestam gebruikt in dit onderzoek
Tryptic Soy Broth	Merck, Germany	1.05459.0500	Isolatie en cultivatie van micro-organismen
Ultrapure water	-	-	Voor monstervoorbereiding