Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Draadmyografie voor dorsale aorta en mesenterische resistentieslagaders van muizen en ratten

602 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70186

⸱

27 februari 2026

 ,  ,  , 
1Department of Physiology and Pharmacology, Center for Hypertension and Personalized Medicine, University of Toledo, College of Medicine and Life Sciences

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Wij bieden een gedetailleerd protocol voor zij-aan-zij draadmyografie om vasculaire reactiviteit te beoordelen in conduit- versus resistentieslagaders die geïsoleerd zijn van muizen en ratten.

Samenvatting

Draadmyografie is een veelgebruikte ex vivo techniek voor de kwantitatieve beoordeling van de vaatfunctie in geïsoleerde slagaders. Omdat grote leiding- en kleine resistentieslagaders fundamenteel verschillen in structuur en fysiologische rol, maakt het parallel analyseren van beide vatklassen met slagaders van dezelfde muis of rat geoogste vergelijkingen mogelijk die de variabiliteit tussen dieren verminderen en vatspecifieke functionele veranderingen aan het licht brengen. Dit artikel presenteert een stapsgewijs protocol voor het beoordelen van vasculaire reactiviteit in geïsoleerde muisgeleiders en resistentieslagaders met behulp van isometrische draadmyografie. We beschrijven de bereiding van een verse, zuurstofrijke fysiologische buffer; zorgvuldige dissectie, reiniging en montage van arteriële segmenten; en normalisatie om schepen dicht bij hun optimale lengte te plaatsen voor actieve krachtgeneratie. Er worden een handleiding voor probleemoplossing en een voorbeeldexperimentele sequentie voor het genereren van cumulatieve concentratie-responscurves voor standaard vasoconstrictors en vasodilatoren worden verstrekt. Dit protocol maakt kwantitatieve metingen van zowel de functie van de endotheel- als gladde spieren mogelijk en faciliteert de detectie van vatspecifieke veranderingen in vasculaire reactiviteit die geassocieerd worden met vasculaire aandoeningen, zoals hypertensie.

Inleiding

Hypertensie wordt gekenmerkt door veranderde vasculaire reactiviteit, zoals endotheeldisfunctie en hyperreactiviteit van de gladde vaatmuskulatur op vasoconstrictoren1. Deze functionele veranderingen, samen met microvasculaire remodellering en verdunning, dragen bij aan een verminderde weefselperfusie en een ontregelde bloeddruk 2,3,4. Ex vivo assays van geïsoleerde vaten zijn krachtige instrumenten om de cellulaire en moleculaire mechanismen te ontleden die de vasculaire tonus bij gezondheid en ziekte regelen, omdat ze een nauwkeurige controle van de vasculaire microomgeving en selectieve farmacologische manipulatie van gladde spieren en endotheelsignaalroutes mogelijk maken.

Vasculaire reactiviteit in geïsoleerde slagaders wordt vaak beoordeeld met twee complementaire ex vivo technieken: draadmyografie en drukmyografie 5,6. Bij draadmyografie worden vatringen of segmenten op pinnen of draden gemonteerd, en wordt isometrische krachtgemeten 7,8. Bij drukmyografie worden intacte vatsegmenten gecanuleerd en onder druk gezet tot een gedefinieerde intraluminale druk, en wordt de diameter van het vat gevolgd met videomicroscopie9. In tegenstelling tot draadmyografie maakt drukmyografie controle mogelijk van transmurale druk en intraluminale stroming. Zo reproduceert het de in vivo hemodynamische omgeving van resistentieslagaders nauwkeuriger en wordt het vaak gebruikt om myogene tonus, stroomgemedieerde responsen en vasculaire structurele of mechanische eigenschappen te bestuderen 9,10. Omgekeerd is draadmyografie technisch eenvoudiger toe te passen (zonder cannulatie of videomicroscopie), ondersteunt het een hogere doorvoer met commerciële multi-kamersystemen, en is het zeer geschikt voor het genereren van reproduceerbare farmacologische concentratie-responscurves in kleine tot middelgrote slagaders met diameters van tientallen tot enkele honderden micrometers 5,6. Daarom wordt draadmyografie vaak gewenst voor farmacologische profilering naast elkaar van vasculaire reactiviteit in geleider- en resistentieslagaders die geïsoleerd zijn van muizen of ratten.

Geleiders (grote elastische) en weerstandslagaders (kleine spieren) verschillen fundamenteel in structuur en functie, en deze verschillen bepalen verschillende experimentele overwegingen en eindpunten. Geleiderslagaders (bijvoorbeeld dalende thoracale aorta) bevatten grote hoeveelheden elastisch weefsel en aanzienlijke gladde spiermassa; Weerstandslagaders (bijv. mesenterische slagaders) hebben relatief hogere gladde spier-tot-lumenverhoudingen en zijn belangrijke bepalende factoren voor perifere weerstand en lokale autoregulatie11,12. Omdat dezelfde agonist verschillende moleculaire responsen in deze vaatbedden kan activeren, levert een zij-aan-zij vergelijking van leidingen en weerstandsvaten van hetzelfde dier nuttige aanvullende informatie. Zo is in geleiderslagaders de afgifte van stikstofoxide afkomstig van endotheel het dominante relaxantkanaal waarmee acetylcholine (ACh) vasorelaxatieinduceert 13,14. Daarentegen induceert ACh in kleine resistentieslagaders ontspanning via stikstofoxide, prostacycline en, belangrijk, endotheel-afgeleide hyperpolarisatiefactoren (EDHF)15,16. Daarom maakt zij-aan-zij draadmyografie van leiding- en weerstandslagaders van dezelfde muis of rat gepaarde vergelijkingen mogelijk, die het detecteren van vatspecifieke functionele veranderingen vergemakkelijken en de variabiliteit tussen dieren verminderen.

Nauwkeurige interpretatie van draadmyografiegegevens hangt af van zorgvuldige aandacht voor een reeks technische variabelen: samenstelling en zuurstofvoorziening van de fysiologische zoutoplossing (PSS), weefselbehandeling en dissectie, montagetechniek, optimale rustpretensie (normalisatie), badtemperatuur en selectie van geschikte farmacologische controles6. Normalisatie verwijst naar de technische procedure waarbij het mechanische bedieningspunt van het vaartuig wordt ingesteld zodat de ontwikkeling van actieve kracht wordt geoptimaliseerd en fysiologische bedrijfsomstandighedenbenadert. In de praktijk is het voor aortaringen gebruikelijk om een vaste pretensie te gebruiken, vaak empirisch bepaald om overdistensie te voorkomen terwijl er stabiele reacties worden gegeven. Voor kleine weerstandslagaders wordt normalisatie uitgevoerd door eerst de interne omtrek te bepalen die overeenkomt met een equivalente transmurale druk van 100 mmHg (IC100). Het vat wordt vervolgens ingesteld op een bepaald deel van deze waarde om de genormaliseerde interne omtrek (IC1) vast te stellen. In de praktijk zetten veel protocollen IC1 rond 0,9 × IC100 voor ratten-MRA en rond de 1,0 × IC100 voor muis-MRA, hoewel deze waarden kunnen worden aangepast op basis van vattype, soort en experimentele doelen 5,17.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het volgende protocol voldoet aan de richtlijnen en is goedgekeurd door de University of Toledo Health Science Campus Animal Care and Use Committee.

VOORZICHTIG Voordat u begint, volgt u te allen tijde de richtlijnen van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en het Institutional Biosafety Committee (IBC); gebruik van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM); Voorzichtigheid met chirurgische of andere scherpe instrumenten; raadpleeg en volg de relevante veiligheidsgegevensbladen (SDS) bij het hanteren van chemicaliën en biologische weefsels; Carbogen omgaan als een onder druk staande gascilinder met goedgekeurde regelaars en veilige opslag; en het afvoeren van biologisch en chemisch afval volgens institutionele procedures.

1. Bereiding van PSS/gemodificeerde Krebs bicarbonaat (Krebs) buffer

OPMERKING: Krebs-buffersamenstelling (eindconcentraties, pH 7,4): 130 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,17 mM MgSO4, 1,18 mM KH2PO4, 1,6 mM CaCl2, 25 mM NaHCO3, 5,5 mM glucose en 0,03 mM EDTA.

  1. Bereid grote hoeveelheden bouillon: los alle bestanddelen behalve NaHCO3, glucose en CaCl2 op in dubbel gedestilleerd water om een bouillon te maken. Bewaar deze bouillon bij 4 °C.
  2. Op de dag van het experiment aliquot je het benodigde volume voorraad (bijv. 1 L), voeg je sequentieel NaHCO3, glucose en CaCl2 toe, en zorg je continu voor zuurstof met carbogen (95% O2/5% CO2).
    OPMERKING: Om de neerslag van calciumzout te minimaliseren, bereid je een 1 M CaCl 2-bouillon voor en bewaar je op 4 °C en voeg je het benodigde volume pas langzaam toe aan de buffer nadat NaHCO3 volledig is opgelost, terwijl je continu roert. Houd carbogen bubbels tijdens toevoeging van CaCl2 (zie stap 1.3) om de vorming van calciumcarbonaat te verminderen. Als er zichtbare neerslag optreedt, gooi dan een nieuwe buffer weg en bereid ze voor.
  3. Voor pH-evenwicht laat je de buffer minstens 20 minuten bellen met carbogen, meet dan de pH en pas je het aan naar pH 7,4 indien nodig.
    OPMERKING: Typische prebubbling pH ≈ 7,7; Continue bubbels verlaagt de pH tot fysiologische ≈7,4.
  4. Bereid myograafkamers voor door ze te vullen met vers bereide Krebs-buffer en begin zachtjes te bubbleren met carbogen. Pas de bubbelfrequentie aan om voldoende gasuitwisseling te garanderen zonder hevig bewegen.
  5. Reserveer een aliquot van vers bereide, zuurstofrijke Krebs-buffer en koel deze op ijs voor weefseldissectie. Verwarm de resterende zuurstofhoudende buffer tot 37 °C (met continu carbogenbubbelen) voor gebruik tijdens experimenten.

2. Dissectie van de dalende thoracale aorta en mesenterische arcade

  1. Euthanace het dier volgens de richtlijnen van de IACUC. Standaardiseer de timing van dierlijke euthanasie en weefseloogst binnen een venster van 2 uur om mogelijke circadiane effecten te minimaliseren.
  2. Open onmiddellijk de thoracale en buikholte via een middenlijnincisie en reflecteer de borstwand lateraal om het hart en de grote vaten bloot te leggen.
    OPMERKING: Voer geen systemische perfusie uit onder standaardomstandigheden, omdat dit onbedoeld endotheelschade kan veroorzaken. Bovendien verbetert het vastgehouden bloed in de mesenteriale vaten het visuele onderscheiden van slagaders en aders en vergemakkelijkt het de beoordeling van arteriële integriteit. In sommige pathologische modellen (bijv. trombotische aandoeningen) kan echter een milde, laagdrukperfusie met hepariniseerde, ijskoude fysiologische buffer aan te raden zijn om obstructieve trombi te verwijderen en tegelijkertijd endotheelschade te minimaliseren.
  3. Verwijder de dalende thoracale aorta. Om de dissectie te vergemakkelijken, verwijder je de longen en slokdarm om de visualisatie te verbeteren. Grijp de dalende thoracale aorta niet direct vast; Houd in plaats daarvan voorzichtig de aortaboog, het periadventiale vet, til iets op en snijd voorzichtig de intercostale takvaten van onder de aorta door. Verwijder de dalende thoracale aorta door net voordat deze door het middenrif gaat te snijden en plaats deze in een met Sylgard bedekte Petrischaal met ijskoude, zuurstofhoudende Krebs-buffer.
    OPMERKING: Houd een lage temperatuur om spontane klank te minimaliseren en de levensvatbaarheid te behouden. Black Sylgard verhoogt het contrast bij het dissectie van het vat.
  4. Verwijder de hele mesenterische arcade. Til de mesenterische arcade voorzichtig op om de arterie superior mesenterica te lokaliseren die vertakkt van de abdominale aorta caudaal naar het middenrif. Snijd de arteria superior mesentericus proximaal door en maak de mesentericale arcade los van het omliggende bindweefsel zonder directe vatmanipulatie. Plaats de mesenterische arcade in een aparte met Sylgard bedekte Petrischaal met ijskoude, zuurstofhoudende Krebs-buffer.

3. Isolatie en montage van aortaringen op pinmyografen

  1. Zet de proximale en distale uiteinden van de dalende thoracale aorta vast met dissectiepennen om het vat recht te maken. Vermijd overstrek om mechanische schade te voorkomen.
    OPMERKING: Plaats pinnen in het periadventitiële vet in plaats van door de vatwand om schade te minimaliseren.
  2. Verwijder onder een stereomicroscoop met een externe lichtbron voorzichtig periadventieel vet en bindweefsel met fijne Vannas-schaar en pincet. Voorkom schade aan de schipwand.
    OPMERKING: Het is gebruikelijk om het periadventitiële vet te verwijderen, tenzij het doel is om de rol van perivasculaire adventitiële weefsels in de regulatie van de vasculaire tonus te bestuderen.
  3. Snijd 2 mm aorta-ringen door, maak schone, loodrechte sneden. Gooi ringen weg die doorboord zijn of zichtbaar beschadigd zijn. Steek waar mogelijk vergelijkbare locaties tussen dieren om variabiliteit te minimaliseren.
  4. Koppel één kamer met zuurstofhoudende Krebs-buffer los van de myografiemachine en vervoer deze voorzichtig naar de stereomicroscoop.
    OPMERKING: Het schudden van de kamer kan de transducer beïnvloeden en de resultaten veranderen, dus houd de kamer voorzichtig vast en zet hem voorzichtig neer.
  5. Gebruik onder de stereomicroscoop de micrometer om de myograafpinnen bij elkaar te brengen en schuif de aorta-ring op de pinnen, zodat de manipulatie van het luminale oppervlak wordt geminimaliseerd.
  6. Let op de micrometermeting met de ring volledig ontspannen; Breng een lichte rek aan om het weefsel voor transport vast te zetten.
  7. Verbind de kamer met het instrument en herstel het vat naar de oorspronkelijke micrometermeting.
  8. Nadat alle ringen zijn gemonteerd, verhit je de kamers tot 37 °C en meet je de temperatuur met de meegeleverde sonde (meestal 20-30 minuten tot 37 °C).
  9. Nul de krachtmetingen in de gebruikersinterface, start de dataverzamelingssoftware en begin met opnemen.
  10. Breng incrementeel pretensie toe op aortaringen tot een voor het vat geschikte vaste waarde met behulp van de micrometer.
    OPMERKING: Een typische pretensiewaarde voor aortaringen van muizen is 5 milliNewton (mN)5. Hoewel gerapporteerde pretensiewaarden voor rat-aortaringen per studie variëren, ondersteunt prior optimization een pretensie van 10 mN in dit protocol18.
  11. Evenwichtig aortaringen gedurende 45-60 minuten bij de geselecteerde pretentie, met herhaalde bufferwisselingen met 37 °C Krebs.
    OPMERKING: Het is gebruikelijk dat aortaringen gedeeltelijk spanning verliezen en daardoor een fijne aanpassing van de voorspanning meerdere keren met de micrometer vereisen voordat de spanning stabiliseert.
  12. Nul de krachtmetingen in de gebruikersinterface voordat je experimentele protocollen begint.

4. Isolatie en montage van MRA op draadmyografen

  1. Speld de mesenterische arcade in een kloksgewijs patroon om de mesenterische takken recht te maken. Begin met het vastzetten van het cekum, en pind vervolgens opeenvolgende rekken van de dunne darm met de klok mee om de mesenterische vasculatuur voorzichtig te spannen zonder te overstrekken. Vervang de buffer indien nodig door verse Krebs om bloed of vuil te verwijderen.
  2. Identificeer de arteria superior mesenteria in het midden van de schaal waar arcades uitstralen.
  3. Kies een geschikte MRA voor isolatie; Typische doelen: interne diameter 200-250 μm (later bepaald tijdens normalisatie).
    OPMERKING: Bij volwassen proefdieren komt dit meestal overeen met 2takken van de tweede orde bij muizen en de 3tot de 4 takken vande derde orde bij ratten. De takorde wordt bepaald door opeenvolgende bifurcaties van de arteria superior mesentericus. 1-orde-takken ontspringen direct uit de superieure mesenteriader, 2n-orde takken uit 1-orde takken, enzovoort.
  4. Onder een stereomicroscoop ontleed je de bijbehorende ader en verwijder je periadventieel vet en bindweefsel met Vannas-schaar en fijne tang.
    OPMERKING: MRA's zijn te onderscheiden van aders door hun dikkere wanden en kleinere lumen, die gemakkelijk zichtbaar zijn door de aanwezigheid van residueel intraluminaal bloed.
  5. Ontspan de nabijgelegen darmpin(s) die de darmwand naast het geselecteerde vat uitrekken, voordat je de slagader verwijdert om een terugslag van het vat te voorkomen.
  6. Verwijder de volledige lengte van de geselecteerde MRA (moet >2 mm lang zijn), waarbij je nette, loodrechte sneden maakt. Met fijne tangen grijp je één uiteinde van de slagader en plaats je het in een schone petrischaal met ijskoude Krebs-buffer (gewone, niet-Sylgard-gecoate schalen vergemakkelijken het volgende monteren). Controleer de slagader op schade; De aanwezigheid van intraluminaal bloed vergemakkelijkt visuele beoordeling van de integriteit.
  7. Verwijder een segment van ongeveer 2 mm uit een onbeschadigd gebied. Gooi alle gebieden weg die tijdens het transport zijn aangeraakt of toon zichtbare schade.
    OPMERKING: Door transparante, niet-Sylgard-gecoate schotels te gebruiken, kan een liniaal onder de schaal geplaatst worden om de lengte van het vat nauwkeurig te meten.
  8. Maak twee 2,5 cm lange 40 μm roestvrijstalen draad klaar voor montage.
  9. Met fijne pincetten rijg je de draden voorzichtig één voor één door het lumen zodat er voldoende draad uit beide uiteinden steekt om te monteren. Minimaliseer endotheeltrauma. Na het inbrengen van beide draden noteer je de exacte lengte met een liniaal voor gebruik in de normalisatieprocedure (zie stap 5.2).
    OPMERKING: Dit is een van de technisch meest uitdagende en tijdrovende stappen van het protocol en vereist geduld en herhaalde oefening om endotheelschade te minimaliseren. Na het inbrengen van de eerste draad is het vaak makkelijker om beide draden aan elkaar te klemmen en door het vat te laten lopen.
  10. Koppel één kamer met zuurstofhoudende Krebs-buffer los van de myografiemachine en vervoer deze voorzichtig naar de stereomicroscoop.
  11. Onder de stereomicroscoop wordt de MRA (de draden aan beide uiteinden) overgebracht naar de myograafkamer. Met de micrometer breng je de myograafkaken samen om de draaduiteinden tussen de kaken vast te klemmen, zodat de slagader vrij tussen hen hangt.
    OPMERKING: In dit stadium is het raadzaam om de draden zo vast te klemmen dat ze op elkaar liggen. Dit houdt de draden op hun plaats en voorkomt dat ze draaien.
  12. Bevestig de bovenste draad onder de bevestigingsschroeven aan de bijna micrometerzijde door de uiteinden met de klok mee te wikkelen; Herhaal dit voor de tweede draad aan de transducerzijde.
    OPMERKING: Draai de schroeven voorzichtig maar stevig aan. Als de schroeven te los zitten, kan het vat wegschuiven; bij te strak aandraaien kan de draad of transducer beschadigd raken. Na het vastmaken van het eerste uiteinde, open je de opening tussen de myograafkaken iets voordat je het andere uiteinde vastzet om een gelijkmatige draadspanning te garanderen.
  13. Beweeg de kaken iets uit elkaar en lijn de draden zo uit dat ze parallel en coplanair liggen, bijna tegen elkaar aan.
    OPMERKING: Voer alle draadaanpassingen weg van het gemonteerde vaartuig uit om schade te minimaliseren.
  14. Herhaal de montage voor alle MRA's.
  15. Verwarm kamers tot 37 °C en monitor de temperatuur (20-30 minuten typisch).
  16. Nul de krachtmetingen in de gebruikersinterface voordat je de normalisatieprocedure start.

5. Normalisatieprocedure voor de MRA

OPMERKING: Aortaringen zijn gemonteerd op een vaste, vooraf bepaalde pretentie. Daarom wordt geen aparte normalisatiestap uitgevoerd.

  1. Stel normalisatieparameters in in de data-acquisitiesoftware: oculairkalibratie = 1; doeldruk = 13,3 kPa (≈ 100 mmHg); genormaliseerde interne omtrek (IC1) = 0,9 voor ratten-MRA's en 1,0 voor muis-MRA's; gemiddelde tijd = 2 s; vertraging = 60 s.
  2. Voer de vatspecifieke parameters in de normalisatiemodule in als volgt:
    1. Voor weefseleindpunten (mm): stel a1 = 0 in en a2 = de gemeten lengte van de MRA in millimeters (de exacte lengte die tijdens de excisie wordt geregistreerd).
    2. Hier komt draaddiameter: 40 μm.
    3. Micrometermeting: voer de basiswaarde van de micrometer in die met het vat is vastgelegd en volledig ontspannen.
  3. Begin de normalisatieprocedure door de gemonteerde MRA stapsgewijs in stappen van 50 μm te rekken. Na elke rek voer je de nieuwe micrometermeting in de normalisatiemodule en wacht je 60 seconden tussen de stapjes.
    OPMERKING: Plotselinge spanningsdalingen na een micrometeraanpassing wijzen meestal op een doorsleping van het vat. De montageschroeven moeten voorzichtig maar stevig worden aangedraaid.
  4. Wacht tot de normalisatiemodule de rustwandspanning (mN/mm) versus de interne omtrek (μm) uitzet en een exponentiële kromme past. Gebruik de micrometer om stapsgewijs te rekken totdat de trek-omtrekcurve de 100 mmHg isobaar snijdt. Verlaag bij de kruising de stapgrootte tot 10-30 μm om te voorkomen dat het vat overbelast raakt.
  5. Wanneer de kromme de isobaar van 100 mmHg snijdt, let dan op de door software berekende interne omtrek en stel de micrometer in op de overeenkomstige waarde die door de module is berekend, zodat de voorbereiding rust op de doelgenormaliseerde interne omtrek (IC₁).
    OPMERKING: Slechte krommpassing duidt meestal op onjuiste parameters die in de software zijn ingevoerd, zoals weefsellengte, draaddiameter of micrometermetingen.
  6. Herhaal de normalisatieprocedure voor alle gemonteerde MRA's en laat vervolgens de schepen 30-45 minuten in balans komen met herhaalde bufferwisselingen met 37 °C Krebs.
  7. Nul de krachtmetingen in de gebruikersinterface direct voordat je met experimenten begint.
    OPMERKING: Belangrijke verschillen tussen muizen en ratten worden samengevat in Tabel 1.
ParameterMuisRat
Pretentiewaarde voor aortaringen5 mN10 mN
Target IC1-ratio voor MRA10.9
Typische MRA-tak order voor 200-250 μm interne diameter2e3-4e

Tabel 1: Belangrijke verschillen tussen muizen en ratten.

6. Experimenteel protocol (voorbeeldsequentie)

  1. Levensvatbaarheidscontrole: Een contractiele respons oproepen met een depolariserende hoge K⁺-uitdaging (bijv. 120 mM KCl).
    OPMERKING: De high-K⁺ buffer (KPSS) wordt bereid door equimolaire substitutie van NaCl met KCl uit de standaard Krebs-buffer om osmolariteit te behouden en wordt continu geoxygeneerd met 95% O2/5%CO2. Om koude schok te voorkomen, verwarm je de KPSS tot 37 °C vóór gebruik. KPSS-buffersamenstelling (eindconcentraties, pH 7,4): 120 mM KCl, 14,7 mM NaCl, 1,17 mM MgSO4, 1,18 mM KH2PO₄, 1,6 mM CaCl2, 25 mM NaHCO3, 5,5 mM glucose en 0,03 mM EDTA.
  2. Voer ten minste drie opeenvolgende wasbeurten uit met een verse 37 °C zuurstofhoudende Krebs-buffer totdat een stabiele passieve basale spanning is hersteld.
    OPMERKING: Alle wasstappen worden uitgevoerd door de badoplossing volledig te verwijderen en te vervangen door een verse 37 °C zuurstofhoudende Krebs-buffer. Commerciële myografen hebben vaak een ingebouwde washfunctie die de myografiekamers afvoert.
  3. Genereer een cumulatieve concentratie-responscurve (CRC) voor fenylefrine (PE), waarbij toenemende concentraties worden toegevoegd (voorbeeld bereik 10⁻9 tot 10⁻4 M). Laat elke concentratie plateaueren voordat je de volgende toevoegt totdat een stabiel maximaal plateau is bereikt.
  4. Voer ten minste drie opeenvolgende wasbeurten uit met een verse 37 °C zuurstofhoudende Krebs-buffer totdat een stabiele passieve basale spanning is hersteld.
  5. Beoordeel de endotheelfunctie: Preconstrictie met een submaximale concentratie PE, laat de respons stabiliseren, en beoordeel vervolgens endotheelafhankelijke relaxatie met ACh (voorbeeld bereik 10⁻⁹ tot 10⁻⁵ M). Laat elke concentratie stagneren voordat je de volgende toevoegt totdat een stabiele maximale relaxatie is bereikt. Recordpercentage ontspanning ten opzichte van de voorvernauwde toon (zie stap 7.4). Preparaten met <70% ontspanning zijn uitgesloten.
    OPMERKING: Vasculaire wandziekten, zoals hypertensie, worden vaak geassocieerd met endotheeldisfunctie, wat vaak leidt tot een verstoorde endotheelafhankelijke vasorelaxatierespons opACh 19. Onder deze omstandigheden mogen preparaten met <70% ontspanning niet automatisch worden uitgesloten, omdat dit kan wijzen op echte ziektegerelateerde endotheeldisfunctie in plaats van technische falen.
  6. Voer ten minste drie opeenvolgende wasbeurten uit met een verse 37 °C zuurstofhoudende Krebs-buffer totdat een stabiele passieve basale spanning is hersteld.
  7. Test andere vasoactieve middelen, met en zonder route-specifieke remmers, zoals vereist door de experimentele vraag.
  8. Aan het einde van het experiment verwijder je alle gemonteerde vaten, maak je alle kamers schoon met 8% azijnzuur, gevolgd door drie wasbeurten water, en zet je tenslotte de gastank en de machine uit.
  9. Voer biologisch en chemisch afval af volgens institutionele procedures.

7. Data-analyse en rapportage

  1. Basisdefinitie en opname. Noteer de basisspanning direct vóór het begin van een vasoconstrictor challenge (d.w.z. high-K⁺ challenge, vasoconstrictor CRC of preconstrictie vóór een vasodilator CRC).
    OPMERKING: Voor verdere analyse is het praktisch eenvoudiger om de krachtmetingen op de gebruikersinterface na voldoende wassen van eerdere stimulatie, direct voor het begin van een vasoconstrictor-uitdaging (d.w.z. weergegeven basisspanning = 0) op nul te stellen.
  2. High-K⁺ uitdaging. Bereken de actieve kracht als: Actieve kracht = Maximale toon na KCl - Basisspanning (eenheden: mN). Druk de actieve kracht uit genormaliseerd naar ofwel eenheidslengte (mN/mm) of dwarsdoorsnede (mN/mm 2) van het gemonteerde arteriële segment. De meting van de dwarsdoorsnede vereist daaropvolgende histologische analyse van de gemonteerde slagadersegmenten om de wanddikte te bepalen.
    OPMERKING: Omdat aortaringen vaak een niet-plateauerende respons produceren, meet je de maximale high-K⁺-respons binnen een vooraf bepaalde tijd (bijvoorbeeld 10 minuten) over alle voorbereidingen om variabiliteit te minimaliseren. Bij MRA's wordt de maximale high-K⁺-respons meestal binnen enkele seconden na stimulatie bereikt.
  3. Contractiele CRC's. Voor elke concentratie in een contractiele cumulatieve CRC (bijv. PE), bereken je de actieve kracht als volgt. Druk de actieve kracht uit bij elke concentratie als percentage van de respons die wordt opgewekt door de high-K⁺ uitdaging. Gebruik deze percentagewaarden voor het passen van contractiele CRC's (zie stap 7.5).
    Actieve kracht = Maximale toon na het toedienen van het medicijn - Basisspanning (eenheden: mN)
    OPMERKING: Bepaalde aandoeningen kunnen variabiliteit veroorzaken in de maximale high-K⁺-responsen tussen preparaten (bijvoorbeeld veranderingen in gladde spiermassa of differentiatietoestand als gevolg van pathologie). Onder deze omstandigheden drukt u de actieve kracht uit bij elke concentratie, genormaliseerd op een eenheidslengte (mN/mm) of een dwarsdoorsnede (mN/mm 2) van het gemonteerde arteriële segment.
  4. Relaxant CRC's. Voor relaxatie-CRC's na een submaximale preconstrictie (preconstrictietoon) bereken je het percentage relaxatie bij elke concentratie als volgt. Gebruik deze percentagewaarden voor het passen van relaxatie-CRC's (zie stap 7.5).
    Ontspanning = (Preconstrictietoon - toon na medicijntoepassing) / (Preconstrictietoon - Basisspanning) × 100.
  5. Curve fit. Voor zowel contractiele als relaxantia cumulatieve CRC's, plot log [agonistenconcentratie] op de x-as versus de genormaliseerde respons op de y-as. Pas de uitgeplotte kromme aan met een logistiek model met vier parameters met behulp van niet-lineaire regressie. Extract Emax (maximaal effect) en pEC50 (−logEC50) voor statistische vergelijkingen, waarbij EC50 de agonistconcentratie is die 50% van Emax produceert.
  6. Gegevenspresentatie: Presenteer de genormaliseerde CRC's. Voor elk van de datapunten op de curve wordt groepsgemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM) of standaarddeviatie (SD) gebruikt. Neem representatieve originele sporen op en bied een parametertabel die de Emax - en pEC50-waarden samenvat (gemiddelde ± SEM of SD).
  7. Statistische analyse:
    1. Vergelijk CRC's tussen experimentele groepen met behulp van tweerichtings-variantieanalyse (ANOVA) met een geschikte post-hoc test (bijv. Bonferroni). Controleer echter aannames (sfericiteit, normaliteit) en gebruik alternatieve benaderingen (bijv. mixed effects-modellen) wanneer gegevens ontbreken of onevenwichtig zijn.
    2. Vergelijk pEC50 en Emax tussen twee experimentele groepen met een ongepaarde t-test, of eenrichtings-ANOVA als je meer dan twee experimentele groepen vergelijkt. Alternatief kunt u niet-parametrische tests gebruiken wanneer variantiehomogeniteit en normaliteitsaannames worden geschonden. Stel statistische significantie in op p < 0,05.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een schema dat de algemene workflow van draadmyografie in leiding- en weerstandslagaders die van muizen of ratten zijn geïsoleerd, weergeeft, is weergegeven in Figuur 1. Representatieve beelden van isolatie en montage van een muis thoracale aorta-ring en een MRA van de 2e orde zijn respectievelijk weergegeven in Figuur 2 en Figuur 3. Softwarescreenshots die pretenspannings- en normalisati...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Draadmyografie blijft een krachtige, hoogresolutiemethode om vasculaire functies ex vivo te onderzoeken. Wanneer deze methode zorgvuldig wordt uitgevoerd, biedt deze methode betrouwbare kwantitatieve eindpunten die verschillende biologische vragen behandelen, terwijl een rigoureuze vergelijking van macro- en microvasculaire bedden binnen hetzelfde dier mogelijk is. Geleiderstudies tonen veranderingen in de globale arteriële mechanica en reactiviteit van grote vaten die relevant ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten om te melden.

Dankbetuigingen

Het werk werd ondersteund door een NHLBI-beurs (R00 HL153896 aan I.O.) en startkapitaal van de Universiteit van Toledo.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15 mL Conical Centrifuge TubesThermo Fisher Scientific14-959-70C
50 mL Conical Centrifuge TubesThermo Fisher Scientific14-959-49A
Acetic acidThermo Fisher ScientificA490-212
AcetylcholineMillipore SigmaA6625-100G
Analytical BalanceMettler ToledoMX304
CaCl2Thermo Fisher ScientificC79-500
Carbogen (95% O2/5% CO2)AirgasCD USP50
Dissection Microscope ZEISSZEISS Stemi 305
Dissection petri dishLiving Systems InstrumentationDD-90-S-BLK
Dissection pinsDanish Myo Technology400626
Dissection tool kitDanish Myo Technology101017Kit consists of dissection scissor (1), multi-purpose scissor (1), Petri dishes (5), forceps (3) and dissection pins.
Dumont #5 - Fine ForcepsFine Science Tools11254-20
EDTAThermo Fisher ScientificBP2482-500
Freezer (-20 °C)Thermo Fisher ScientificTSG2325FA
Freezer Hinged BoxesUSA Scientific2310-5848
Gloves (Large)Thermo Fisher Scientific19-041-171D
Gloves (Medium)Thermo Fisher Scientific19-041-171C
Gloves (Small)Thermo Fisher Scientific19-041-171B
GlucoseThermo Fisher ScientificD16-500
Graduated CylinderThermo Fisher Scientific08-572G
GraphPad PrismGraphPad SoftwareN/AData analysis and graphical presentation
Hydrochloric Acid SolutionThermo Fisher ScientificSA48-1
Ice BucketThermo Fisher Scientific03-395-156
KClThermo Fisher ScientificP217-500
KH2PO4Thermo Fisher ScientificP380-500
LabChart 8 SoftwareAD InstrumentsN/AData capture software
Laboratory RefrigeratorThermo Fisher ScientificFBG49RPGA
LED Light SourceThermo Fisher ScientificAMPSILED21
Magnetic StirrerThermo Fisher ScientificFB30786159
Magnetic Stirring Bars (Large)Thermo Fisher Scientific14-513-68
Magnetic Stirring Bars (Medium)Thermo Fisher Scientific14-513-61
MgSO4Thermo Fisher ScientificM63-500
Micro Spoon and Spatula Sampling SetThermo Fisher ScientificS43322
Microcentrifuge TubesUSA Scientific1615-5510
Mini MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific07-203-954
Mini-screwdriverThermo Fisher ScientificNC1349489
Multi wire myograph systemDanish Myo TechnologyDMT 620M
NaCl Thermo Fisher ScientificS271-3
NaHCO3Thermo Fisher ScientificS233-500
pH MeterThermo Fisher Scientific01-912-351Includes pH meter, LE420 sensor, installation QuickGuide, and pH buffer starter pack
Phenylephrine Millipore SigmaP6126-5G
Pipet ControllerThermo Fisher Scientific01-001-023
Pipette Tips in Racks (10 µL)USA Scientific1111-3810
Pipette Tips in Racks (1000 µL)USA Scientific1111-2830
Pipette Tips in Racks (200 µL)USA Scientific1111-1810
PYREX Reusable Media Storage BottlesThermo Fisher Scientific06-414-1D
Serological Pipettes (10 mL)Thermo Fisher Scientific02-923-204
Serological Pipettes (25 mL)Thermo Fisher Scientific02-923-205
Single-Channel micropipette Multi-PackThermo Fisher Scientific13-684-2503x pipettes (0.5-10 μL, 10-100 μL, 100-1000 μL)
Stainless steel wire (40 μm)Danish Myo Technology400447
TimerThermo Fisher Scientific02-261-840
Ultra Pure Water SystemSartoriusH2O-MM-UV-SET-US
Vannas Spring ScissorsFine Science Tools15000-00
Volumetric FlaskThermo Fisher Scientific13-756-400
Vortex MixerThermo Fisher Scientific10-320-807
Water bathThermo Fisher Scientific07-202-155
Weighing DishesThermo Fisher Scientific02-202-101

Referenties

  1. De Oliveira, M. G., Nadruz, W. Jr, Mónica, F. Z. Endothelial and vascular smooth muscle dysfunction in hypertension. Biochem Pharmacol. 205, 115263(2022).
  2. Gallo, G., Volpe, M., Savoia, C. Endothelial dysfunction in hypertension: current concepts and clinical implications. Front Med. 8, (2022).
  3. Touyz, R. M., et al. Vascular smooth muscle contraction in hypertension. Cardiovasc Res. 114 (4), 529-539 (2018).
  4. Serné, E. H., de Jongh, R. T., Eringa, E. C., Ijzerman, R. G., Stehouwer, C. D. A. Microvascular dysfunction. Hypertension. 50 (1), 204-211 (2007).
  5. Wenceslau, C. F., et al. Guidelines for the measurement of vascular function and structure in isolated arteries and veins. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 321 (1), H77-H111 (2021).
  6. Del Campo, L., Ferrer, M. Wire myography to study vascular tone and vascular structure of isolated mouse arteries. Methods Mol Biol. 1339, 255-276 (2015).
  7. Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260 (5552), 617-619 (1976).
  8. Sun, J., et al. Isometric contractility measurement of the mouse mesenteric artery using wire myography. J Vis Exp. (138), e58064(2018).
  9. Halpern, W., Osol, G., Coy, G. S. Mechanical behavior of pressurized in vitro prearteriolar vessels determined with a video system. Ann Biomed Eng. 12 (5), 463-479 (1984).
  10. Jadeja, R. N., Rachakonda, V., Bagi, Z., Khurana, S. Intravital assessment of vascular function. J Vis Exp. (101), e50997(2015).
  11. Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Structure and mechanical properties of resistance arteries in hypertension. Hypertension. 36 (3), 312-318 (2000).
  12. Lee, R. M. K. W., Dickhout, J. G., Sandow, S. L. Vascular structural and functional changes in hypertension: models, remodeling and relevance. Hypertens Res. 40 (4), 311-323 (2017).
  13. Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in arterial smooth muscle relaxation. Nature. 288 (5789), 373-376 (1980).
  14. Palmer, R. M., Ferrige, A. G., Moncada, S. Nitric oxide release accounts for endothelium-derived relaxing factor activity. Nature. 327 (6122), 524-526 (1987).
  15. Brandes, R. P., et al. An endothelium-derived hyperpolarizing factor distinct from nitric oxide and prostacyclin. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (17), 9747-9752 (2000).
  16. Garland, C. J., Hiley, C. R., Dora, K. A. EDHF: spreading the influence of the endothelium. Br J Pharmacol. 164 (3), 839-852 (2011).
  17. Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile properties of resistance vessels in hypertensive rats. Circ Res. 41 (1), 19-26 (1977).
  18. Grano De Oro, A., et al. Spontaneous vascular dysfunction in Dahl salt-sensitive rats without high-salt diet. Physiol Rep. 12 (14), e16165(2024).
  19. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  20. Mulvany, M. J. Structure and function of small arteries in hypertension. J Hypertens Suppl. 8 (7), S225-S232 (1990).
  21. Huda, K., Lawrence, D. J., Thompson, W., Lindsey, S. H., Bayer, C. L. In vivo noninvasive systemic myography in pregnant mice. Nat Commun. 14 (1), (2023).
  22. Choi, R., et al. Optimization of resting tension for wire myography in rat pulmonary arteries. Physiol Rep. 12 (1), e15911(2024).
  23. Lu, X., Kassab, G. S. Assessment of endothelial function across vessel sizes using a unified myograph. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 300 (1), H94-H100 (2011).
  24. Hou, T., Guo, Z., Gong, M. C. Circadian variations of vasoconstriction and blood pressure. Curr Opin Pharmacol. 57, 125-131 (2021).
  25. Li, T., et al. sex-dependent vascular responsiveness mediated by estrogen receptor pathways. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 306 (8), H1105-H1115 (2014).
  26. Schubert, R., Gaynullina, D., Shvetsova, A., Tarasova, O. S. Myography of isolated blood vessels. Front Physiol. 14, 1176748(2023).
  27. Ruddy, J. M., Jones, J. A., Spinale, F. G., Ikonomidis, J. S. Regional heterogeneity within the aorta. J Thorac Cardiovasc Surg. 136 (5), 1123-1130 (2008).
  28. Ameer, O. Z., et al. Regional abnormalities within the aorta in metabolic syndrome. Exp Physiol. 106 (3), 771-788 (2021).
  29. Mezhenskyi, O. R., Philyppov, I. B. Regional differences in endothelium-dependent relaxation of rat thoracic aorta. Physiol Rep. 12 (6), (2024).
  30. Zhang, L., Rong, S., Dong, H. Functional heterogeneity of endothelium-dependent vasorelaxation in mesenteric arteries. Microvasc Res. 158, 104777(2025).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Vasculaire reactiviteitmesenterische arteriënisometrische myografiearteriële dissectievasculaire functieendotheelfunctiegladspierfunctie

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.