Methodenartikel

Cryo-elektrontomografie workflow voor dik weefsel aangetoond bij de muishippocampus

DOI:

10.3791/70192

⸱

27 maart 2026

 ,  , 
1Cryo-EM Center, Southern University of Science & Technology, 2Interdisciplinary Center for Brain Information, the Brain Cognition and Brain Disease Institute, Shenzhen-Hong Kong Institute of Brain Science, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol standaardiseert cryo-elektrontomografie (cryo-ET) voor dik weefsel door hogedrukbevriezing (HPF) te integreren met de wafelmethode, cryogene focus ion beam (cryo-FIB) lift-out en dosissymmetrische, parallelle acquisitie, waardoor uniform dunne lamellen en gevitrificeerde monsters worden opgeleverd voor reproduceerbare in situ-analyse in de hippocampus van de muis.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cryo-elektrontomografie (cryo-ET) maakt 3D-visualisatie van de native cellulaire ultrastructuur mogelijk, maar de toepassing ervan op dik weefsel wordt beperkt door het gebrek aan betrouwbare vitrificatie en laagdoorvoerde lamellapreparatuur. Hier wordt een end-to-end workflow gepresenteerd die hogedrukbevriezing (HPF; ~2100 bar; dissectie-tot-vriestijd ≤90 s) integreert met een "waffle"-assemblage met koperfolie om weefsel vooraf te verdunnen, cryo-FIB lift-out en gecontroleerd uitdunnen tot 120–200 nm lamellen met over-kantelcompensatie. Geleidende coating is gestandaardiseerd (sputter-Pt 30 mA/15 s; GIS-cap 0,5–1,0 μm) om gordijnen te minimaliseren. Geautomatiseerde, dosissymmetrische gegevensverzameling (0°, ±3°, ±6°... op ±60–66°; stapgrootte van 2–3°; totale dosis 100–150 e⁻/Å2) wordt geïmplementeerd via PACEtomo-scripts, waarbij de starthellingshoek is afgeleid van de freeshoek en de oriëntatie van het monster. Verwerking met AreTomo 3 biedt functies voor bewegingscorrectie, CTF-schatting, uitlijning en WBP-reconstructie in bijna realtime; IsoNet kan optioneel missing-wedge anisotropie verminderen. Subtomogramgemiddelden (RELION 4.0) volgen een pseudo-subtomogramstrategie met resolutierapportage gebaseerd op een FSC-cutoff van 0,143. Gedemonstreerd op de muishippocampus produceert de workflow routinematig goed gevitrificeerde monsters en uniforme lamellen (doeldikte 150 ± 40 nm) en bereikt hoogdoorvoer kantelserieverzameling (meestal 5–8 minuten per kantelserie). Dit protocol biedt een reproduceerbare route om in situ structurele biologie direct te bestuderen vanuit complexe weefselomgevingen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cryo-elektrontomografie (cryo-ET) is uitgegroeid tot een cruciale techniek voor het visualiseren van macromoleculaire complexen en cellulaire architecturen in hun eigene, gehydrateerde toestand 1,2,3,4,5. Door driedimensionale volumes te reconstrueren uit kantelseries van projectiebeelden, overbrugt cryo-ET de kloof tussen cellulaire context en bijna-atomaire resolutie, en biedt ongekende inzichten in structurele biologie in situ6. Hoewel cryo-elektrontomografie workflows voor cellulaire monsters7 (inclusief cryo-FIB-verdunde cellen in suspensies en hechtende cellen) nu goed gevestigd zijn, blijft hun directe uitbreiding naar dikke, architectonisch intacte weefsels zeer uitdagend 8,9,10. Dit geldt vooral voor weefsels met een hoog watergehalte zoalshersenen 11, waar betrouwbare vitrificatie en de voorbereiding van elektronentransparante lamellen (meestal <200 nm) blijvende knelpuntenvormen 12.

Het bereiken van vitrificatie in weefsels is een uitdaging vanwege hun hoge watergehalte en beperkte warmteoverdracht. Hoewel plunge freezing effectief is voor dunne monsters (≤20 μm)13, faalt het voor de meeste weefsels. Hogedrukbevriezing (HPF) onderdrukt ijsnucleatie door hoge druk toe te passen, waardoor glasvorming van monsters tot ~200 μm in theorie mogelijk is. De efficiëntie van conventionele HPF is echter vaak suboptimaal voor het glasificeren van weefsels. Om de uitkomsten te verbeteren hebben recente inspanningen strategieën toegepast zoals het toevoegen van cryoprotectanten14 en het uitvoeren van pre-sectie 15,16 (bijvoorbeeld het gebruik van een vibratoom) om de monsterdikte mechanisch te verminderen voordat11,17 wordt ingevroren. Hoewel deze benaderingen de vitrificatiekwaliteit kunnen verbeteren, brengen ze vaak langdurig ex vivo gebruik en het gebruik van chemische additieven in die het risico lopen de natuurlijke structuren te veranderen. Om deze beperkingen aan te pakken, wijzigde deze studie de "waffle"-dragerstrategie die oorspronkelijk was ontwikkeld door Kelley et al.18 door een cruciale optimalisatie toe te passen: het hersenweefsel wordt fysiek samengedrukt met twee gepolijste koperen dragers vóór het bevriezen, waardoor het monster wordt voorverdund en tegelijkertijd wordt vastgezet tussen een gefilmd rooster en een koperen folie. Dit ontwerp bevordert niet alleen een snelle en uniforme vitrificatie, maar verbetert ook de mechanische stabiliteit aanzienlijk, waardoor rasterbreuk en monsterverlies tijdens de daaropvolgende behandeling effectief worden voorkomen, en zo een robuuste basis legt voor het verkrijgen van intacte, hoogwaardige bevroren weefselmonsters.

Na vitrificatie blijft verdunning een grote belemmering voor zowel doorvoer als kwaliteit. Als een vroege en breed toegepaste techniek maakt cryo-ultramicrotomie talrijke fundamentele in situ structurele studies mogelijk. Desalniettemin introduceert het vaak compressie- en snijartefacten19,20 die de structurele integriteit aantasten. Daarentegen biedt cryo-gefocuste ionenbundel (cryo-FIB) freesen21 superieure precisie en minimale vervorming 7,22. Aanvankelijk werd cryo-FIB freesen direct toegepast op gevitrificeerde monsters op roosters om lamellen23 te produceren; Deze in situ-benadering is echter vooral effectief voor dunne exemplarenvan 24,25 (bijvoorbeeld gekweekte cellen of perifere weefselgebieden) en kan geen toegang krijgen tot diepere structuren binnen dikke, omvangrijke weefsels. Om deze dieptebeperking te overwinnen, werden lift-out strategieën26 ontwikkeld, waarmee locatie-specifieke extractie van interessegebieden (ROI's) uit het binnenste van monsters mogelijk is. Latere methodologische vooruitgang, waaronder serial lift-out27 en on-grid serialized sectioning (SOLIST)28, verbeterden de doorvoer, lamellaire stabiliteit en de precisie van 3D-correlatieve targeting in complexe weefsels verder. Meer recentelijk zijn innovaties het vakgebied blijven vooruithelpen, waaronder de zeszijdige hechtingsmethode van Tang et al.29, die de mechanische stabilisatie tijdens lift-out en uitdunnen verbetert, evenals nieuwe on-grid freesmethoden door Benjamin C. Creekmore et al.11 die toegang tot diepe structuren mogelijk maken terwijl de native weefselcontext behouden blijft. Ondanks deze vooruitgang verschillen protocollen nog steeds in efficiëntie, reproduceerbaarheid en aanpassingsvermogen tussen verschillende weefseltypen. Er blijft een kritieke kloof bestaan in het opzetten van een gestandaardiseerde, gemakkelijk reproduceerbare en breed toepasbare workflow die deze optimalisaties integreert in een coherente pijplijn voor diverse dikke weefsels.

Deze kloof wordt hier overbrugt door belangrijke technische details uit gevestigde methodologieën te synthetiseren en deze te verfijnen tot een gegeneraliseerde, end-to-end pijplijn. Dit protocol maakt niet alleen gebruik van de verbeterde HPF-waffle-methode voor robuuste vitrificatie, maar bevat ook een reeks geoptimaliseerde stappen in cryo-FIB lift-out en verdunning, zoals systematische compensatie voor overkantelingen, gestandaardiseerde geleidende coating en gekalibreerde freessequenties, die gezamenlijk de uniformiteit van lamellen verbeteren, artefacten (bijv. gordijnen) verminderen en de doorvoer verbeteren. In tegenstelling tot protocollen die zijn afgestemd op specifieke celtypen of modelorganismen, is deze workflow ontworpen met generaliseerbaarheid als kern, en biedt het een veelzijdig kader dat aanpasbaar is aan een breed scala aan dikke, complexe weefsels, waaronder die relatief zacht zijn en gevoelig voor compressie, buiten de aangetoonde muishippocampus.

Gedemonstreerd in het uitdagende model van de muishippocampus, dat bekend staat om zijn gevoeligheid voor ijsschade en structurele complexiteit, levert deze geïntegreerde en algemene workflow betrouwbaar hoogwaardige lamellen op (120–200 nm) en ondersteunt efficiënte tilt-series acquisitie (5–8 min/serie). Deze consolidatie van best practices in een coherent, toegankelijk en breed toepasbaar protocol biedt een reproduceerbaar kader dat de technische drempel voor de implementatie van cryo-ET in dikweefselonderzoek in diverse biologische en biomedische contexten verlaagt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures waarbij dierlijk weefsel betrokken is, voldeed aan SUSTech IACUC (Protocol SUSTech-JY202501019). De regenten en de gebruikte uitrusting staan vermeld in de Materiaaltabel.

1. Voorbeeldondersteuning voorbereiding

  1. HPF-dragervoorbereiding (zie Figuur 1A)
    1. Verkrijg een paar 6 mm koperen HPF-dragers (type B). Zorg dat een van de dragers een vlak oppervlak heeft.
    2. Maak het vlakke oppervlak van de drager nat en ga verder met slijpen. Gebruik eerst schuurpapier van 8000 korrel totdat de oorspronkelijke bewerkingssporen volledig zijn verwijderd. Daarna wissel je over op schuurpapier van korrel 12000 en blijf je slijpen totdat de krassen van de vorige stap grotendeels zijn verdwenen, wat resulteert in een uniform gladde afwerking. Figuur 2 toont typische beelden van het draagvlak tijdens het slijp- en polijstproces.
    3. Polijst het geslepen oppervlak met een zachte metallografische doek en W0.5 diamantpasta: breng eerst de pasta aan op de doek, polijst het oppervlak vervolgens in een cirkelvormige beweging gedurende 1–2 minuten totdat een gladde, hooggepolijste afwerking is bereikt. Spoel de drager grondig af met ethanol, gevolgd door gedestilleerd water om alle schurende resten te verwijderen.
    4. Dompel de gepolijste dragers minimaal 4 uur (of een nacht) onder in 1-hexadeceen voordat ze ze gebruiken.
      OPMERKING: Gepolijste en behandelde dragers kunnen ondergedompeld worden in 1-hexadeceen.
      VOORZICHTIG: 1-Hexadeceen is brandbaar en schadelijk bij inademing; Werk in een dampafzuigkap met PBM.
  2. TEM ondersteunt gridvoorbereiding (zie Figuur 1B)
    1. Gebruik koperen roosters van 100 mesh met een doorlopende Formvar/koolstofondersteuningsfolie.
    2. Sputter-coaten beide zijden van de roosters met goud met een sputter coater: stel de stroom in op 50 mA en bedek elke kant 120 seconden om een laag van ongeveer 6 nm per zijde te bereiken.
  3. Koperfolievoorbereiding (zie Figuur 1C)
    1. Verkrijg koperfolie van hoge zuiverheid met een dikte van 1 μm.
      OPMERKING: De thermische geleidbaarheid van koper varieert met de zuiverheid, en een lagere zuiverheid resulteert in een lagere thermische geleiding. Daarom is koperfolie van hoge zuiverheid (Cu ≥ 99,9%) vereist.
    2. Pons het koperen folie in schijven met een diameter van 3 mm met een ronde perforator.

2. Hoogdrukbevriezing

  1. Plaats een druppel van 10 μL sucroseoplossing van 10% op een schoon glasoppervlak.
  2. Ontleed snel de hippocampus van een pas geëuthanaseerde muis. Exceer kleine weefselstukjes van ongeveer 0,5–1 mm3 met een scherp scheermesje (zie Figuur 1D).
  3. Breng het weefsel over op de koperen ondersteunings-TEM Grids (100 mesh) binnen de HPF-drager met behulp van een tandenstoker of fijne borstel. Gebruik 2-methylbutaan (isopentane) om het weefsel voorzichtig op zijn plaats te manoeuvreren en tegelijkertijd de mechanische belasting op het rooster te minimaliseren.
    VOORZICHTIG: 2-methylbutaan (isopentane) is extreem brandbaar. Hanteer het in een afstoverkap zonder ontstekingsbronnen.
  4. Bedek het weefsel en het rooster met een koperen folieschijf van 3 mm doorsnee. Voltooi de assemblage door de tweede HPF-drager (plat met de voorkant naar beneden) bovenop te plaatsen om het verzegelde "wafel"-sandwich te vormen (zie Figuur 1E).
    OPMERKING: De koperen folie vervult een cruciale mechanische functie in de wafelconstructie. Het klemt het weefsel tussen het TEM-rooster en de folie zelf. Tijdens de assemblage oefent deze configuratie zachte druk uit, waardoor een dunnere, meer uniforme weefselsnee ontstaat die ideaal is voor vitrificatie. Bovendien voorkomt de folie weefselverlies tijdens het hanteren en helpt het de druk te verdelen tijdens hogedrukbevriezing, waardoor het risico op rasterbreuk wordt verminderd. Na het bevriezen maakt de folie het ook gemakkelijker om de dragers van het gevitrificeerde monsterrooster te scheiden. Deze voorbereidingsmethode kan echter mechanische compressieschade veroorzaken en is mogelijk niet geschikt voor monsters die gevoelig zijn voor drukgeïnduceerde artefacten. Voor dergelijke monsters moeten alternatieve snijtechnieken worden overwogen die een geschikte dikte bereiken zonder compressie, zoals vibratoomsectie of monsterponsen.
  5. Start onmiddellijk de hogedrukvriesprocedure volgens het operationele protocol van de fabrikant. Stel de doeldruk in op ~2100 bar en zorg ervoor dat de totale tijd van weefseldissectie tot bevriezing niet hoger is dan 90 seconden.
    OPMERKING: De gehele procedure van dissectie tot bevriezing moet binnen 90 seconden worden voltooid om structurele veranderingen die gepaard gaan met langdurig ex vivo te minimaliseren. Het weefseldiktebereik voor hersenen is ongeveer 20–40 μm.

3. FIB-frezen en lift-out

OPMERKING: Voer de volgende stappen uit met een dual-beam microscoop uitgerust met een cryo-trap. Houd de temperatuur van het monster gedurende de hele periode onder -170 °C.

  1. Voorbereiding van het ontvangerrooster
    1. Verkrijg een nieuw gouden raster van 300 mesh als laatste ontvangerrooster voor de lift-outprocedure.
    2. Onder een stereomicroscoop op kamertemperatuur klem je het rooster voorzichtig in een compatibele cryo-FIB AutoGrid-ring.
    3. Bewaar de gemonteerde AutoGrid direct in een droge oven die op ongeveer 40 °C wordt gehouden om rijpvorming vóór gebruik te minimaliseren.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat het rooster tijdens het knippen vlak en gecentreerd ligt om buiging of verkeerde uitlijning te voorkomen.
  2. Terugtrekking en montage van het glasgevulde weefselrooster
    1. Terwijl de assemblage continu wordt ondergedompeld in vloeibare stikstof (LN₂), scheid je zorgvuldig het gevitrificeerde TEM-rooster (met het weefsel en de koperfolie) van de omliggende "wafel"-componenten.
      OPMERKING: De koperen folieafstandhouder maakt het rooster doorgaans gemakkelijk te scheiden van de dragers.
    2. Op een voorgekoeld cryo-loading werkstation monteer je het geïsoleerde weefselrooster in een tweede cryo-FIB AutoGrid-ring onder LN₂-bescherming.
  3. Roosters meeladen op de cryo-transfer shuttle
    1. Laad beide AutoGrids in de aangewezen slots van de cryo-transfer shuttle.
    2. Oriënteer elke AutoGrid zodat de freesinkeping naar buiten wijst en verticaal is.
    3. Houd de geladen shuttle onder LN₂-onderdompeling of voorgekoeld tot deze in de FIB/SEM-microscoop wordt overgebracht.
  4. Lokalisatie en geleidende coating in de FIB/SEM
    1. Na cryo-transfer in de microscoop navigeer je naar het weefselrooster met lage SEM-vergroting.
    2. Breng een geleidende en beschermende laag aan op het gehele roosteroppervlak.
      1. Sputter-coat het roosteroppervlak met platina (Pt) bij 30 mA gedurende 15 seconden.
      2. Plaats een organometalen PT-kap van 0,5–1,0 μm dik met behulp van het Gas Injection System (GIS).
      3. Breng een laatste sputter-gecoate PT-laag aan op het roosteroppervlak bij 30 mA gedurende 15 seconden.
        OPMERKING: De GIS-cap is cruciaal voor het verminderen van gordijnartefacten.
  5. Isolatie en lift-out van weefselblokken (zie Figuur 3)
    1. Locatiekeuze en oriëntatie
      1. Navigeer naar het geselecteerde interessegebied (ROI) op het weefselrooster met behulp van het SEM-elektronenbundelbeeld.
      2. Oriënteer het monster voor front-side frees. Een typische trappositie is ingesteld op 110° rotatie en 7° helling, en deze positie presenteert het monsteroppervlak onder een hoek die geschikt is voor de toegang tot de ionenbundel.
        OPMERKING: Bij afwezigheid van fluorescerende markers kan een pre-screeningstrategie worden toegepast. Deze strategie is gericht op het lokaliseren van het doelweefselgebied en het uitsluiten van gebieden met cryoprotectiva of andere niet-weefselcomponenten. Na het selecteren van een gebied dat blijkbaar vrij is van oppervlakteijs, frees je een kleine testgreppel met een hogere bundelstroom (bijv. 15 nA bij 30 kV) bij de standaard frontzijde oriëntatie en polijst met een lagere bundelstroom (bijv. 1 nA bij 30 kV). Schakel over naar de elektronenbundel om de doorsnede te onderzoeken: het weefsel vertoont een uitstekend contrast onder de elektronenbundel, een kenmerk dat vooral opvalt in membraneuze structuren en gebieden rijk aan zware elementen; Daarentegen vertoont de cryoprotectant typisch een uniform contrast onder de elektronenbundel. Dit maakt snelle verificatie mogelijk voordat de volledige lift-out procedure wordt uitgevoerd.
    2. Sleuffrees om het blok te isoleren (Figuur 3A)
      1. Definieer een rechthoekige greppel rondom het doelweefselblok met behulp van de ionenbundel die werkt op 30 kV.
      2. Begin met frezen op een bepaalde afstand van het blok met een relatief hoge stroom van 15 nA om snel materiaal te verwijderen.
      3. Naarmate de greppelwanden het blok tot op enkele micrometers naderen, verminder je de ionenstraalstroom tot 7 nA. Het verminderen van de stroom zorgt voor een nauwkeurigere controle en minimaliseert schade door ionenbundels en verhitting van het biologische materiaal in het betreffende gebied.
      4. Laat één kant van het blok aan het bulkmateriaal bevestigd als een "lipje" om het tijdelijk op zijn plaats te houden.
    3. Optioneel ondersnijfreesen voor dikke blokken (Figuur 3B)
      1. Voor weefselblokken met een geschatte dikte van meer dan 20 μm voer je een ondergesneden freesstap uit vanaf de achterzijde om de uiteindelijke lift-out te vergemakkelijken.
      2. Draai het podium (bijvoorbeeld naar -70°) en pas de helling van het podium aan (bijvoorbeeld naar 23°) om toegang te krijgen tot de onderkant van het blok.
      3. Fres de onderzijde verbinding met de FIB op 30 kV en een stroom van 3 nA.
    4. Bevestiging aan de micromanipulatornaald (Figuur 3C)
      1. Om het monster aan de naald te bevestigen, voert u sequentiële dwarsdoorsnede-freespatronen uit.
        OPMERKING: Het goudblok kan uit de staaf van een gouden raster van 300 mesh worden gehaald.
    5. Uitrollen van het weefselblok (Figuur 3D)
      1. Snijd de resterende "tab" die het blok met het bulkmonster verbindt af met de FIB (30 kV, 1 nA).
      2. Beweeg voorzichtig de micromanipulatornaald om het nu geïsoleerde weefselblok op te tillen zodat het volledig vrij is van de greppel en het omliggende oorspronkelijke rooster. Trek vervolgens de naald terug en vervoer het blok naar het ontvangerrooster.
    6. Blokoverdracht, lassen en hercoating
      1. Navigeer met de naald naar een voorgekoeld 300-mesh gouden ontvangerrooster.
      2. Laat het blok zakken op een gekozen rastervierkant. Breng het weefselblok in contact met de film op het rooster en til het blok vervolgens verticaal op om het contact te verbreken. Maal een ~3–4 μm dikke snee van het blok op de roosterfilm met behulp van de ionenbundel (30 kV, 1 nA) (Figuur 3E).
        OPMERKING: Als er ijsresten aanwezig zijn, maak dan de bevestigingsplaats vooraf schoon met een rechthoekig patroon (30 kV, 50 pA). Zorg dat het blok contact maakt met de roosterfilm om elektrostatische lading te verminderen, die de snee willekeurig kan verplaatsen.
      3. Las de snede stevig door te frezen met reinigingspatronen aan beide zijden van de overgang (30 kV, 30 pA) (Figuur 3F).
      4. Breng de geleidende/beschermende coating opnieuw aan zoals beschreven in Stap 3.4.2 (Figuur 3G).
        OPMERKING: Voor deze GIS-plateringsstap kan de duur worden verkort afhankelijk van de blokgrootte.
    7. Lamellaverdunning
      1. Draai de fase (bijvoorbeeld naar -70°) en stel een beginfase helling in (bijv. 15°) (Figuur 3H).
        OPMERKING: De monsterhouder heeft een voorkanteling van 45°.
      2. Definieer de uiteindelijke lamellapositie binnen een glad gebied van het weefselblok.
        OPMERKING: Bevestig dat het geselecteerde gebied vrij is van ijsbesmetting.
      3. Voer systematisch frezen uit met behulp van de ionenbundelstromen zoals gespecificeerd in Tabel 1. Er wordt vooruitgang geboekt van hogere naar lagere stromen naarmate het doelvlak wordt naderd (Figuur 3I,J). Optioneel kan, wanneer het zich binnen 1–2 μm van de lamella bevindt, een spanningsontlastingsgreppel ongeveer 1,5 μm verderop worden gefreesd om te voorkomen dat de lamellabuigt of krult.
        OPMERKING: Wanneer het resterende materiaal zich binnen ~1 μm van het doelvlak bevindt, beperk dan de verwijderde dikte per pass.

4. Cryo-ET gegevensverzameling

  1. Na succesvolle lamellavoorbereiding laadt u het rooster zorgvuldig in een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) uitgerust met een cryohouder, een energiefilter en tomografiesoftware (bijv. SerialEM).
  2. Maak een atlaskaart van het gehele raster (bijv. Figuur 4A; typische vergroting is 155×).
  3. Navigeer naar de lamellapositie en maak een montagekaart (bijv. Figuur 4B; typische vergroting is 3600× met een defocus van -100 μm).
  4. Stel de nominale opnamevergroting in en controleer of de pixelgrootte geschikt is voor de beoogde resolutie; in de huidige studie werd een pixelgrootte van 2,109 Å gebruikt. Pas de bijbehorende verlichtingsparameters aan, waaronder vlekgrootte, C2-apertuurdiameter en belichtingsoppervlak, om een geoptimaliseerde dosissnelheid voor de directe elektronendetector te bereiken.
  5. Stel de focus- en proefverlichtingscondities in om overeen te komen met die ingesteld voor de Record-parameter.
  6. Voer gegevensverzameling uit met behulp van de PaceTomo-scripts32, volgens de onderstaande stappen:
    1. Selecteer doelen vooraf op de montagekaart met de functie "punten toevoegen" in de navigator, zodat het eerste kenmerk voldoende contrast vertoont.
    2. Selecteer doelen met het PACEtomo_selectTargets.py script32, en pas het uitgelichte gebied aan bij de preview-vergroting indien nodig. Typische interessegebieden worden weergegeven in Figuur 4C.
    3. Verkrijg de kantelreeks met een dosissymmetrisch schema (bijv. 0°, +3°, -3°, +6°, -6°... tot ±60°–66°) met een toename van 2° of 3°. Stel de acquisitieparameters in in het PACEtomo.py-script: de starthellingshoek wordt bepaald door de freeshoek gespecificeerd in stap 3.7.1 (d.w.z. 8°), waarvan het teken afhankelijk is van de belastingoriëntatie van het monster in de cryo-EM; de minimale en maximale kantelhoeken verwijzen naar absolute waarden; en de stapgrootte komt overeen met de kantelverhoging (bijv. 3°).
      OPMERKING: Deze startkantelhoek is ontworpen om de lamella horizontaal en loodrecht op de elektronenbundel te positioneren. Als de freeshoek onbekend is, kantel het beeld zodat de lamella op de grootste schijnbare hoogte wordt weergegeven; Dit zorgt voor een voldoende nauwkeurige uitlijning.
    4. Houd een cumulatieve elektronendosis van 100–150 e⁻/Å2 verdeeld over alle kantelen. Indien beschikbaar, gebruik een energiefilter met een spleetbreedte van 10 eV.
    5. Start gegevensverzameling. Geautomatiseerde scherpstelling en tracking worden geïmplementeerd bij elke kantelhoek. De gebruikelijke acquisitietijd voor een enkele kantelserie is 5–8 minuten.
      OPMERKING: Een handleiding voor probleemoplossing is opgenomen in Tabel 2.

5. Dataverwerking

  1. Proces Tilt-Series Motion Correction, CTF Estimation, Alignment en 3D Tomogram Reconstruction beelden met behulp van AreTomo 333 om drie kernstappen uit te voeren: (1) bewegingscorrectie van ruwe beeldframes, (2) schatting van de contrastoverdrachtsfunctie (CTF) voor elke kantelbeeld, en (3) uitlijning van de volledige tilt-serie.
    1. Daarna reconstrueren we driedimensionale (3D) tomogrammen via het gewogen terugprojectie-algoritme. Vereiste invoer voor deze stap omvatte: ruwe beeldframes, mdoc-metadatabestanden (die kantelserie-verwervingsparameters documenteren) en de vooraf bepaalde rotatieas van het monster.
  2. Ontbrekende wigcorrectie
    1. Na reconstructie worden de gegenereerde tomogrammen onderworpen aan ontbrekende wigcorrectie met behulp van IsoNet34.
  3. Deeltjespluk en curatie
    1. Voer deeltjespicking uit in EMAN 2.935 met behulp van de template matching-methode. Na geautomatiseerde selectie werden vals-positieven (d.w.z. niet-doelgebieden of foutief geselecteerde gebieden) handmatig uitgesloten om de kwaliteit van de geselecteerde deeltjesdataset te waarborgen.
  4. Subtomogramgemiddelde
    1. Importeer de kantelreeks en hun bijbehorende deeltjescoördinaten in RELION 4.0. Voer subtomogramgemiddeling uit volgens de standaardworkflow zoals beschreven in de RELION 4.0-documentatie (https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/STA_tutorial/Introduction.html), die naleving van vastgestelde best practices voor reproduceerbaarheid waarborgt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Succesvolle toepassing van dit protocol maakt de productie van hoogwaardige, gevitrificeerde weefsellamellen mogelijk en de daaropvolgende reconstructie van tomogrammen die de natuurlijke cellulaire ultrastructuur onthullen. De volgende uitkomsten, aangetoond met behulp van muishippocampusweefsel, zijn representatief voor een succesvol experiment.

Weefselblokken die werden verwerkt door hogedrukvriezing met de "waffle"-methode vertoonden een uniforme en elektr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hier gepresenteerde workflow stelt een gegeneraliseerde, geoptimaliseerde en reproduceerbare pijplijn vast voor in situ cryo-elektrontomografie van inheemse, dikke weefsels. De belangrijkste bijdrage ligt niet in de uitvinding van enkele technieken, maar in de systematische integratie, verfijning en gedetailleerde standaardisatie van het gehele proces, van robuuste vitrificatie met een aangepaste waffle-HPF-methode tot een nauwkeurig gekalibreerd cryo-FIB lift-out en verdunni...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken het personeel van het Cryo-EM Center aan de Southern University of Science and Technology voor hun technische ondersteuning. Dit project werd ondersteund door de National Science and Technology Innovation (Brain Science and Brain-like Intelligence Technology – National Science and Technology Major Project, subsidie nr. 2022ZD0211905) en de National Natural Science Foundation of China (subsidie nr. 32200998 en nr. 32161133022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1-HexadeceenSigma-AldrichH2131Chemicaliën & Reagentia
2-MethylpentaanSigma-AldrichM65807Chemicaliën & Reagentia
Clip-ringThermo Fisher Scientific1131750;1188953Verbruiksartikelen
KoperfolieFengcheng Metal Materials1 µm dikteVerbruiksartikelen
Koperondersteuning TEM Grids (100 mesh)Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., LtdBZ10021bVerbruiksartikelen
Cryo-EMThermo Fisher ScientificKrios G4Apparatuur 
Cryo-FIBThermo Fisher ScientificAquilos 2Apparatuur 
Cryo-FIB AutogridThermo Fisher Scientific1205101Verbruiksartikelen
Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh)QuantifoilAltrAufoilVerbruiksartikelen
HogedrukvriesmachineLeica MicrosystemsEM ICEApparatuur 
HPF drager, koperLeica Microsystemstype B (6 mm)Verbruiksartikelen
IonenspuitercoaterQuorumQ150RS plusApparatuur 
Metallografische polijstpastaLab-testecW0.5Verbruiksartikelen
PolijstdoekGORALB00809Verbruiksartikelen
SchuurpapierEagle Brand Schuurpapier8000-grit, 12000-gritVerbruiksartikelen
StereomicroscoopLeica MicrosystemsS9iApparatuur 
SucroseSigma-Aldrich200-334-9Chemicaliën & Reagentia
Tilt-Series Verwervingssoftwarehttps://bio3d.colorado.edu/SerialEM/SerialEM 4.0.9Software
Tilt-Series Uitlijning & Reconstructie Softwarehttps://github.com/czimaginginstitute/AreTomo3 AreTomo 3Software
Tilt-Series Verwervingssoftwarehttps://github.com/eisfabian/PACEtomoPaceTomoSoftware
Tilt-Series Uitlijning & Reconstructie Softwarehttps://github.com/IsoNet-cryoET/IsoNetIsoNetSoftware
Tilt-Series Uitlijning & Reconstructie Softwarehttps://github.com/cryoem/eman2EMAN2Software
Tilt-Series Uitlijning & Reconstructie Softwarehttps://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/index.htmlRelion 4Software

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Young, L. N., Villa, E. Bringing structure to cell biology with cryo-electron tomography. Annu Rev Biophys. 52 (1), 573-595 (2023).
  2. Baumeister, W. Cryo-electron tomography: A long journey to the inner space of cells. Cell. 185 (15), 2649-2652 (2022).
  3. Hong, Y., Song, Y., Zhang, Z., Li, S. Cryo-electron tomography: The resolution revolution and a surge of in situ virological discoveries. Annu Rev Biophys. 52 (1), 339-360 (2023).
  4. Nogales, E., Mahamid, J. Bridging structural and cell biology with cryo-electron microscopy. Nature. 628 (8006), 47-56 (2024).
  5. Schur, F. K. M. Toward high-resolution in situ structural biology with cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Curr Opin Struct Biol. 58, 1-9 (2019).
  6. Briggs, J. A. G. Structural biology in situ—the potential of subtomogram averaging. Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 261-267 (2013).
  7. Berger, C., et al. Cryo-electron tomography on focused ion beam lamellae transforms structural cell biology. Nat Methods. 20 (4), 499-511 (2023).
  8. McCafferty, C. L., et al. Integrating cellular electron microscopy with multimodal data to explore biology across space and time. Cell. 187 (3), 563-584 (2024).
  9. Pöge, M., et al. Making plant tissue accessible for cryo-electron tomography. Elife. 106455, 1-41 (2025).
  10. Bäuerlein, F. J. B., et al. Cryo-electron tomography of large biological specimens vitrified by plunge freezing. Preprint. bioRxiv. , (2023).
  11. Creekmore, B. C., Kixmoeller, K., Black, B. E., Lee, E. B., Chang, Y. -W. Ultrastructure of human brain tissue vitrified from autopsy revealed by cryo-ET with cryo-plasma fib milling. Nat Commun. 15 (1), 2660(2024).
  12. Chen, Z., Guo, Q. Innovations in cryo-electron tomography for tissues: Challenges and future prospects. Curr Opin Struct Biol. 93, 103112(2025).
  13. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q Rev Biophys. 21 (2), 129-228 (2009).
  14. Matsui, A., et al. Cryo-electron tomographic investigation of native hippocampal glutamatergic synapses. Elife. 13, RP98458(2024).
  15. Ning, J., et al. Uncovering synaptic and cellular nanoarchitecture of brain tissue via seamless in situ trimming and milling for cryo-electron tomography. Preprint. bioRxiv. , (2025).
  16. Zhang, J., et al. Vhut-cryo-fib, a method to fabricate frozen hydrated lamellae from tissue specimens for in situ cryo-electron tomography. J Struct Biol. 213 (3), 107763(2021).
  17. Glynn, C., et al. A generalizable and targeted molecular biopsy approach for in situ cryogenic electron tomography of vitreous brain tissue. Cell Rep Methods. 5 (7), 101080(2025).
  18. Kelley, K., et al. Waffle method: A general and flexible approach for improving throughput in fib-milling. Nat Commun. 13 (1), 1857(2022).
  19. Pierson, J., Ziese, U., Sani, M., Peters, P. J. Exploring vitreous cryo-section-induced compression at the macromolecular level using electron cryo-tomography; 80s yeast ribosomes appear unaffected. J Struct Biol. 173 (2), 345-349 (2011).
  20. Alamoudi, A., Studer, D., Dubochet, J. Cutting artefacts and cutting process in vitreous sections for cryo-electron microscopy. J Struct Biol. 150 (1), 109-121 (2005).
  21. Rigort, A., et al. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (12), 4449-4454 (2012).
  22. Mahamid, J., et al. A focused ion beam milling and lift-out approach for site-specific preparation of frozen-hydrated lamellas from multicellular organisms. J Struct Biol. 192 (2), 262-269 (2015).
  23. Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy. Nat Methods. 4 (3), 215-217 (2007).
  24. Engel, B. D., et al. Native architecture of the Chlamydomonas chloroplast revealed by in situ cryo-electron tomography. Elife. 4, e04889(2015).
  25. Hayles, M. F., et al. The making of frozen-hydrated, vitreous lamellas from cells for cryo-electron microscopy. J Struct Biol. 172 (2), 180-190 (2010).
  26. Rubino, S., et al. A site-specific focused-ion-beam lift-out method for cryo transmission electron microscopy. J Struct Biol. 180 (3), 572-576 (2012).
  27. Schiøtz, O. H., et al. Serial lift-out: Sampling the molecular anatomy of whole organisms. Nat Methods. 21 (9), 1684-1692 (2023).
  28. Nguyen, H. T. D., et al. Serialized on-grid lift-in sectioning for tomography (solist) enables a biopsy at the nanoscale. Nat Methods. 21 (9), 1693-1701 (2024).
  29. Tang, X., et al. Step-by-step procedure for an optimized serial lift-out cryo-focused ion beam milling technique in tissue analysis. Biophys Rep. 11, 1-13 (2025).
  30. Wolff, G., et al. Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of fib-milled cryo-lamellae. J Struct Biol. 208 (3), 107389(2019).
  31. Berger, C., Watson, H., Naismith, J. H., Dumoux, M., Grange, M. Xenon plasma focused ion beam lamella fabrication on high-pressure frozen specimens for structural cell biology. Nat Commun. 16 (1), 2286(2025).
  32. Eisenstein, F., et al. Parallel cryo electron tomography on in situ lamellae. Nat Methods. 20 (1), 131-138 (2022).
  33. Peck, A., et al. Aretomolive: Automated reconstruction of comprehensively-corrected and denoised cryo-electron tomograms in real-time and at high throughput. Preprint. bioRxiv. , (2025).
  34. Liu, Y. -T., et al. Isotropic reconstruction for electron tomography with deep learning. Nat Commun. 13 (1), 6482(2022).
  35. Chen, M., et al. A complete data processing workflow for cryo-ET and subtomogram averaging. Nat Methods. 16 (11), 1161-1168 (2019).
  36. Yang, Q., et al. The reduction of fib damage on cryo-lamella by lowering energy of ion beam revealed by a quantitative analysis. Structure. 31 (10), 1275-1281.e4 (2023).
  37. Tacke, S., et al. A streamlined workflow for automated cryo focused ion beam milling. J Struct Biol. 213 (3), 107743(2021).
  38. Boltje, D. B., et al. A cryogenic, coincident fluorescence, electron, and ion beam microscope. Elife. 11, e82891(2022).
  39. Yang, J., et al. Integrated fluorescence microscopy (IFLM) for cryo-fib-milling and in-situ cryo-ET. Preprint. bioRxiv. , (2023).
  40. Li, S., et al. Eli trifocal microscope: A precise system to prepare target cryo-lamellae for in situ cryo-ET study. Nat Methods. 20 (2), 276-283 (2023).
  41. Medeiros, J. M., et al. Robust workflow and instrumentation for cryo-focused ion beam milling of samples for electron cryotomography. Ultramicroscopy. 190, 1-11 (2018).
  42. Goetz, S. K., et al. A modular platform for automated cryo-fib workflows. Elife. 10, e70506(2021).
  43. Eisenstein, F., Fukuda, Y., Danev, R. Smart parallel automated cryo-electron tomography. Nat Methods. 21 (9), 1612-1615 (2024).
  44. Swulius, M. T., et al. Deep learning-based segmentation of cryo-electron tomograms. J Vis Exp. (189), e64435(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Hogedrukvriesenweefsellamellenpreparatiecryo FIB fresenplatina sputtercoatingsubtomogram averagingcorrelatieve microscopienatuurlijke cellulaire ultrastructuursynaptische structuren

Gerelateerde artikelen