Kwantificering van veranderingen in bifidobacterieën en lactobacillenkolonievormende eenheden tijdens rifaximinebehandeling en synbiotische gel bij gezonde vrijwilligers

Summary

Deze klinische studie evalueerde het aantal bifidobacteriën en lactobacillen na 1 week rifaximinbehandeling en een synbiotische gel bestaande uit Lactobacillus acidophilus NCFM en Bifidobacterium lactis Bi07, met agave-inuline, tijdens de rifaximinbehandeling en 4 weken daarna, vergeleken met een placebogel, wat aantoont dat de synbiotische gel kan helpen om lactobacillen en bifidobacteriën te behouden.

Abstract

Hoewel de darmmicrobiota over het algemeen stabiel is, kan deze worden beïnvloed door antibioticabehandeling. Rifaximine, dat wordt gebruikt voor de behandeling van gastro-intestinale aandoeningen, wordt vaak samen met probiotica toegediend om het risico op dysbiose te verkleinen. Lactobacillus acidophilus reageert met darmcellen en gebruikt prebiotische verbindingen. Bifidobacteriën, met name Bifidobacterium infantis ssp. lactis Bi07, is een probioticum dat in verband wordt gebracht met gunstige effecten in de darm. In vitrostudies hebben aangetoond dat agavefructanen beter zijn dan chicoréi-inuline. Er zijn geen studies gedocumenteerd van veranderingen in het aantal fecale lactobacillen en bifidobacteriën na gelijktijdige toediening van rifaximine en synbiotica. Ons doel was om veranderingen in de CFU-tellingen van darmbifidobacteriën en lactobacillen bij gezonde vrijwilligers te evalueren na inname van Synbiotic Gel, dat Lactobacillus acidophilus NCFM, Bifidobacterium lactis Bi07 en agave-inuline als prebioticum bevat, gedurende 1 week van rifaximinbehandeling en gedurende 4 weken daarna. In een gerandomiseerde, placebogecontroleerde, dubbelblinde klinische studie werden gezonde deelnemers zonder antimicrobiële behandeling in de voorgaande maand 1:1 gerandomiseerd in twee groepen (10 deelnemers per groep). De Synbiotic Gel-groep kreeg 10,32 g agave-inuline als prebioticum en 4 × 10^{9 CFU} /g Lactobacillus acidophilus NCFM en 4 × 10⁹ CFU/g Bifidobacterium lactis Bi07 per dag, gedurende 5 weken, en 200 mg rifaximine tweemaal daags gedurende de eerste week. De placebo-gelgroep kreeg 5 weken placebogel en 200 mg rifaximine tweemaal daags gedurende de eerste week. Bacteriële veranderingen werden geschat door CFU te kwantificeren via microbiologische beoordeling van ontlastingen. Vijf weken later veranderden de populaties van lactobacillen en bifidobacteriën niet. De detectie van Lactobacillus acidophilus NCFM en Bifidobacterium lactis Bi07 in sommige ontlastingsmonsters wijst op tijdelijke en gedeeltelijke kolonisatie, wat de noodzaak van dosis-responsstudies met dit synbiotische product benadrukt.

Introduction

De menselijke darmmicrobiota is een dichtbevolkte gemeenschap die permanent aanwezige inheemse soorten en andere tijdelijke micro-organismen omvat. Hoewel de samenstelling per individu kan verschillen, wordt het over het algemeen als stabiel beschouwd. Het kan echter worden beïnvloed door leeftijd, infectie en antibioticabehandeling ^1,2,3. Rifaximine, een breedspectrumantibioticum met lage darmopname, wordt gebruikt voor de behandeling van darmaandoeningen en kan de microbiota veranderen. Probiotische bacteriën uit de geslachten Lactobacillus en Bifidobacterium worden gebruikt om deze effecten te verzachten².

Stammen van Bifidobacterium spp. zijn gerapporteerd als rifaximine-resistent², wat een interessant effect heeft door een darmbiota te bevorderen met voldoende populaties van Bifidobacterium-soorten voor gunstige probiotische effecten.

Bovendien is Lactobacillus acidophilus algemeen erkend vanwege zijn vermogen om te interageren met het gastro-intestinale epitheel⁴ en zijn vermogen om prebiotica te benutten, zoals polysachariden, oligosacchariden en fructooligosacchariden. Echter, slechts enkele probiotische stammen, zoals de Lactobacillus acidophilus North Carolina Food Microbiology (NCFM) stam, zijn geïdentificeerd. Daarom is het belangrijk om hun in vivo effecten te bestuderen, evenals de aanwezigheid van Bifidobacterium lactis Bi07 in het maag-darmkanaal, aangezien deze in verband is gebracht met diverse gezondheidsbevorderende voordelen ^2,5. Deze probiotica vereisen een prebioticum om optimaal te groeien, daarom werkt een synbioticum met zowel een probioticum als een prebioticum synergetisch; dat wil zeggen, het gunstige effect is hoger dan dat van het probioticum alleen. Samen met prebiotica, die als substraten voor probiotica dienen, wordt verwacht dat deze symbiose de overleving van probiotische micro-organismen in het maag-darmkanaal zal verbeteren, wat leidt tot een grotere restauratie van de microbiota⁶.

Een belangrijke bron van prebiotica zijn agavefructanen, waarvan is gerapporteerd dat ze superieure in vitro effecten op de microbiota hebben dan die van cichoreiwortel (Cichorium intybus L.).⁷. Studies hebben de effecten van probioticaconsumptie gerapporteerd; zo onderzochten Engelbrektson et al. of het gebruik van probiotica tijdens en na antibioticatoediening de veranderingen in de microbiota veroorzaakt door antibiotica⁸ kon verminderen. Ze ontdekten dat de groep die de probiotica-blend ontving, een snellere herstelperiode van normale microbiota vertoonde dan degenen zonder^. Bovendien bestudeerden Koning et al. dysbiose in de darmmicrobiota van 40 gezonde vrijwilligers die behandeld werden met 500 mg amoxicilline tweemaal daags gedurende 7 dagen, en het mogelijke herstel van de microbiota na inname van een probiotica-mix. De resultaten toonden aan dat de behandeling met amoxicilline de samenstelling van de natuurlijke microbiota beïnvloedde. Wanneer een probiotica-mengsel werd toegediend, herstelde de microbiota aanzienlijk na twee^{maanden inname}.

De literatuur meldt echter dat er geen studies hebben onderzocht naar het effect van synbiotische consumptie (met agavefructan als prebioticum) op darmmicrobiota tijdens en na antibioticatoediening, zoals rifaximine; We vonden alleen studies met probiotica. Daarom evalueerde deze studie veranderingen in de CFU-tellingen van darmbifidobacteriën en lactobacillen bij gezonde vrijwilligers na inname van synbiotische gel, die Lactobacillus acidophilus NCFM, Bifidobacterium lactis Bi07 en agave-inuline als prebioticum bevat, gedurende 1 week rifaximinbehandeling en gedurende 4 weken daarna.

Protocol

Het protocol werd goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor Biomedisch Onderzoek bij Mensen (CIIBH) van het Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubiran (INCMNSZ) (REFERENTIE 1734). Alle deelnemers gaven geïnformeerde toestemming voordat ze in deze studie werden opgenomen.

Studieontwerp en populatie

Dit was een gerandomiseerde, placebogecontroleerde, dubbelblinde klinische studie met een follow-upperiode van 5 weken. Werknemers van de INCMNSZ werden uitgenodigd om deel te nemen aan de studie, en gezonde vrijwilligers van 20–50 jaar zonder antimicrobiële behandeling in de voorgaande maand die het informed consent-formulier accepteerden en ondertekenden, werden tussen 2011 en 2012 opgenomen. De proefpersonen werden 1:1 gerandomiseerd in de Synbiotic Gel-groep met 10,32 g agave-inuline als prebioticum en 4 × 10⁹ CFU/g Lactobacillus acidophilus NCFM en 4 × 10⁹ CFU/g Bifidobacterium lactis Bi07 per dag, opgenomen in 4 zakjes gedurende 5 weken, en 200 mg rifaximine twee keer per dag gedurende de eerste week. De placebo-gelgroep kreeg 4 pakjes van 15 g placebogel, met dezelfde presentatie en sensorische kenmerken als de synbiotische gel, gedurende 5 weken, en 200 mg rifaximine tweemaal daags gedurende de eerste week (Figuur 1).

Klinische evaluatie

In beide studiegroepen werden symptomen en ontlasting beoordeeld met behulp van de Bristol Scale. Gewicht, lengte en body mass index (BMI) werden ook gemeten. Er werd een dagboek gebruikt om de consumptie van synbiotische gel, placebogel en rifaximine te evalueren en om de aanwezigheid of afwezigheid van bijwerkingen gerelateerd aan gelinname te registreren.

Vezelconsumptie

De vezelinname werd beoordeeld met behulp van een voedingsdagboek en een 24-uurs terugroepactie per week in beide groepen.

Therapietrouw

De naleving van het gebruik van rifaximine en gel werd geëvalueerd door het aantal doseringen rifaximine en het aantal geurzakjes synbiotische en placebogels per deelnemer te tellen. De aanwezigheid van Lactobacillus acidophilus en Bifidobacterium lactis werd vastgesteld met behulp van Polymerase-kettingreactie (PCR).

Microbiologische beoordeling van ontlasting

Bij bezoek 0 en wekelijks voor 5 bezoeken (6 bezoeken) per groep werden de aantallen Lactobacillen, Bifidobacteriën en Enterobacteriën geëvalueerd in 120 ontlastingsmonsters met de plaattellingsmethode. Deze methode meet kolonievormende eenheden (CFU) door verdunde monsters op gespecialiseerd vast medium¹⁰ te plaatsen. Aan het begin van elk bezoek werden ontlastingsmonsters verzameld.

Om micro-organismen te identificeren, werden ontlastingsmonsters verzameld en opgeslagen in BBL-buizen. Het PBG-flesje werd gebruikt voor anaerobe bacteriën, en fecale monsters werden vervoerd in een piepschuimen koeler met bevroren gelpacks om een lage temperatuur te behouden voordat ze in het laboratorium verwerkt werden. Het deksel van het PBG-flesje voor coprocultuur werd verwijderd en het ontlastingsmonster werd met een wattenstaafje genomen, zodat het wattenstaafje met het monster werd geïmpregneerd. De applicator werd vervolgens in een buis geplaatst met een vast kweekmedium.

Voor anaerobe bacteriën werden de flesjes gewogen en werd 5–10 g ontlasting met een lepel verzameld. De ontlasting werd vervolgens gemengd met de inhoud van het flesje en stevig verzegeld. Voor de verwerking van monsters werden de flesjes met de monsters en steriele Stomacher-zakken gewogen. Het monster werd in een zak geleegd, 60 seconden gecentrifugeerd, waarna 4,5 mL 0,1% peptonwater werd toegevoegd. Vervolgens werd 500 μL van het monster overgebracht in een buisje en gevortexed om het mengsel te homogeniseren. Nadat 100 μL van het monster dubbel was geïnëntificeerd op elke plaat van het specifieke selectiemedium, Man Rogosa Sharpe (MRS) medium voor lactobacillen en DP Beerens medium met cysteïne + cycloheximide (om ongewenste flora te elimineren) voor bifidobacteriën, tot verdunning 8 (verdunningsfactor 0,1 mL). Voor enterobacteriën werd MacConkey-medium gebruikt bij verdunningen van 5–8 (verdunningsfactor 0,1 mL), waarbij bacteriële kolonies werden gescheiden en gekwantificeerd¹¹. Elk medium poeder werd opgelost in gezuiverd gedestilleerd water, de oplossing werd tot kookpunt verhit om volledige oplossing te garanderen, en het werd 15 minuten gesteriliseerd in een autoclaaf bij 121 °C. Het mengsel werd afgekoeld tot 46,5 °C om de gietplaattechniek uit te voeren, waarbij 1 mL per bord dubbel werd gegoten in steriele Petrischalen met 15–20 mL kweekmedium, waardoor de platen konden stollen. De geïnëntificeerde monsters werden geïncubeerd bij 37 °C in een CO2-verrijkte atmosfeer in anaerobe GasPak-systemen om anaerobe omstandigheden gedurende 24–48 uur te behouden. De kolonievormende eenheden (CFU) werden met een pen gemarkeerd en geteld^{met 12}. De volgende formule werd toegepast:

CFU/mL = (aantal kolonies × totale verdunningsfactor)/volume van de geplateerde kweek (mL)

Identificatie van morfologische kenmerken van lactobacillen en bifidobacteriën

Gram Stain werd gebruikt om de morfologische kenmerken van het exemplaar te identificeren. Een monster van bacteriekolonies van elke stam werd op een microscoopglaasje geplaatst, 1 minuut gekleurd met kristalviolet en daarna afgespoeld met gedestilleerd water. Een jodiumoplossing werd 1 minuut aangebracht en daarna afgespoeld met gedestilleerd water. Een alcohol-acetonoplossing werd 10 seconden gebruikt als ontkleuringsmiddel en afgespoeld met gedestilleerd water. Tot slot werd safranine als tegenkleuring 1 minuut aangebracht en afgespoeld met gedestilleerd water. De microscoopglaasjes werden waargenomen onder een optische microscoop met immersieolie en een 100x objectief.

Totale kwantificatie werd uitgevoerd met conventionele polymerasekettingreactie (PCR) op willekeurig geselecteerde fecale monsters van vijf proefpersonen per groep, waarbij in totaal 60 monsters over 5 weken werden verkregen. Isolaten uit kweekmedia werden verwerkt voor genetisch materiaalextractie. De PCR werd uitgevoerd met universele bacteriële primers om een fragment van het 16S rRNA-gen¹³ te amplificeren. PCR-producten werden gezuiverd en gesequenced. De sequenties werden geverifieerd en ingediend bij de GenBank-database om de aanwezigheid van lactobacillus- en bifidobacteriële stammen die uit de fecale monsters waren geïsoleerd te bevestigen.

Statistische analyse

De gegevens worden gepresenteerd als absolute en relatieve frequenties of mediaan (p25-P75). De cumulatieve ernst van de symptomen werd bepaald met behulp van de Likert-score (mild, 1; matig, 2; ernstig, 3) bij elke follow-up. Intergroepvergelijkingen werden uitgevoerd met behulp van de Wilcoxon-rangsomtest en chi-kwadraat of de exacte Fisher-test. Intra-groep vergelijkingen tussen week 0 en 5 werden uitgevoerd met behulp van de Friedman-test en meervoudige vergelijkingen met Durbin-Conover. De statistische significantie werd vastgesteld op P < 0,05.

Results

Twintig gezonde vrijwilligers werden willekeurig verdeeld in de Synbiotische Gel-groep (n = 10) en de Placebo-Gel-groep (n = 10) (Figuur 2 en Tabel 1). In de Synbiotische Gel-groep waren er zeven mannen en drie vrouwen, met een mediane leeftijd van 31 jaar (bereik 27–35 jaar); in de Placebo Gel-groep waren er drie mannen en zeven vrouwen, met een mediane leeftijd van 33 jaar (bereik 28–38 jaar). De groepen waren vergelijkbaa...

Discussion

In de huidige studie vonden we een significante vermindering van enterobacteriële tellingen in de fecale monsters van de placebogroep vanaf de eerste week van de interventie en bij de groep Synbiotic Gel in de eerste en tweede week. Deze verandering kan worden verklaard met behulp van rifaximine, dat is beschreven als het verminderen van pathogene bacteriële overgroei¹⁴. In onze studie liet de Synbiotic Gel-groep na rifaximine een positief effect zien: de mediane ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BBL tube	NA	NA	Elk merk kan worden gebruikt
DP medium	NA	NA	Elk merk kan worden gebruikt
Frozen gel packs
MacConkey medium	NA	NA
MRS medium	NA	NA	Elk merk kan worden gebruikt
PBG vial			Fosfaatbuffer, gelatine, zouten 0,05% cysteïne als reducerend middel voor02
Petri dishes
Placebo Blend	KuragoBiotek-BabyCat.	NA	Dezelfde fysische en sensorische eigenschappen als de sym iotieke gel, maar zonder de actieve ingrediënten
Styrofoam container
Symbiotic blend	KuragoBiotek-BabyCat.	NA	Zuivelvrij product dat bestaat uit Lactobacillus acidophilus NCMF en Bifidobacterium infantis Bi-07 (2 x 109 CFU/g), en 17,2 g agave-inulin als prebiotisch in een verpakking van 15 g