Een protocol voor grootte-gebaseerde verrijking van lipidendruppels uit de epitheelcellen en melkweefsels van runderen

Samenvatting

Dit protocol heeft als doel om grootte-gebaseerde scheiding en verrijking van lipidendruppels te bereiken via sequentiële centrifugatie, waardoor nauwkeurig, reproduceerbaar onderzoek mogelijk is naar lipidmetabolismemechanismen en lipidendruppel-geassocieerde biologische processen.

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een sequentiële differentiële centrifugatiebenadering om lipidedruppels (LD's) van verschillende groottes te verrijken van rundse melkepitheelcellen (BMEC's) en melkweefsels, waardoor grootte-opgeloste analyses verder mogelijk zijn dan conventionele bulk-LD-isolatiemethoden. Als dynamische regulerende hubs van intracellulair lipidmetabolisme vervullen LD's essentiële functies door neutrale lipiden (zoals triglyceriden en cholesterylesters) op te slaan en hun synthese, hydrolyse en transport te coördineren. Ze spelen een centrale rol bij het behouden van energiehomeostase, het ondersteunen van membraanbiogenese en het faciliteren van cellulaire signaaltransductie. LD-extractie is essentieel voor het onderzoeken van de regulerende mechanismen van het lipidmetabolisme. Het bestuderen van de lipidmetabolisme van de melkklier heeft aanzienlijke implicaties voor de ontwikkeling van zuigelingen, de menselijke gezondheid, landbouw-economie en fundamentele celbiologie. Daarom beschrijven we een differentiële centrifugatiemethode voor het extraheren van LD's uit BMEC's en melkklierweefsel. In tegenstelling tot conventionele bulk-LD-isolatiebenaderingen maakt dit protocol groottegebaseerde verrijking van LD-subpopulaties mogelijk door sequentieel de centrifugale krachten aan te passen. De integriteit en relatieve verrijking van LD-fracties worden voorlopig geëvalueerd met behulp van BODIPY493/503-kleuring, wat een praktische en reproduceerbare benadering biedt voor downstream-analyses van lipidmetabolisme en LD-gerelateerde processen.

Inleiding

Lipidendruppels (LD's) zijn dynamische organellen binnen cellen die dienen als primaire opslagplaatsen voor neutrale lipiden¹. Abnormale ophoping van LD's wordt geassocieerd met een breed scala aan ziekten, die verder reiken dan obesitas, en ook aandoeningen zoals leververvetting², hart- en vaatziekten³, diabetes⁴ en kanker⁵. Omgekeerd kan een onvoldoende aantal LD's ook ernstige gevolgen hebben, wat leidt tot verlies van cellulaire energiereserves en daaropvolgende functionele beperkingen⁶. In de context van de landbouw-economie kunnen onvoldoende LD's bij herkauwers leiden tot onvoldoende melkvetafscheiding, wat leidt tot een melkvetdepressie, wat op zijn beurt de voedingswaarde en verkoopbaarheid van zuivelproducten aantast⁷. Momenteel is de regulatie van het LD-metabolisme uitgegroeid tot een belangrijk onderzoeksgebied.

De ontwikkeling van extractietechnieken voor LD's sinds de 20e eeuw is consequent gericht op het winnen van LD's in grotere hoeveelheden, met een hogere zuiverheid en beter bewaarde biologische activiteit. Dit houdt in dat methodologieën continu worden vastgesteld en geoptimaliseerd. Momenteel hebben verschillende bedrijven commerciële kits ontworpen voor LD separation⁸. Hoewel deze kits de scheidingstijd aanzienlijk verkorten en alleen conventionele centrifuges vereisen, kan het reagens voor monsters die moeilijk te dissociëren zijn niet worden aangepast en is het moeilijk om de teststappen te optimaliseren. Bovendien speelt het extraheren van LD's een onmisbare rol bij het ophelderen van ziektemechanismen, waaronder die van stofwisselingsziekten zoals leververvetting⁹, kanker¹⁰ en neurodegeneratieve ziekten¹¹, en dient als een multidimensionale sonde om pathologische routes te ontcijferen. De eiwit- en lipidensamenstellingen kunnen ook worden ontleed door LD's te extraheren om de diversiteit van LD's biologische functies te onthullen¹².

De vorming van melkvet is niet slechts een proces van substraatafbraak; het vertegenwoordigt eerder een sterk georkestreerd lipidesynthese- en verpakkingsproces dat wordt uitgevoerd door melkepitheelcellen. ¹³. De productie van melkvet bij melkkoeien is afhankelijk van het apicale membraansecretiemechanisme van deze cellen: triglyceriden die in het endoplasmatisch reticulum worden gesynthetiseerd, vormen cytoplasmatische LD's, die vervolgens naar het apicale membraan worden getransporteerd en via knoppen worden afgescheiden. Tijdens dit proces worden LD's omhuld door een melkvetbolbolmembraan afkomstig van het apicale membraan, wat resulteert in de vorming van structureel stabiele melkvetbolletjes¹⁴. De koviale melkklier dient als een klassiek model voor het bestuderen van lactatie bij zoogdieren, en de kernmechanismen^die LD-synthese en -secretie regelen zijn bij mensen sterk geconserveerd. Het opzetten van methoden om LD's uit zowel BMEC's als melkweefsel te extraheren, kan de veeteelt met de menselijke gezondheid een brug overbruggen. Proteomische en lipidomische analyses van de geëxtraheerde LD's kunnen vervolgens worden ingezet om de melkproductie en kwaliteit te verbeteren, waardoor veiligheid en beveiliging worden gegarandeerd.

De huidige methode is voornamelijk gebaseerd op het laagdichtheidskarakteristiek van LD's, waardoor ze tijdens centrifugatie¹⁶ naar de top van de gradiënt zweven. De extractieprocedure bestaat uit drie hoofdstappen: monsterverzameling, ultracentrifugatie voor LD-flotatie en LD-was. Sucrose (2,5 M) wordt aan de buffer toegevoegd om de LD's te beschermen, waarna de centrifugatiesnelheid wordt aangepast volgens de experimentele eisen; doorgaans kunnen grote LD's worden verrijkt bij krachten onder 10.000 x g, terwijl hogere snelheden (boven 10.000 x g) worden gebruikt om kleine LD's te extraheren, omdat grotere LD's onder deze omstandigheden kunnen scheuren. Ten slotte ondergaan de geëxtraheerde LD's meerdere wasbeurten om besmetting te voorkomen, en wordt de zuiverheid van de extractie voorlopig beoordeeld met behulp van BODIPY493/503-kleuring.

Conventionele LD-isolatiemethoden bereiken voornamelijk bulkherstel van heterogene LD-populaties, waardoor de analyse van grootteafhankelijke structurele en functionele verschillen beperkt wordt. Het huidige protocol breidt standaardbenaderingen uit door groottegebaseerde verrijking van LD-subpopulaties mogelijk te maken via sequentiële differentiële centrifugatie, wat onderzoek naar LD-groei, omzet, intracellulaire handel en differentieel gebruik via lipolytische of autophagische routes vergemakkelijkt. Deze benadering bereikt verrijking in plaats van absolute zuivering, en gedeeltelijke overlap tussen groottefracties kan optreden door continue grootteverdelingen en gedeelde fysische eigenschappen.

Protocol

Bepaal de grootte van de doellipide druppels voor verrijking (Figuur 1).

1. Reagensopstelling

1. PBS: Weeg 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 3,58 g Na₂HPO₄·12H₂O, en 0,24 g KH₂PO₄ in 800 mL ddH₂O. Stel de pH bij op 7,4 met HCl, meng grondig en breng het volume tot 1 L. Bewaar tot 1 jaar na autoclavatie op 4 °C.
2. Sucrose (2,5 M): Weeg 856 g sucrose en los deze op in 400 mL ddH₂O. Roer goed totdat de sucrose volledig is opgelost, pas het volume aan op 1 L. Autoclave de oplossing en bewaar tot 3 maanden bij 4 °C.
3. Buffer A: Weeg 1,79 g tricine en los het op in 400 mL ddH₂O. Stel de pH aan op 7,8 met KOH. Voeg na pH-aanpassing 50 mL vooraf bereide 2,5 M sucroseoplossing toe. Meng grondig en stel het volume in op 500 mL. Na autoclaveren kan de buffer tot 3 maanden op 4 °C worden bewaard.
4. Buffer B: Gewicht 0,95 g HEPES, 1,49 g KCl en 0,038 g MgCl₂·6H₂O apart in 180 mL ddH₂O. Stel de pH in op 7,4 met KOH, meng grondig en breng het volume naar 200 mL. Na autoclaving bewaar je tot 3 maanden op 4 °C.
5. PMSF (1.000x, 0,2 M): Weeg 0,175 g PMSF en los het op in 5 mL DMSO. Bewaar deze beschermd tegen licht bij -20 °C tot een jaar.
   OPMERKING: PMSF is zeer giftig; Passende beschermingsmaatregelen moeten worden genomen. Zorg tijdens de voorbereiding voor volledige bescherming tegen licht; PMSF is moeilijk op te lossen en kan worden gealiquoteerd in 1,5 mL microcentrifugebuizen.

2. Extractie van LD's uit cellen

1. BMEC-cultuur
   1. Haal vijf buizen met ingevroren BMEC-cellen uit de -80 °C koelkast en ontdooi ze snel in een waterbad van 37 °C. Centrifugeer de buizen op 250 x g gedurende 4 minuten en 30 seconden na volledig ontdooien.
   2. Verwijder het cryopreservatiemedium met een pipettor, voeg 1 ml 10% FBS toe om de cellen opnieuw te laten suspensieren, meng en voeg de cellen voorzichtig toe aan een 100 mm celkweekschotel met 6 ml 10% FBS. Wieg de schaal voorzichtig om een gelijkmatige celverdeling te garanderen en incubeer bij 37 °C met 5% CO₂.
   3. Monitor de celmorfologie onder een microscoop en voer subcultivatie uit wanneer cellen 80%–90% confluentie bereiken.
      OPMERKING: Zorg voor optimale celconditie en voldoende celaantal vóór LD-extractie om opbrengst en reproduceerbaarheid te verbeteren.
   4. Verwijder het oorspronkelijke cultuurmedium in de petrischaal met een pipet, en voeg 1 mL PBS toe langs de wand van elke schaal. Na twee keer wassen voeg je 1 ml trypsine toe aan elk gerecht en laat je het incuberen bij 37 °C gedurende 3 minuten en 30 seconden.
   5. Let op of de cellen volledig zijn verteerd onder de microscoop, voeg 1 mL van 10% FBS toe om de vertering na voltooiing te beëindigen. Voorzichtig de cellen opnieuw ophangen door te pipetten, ze over te brengen in een microcentrifugebuis van 2 mL en te centrifugeren op 250 x g gedurende 4 minuten en 30 seconden.
   6. Gooi het supernatant weg en herhaal de procedures beschreven in Stap 1.2.
   7. Zet cellen uit met ongeveer 30 kweekschalen of grotere kweekvaten, of gebruik grotere kweekschalen voor celkweek. Voeg 150 μmol/L t10,c12-CLA (verdund in DMEM) toe om cellen te behandelen de avond voor extractie. Gebruik 7 ml kweekmedium per 100 mm kweekschaal. De cultuurtijd hangt af van de grootte van de LD's die gescheiden moeten worden.
      OPMERKING: Op basis van eerdere optimalisatie behandel BMEC's met t10,c12-CLA gedurende 6 uur om grote LD's te verrijken of gedurende 12–24 uur om kleine LD's te verrijken. Omdat cellen weinig LD's bevatten, worden exogene vetzuren meestal toegevoegd om de ophoping van LD's te stimuleren. In deze studie voeg je t10,c12-CLA toe aan gekweekte cellen om de ophoping van LD's te induceren.
2. Monsterverzameling
   1. Gooi het originele medium weg, voeg 1 ml ijskoude PBS toe en was het drie keer. Gooi PBS niet weg tijdens de laatste was. Gebruik bijvoorbeeld 30 schalen van 100 mm cellen en verzamel cellen van elke 10 platen in één 15 mL centrifugebuis; elke buis bevat ongeveer 1x108, wat resulteert in een totaal van 3 centrifugebuizen.
      OPMERKING: Houd alle monsters tijdens het extractieproces op ≤4 °C om eiwitafbraak in LD's te voorkomen.
   2. Na het balanceren, centrifugeer op 1.000 x g, 4 °C gedurende 10 minuten.
   3. Gooi de PBS weg. Voeg 10 mL voorbereide Buffer A en 10 μL PMSF (1.000x, 0,2 M) toe aan de centrifugebuis. Meng goed en laat het 20 minuten op ijs uitbroeden.
3. Cellyse en initiële fractionering
   1. Disrupt cellen met een sonde-type ultrasone homogenisator die in gepulseerde cycli van 5 s ON en 10s OFF werkt, wat resulteert in een totale effectieve sonicatietijd van 10 minuten over een periode van 30 minuten. Stel het instrument in op 40% vermogen (overeenkomend met een probeamplitude van ongeveer 76 μm) met een probe met een diameter van 3 mm.
      OPMERKING: Houd monsters gedurende de hele procedure op ijs om oververhitting te voorkomen.
   2. Centrifugeer het homogenaat op 3.000 x g en 4 °C gedurende 10 minuten om kernen en cellulair afval te verwijderen. Verzamel het supernatant als het post-nucleaire supernatant (PNS).
4. Ultracentrifugatie van drijvende LD's
   1. Filter het supernatant door een 100 μm celzeef.
   2. Pipetteer 10 mL PNS in een 15 mL centrifugebuis. Voeg 2 mL sucrose (2,5 M) en 2 mL Buffer B achtereenvolgens toe aan de bovenkant van het PNS (het sucrosevolume kan passend worden verminderd terwijl het volume van Buffer B wordt verhoogd om de LD-zuiverheid te verbeteren), en centrifugeer dan voor het eerst (5.000 x g, 4 °C, 20 min).
   3. Na de centrifugatie verzamel je de melkachtige, roomachtige LD-laag bovenop de buis. Om LD's te verzamelen, voeg je eerst 100 μL Buffer B toe aan een 1,5 mL microcentrifugebuis, en gebruik je vervolgens een 20 μL pipet om de drijvende LD-laag meerdere keren voorzichtig te aspireren, waarbij zoveel mogelijk LD's worden verzameld.
      OPMERKING: LD's vormen een zwevende crèmekleurige laag aan de bovenkant; Vermijd het aanzuigen van de onderliggende oplossing zoveel mogelijk om besmetting te voorkomen.
   4. Voer een tweede centrifugatie uit (10.000 x g, 4 °C, 30 min) en verzamel de LD's.
   5. Breng de oplossing over naar een ultracentrifugebuis die compatibel is met een schanderende emmerrotor, sluit deze af en balanceer de buizen. Voer de derde centrifugatie uit in een ultracentrifuge (50.000 x g, 4 °C, 40 min) en verzamel de LD's.
      OPMERKING: Balanceer buizen nauwkeurig (tot 0,0001 g) om veilige werking van de ultracentrifuge te garanderen.
   6. Na het balanceren voer je de vierde centrifugatie uit (150.000 x g, 4 °C, 50 min) om LD's verder te verzamelen. Optimaliseer snelheid en duur volgens de streefgrootte van LD.
      OPMERKING: Langdurige of herhaalde hogesnelheidscentrifugatie kan LD's verstoren. Daarentegen verwijdert kortdurende centrifugatie bij 10.000 x g tijdens het wassen voornamelijk onzuiverheden en heeft het minimale impact op de integriteit van de LD. Deze methode is aanpasbaar; optimalisatie kan vereist zijn voor verschillende celtypen of weefsels.
5. LD's wassen
   1. Suspendeer de verzamelde LD's opnieuw in koude Buffer B en centrifugeer op 10.000 x g en 4 °C gedurende 5 minuten.
   2. Verwijder voorzichtig het supernatant en herhaal de wasstap minstens vier keer met hetzelfde buffervolume, centrifugale kracht en centrifugatietijd. Voor kleine LD's verhoog je de centrifugale kracht indien nodig om een efficiënte scheiding te garanderen.
   3. Na de laatste wasbeurt voeg je de LD-fracties samen, meng je voorzichtig en bewaar je bij −80 °C.
      OPMERKING: Laat geen wasstappen weg, ook al is het onvermijdelijk dat er wat LD-verlies is. Blijf wassen totdat er geen zichtbaar membraanafval meer over is.

3. Extractie van LD's uit weefsel

1. Monsterverzameling
   1. Haal borstweefselmonsters van runderen uit vloeibare stikstof. Weeg 5 gram weefsel af en ontdooi het op ijs totdat er geen ijskristallen meer overblijven.
   2. Spoel het weefsel af met PBS of fysiologische zoutoplossing.
   3. Snijd het weefsel in stukjes van 1-2 mm met een chirurgische schaar.
   4. Breng het gemalen weefsel over in een voorgekoelde mortel met 12 mL Buffer A en 10 μL PMSF (1.000x, 0,2 M). Maal het mengsel ongeveer 10 minuten op ijs.
   5. Incubeer het homogenaat 20 minuten op ijs.
   6. Na grondig malen verzamel je het homogenaat in een 15 mL centrifugebuis.
   7. Centrifugeer op 2.500 x g, 4 °C gedurende 10 minuten. Het resulterende supernatant is PNS.
2. Ultracentrifugatie van drijvende LD's
   1. Filter het supernatant door een 100 μm celzeef.
   2. Pipetteer 10 mL PNS in een 15 mL centrifugebuis. Voeg achtereenvolgens 2 ml sucrose en 2 ml Buffer B toe. Voer de eerste centrifugatie uit (4.000 x g, 4 °C, 20 min). Verzamel het melkachtige, roomachtige materiaal.
   3. Voer een tweede centrifugatie uit (7.000 x g, 4 °C, 30 min) en verzamel de LD's.
   4. Voer een derde centrifugatie uit (10.000 x g, 4 °C, 40 min) en verzamel de LD's.
   5. Breng het supernatant over in een SW40-buis en voer ultracentrifugatie uit (50.000 x g, 4 °C, 50 min). Verzamel de LD's.
   6. Voer een vijfde centrifugatie uit (100.000 x g, 4 °C, 60 min). Verzamel de LD's.
3. LD's wassen
   Zie de wasmethode voor cel-extractie-LD's.

4. Voorlopige validatie van LD-zuiverheid door kleuring

1. Bereid vooraf een neutrale lipidefluorescerende kleurstofoplossing van 10 μg/mL voor onder lichtbeschermde omstandigheden (BODIPY: Buffer B = 1:100, V/V).
2. Voeg een passende hoeveelheid gemengde LD's en Buffer B toe aan een microcentrifugebuis. Voeg onder lichtbeschermde omstandigheden een geschikte hoeveelheid neutrale lipide fluorescerende kleurstofoplossing toe. Meng goed en laat het 10 minuten incuberen.
3. Maak een schoon microscoopglaasje klaar. Doeer 2,5 μL van het mengsel op de dekmantel. Plaats de glaasje voorzichtig over het mengsel, zodat er luchtbellen ontstaan. Observeer onder een omgekeerde fluorescentiemicroscoop.

5. Validatie van LD-zuiverheid door Western blot

1. De eiwitconcentratie van LD-fracties werd gemeten met een BCA-proteïne-assaykit.
2. Voor Western blot-analyse wordt 20 μg eiwit uit elk monster gemengd met 5x SDS loading buffer en 10 minuten verwarmd op 99 °C om volledige denaturatie te garanderen.
3. Vervolgens scheid je de eiwitten met SDS–PAGE op 10% gradient polyacrylamide gels op basis van hun molecuulgewicht.
4. Na elektroforese worden de eiwitten overgebracht op vooraf geactiveerde PVDF-membranen en vervolgens 1,5 uur bij kamertemperatuur met 5% BSA geblokkeerd. Vervolgens incubeer je de membranen 's nachts bij 4 °C met primaire antilichamen, waaronder konijn anti-Perilipin 2 (1:500) en konijn anti-β-actine (1:5000).
5. Was de membranen drie keer met 1x TBST gedurende elk 10 minuten, en incubeer dan met HRP-geconjugeerde geitenantikonijn secundair antistof (1:5000) gedurende 1,5 uur op kamertemperatuur.
6. Na drie extra wasbeurten met TBST, detecteer je eiwitbanden met een enhanced chemiluminescence (ECL) kit en visualiseer je met een gelbeeldvormingssysteem.

6. Pauzepunten en opslagrichtlijnen

1. Houd PNS tot 1–2 uur in het ijs voor ultracentrifugatie.
2. Houd verzamelde LD's tot 1–2 uur op ijs voordat je ze wast. Voor kortdurende opslag bewaar LDs tot 24 uur op 4 °C. Voor langdurige opslag bewaar LDs op −80 °C en beperk de vries-dooicycli tot maximaal één om de LD-integriteit te behouden.
3. Houd tijdens alle experimentele pauzes monsters op ijs met de buisdoppen gesloten om besmetting te minimaliseren.

7. Probleemoplossing

1. Dunne drijvende laag: pas het buffervolume of de centrifugatiekracht aan.
2. Slechte floatation: verhoog de centrifugatiesnelheid of verleng de tijd.
3. Verontreiniging: zorg voor steriele behandeling en gefilterde buffers.
4. LD-ruptuur: bewaar monsters op ijs, verminder de centrifugatiekracht of susselt voorzichtig.

Resultaten

Werkstroom en methodologisch kader
Er werd een beslissingsboomschema (Figuur 1) opgesteld om de keuze van centrifugatievoorwaarden volgens experimentele doelstellingen te begeleiden. Specifiek werden centrifugale krachten ≤10.000 x g gebruikt om grote LD's (≥2 μm) te verrijken, terwijl krachten >10.000 x g werden toegepast om kleine LD's (<1 μm) te verrijken. Dit kader biedt een praktische basis voor het bereiken van gro...

Discussie

LD's zijn unieke organellen die worden gekenmerkt door een neutrale lipidenkern die wordt omgeven door een fosfolipide-monolaag. Ze knoppen uit het endoplasmatisch reticulum en veranderen dynamisch hun grootte en aantal, wat intracellulair transport en uitgebreide communicatie met andere subcellulaire structuren faciliteert om de cellulaire lipidehomeostase^te coördineren 17,18,19. Dit dynamische...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200072	reagens
10% PAGE Gel Rapid Preparation Kits	Beijing BIOMAN	PG112	reagens
100 μm cell strainer	Beyotime	FSTR100	reagens
100-mm cell culture dish	Corning	490167	reagens
Amersham Imager 600	GE Healthcare Life Sciences	600	apparatuur
Autoclaaf	Panasonic	MLS-3751L	apparatuur
BCA-eiwit-assaykit	Beijing Dingguo.	BCA01	reagens
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922	reagens
Centrifuge	Eppendorf		apparatuur
DMEM	HyClone	SH30022.01	reagens
DMSO	Solarbio	D8370	reagens
Foetaal runderserum	Gibco	2492319	reagens
HEPES	MedChemExpress	HY-D0857	reagens
HRP-geconjugeerd AffiniPure geiten anti-konijn secundair antilichaam	Proteintech	SA00001-2	reagens
KCl	HUSHI	20030666	reagens
KH2PO4	HUSHI	10017608	reagens
MgCl2	HUSHI	20059028	reagens
Na2HPO4·12H2O	HUSHI	S112623	reagens
NaCl	HUSHI	10019328	reagens
Omni-Easy Instant Protein Loading Buffer	Shanghai Epizyme Biomedical Technology	LT101S	reagens
Omni-ECL Ultra-gevoelige chemiluminescentie detectiekit	Shanghai Epizyme Biomedical Technology	SQ201	reagens
PBS	HyClone	SH30256.01	reagens
Penicilline & Streptomycine 100×	NCM Biotech	CLOOC5	reagens
pH-meter	METTLER TOLEDO	S220K	apparatuur
Pipet	Eppendorf		apparatuur
PMSF	Coolaber	CP8651	reagens
PVDF-membraan overdrachtskit	GenScript	eBlot L1	reagens
Konijn anti-Perilipin 2	Abcam	15294-1-AP	reagens
Konijn anti-β-actine	Proteintech	20536-1-AP	reagens
Onderzoekskwaliteit omgekeerde fluorescentiemicroscoop	Olympus	IX73	apparatuur
Sucrose	Solarbio	S8271	reagens
SW 40 Ti Rotor	BECKMAN COULTER	331301	apparatuur
Trans-10, cis-12 geconjugeerde linolzuur	CAYMAN	90145	reagens
Tricine	Coolaber	CT11331	reagens
Ultracentrifuge	BECKMAN COULTER	Optima XE-100	apparatuur
Ultrasonische celbreker	SCIENTZ	JY92-11N	apparatuur