Site-specifieke lysinelactylering via genetische code-expansie in E. coli - en zoogdiercellen

Samenvatting

Deze studie stelde een methode vast die genetische code-uitbreiding gebruikt om lactyllysine (Klac) succesvol te integreren op specifieke locaties van de menselijke enolase-1 (hENO1) en superfolder GFP (sfGFP) in Escherichia coli - en zoogdiercellen.

Samenvatting

Lactylatie is een recent ontdekte posttranslationele modificatie (PTM) met diverse biologische functies. Sinds de eerste identificatie in 2019 als regulator van macrofagenpolarisatie, is histonlactylatie uitgegroeid tot een cruciale schakel die het cellulaire metabolisme verbindt met functionele regulatie. Biochemisch betreft het de covalente overdracht van een lactylgroep naar lysineresiduen, gemedieerd door lactyltransferasen waarbij lactyl-CoA als acyldonor wordt gebruikt, of door aminoacyl-tRNA-synthetasen (AARS'en) via een lactyl-AMP-intermediair. Via deze mechanismen zijn intracellulaire lactaatniveaus direct gekoppeld aan eiwitmodificatie en -functie. Lactylatie bemiddelt een reeks kritieke cellulaire processen, van fysiologische functies zoals genregulatie, DNA-reparatie, metabole herprogrammering en immuunmodulatie tot pathologische processen zoals tumorprogressie en metastase. Ondanks de identificatie van talrijke lactylatieplaatsen door proteomics, blijft het bereiken van locatie-specifieke lysinelactylatie via mutagenese een uitdaging. Om dit aan te pakken, maken we gebruik van genetic code expansion-technologie, waarbij we een lactyl-lysine-specifiek aminoacyl-tRNA synthetase (KlacRS) en het verwante tRNA gebruiken om lactyl-lysine (Klac) nauwkeurig op te nemen in aangewezen residuen. Deze strategie maakt het mogelijk om homogene lactylatie-eiwitvarianten te genereren voor directe functionele studies. Hier beschrijven we een gestroomlijnd protocol voor locatie-specifieke eiwitlactylering, gevalideerd in zowel Escherichia coli (E. coli) als zoogdiercellen, waarbij humane enolase-1 (hENO1) en superfolder GFP (sfGFP) als modelsystemen worden gebruikt.

Inleiding

Lysinelactylatie (Klac), oorspronkelijk geïdentificeerd op histonen, is uitgegroeid tot een belangrijke knoop die abnormale tumormetabolisme en epigenetische regulatie¹ verbindt. De ophoping van lactaat als gevolg van verhoogde aerobe glycolyse in tumorcellen vormt een metabole basis voor lactylering, waardoor lactaat niet alleen als een metabolisch bijproduct kan fungeren, maar ook als een signaalmolecuul dat de eiwitfunctie direct moduleert. Toenemend bewijs wijst erop dat lactylatie breed deelneemt aan tumorinitiatie en -progressie door het coördineren van kankercelproliferatie ^2,3,4,5, metastase⁶, metabole herprogrammering⁷ en therapeutische resistentie ^8,9.

Op fenotypisch niveau is verhoogde lactylatie nauw geassocieerd met verhoogde tumoragressiviteit. Zo bevordert H3K18-lactylatie bij clear-cell renale celcarcinoom (ccRCC) proliferatie en metastase door de door bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor β (PDGFRβ) op te reguleren, waardoor een positieve feedbackloop wordt gecreëerd tussen lactaataccumulatie en oncogene signalering¹⁰. Evenzo stimuleert verhoogde H3K18-lactylatie bij colorectale kanker (CRC) de tumorprogressie via verbeterde transcriptie van de Rubicon-achtige autophagy-enhancer (RUBCNL), waardoor de autofagosoomrijping wordt bevorderd en de overleving van kankercellen¹¹ ondersteund wordt.

Naast directe effecten op tumoragressiviteit mediaert lactylatie ook tumormetabole herprogrammering door de expressie en activiteit van metabolisme-gerelateerde genen^te moduleren. Bij niet-kleincellige longkanker (NSCLC) verlaagt histonlactylatie glycolysegerelateerde enzymen terwijl tricarboxylzuur (TCA) cyclusenzymen worden opgereguleerd, wat de opname van tumorcellen glucose versterkt en metabole ontregeling verergert^. Consistent toont globale lactylomeprofilering aan dat lactylatie bij voorkeur enzymen aanpakt die betrokken zijn bij centrale metabole routes, waaronder glucosemetabolisme, TCA-cyclus, aminozuur/vetzuurmetabolisme, en deze modificaties correleren sterk met agressieve tumorfenotypes⁷.

Belangrijk is dat de biologische gevolgen van lactylatie sterk plaats-afhankelijk zijn, en deze modificatie is uitgegroeid tot een belangrijke bepalende factor voor tumortherapeutische resistentie. In CRC verbetert K673-lactylatie van meiotische recombinatie 11 (MRE11) de herstel van homologe recombinatie (HR), waardoor resistentie ontstaat tegen chemotherapie en poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) remmers¹³. Bij glioblastoom (GBM) verhoogt de interactie tussen aldehydedehydrogenase 1-familielid A3 (ALDH1A3) en pyruvaatkinase M2 (PKM2) de lactaatproductie, wat vervolgens de K247-lactylatie van röntgenreparatie kruiscomplement eiwit 1 (XRCC1) induceert om DNA-schadeherstel te verbeteren, waardoor radioresistentie en temozolomide (TMZ) chemoresistentie¹⁴ worden aangedreven. Deze studies benadrukken gezamenlijk dat nauwkeurige controle van lactylatie bij gedefinieerde lysineresiduen essentieel is voor mechanistische dissectie en therapeutische targeting.

Vooruitgang in hoogresolutie massaspectrometrie heeft wijdverspreide lactylatie over metabole enzymen, transcriptiefactoren en signaaltransducators aan het licht gebracht, wat de brede rol in het reguleren van metabolisme, signaaltransductie en cellulaire fysiologie^onderstreept 15,16,17,18. Tot nu toe zijn verschillende writer-enzymen gerapporteerd die lactylatie katalyseren – bijvoorbeeld AARS1 mediaert p53-lactylatie om tumorigenese¹⁹ te bevorderen, en AARS1/2 reguleert cGAS-lactylatie om aangeboren immuniteit te onderdrukken – maar deze enzymen zijn substraatselectief en kunnen momenteel geen volledig locatie-specifieke lactylatie bereiken op willekeurige eiwitten²⁰. Het vakgebied blijft dus uitgedaagd door hoe Klac op een gerichte manier te manipuleren voor onderzoeks- of therapeutische doeleinden.

Functionele studies vertrouwen nog steeds voornamelijk op site-directed mutagenese—typisch het vervangen van een lysine (K) door glutamine (Q) om de ongeladen toestand van acyl-lysine modificaties zoals acetylatie of lactylatie^{na te} bootsen 21,22,23,24. Deze benadering heeft echter aanzienlijke beperkingen in het getrouw recapituleren van native lactylatie: de chemische structuur en zijketengeometrie van glutamine verschillen van die van een lactylated lysine, en belangrijk is dat een K naar Q-substitutie geen onderscheid kan maken tussen geacetyleerde en lactylatie-toestanden wanneer beide modificaties op dezelfde plaats kunnen plaatsvinden.

Genetische code-uitbreiding (GCE) biedt een krachtige oplossing voor deze beperkingen door de directe opname van niet-canonieke aminozuren in eiwitten op gedefinieerde locaties mogelijk te maken. Door positieve screening van een Methanosarcina mazei pyrrolysyl-tRNA synthetase (MmPylRS) mutantenbibliotheek hebben we eerder een variant geïdentificeerd met Klac-afhankelijke groei. Deze mutant, met mutaties L301M, Y306L, L309A en C348F, kreeg de aanduiding KlacRS1^25,26. KlacRS1 aminoacylaat zijn verwante orthogonale tRNA met Klac, onderdrukt het amber stop-codon en maakt efficiënte, locatie-specifieke opname van Klac in doeleiwitten mogelijk. Naast KlacRS1 zijn verschillende andere aaRS-varianten gerapporteerd die Klac-incorporatie kunnen opleveren, waaronder MbPylRS-afgeleide LacKRS (L270I/Y271L/L274A/C313F) en LacKRS3 (Y271M/C313S)^19,27, evenals een MmPylRS-afgeleide LacKRS (C348T/Y384F)²⁸. Samen vormen deze tools een veelzijdige genetische toolkit voor het produceren van locatie-specifieke lactylatie-eiwitvarianten om de biologische gevolgen van individuele lactylatiegebeurtenissen te begrijpen.

In onze eerdere studies pasten we dit GCE-gebaseerde systeem toe om ALDOA-eiwitten tot expressie te brengen die plaats-specifieke lactylatie bij Lys147 bevatten in zowel E. coli- als zoogdiercellen. Functionele analyses toonden aan dat lactylatie bij Lys147 een negatief terugkoppelingseffect uitoefent op de glycolyse, de thermische en chemische stabiliteit van ALDOA verbetert en de translocatie van het cytoplasma naar de kern bevordert. Deze resultaten onthulden niet alleen een eerder niet erkend regulerend mechanisme van ALDOA, maar bevestigden ook de robuustheid, veelzijdigheid en praktische bruikbaarheid van dit locatie-specifieke lactylatieplatform^25,26. Voortbouwend op deze basis gebruiken we hier humane enolase-1 (hENO1) en superfolder GFP (sfGFP) als representatieve voorbeelden om een gestroomlijnde strategie te beschrijven voor precieze Klac-incorporatie met ons orthogonale KlacRS/tRNA-systeem.

Protocol

1. Amber stopcodonmutagenese voor genetische codering van Lactyllysine in het doelgen

1. Introduceer een TAG amber stopcodon op positie 89 van het hENO1-gen en positie 149 van het sfGFP-gen via site-directed mutagenese volgens het protocol van de fabrikant, zuiver het PCR-product en voer homologe recombinatie uit. Gebruik de volgende primers:
   ENO1-K89TAG-F CACAGAACAAGAGtagATTGACAAACTGATGATCGAG
   ENO1-K89TAG-R TctaCTCTTGTTGTGTGACGTTCAGTTTTTTG
   sfGFP-N149TAG-F CAACAGCCATtagGTGTATATCACCGCCGACAAGC
   sfGFP-N149TAG-R CACctaATGGCTGTGTTGAAGTTACTCCAGC
   OPMERKING: Voor plaatsspecifieke opname van lactyleerde lysine moet de doelplaats worden gemuteerd tot een amber stop codon (TAG) of andere onzincodeons, en TAA of TGA moeten worden gebruikt als het echte stopcodon.
2. Ontdooi DH5α-competente cellen op ijs, meng 5 μL van het recombinatieproduct met 50 μL cellen en breng 30 minuten op ijs. Breng het mengsel onder een hitteshock van 45 seconden bij 42 °C en leg het daarna 2-3 minuten op ijs. Voeg 350 μL LB medium toe en incubeer bij 37 °C met schudden (220 rpm) gedurende 1 uur.
3. Breng de cellen uit op een voorverwarmde LB-plaat met ampicilline en incubeer bij 37 °C gedurende 12-16 uur. Kies twee losse kolonies voor Sanger-sequencing om de mutatie te bevestigen.

2. Expressie van Lactylated eiwit in E. coli-cellen

1. Co-transformeer 50 μL chemisch competente cellen van E. coli DH10B met ongeveer 100 ng pBad-ENO1-K89TAG, dat codeert voor het doelgen, en pEvol-MmKlacRS1 (Addgene-plasmide # 232157), dat codeert voor het KlacRS- en tRNA-paar.
2. Incubeer het mengsel 25 minuten op ijs, laat het 45 seconden bij 42 °C een hitteshock en zet het weer in het ijs voor 3 minuten. Voeg 350 μL LB-medium bij kamertemperatuur toe, schud krachtig op 220 rpm gedurende 1 uur bij 37 °C.
3. Breng de celkweek uit op een LB/plaat aangevuld met 100 μg/mL Ampicilline (Amp₁₀₀) en 50 μg/mL Chloramfenicol (Cm₅₀). Bred de platen uit bij 37 °C gedurende 12-16 uur.
4. Kies één kolonie om een 4 ml startercultuur te inoculeren en deze 's nachts uit te broeden. De volgende dag breidd je de nachtkweek uit tot 400 mL LB/ampère₁₀₀cm₅₀ en schud je dan bij 220 rpm, 37 °C krachtig tot OD 600 0,6-0,8 bereikt.
5. Induceer met 0,2% L-arabinose en 1 mM Klac; Incubeer bij 30 °C, 220 tpm voor nog eens 16 uur.

3. Genetische codering van Lactyllysine in HEK 293T-cellen

1. Zaadcellen in 12-wellplaten met een dichtheid van 1 x 10^{5 cellen} per put met 1 mL DMEM-medium. Na 24 uur incubatie, wanneer de celconfluentie 70%-80% bereikt, voer transfectie uit.
   OPMERKING: Een samenvloeiing van 70%-80% wordt aanbevolen voor transfectie, terwijl kolonievormingsassays lagere zaaidichtheden vereisen, wat empirisch moet worden bepaald.
2. Voor het bereiden van een verdunde DNA-oplossing voeg 0,75 μg pcDNA-sfGFP-N149TAG en pNeu-KlacRS (Addgene plasmide # 232155) in een verhouding van 1:1 toe aan 38 μL serumvrije DMEM met hoge glucose. Pipetteer voorzichtig op en neer of vortex kort om te mengen.
3. Voor het bereiden van verdunde transfectiereagens voeg je 2,25 μL transfectiereagens toe aan 38 μL serumvrije DMEM met hoge glucose. Pipetteer voorzichtig 3-4 keer omhoog en omlaag om te mengen.
   OPMERKING: Of Opti-MEM gebruikt kan worden, hangt af van de instructies van de fabrikant, omdat de seruminhoud de transfectie-efficiëntie kan verstoren.
4. Voeg het verdund transfectiereagens direct toe aan de verdunde DNA-oplossing.
   OPMERKING: Meng de oplossingen niet in omgekeerde volgorde.
5. Pipette direct 3x-4x op en neer of vortex kort om te mengen. Incubeer 10-15 minuten op kamertemperatuur om transfection/DNA-complexen te laten vormen.
   OPMERKING: Het transfectie-/DNA-complex moet binnen 20 minuten na voorbereiding worden gebruikt.
6. Voeg het 50 μL transfection/DNA-mengsel druppelgewijs toe aan het medium in elke put en homogeniseer het mengsel door de plaat voorzichtig te draaien.
7. Vervang medium na 6 uur na transfectie door een verse DMEM met 1 mM Klac. Cultuur voor 24-48 uur.
   OPMERKING: Op basis van onze eerdere gegevens toonde Klac bij concentraties van 1-5 mM geen cytotoxische effecten op cellen²⁶. De werkconcentratie van Klac moet geoptimaliseerd worden op basis van het eiwitexpressieniveau. Als het doeleiwit gevoelig is voor verlies van de lactylatiemodificatie, wordt toediening van HDAC-remmers (bijv. Trichostatine A) of de sirtuin-remmer NAM (nicotinamide) aanbevolen.

4. His-tag zuivering van Lactylated eiwit in E. coli-cellen

1. Oogst de cellen door centrifugatie op 6.900 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Opnieuw suspenderen in 50 mL lysisbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl). Lyse via ultrasonicatie op ijs voor 3 seconden puls, 8 seconden interval bij 200 W gedurende 30 minuten. Centrifugeer op 13.800 x g, 4 °C gedurende 30 minuten en verzamel daarna supernatant.
   OPMERKING: Als het doeleiwit gevoelig is voor mechanische afschuiving, kan de ultrasonicatiestap worden vervangen door milde cellyse met behulp van een geformuleerd eiwitextractie-reagens geschikt voor E. coli.
2. Filter supernatant door een membraan van 0,45 μm om de oplosbare fracties op te vangen. Laad de geklaarde lysaten op een 1 mL Ni-NTA zwaartekrachtkolom. Wash met ongeveer 5 mL Buffer A (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl,
   5 mM imidazol) totdat er geen detecteerbaar eiwit meer in het eluaat wordt gevonden. Eliuteer het eiwit met 1 mL Buffer B (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl, 200 mM imidazol) voor 5x. Bewaar alle fracties. Controleer op geëlueerd eiwit met een snelle Bradford-assay.
3. Combineer de gezuiverde eiwitfracties en voer bufferuitwisseling uit naar de opslagbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl). Aliquot de geconcentreerde eiwitten in 50 μL in elke buis, vries het snel in en sla op bij -80 °C voor de volgende analyse.

5. Biochemische karakterisering van het lactylatie-eiwit

1. SDS-PAGE en Western Blotting
   1. Scheid het eiwit met SDS-PAGE (90 V voor 20 minuten, daarna 150 V voor 50 minuten). Kleur de gel met Coomassie Blue, verhit 15 seconden in een magnetron, en destaine met een ontkleuringsoplossing (40% absolute ethanol, 10% glaciale azijnzuur en 50% gedeïoniseerd water) op een shaker (50 rpm, 15 min). Herhaal de destainingstap totdat de eiwitbanden duidelijk zichtbaar zijn.
   2. Activeer een PVDF-membraan in methanol gedurende 1 minuut. Stel de transferstack in de volgorde samen: spons, filterpapier, gel, membraan, filterpapier, spons. Voer de overdracht uit op 250 mA gedurende 1 uur in een voorgekoelde buffer. Blokkeer het membraan 1,5 uur met 5% magere melk en was daarna 3 keer met TBST (10 minuten per stuk).
   3. Incubeer met primaire antistoffen (Anti-His 1:10.000; Anti-L-Lactyl Lyssine 1:1.000) bij 4 °C 's nachts. Was 3 keer met TBST.
      OPMERKING: Optimale verdunningsverhoudingen moeten empirisch worden bepaald voor antilichamen verkregen uit verschillende commerciële bronnen.
   4. Incubeer met konijn secundair antilichaam (1:10.000) gedurende 1,5 uur op kamertemperatuur. Was 3 keer met TBST. Afbeelding met chemiluminescentie en opgeslagen data in Image Lab.
2. Massaspectrometrie-analyses
   1. Voor intacte massaanalyse verdun je de eiwitten tot een eindconcentratie van 0,1 μg/μL met water dat 0,1% mierszuur (FA) bevat en ze vervolgens ondergaat aan een ultra-high performance vloeistofchromatografie (UPLC) systeem. De mobiele fase bestond uit oplosmiddel A (0,1% FA in water) en oplosmiddel B (acetonitril, ACN) met een debiet van 0,3 mL/min.
   2. Meet de molecuulgewichten van hENO1-89Klac met een hoogresolutie quadrupole-time-of-flight (Q-TOF) massaspectrometer met het m/z-bereik ingesteld op 300-2000. Verzamel en verwerk alle gegevens met behulp van de MassLynx-software.
   3. Voor proteomische analyse analyseer je de eerder beschreven verteerde cellysaten met behulp van een nanostroomvloeistofchromatografiesysteem gekoppeld aan een hoogresolutie tribrid-massaspectrometer uitgerust met een analyzer. De mobiele fase bestond uit oplosmiddel A (0,1% FA in water) en oplosmiddel B (ACN/water, 8:2, v/v) met een debiet van 300 nL/min.
   4. Afzonderlijke peptiden op een omgekeerde fase C18 capillaire kolom (75 μm x 250 mm) met een gradiënt van 90 minuten: 3%-8% B (0-5 min), 8%-28% B (5-60 min), 28%-38% B (60-75 min), 38%-100% B (75-80 min) en 100% B (80-90 min). Verkrijg MS1-spectra over m/z 350-1800 met een resolutie van 120.000 en een AGC-doel van 4e5. Genereer MS2-spectra door fragmentatie van botsingsdissociatie (HCD) met hogere energie (botsingsenergie = 32%), met een eerste massa van m/z 110, een resolutie van 30.000 en een AGC-doel van 5e4.
3. Flowcytometrie-analyse
   1. Was de cellen 2x met voorgekoelde PBS-buffer, gevolgd door centrifugatie op 1.380 x g gedurende 3 minuten na elke was. Sussie de celpellet die na centrifugatie is verkregen in 500 μL PBS-buffer en pipetteer voorzichtig om te mengen. Filter de celsuspensie door een steriele gaas van 300 maas, verzamel het filtraat in een flowcytometriebuis om interferentie door celaggregaten tijdens detectie te minimaliseren. Analyseer het voorbereide monster met een flowcytometer met dubbele lasers, met excitatie bij 405 nm en detectie bij 488 nm voor de bijbehorende fluorescentiesignalen.

Resultaten

We evalueerden eerst de incorporatiespecificiteit van Klac in eiwitten in E. coli. Het gen voor humaan enolase 1 (hENO1) werd ontworpen om een amberkleurige stopcodon te bevatten bij residu K89 (hENO1-89TAG), en dit construct werd co-expressief gemaakt met het orthogonale KlacRS en het verwante tRNA-paar in E. coli. Bij afwezigheid van 1 mM Klac-suppletie werd geen volledige hENO1 gedetecteerd; daarentegen, toen 1 mM Klac aan het groeimedium werd toegevoegd, we...

Discussie

Hier beschrijven we een strategie voor locatie-specifieke opname van Klac in eiwitten in zowel prokaryote als eukaryote cellen. Door een amber stopcodon in te brengen op de gewenste positie van het doelgen en dit samen met het orthogonale KlacRS/tRNA-paar in gastheercellen te co-expressen, kan authentieke lactyllysine nauwkeurig worden opgenomen in eiwitten in levende cellen, wat een krachtig hulpmiddel biedt om lactylatiespecifieke biologie te onderzoeken.

We...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
6*his,His tag Recombinant monoclonal antibody	Proteintech	84814-1-RR	Een klasse van specifieke immunoglobulinen die zich richten op de 6×His tag (een kort peptide bestaande uit zes opeenvolgende histidineresiduen, HHHHHH) in recombinante eiwitten.
ACQUITY UPLC system	Waters		UltraPerformance Vloeistofchromatografie
Anti-L-Lactyllysine Rabbit mAb	PTM Biolabs	PTM-1401RM	Een klasse van specifieke immunoglobulinen die zich richten op L-Lactyl Lysine (Klac), een post-translationele modificatie (PTM) van eiwitten.
ClonExpress II One Step Cloning Kit	Vazyme	C112	Gebaseerd op eenvoudige, snelle en efficiënte DNA naadloze kloningstechnologie, kunnen insertfragmenten directioneel worden gekloond in elke site van elke vector.
CytoFlex flow cytometer	Beckmann Coulter		Flow cytometer met hoge gevoeligheid detectie en mogelijkheden voor meerkleurig analyse
DH10B	Biorabbit	EC005H-S	Een type competente cellen voor plasmide transformatie, genklonen en blauw-wit screening.
DH5α	Vazyme	C502	Een type competente cellen voor plasmide transformatie, genklonen en blauw-wit screening.
EASY-nano LC 1200 system	Thermo Fisher Scientific		Nano-vloeistofchromatografie voor het scheiden van complexe monsters met hoge gevoeligheid en hoge resolutie
Orbitrap Eclipse Tribrid mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific		een vlaggenschip hoogwaardig tribrid vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) systeem
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase	Vazyme	P505	Een hoog-fideliteit enkel enzym dat snelle amplificatie en trouw combineert
PolyJet	SignaGen	SL100688	PolyJet DNA In Vitro Transfectie Reagens is geformuleerd als een krachtig transfectie reagens dat effectieve en reproduceerbare transfectie verzekert met minder cytotoxiciteit.