Dit experimentele protocol demonstreert een diep cervicaal lymfebuis-canulemodel dat directe en kwantitatieve beoordeling van lymfedrainage vanuit het hoofdgebied mogelijk maakt. Het model faciliteert gedetailleerde analyse van door het centrale zenuwstelsel (CZS) afgeleide opgeloste stoffen, populaties immuuncellen en de distributie en klaring van op het CZS gerichte therapieën.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Cervicale lymfebuis-gecoruleerde rat-model voor het beoordelen van lymfetransport vanuit het hoofd en de hersenen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Lymfe stroomt vanuit het centrale zenuwstelsel (CZS) via een reeks lymfevaten (LV's) en lymfeklieren die samenkomen bij de cervicale lymfekanalen. Naast het handhaven van de vloeistofbalans spelen deze lymfekanalen een sleutelrol bij het transporteren van een breed scala aan stoffen, waaronder endogene metabolieten, signaalmoleculen, immuuncellen en kleine en macromoleculaire geneesmiddelen. Dit is cruciaal voor fysiologische homeostase en immuunfunctie in zowel intracraniële (bijv. hersenen) als extracraniële gebieden (bijv. neus- en mondholtes). Verminderde lymfedrainage uit de hersenen wordt steeds vaker in verband gebracht met een reeks neurologische en neurodegeneratieve aandoeningen. Cervicale lymfebuiscanulatie maakt het mogelijk om lymfe te verzamelen die het hoofd en de hersenen draineren, waardoor de concentratie en transportsnelheid van verschillende stoffen via het lymfestelsel kunnen worden gemeten. Veranderingen in deze factoren als reactie op verschillende uitdagingen (bijv. medicijnen, stress, trauma) en ziekten (bijv. beroerte, infectie, Alzheimer) kunnen ook worden vastgesteld. Hier beschrijven we een verdoofd, diep cervicaal kantbuis gecanuleerd rattenmodel dat lymfeverzameling enkele uren na de operatie mogelijk maakt. De methode kan worden gecombineerd met beeldvormings- en multi-omics-technologieën voor de meting van een breed scala aan parameters van belang in de lymfe. Dit faciliteert fundamenteel fysiologisch en pathofysiologisch onderzoek naar het hoofd- en halsgebied, evenals farmacokinetische/farmacodynamisch onderzoek naar geneesmiddelen, met name voor de behandeling van CZS-ziekten.
Inleiding
Het lymfestelsel, dat door het hele lichaam is verspreid, is essentieel voor het handhaven van vloeistofhomeostase, het reguleren van immuunresponsen en het faciliteren van het transport van voedingsstoffen en signaalmoleculen1. De perifere lymfevaten beginnen in de lymfatische haarvaten, die interstitiële vloeistof en opgeloste stoffen verzamelen en afwateren in grotere verzamellymfatische vaten (LV's) die een omringende gladde spierlaag bevatten; Deze vaten leveren vervolgens lymfe af aan lokale lymfeklieren voor immuunverwerking 2,3. Het lymfatische netwerk dat het hoofdgebied draineert is belangrijk voor de homeostase van zowel intracraniële (bijv. hersenen) als extracraniële (bijv. neus- en mondholtes) organen. De structuur en organisatie van het extracraniële lymfenetwerk lijken op die van perifere lymfekaten door het hele lichaam, terwijl het intracraniële lymfestelsel unieke anatomische en functionele kenmerken vertoont (zie Figuur 1 voor een gedetailleerde schematische weergave in rattenmodellen)4,5. Hoewel typische LV's ontbreken in het hersenparenchym, worden lymfatische functies gemedieerd door het gespecialiseerde gliaal-afhankelijke lymfatische transportsysteem (glymfatisch) dat de uitwisseling tussen cerebrospinaal vocht (CSF) en interstitiële vloeistof (ISF)6 bevordert. Hoewel het glymfatische systeem het mengen van ISF binnen het hersenparenchym met CSF mogelijk maakt, transporteren de meningeale, perivasculaire en nasofarynxe LV's opgeloste stoffen uit het CSF weg van de schedelholte. Specifiek leidt de meningeale lymfatische baan CSF van de subarachnoïdale ruimte naar meningeale LV's, waarbij intracraniële vloeistofdynamica wordt gekoppeld aan perifere lymfatische clearance7. Parallel maken perineurale banen het mogelijk om CSF en bijbehorende opgeloste stoffen langs de schedels van de hersen- en spinale zenuwen te efflosen, vooral via de olfactorische zenuwen naar de nasofarynxe lymfatische plexus 5,8. Gelijktijdig werk van deze systemen houdt de vloeistofhomeostase in de hersenen 6,7,8. Recente vooruitgang in het begrijpen van het door het zenuwkanaal drainerende lymfestelsel heeft nieuwe inzichten opgeleverd in de hersenfysiologie en pathofysiologie. Deze bevindingen kunnen nieuwe wegen bieden voor therapeutische interventie bij CNS-ziekten9.
Figuur 1: Schematische weergave van de lymfatische clearancepaden van het ZENUW. Deze routes bestaan uit (A) de glymfatische route via perivasculaire ruimtes; (B) de nasofarynxe lymferoute en (C) de meningeale LV's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De lymfenetwerken die uit het hoofd en het centrale zenuwstelsel aflopen, komen samen in de cervicale lymfekanalen in de hals, waar lymfe via de cervicale lymfeklieren wordt gefilterd voordat het de systemische circulatie binnenkomt. De cervicale lymfeklieren worden ingedeeld in oppervlakkige (sCLN's) en diepe cervicale lymfeklieren (dCLN's) op basis van hun anatomische locatie in de nek. Veranderingen in de samenstelling van lymfevocht in de cervicale lymfegangen worden verondersteld onderliggende pathofysiologische variaties in de hersenen te weerspiegelen, waarbij de ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Parkinson (PD), traumatisch hersenletsel (TBI) en post-beroerte cognitieve stoornissen (PSCI) representatieve voorbeelden zijn 9,10,11,12,13 . Opmerkelijk is dat in AD een verstoorde drainage van amyloïde-β (Aβ) en gefosforyleerde tau-eiwitten (P-tau) via deze lymferoutes is geïdentificeerd als een bijdragende factor aan het verloop van de ziekte 9,10,14. Door lymfekanalen direct te verbinden met aangrenzende aders om lymfedrainage om te leiden, wordt lymfatische veneuze anastomose (LVA) onderzocht bij zowel dieren als mensen als een therapeutische strategie om de lymfetoevoer uit het CZS te vergroten, waardoor de Aβ-clearing uit de hersenen wordt vergemakkelijkt en mogelijk de progressie van AD 6,15,16 wordt vertraagd. Het belang van deze route wordt verder geïllustreerd door observaties bij muizen die chirurgisch werden verwijderd van de cervicale lymfeklieren (lymfadenectomie), wat resulteerde in een verminderde cervicale lymfatische clearance. Verminderde clearance leidt tot toxische ophoping van Aβ en P-tau, met daaropvolgende activatie van pathologische kinase-signaalwegen. Deze veranderingen worden geassocieerd met een progressieve verslechtering van AD-achtige tauopathie en een verhoogd risico op angst- en depressieachtig gedrag14,16. Bovendien suggereren CSF-gebaseerde studies dat CZS-tumoren, zoals hersenlymfomen, de lymfatische clearance door de diepe cervicale lymfekanalen fysiek kunnen blokkeren, terwijl tegelijkertijd de oncoproteïneconcentraties in het CSF 9,17,18 stijgen. Bewijs uit op basis van CNS-ontstekingen gebaseerde studies wijst verder op dat cellen die in de meningeale LV's ontstaan via de meningeale LV's naar de cervicale lymfeklierenkunnen migreren 8,19. Deze cellen bestaan voornamelijk uit lymfocyten, met kleinere populaties van dendritische cellen, macrofagen en endotheelcellen19,20. Tijdens ontsteking of na een CNS-beschadiging of operatie wordt de lymfatische immuuncelhandel duidelijk versterkt, gepaard met verhoogde niveaus van immuunbiomarkers zoals cytokinen, chemokines en andere ontstekingsmediatoren21.
Naast zijn patho-fysiologische rollen wordt het cervicale lymfenetwerk steeds meer erkend als een belangrijk kanaal voor de afvoer van medicijnen. Eerdere dierstudies hebben aangetoond dat verschillende geneesmiddelformuleringen die zijn ontworpen voor toediening van het CZS via de cervicale lymfekanalen en lymfeklieren (in verschillende mate) uit de hersenen kunnen worden verwijderd, zoals geïllaboreerd door intracerebraal toegediende nanodeeltjes-gebaseerde middelen (bijv. lamotrigine, talazoparib) en biologische middelen (bijv. monoklonale antilichamen, radiogelabelde tracer-eiwitten)22,23,24,25. Bij mensen hebben MRI-beeldvormingsstudies aangetoond dat bepaalde moleculen, zoals gadobutrol, actief worden getransporteerd van het glymfatische systeem naar de cervicale lymfekanalen26.
Zoals eerder genoemd, leiden cervicale lymfeklieren, zowel sCLN's als dCLN's, lymfe af uit verschillende delen van het hoofd; echter, de specifieke schedelgebieden die door elke knoop worden afgevoerd blijven onduidelijk:27,28. Overlappende drainagegebieden, anatomische variabiliteit tussen individuen en mogelijke structurele verschillen tussen soorten maken de beschrijving van cervicale lymfatische drainagepatronen bij zowel dieren als mensen verder ingewikkeld29. Binnen het complexe cervicale lymfatische netwerk zijn de diepe cervicale lymfekanalen geïdentificeerd als belangrijke uitstroomroutes voor CSF, gelegen stroomafwaarts van de nasofarynxe en meningeale LV's8. In vergelijking met de oppervlakkige cervicale lymfekanalen, die fijne en variabele netwerken vormen in het subcutane weefsel en sterk verschillen in grootte en vertakking tussen individuele ratten, biedt de diepe cervicale lymfebuis een toegankelijkere en praktischere route voor het verzamelen van CNS-afgeleide lymfe in kleine diermodellen20,30. Het huidige protocol richt zich daarom op het opzetten van een betrouwbare methode om lymfe te verzamelen uit de diepe cervicale lymfebuis.
Slechts een beperkt aantal studies in het afgelopen decennium heeft de verzameling van cervicale lymfevloeistoffen beschreven om CNS-ziekten te bestuderen of de distributie van geneesmiddelen te analyseren. Een eerdere studie beschreef de meting van medicijnconcentraties in cervicale lymfe door vloeistof te spoelen of uit geïsoleerde weefselsecties te spoelen of te persen (zoals die naast een enkele dCLN). Experimentele protocollen voor de continue verzameling van lymfe uit de cervicale lymfekanalen bij kleine proefdieren, met name ratten, blijven echter nog onderontwikkeld. Dit protocol stelt een gemakkelijk toegankelijke en reproduceerbare methode vast voor het canuleren van de (rat) cervicale lymfebuis om continue lymfeverzameling mogelijk te maken en om het lymfetransport van het zenuwstelsel, immuunresponsen en farmacokinetiek te onderzoeken. Het belangrijkste voordeel ligt in het vermogen om de lymfestroom en samenstelling over bepaalde tijdsintervallen te kwantificeren, waardoor de kwantitatieve meting van geneesmiddelen, lipiden, vetzuren en cellulaire bestanddelen mogelijk is. Dit model legt met name lymfatische transportprocessen vast die niet voldoende worden weergegeven door plasma/CSF-monster- of beeldvormingstechnieken, en biedt nieuwe inzichten in de verwerping van CNS-geneesmiddelen, lipiden- en nutriëntentransport, en immuunsignalering20.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De procedure(s) die in dit protocol worden beschreven, zijn goedgekeurd door de universiteitscommissie voor dierenethiek en uitgevoerd in overeenstemming met de experimentele ethische richtlijnen van China Pharmaceutical University. Voordat u met dierengerelateerde procedures begint, verkrijg u de benodigde goedkeuringen van de relevante institutionele of organisatorische ethische commissie. Mannelijke Sprague-Dawley (SD) ratten van 220 tot 250 g worden als proefdieren gebruikt. Dieren worden afkomstig van erkende leveranciers van experimentele dieren (zie de Materiaaltabel) en in speciale kooien gehouden met gratis toegang tot voedsel en water tot de start van het experiment. In dit protocol wordt de canulatie van de linker diepe cervicale lymfebuis beschreven als een representatief voorbeeld. Momenteel is er beperkt bewijs dat anatomische verschillen beschrijft tussen de diepe cervicale lymfekanalen aan de linker- en rechterkant. Op basis van observaties uit eerder uitgevoerde experimenten zijn er geen significante verschillen tussen de twee zijden waargenomen, inclusief in lymfestroomsnelheden.
1. Veiligheidsmaatregelen en procedures
- Voer alle procedures uit volgens de institutionele bioveiligheidsrichtlijnen, en al het personeel moet voldoende training krijgen in microchirurgische technieken, het hanteren van experimentele dieren en chemische veiligheid voordat dit protocol wordt uitgevoerd.
- Draag gedurende de procedure geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), waaronder een laboratoriumjas, chirurgische handschoenen en beschermende bril. Omdat een vluchtig anestheticum (isofluran) wordt gebruikt en na langdurige blootstelling depressie van het centrale zenuwstelsel en cardiovasculaire toxiciteit bij mensen kan veroorzaken, voer de procedure uit in een goed geventileerde omgeving. Voedsel en drinken mogen niet het laboratorium binnengebracht worden en zorg ervoor dat stromend water altijd gemakkelijk toegankelijk is.
- Behandel alle scherpe voorwerpen, inclusief spuitnaalden, scheermesjes en microschaar, zorgvuldig en gooi ze direct na gebruik weg in aangewezen scherpe containers; Onder geen enkele omstandigheid mogen wegwerpvoorwerpen worden hergebruikt.
- Behandel alle biologische monsters (bijv. verzamelde lymfe) en dierlijke lichaamsvloeistoffen (bijv. bloed) als potentieel gevaarlijk, en behandel alle verzamelapparatuur zorgvuldig terwijl je monsters uit de buurt van het operatiegebied houdt. In het geval van een accidentele naaldprik of huidcontact met gevaarlijke stoffen, was het getroffen gebied onmiddellijk met zeep en water en meld het incident volgens de veiligheidsprotocollen van de instelling.
2. Voorbereiding op de dag voor de operatie
- Vasten of voed de ratten volgens de eisen van het specifieke experiment. Dit protocol verplicht geen specifieke vasten- of gevoede staat.
- Bereid een antistollingsoplossing voor door heparine of ethylenediaminetetraazijnzuur (EDTA) te verdunnen tot een eindconcentratie van 10 IU/mL. Laad dit mengsel (ongeveer 0,7 mL) vooraf in een 1 mL steriele insulinespuit voorzien van een 30 G naald, om het binnenoppervlak van de polyethyleen (PE) canule (gebruikt voor lymfebuiscannulatie) voor te coaten. Bewaar dit bereide mengsel onder steriele omstandigheden tot gebruik.
- Bereid canules voor voor lymfemonsterafname door een PE-canule in een kop-tot-staart-configuratie te monteren, met 0,5 mm buitendiameter (OD), 0,3 mm binnendiameter (ID) buis voor beide terminalsecties en 0,6 mm OD, 0,5 mm ID-buis voor het middengedeelte.
- Snijd de canulesegmenten in lengtes van 2 cm voor het proximale deel dat met de spuitnaald verbonden is, 40 cm voor het middelste gedeelte en 8 cm voor het distale gedeelte dat bedoeld is voor cannulatie.
- Snijd en schuin het distale uiteinde van de canule onder een hoek van ongeveer 45° om een soepele inbreng in de cervicale lymfebuis te vergemakkelijken. Zie Figuur 2 voor een gedetailleerde illustratie van de canule-assemblage.
OPMERKING: Deze afschuining vergemakkelijkt een soepele inbreng in de lymfebuis en vermindert het risico op blokkades door de effectieve dwarsdoorsnede te vergroten. Na succesvolle cannulatie wordt het proximale (2 cm) gedeelte losgekoppeld en wordt lymfe direct verzameld vanaf het blootgestelde uiteinde van het middelste gedeelte (zoals in detail beschreven in stap 4.9 en 4.10).
Figuur 2: Schematisch diagram van de canule-assemblage (niet op schaal). Het diagram illustreert de afmetingen van elk onderdeel van de geassembleerde PE-buis die is gebruikt om de canule te bouwen. Van links naar rechts zal de samengestelde canule hierna respectievelijk het proximale uiteinde, het middelste deel en het distale uiteinde worden genoemd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Bereid het anesthesieinhalatiesysteem voor door vloeibare isofluraan vooraf in de onder druk staande container te laden die is uitgerust met een verdamper. Voer voor gebruik een testrun (priming) uit van de vaporizer om de luchtdichtheid te bevestigen en een stabiele en consistente gasstroom te garanderen.
- Indien nodig, bereid de testmedicijnkandidaat voor in een geschikt voertuig. Voer stabiliteitsstudies uit om de integriteit van de formulering tijdens opslag en gedurende de toedieningsperiode te bevestigen. Voeg aanvullende middelen toe (bijv. biologische kleurstoffen zoals Evans Blue) waar van toepassing.
- Bereid de containers voor op lymfeafname door steriele microcentrifugebuizen vooraf te wegen en hun begingewicht te registreren. Label elke buis achtereenvolgens volgens de geplande verzameltijden (bijvoorbeeld uurlijke intervallen). Voeg geconcentreerde heparine (of EDTA) toe aan elke buis en verwijder het oplosmiddel door stikstofblowdown-verdamping, waarbij 2 tot 5 IE gedroogde heparine (of EDTA) per buis overblijft om ongelijkmatige verdunning van de verzamelde lymfe te voorkomen.
3. Voorbereidingen direct voorafgaand aan de operatie
- Controleer de openheid van elke canule door te spoelen met de voorbereide antistollingsoplossing. Verbind een spuit aan het proximale uiteinde van de samengestelde canule en laat voorzichtig een klein volume oplossing los. Zorg ervoor dat de oplossing soepel uit het distale uiteinde verlaat zonder tekenen van lekkage. Als lekkage wordt gedetecteerd, zoals meestal wordt aangegeven door vloeistof die ontsnapt bij het aansluitpunt(en), verwijder dan de gehele canule-assemblage en bouw een nieuwe volgens stap 2.3.
OPMERKING: Deze stap bedekt tegelijkertijd het binnenoppervlak van de canule vooraf met antistollingsmiddel (deze stap kan ook de dag voor de operatie worden uitgevoerd, zodat de canule 's nachts wordt voorbekleed). - Begin ongeveer 5 minuten voor de start van de operatie met het toedienen van ingeademde isoflurane via een neus-kegelmasker. Houd de verdoving gedurende de hele procedure met een toedieningssnelheid van 0,4 tot 0,6 L/min onder een druk van 101,3 kPa bij 20 °C. Zorg voor diepte van de anesthesie door de teenknellingsrespons te beoordelen.
- Houd continu de diepte van de anesthesie in de gaten. Laat de rat onmiddellijk inslapen als er tekenen van stress of fysiologische instabiliteit worden waargenomen.
- Plaats de rat op rugligging op een verwarmd chirurgisch pad dat op 37 °C wordt gehouden. Kantel het hoofd en strek de nek uit, met indien nodig een kleine steun (kussen), om de blootstelling van het baarmoederhalsgebied te maximaliseren. Bevestig het hoofd in het anesthesiemasker om continue toediening van isofluraan te garanderen en bind de voorpoten voorzichtig vast met elastiekjes of chirurgische tapes om beweging tijdens de procedure te minimaliseren.
- Spoel de vacht over het baarmoederhalsgebied met steriele normale zoutoplossing om het scheren te vergemakkelijken. Scheer de gehele operatieplek grondig (met een dubbelzijdig veiligheidsscheermesje), meestal de nek- en sleutelbeenregio, om volledige verwijdering van de vacht vóór de incisie te garanderen (zie Figuur 3A voor een voorbeeld van het afgeschoren nekgebied).
- Maak het hele afgeschoren gebied schoon met desinfectiemiddelen, zoals een jodiumhoudend middel.
- Markeer de operatielocatie door een stippellijn van 2,5 cm te tekenen om de lengte van de initiële incisie te bevestigen. Plaats de lijn iets rechts van de middenlijn van het lichaam van de rat. Plaats het bovenste uiteinde van de incisie ongeveer 1 tot 1,5 cm onder de onderlip (zie Figuur 3B voor een voorbeeld van de incisieplaats, met metingen ondersteund door een liniaal).
Figuur 3: Voorbereiding van de operatieplaats. (A) Het nekgebied wordt afgeschoren ter voorbereiding op de incisie; (B) de geschatte lengte en locatie van de incisie, aangegeven door de 2,5 cm stippellijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Annulatie van de cervicale lymfebuis
- Plaats de rat met zijn kop naar de bediener gericht. Gebruik hiervoor een microscoop vanwege de relatief kleine diameter van de cervicale lymfebuis.
- Met een steriel scalpel snijd je zorgvuldig de oppervlakkige laag van de cervicale spier in langs de eerder genoemde 2,5 cm lange markering, bijna parallel aan de middenlijn (zie Figuur 4A voor de geopende oppervlakkige huidlaag).
- Scheid voorzichtig de overige spierlagen, voornamelijk de oppervlakkige cervicale fascia, om de cervicale arterie bloot te leggen, die meestal te onderscheiden is door zijn rode kleur.
- Trek de sternomastoideus en submandibulaire klier terug en kantel ze voorzichtig weg van het operatieveld om de identificatie van de cervicale lymfebuis te vergemakkelijken. Gebruik een weefselexpander om het operatievenster te behouden en gebruik een wattenstaafje om het spierweefsel tijdelijk apart te houden terwijl je de lymfeklier en de bijbehorende lymfebuis lokaliseert. Zorg ervoor dat de weefselexpander gedurende het hele canulatieproces op zijn plaats zit (zie Figuur 4B voor het geopende operatievenster met de weefselexpander op zijn plaats).
- Lokaliseer de cervicale lymfebuis (bij voorkeur onder een microscoop): De buis verschijnt als een ondoorzichtig, kleurloos vat met een diameter van ongeveer 0,2 tot 0,5 mm en loopt direct parallel aan de halsslagader. Een of meer aangrenzende, vleeskleurige dCLN's zijn vaak te zien langs het verloop van de cervicale lymfebuis (zie Figuur 4C voor een microscopisch beeld van de blootgestelde diepe cervicale lymfebuis en een aangrenzende dCLN).
OPMERKING: De cervicale lymfekanalen hebben doorgaans een kleur die sterk lijkt op die van het omliggende weefsel, en hun identificatie vereist vaak zorgvuldige inspectie, vooral bij ratten met meer vetweefsel. Voor chirurgische praktijkdoeleinden (maar niet voor studies naar lymfatisch transport van geneesmiddelen of endogene stoffen) kan Evans Blue aan het begin van de operatie subcutaan onder de nek worden geïnjecteerd, zodat de cervicale lymfebuis beter zichtbaar is wanneer de kleurstof via de lymfecellen wegloopt. - Met een paar stompe pincetten laat je voorzichtig door het gescheiden bindweefsel gaan en houd je de tang op zijn plaats zodat de cervicale lymfebuis duidelijk zichtbaar blijft in het operatieveld.
- Isoleer zorgvuldig de cervicale lymfebuis van het omliggende bind- en vetweefsel door een stomp dissectie, waarbij je extra goed oplet om schade te voorkomen, omdat het vat extreem fragiel is.
- Gebruik een micro-schaar om een kleine incisie te maken in de bovenste helft van het blootgestelde kanaal. Koppel het kanaal niet volledig los; de twee helften moeten intact blijven.
- Controleer of de voorbereide canule, vooraf bedekt met antistollingsoplossing (zoals beschreven in stap 2.3), vrij is van luchtbellen door een voorzichtige spoeling uit te voeren. Grijp direct voor het plaatsen voorzichtig het distale uiteinde van de canule met een tang, zodat het afgeschuinde vlak omhoog wordt gericht. Vervolgens schuif je de canule voorzichtig ongeveer 2 mm in het kanaal door de incisie, richt je hem naar de kop (zie Figuur 4D voor een illustratie van succesvolle cannulatie). De daadwerkelijke diepte van de inbreng kan variëren afhankelijk van de individuele rat.
OPMERKING: Omdat de invoeging van de canule bij deze procedure relatief ondiep is, kan een extra fixatiepunt aan het omliggende gebied nuttig zijn. Dit wordt bereikt door een kleine secundaire huidpunctie (gaatje) ongeveer 1,5 cm van het chirurgische venster te maken met behulp van een schaar. Deze opening wordt verder gestabiliseerd in volgende stappen (bijvoorbeeld met hechting of lijm). Figuur 4E toont deze stap in de context van het gebruik van weefsellijm. De canule moet door het gat worden gehaald om te helpen bij het vastzetten van de positie. - Koppel de insulinespuit samen met het korte (2 cm) proximale segment van de canule los van de rest van de canule. Lymfe kan vervolgens direct worden verzameld vanaf het blootgestelde proximale uiteinde van het middelste segment met een grotere diameter. Monitor de distale punt van dit verzamelsegment gedurende 1–2 minuten. Bevestig een succesvolle canulatie door een zichtbare, langzame en gestage uitstroom van lymfevocht uit de gecanuleerde buis.
- Zodra de canulatie succesvol is bevestigd, wordt de canule vastgezet door een klein druppeltje cyanoacrylaatweefseladhesief aan te brengen met een pipet, zowel bij de incisie in de lymfebuis als bij het secundaire fixatiegat (zie Figuur 4E voor een demonstratie van de canulefixatie). Wees extra voorzichtig om te voorkomen dat het vat wordt verstopt of de lymfestroom wordt belemmerd.
- Observeer de lymfestroom enkele minuten om een gestage uitstroom te bevestigen (er vormt zich meestal binnen een minuut een zichtbare druppel aan het uiteinde van de canule). Na verificatie verwijder je voorzichtig de weefselexpander uit het operatievenster en plaats je de submandibulaire klier terug op de oorspronkelijke plek.
- Bevestig een vooraf gelabelde, met antistollingsmiddelen gecoate microcentrifugebuis (zie Stap 2.6) aan het distale uiteinde van de canule om de vrij stromende lymfe op te vangen.
Figuur 4: Canulatie van de cervicale lymfebuis. (A) Incisieplaats in de nekregio; (B) het operatievenster werd geopend met een weefselexpander op zijn plaats en de submandibulaire klier naar rechts teruggetrokken; (C) cervicale lymfebuis en één dCLN onder een microscoop gevisualiseerd. (D) Geslaagde cannulatie, aangegeven door de groene stippellijn (microscopisch aanzicht). (E) Weefsellijm werd aangebracht op de incisieplaats en er werd een secundaire huidpunctie gemaakt met een pipet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. Postoperatieve periode en medicijntoediening
- Na voltooiing van de cannulatie van de cervicale lymfebuis worden alle spierlagen opnieuw geplaatst op hun oorspronkelijke locatie. Sluit vervolgens de huidincisie met hechtingen en/of weefsellijm; typisch kan een incisie van 2,5 cm lang correct worden gesloten met 8 hechtingen (zie Figuur 5A voor een chirurgisch venster dat met hechting is gesloten). Verwijder na voltooiing van deze stap de beperkende elastiek(en) of chirurgische tapes op de voorpoten.
- Geef medicijnen in het CSF via een passende route, zoals intracisterna magna (ICM), intra-cerebroventriculaire (ICV) of lumbale intrathecale (LIT) injectie. Met ICM-toediening als voorbeeld, identificeer de injectieplaats bij de cisterna magna, gelegen aan de basis van de schedel en zichtbaar als de enige zachte deuk op het dorsale oppervlak. Scheer de omliggende vacht indien nodig om visualisatie te vergemakkelijken (zie Figuur 5B voor een gemarkeerd geschikt gebied voor ICM-injectie).
OPMERKING: Om de intracraniële druk (ICP) tijdens ICM-injectie te behouden, wordt vaak een gelijkwaardig volume CSF ontnomen vóór toediening van het medicijn. Het wordt aanbevolen om een nieuwe, vooraf gevulde spuit te gebruiken voor de injectie. Het buigen van de spuitnaald kan het toedienen vergemakkelijken (zie Figuur 5C voor een demonstratie van ICM-injectie met een gebogen spuitnaald). - Houd de rat op rugligging op het verwarmde chirurgische pad (gehouden op 37 °C) om de lichaamstemperatuur na injectie en gedurende de monsterverzamelperiode te behouden.
Figuur 5: Behandeling na de operatie. (A) Gesloten incisieplaats met zijdehechting. (B) Ongeveer locatie van cisterna magna met omliggende vacht afgeschoren. (C) ICM-toediening van een medicijnkandidaat met een insulinespuit en een gebogen naald. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
6. Verzameling van lymfemonsters en analyse
- Verzamel lymfe continu in met antistollingsmiddelen gecoate microcentrifugebuizen, waarbij de buizen op vooraf bepaalde intervallen (meestal elk uur) worden verplaatst. Bewaar de verzamelde monsters met koelzakken in een koelbox. Zie Figuur 6 voor een verzameld cervicale lymfemonster in een microcentrifugebuis.
- Na voltooiing van het lymfeafnameproces euthanasen de rat humaniaal volgens de juiste protocollen.
- Bepaal de lymfestroomsnelheid door het volume lymfe te meten dat tijdens elk gepland interval (per uur) wordt verzameld.
- Meet de concentraties van geneesmiddelen (of interessante stoffen) in de lymfe met behulp van passende analysemethoden, waaronder HPLC, HPLC-MS of commercieel verkrijgbare assaykits, om hun clearancekinetiek uit het CZS via het lymfestelsel te karakteriseren.
- Bereken het lymfatische geneesmiddelmassatransport door de gemeten medicijnconcentraties te vermenigvuldigen met de bijbehorende lymfevolumes.
Figuur 6: Lymfemonsterafname. Foto van één verzameld monster (ca. 100 μL) in een microcentrifugebuis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
7. Behandeling na de procedure en afvalverwijdering
- Bewaar tijdelijk geëuthanaseerde ratten in aangewezen medische afvalcontainers binnen een speciale koelopslagruimte (bijvoorbeeld een koelkast) totdat ze zijn opgehaald en afgevoerd door een professioneel team voor de verwerking van medisch afval.
- Verzamel alle weggegooide scherpe voorwerpen in een aangewezen vuilnisbak, gescheiden van al het andere afval.
- Gooi alle andere niet-scherpe voorwerpen die in het experiment zijn gebruikt (bijv. wattenstaafjes, elastiekjes, PE-canules) weg in medische afvalzakken, en gooi deze niet weg met huishoudelijk of algemeen afval. Zorg ervoor dat er geen scherpe voorwerpen in deze tas worden gedaan.
- Maak alle resterende herbruikbare hulpmiddelen schoon en desinfecteer volgens laboratoriumprotocollen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een representatieve dataset van uurlijke lymfestroomsnelheden (mL/h) werd verkregen met behulp van het cervicale lymfecanulatiemodel (zie Figuur 7 voor de bijbehorende grafiek). In dit experiment met drie (n = 3) studieratten werd lymfe continu verzameld in microcentrifugebuizen, die elk uur over een periode van 6 uur werden vervangen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol stelt een reproduceerbare methode vast voor het canuleren van de cervicale lymfebuis bij ratten, waardoor continue lymfeverzameling over langere periodes mogelijk is. Met voldoende microchirurgische training kan de procedure efficiënt worden uitgevoerd en levert het consistente lymfemonsters op onder stabiele fysiologische omstandigheden, onderhouden door continue anesthesie, waardoor het geschikt is voor routinematig experimenteel gebruik. Eenmaal beheerst duurt de chirurgi...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs geven aan dat zij geen bekende concurrerende financiële belangen of persoonlijke relaties hebben die het werk in dit artikel zouden kunnen beïnvloeden.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken oprecht de heer Zhenglin Hao en mevrouw Jie Zhao van het Animal Experimental Centre van de China Pharmaceutical University voor hun steun bij het uitvoeren van dierproeven.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 30 gauge needle | Yushou Health | Gebruikt voor het verbinden van het proximale uiteinde van canule (0503) met de heparine spuit | |
| Anaesthesiedispenser met verdamper | YYUN Instrument Company | ||
| Blunt forceps | RWD Life Science | F22002-10 | |
| Wattenstaafjes | Qingdao Shultz Biotechnology | MQ-02 | Wordt gebruikt om spierweefsel tijdelijk op zijn plaats te houden |
| Verwarmde chirurgische pad | Shanghai Yiheng Instruments | Afmeting 15 × 20 cm | |
| Heparine natrium | Shanghai Aladdin Biochemical Technology | H123383 | Verdunning vereist voor gebruik |
| Insulien spuit (1 mL) | Yushou Health | U100-1ML | Alleen gebruikt voor heparine pre-coating |
| Isofluraanoplossing voor inhalatie | RWD Life Science | R510-22-10 | Gebruikt voor anesthesie via verdamper |
| Markeerstiften | Elk merk | N/A | |
| Micro-centrifugebuis (1,5 mL) | Nantong Hairui Experimental Equipment | HR10003 | Gebruikt voor het verzamelen van lymfe |
| Micro-schaar | RWD Life Science | GD234BA0007925 | |
| Nylon chirurgische hechting | Shanghai Yiheng Instruments | 4-0 35CM | |
| Pipet (volume instelbaar, meetbereik 5 tot 50 μL) | Dragon Laboratory Instruments Limited | 7030301006 | Gebruikt alleen voor het meten van weefselkleefstof |
| Pipet tips | Biosharp Life Sciences | BS-10-T | Gebruikt alleen voor het overbrengen van weefselkleefstof, geen specifiek vereist volume |
| Polyethyleen (PE) canule 0,5 mm OD, 0,3 mm ID (0503) | AniLab Scientific Instruments(Ningbo) | PE-0503 | |
| Polyethyleen (PE) canule 0,6 mm OD, 0,5 mm ID (0605) | AniLab Scientific Instruments(Ningbo) | PE-0605 | |
| Veiligheidsschaafmesjes | Gillette Shanghai | Q31/0115000301C004 | Gebruikt alleen voor het scheren van vacht |
| Elastiek | Elk merk | N/A | Gebruikt voor het vasthouden van de voorpoten van ratten |
| Liniaal | Elk merk | N/A | |
| Scapel mesjes (#23) | RWD Life Science | S31010-01 | |
| Natriumchloride (0,9%) oplossing voor infusie | Shijiazhuang No. 4 Pharmaceutical | H20066533 (goedkeuringsnummer) | Gebruikt alleen voor het spoelen van vacht |
| Sprague-Dawley ratten | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology | 101 | Gewicht 220 tot 250 gram, geen leeftijdsvereiste |
| Chirurgische lamp | Beijing Heo Bio-Tech | XHA011-1 | |
| Chirurgische microscoop | Shanghai Cewei Optoelectronic Technology | SMZ755T | Dissectiemicroscoop zonder mechanische standaard, kan worden uitgerust met een intrekbare standaard |
| Weefselkleefstof | 3M Vetbond | 1469SB | Hoofdbestanddeel cyanoacrylaat |
| Weefselexpander (Colibri) | RWD Life Science | R22029-04 | Uitbreidingsbereik 20mm/4cm |
Referenties
- Hu, D., et al. Lymphatic system identification, pathophysiology and therapy in the cardiovascular diseases. J Mol Cell Cardiol. 133 (1), 99-111 (2019).
- Breslin, J. W., et al. Lymphatic vessel network structure and physiology. Compr Physiol. 9 (1), 207-299 (2018).
- Moore, J. E. Jr, Bertram, C. D. Lymphatic system flows. Annu Rev Fluid Mech. 50, 459-482 (2018).
- Dupont, G., et al. Our current understanding of the lymphatics of the brain and spinal cord. Clin Anat. 32 (1), 117-121 (2019).
- Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. J Exp Med. 212 (7), 991-999 (2015).
- Xu, J., et al. The lymphatic system: a therapeutic target for central nervous system disorders. Neural Regen Res. 18 (6), 1249-1256 (2023).
- Raper, D., Louveau, A., Kipnis, J. How do meningeal lymphatic vessels drain the CNS. Trends Neurosci. 39 (9), 581-586 (2016).
- Louveau, A., et al. Understanding the functions and relationships of the glymphatic system and meningeal lymphatics. J Clin Invest. 127 (9), 3210-3219 (2017).
- Salvador, A. F. M., Abduljawad, N., Kipnis, J. Meningeal lymphatics in central nervous system diseases. Annu Rev Neurosci. 47 (1), 323-344 (2024).
- Guo, X., et al. Emerging roles of meningeal lymphatic vessels in Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 94 (S1), S355-S366 (2023).
- Mestre, H., et al. Cerebrospinal fluid influx drives acute ischemic tissue swelling. Science. 367 (6483), eaax7171(2020).
- Da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
- Zou, W., et al. Blocking meningeal lymphatic drainage aggravates Parkinson's disease-like pathology in mice overexpressing mutated α-synuclein. Transl Neurodegener. 8 (1), 7(2019).
- Wu, C., et al. Tauopathy after long-term cervical lymphadenectomy. Alzheimers Dement. 21 (4), e70136(2025).
- Fang, Y., et al. A new perspective on cerebrospinal fluid dynamics after subarachnoid hemorrhage: from normal physiology to pathophysiological changes. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (4), 543-558 (2022).
- Yen, Y. H., Chen, M. W., Lim, J. X., Chew, K. Y. Exploring lymphovenous anastomosis for Alzheimer's disease: addressing brain lymphatic dysfunction, feasibility, and outcome metrics. Plast Reconstr Surg. , (2025).
- Rubenstein, J., Ferreri, A. J., Pittaluga, S. Primary lymphoma of the central nervous system: epidemiology, pathology and current approaches to diagnosis, prognosis and treatment. Leuk Lymphoma. 49 (1), 43-51 (2008).
- Camilleri-Broët, S., et al. A uniform activated B-cell-like immunophenotype might explain the poor prognosis of primary central nervous system lymphomas: analysis of 83 cases. Blood. 107 (1), 190-196 (2006).
- Papadopoulos, Z., Herz, J., Kipnis, J. Meningeal lymphatics: from anatomy to central nervous system immune surveillance. J Immunol. 204 (2), 286-293 (2020).
- Hoang, T. A., et al. Development and application of a novel cervical lymph collection method to assess lymphatic transport in rats. Front Pharmacol. 14 (1), 1111617(2023).
- Licastro, E., et al. Glymphatic and lymphatic communication with systemic responses during physiological and pathological conditions in the central nervous system. Commun Biol. 7 (1), 229(2024).
- Sarker, A., et al. Intrathecal [(64)Cu]Cu-albumin PET reveals age-related decline of lymphatic drainage of cerebrospinal fluid. Sci Rep. 13 (1), (2023).
- Khang, M., et al. Intrathecal delivery of nanoparticle PARP inhibitor to the cerebrospinal fluid for the treatment of metastatic medulloblastoma. Sci Transl Med. 15 (720), eadi1617(2023).
- Pizzo, M. E., et al. Intrathecal antibody distribution in the rat brain: surface diffusion, perivascular transport and osmotic enhancement of delivery. J Physiol. 596 (3), 445-475 (2018).
- Yan, J., et al. Lymphatic clearance is the main drainage route of lamotrigine-loaded micelles following delivery to the brain. J Pharm Pharmacol. 71 (10), 1488-1496 (2019).
- Ringstad, G., Eide, P. K. Glymphatic-lymphatic coupling: assessment of the evidence from magnetic resonance imaging of humans. Cell Mol Life Sci. 81 (1), 131(2024).
- Pan, W. R., Suami, H., Taylor, G. I. Lymphatic drainage of the superficial tissues of the head and neck: anatomical study and clinical implications. Plast Reconstr Surg. 121 (5), 1614-1624 (2008).
- Bou-Assaly, W. The forgotten lymph nodes: review of the superficial head and neck lymphatic system. Radiol Imaging. 1 (1), 9-13 (2016).
- Yağmurlu, K., et al. Anatomical features of the deep cervical lymphatic system and intrajugular lymphatic vessels in humans. Brain Sci. 10 (12), 953(2020).
- Suami, H., Scaglioni, M. F. Lymphatic territories (lymphosomes) in the rat: an anatomical study for future lymphatic research. Plast Reconstr Surg. 140 (5), 945-951 (2017).
- Zawieja, D. C., et al. Lymphatic cannulation for lymph sampling and molecular delivery. J Immunol. 203 (8), 2339-2350 (2019).
- Hoang, T. A., et al. Quantifying the lymphatic transport of model therapeutics from the brain in rats. Mol Pharm. 21 (5), 2473-2483 (2024).
- Hoang, T. A., et al. Acute neuroinflammation alters the transport of a model therapeutic protein from the brain into lymph and blood. Mol Pharm. 21 (10), 5138-5149 (2024).
- Maloveska, M., et al. Dynamics of Evans blue clearance from cerebrospinal fluid into meningeal lymphatic vessels and deep cervical lymph nodes. Neurol Res. 40 (5), 372-380 (2018).
- Trevaskis, N. L., et al. The mesenteric lymph duct cannulated rat model: application to the assessment of intestinal lymphatic drug transport. J Vis Exp. (97), e52389(2015).
- Gakuba, C., et al. General anesthesia inhibits the activity of the glymphatic system. Theranostics. 8 (3), 710-722 (2018).
- Miao, A., et al. Brain clearance is reduced during sleep and anesthesia. Nat Neurosci. 27 (6), 1046-1050 (2024).
- Bachmann, S. B., et al. Differential effects of anaesthesia on the contractility of lymphatic vessels in vivo. J Physiol. 597 (11), 2841-2852 (2019).
- Ruscic, K. J., Padera, T. P. Silence of the lymphs: some anaesthetic regimens inhibit lymphatic pumping. J Physiol. 597 (11), 2827-2828 (2019).
- Dahan, A., et al. The effect of general anesthesia on the intestinal lymphatic transport of lipophilic drugs: comparison between anesthetized and freely moving conscious rat models. Eur J Pharm Sci. 32 (4), 367-374 (2007).
- de Jong, W. H., et al. Long-term cannulation of the vena cava of rats for blood sampling: local and systemic effects observed by histopathology after six weeks of cannulation. Lab Anim. 35 (3), 243-248 (2001).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
