Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
Deze studie identificeert een verminderde diversiteit van darmmicrobiota en veranderde metabole routes bij type 2 diabetes (T2DM), waarbij verhoogde proteobacteriën en minder gunstige taxa worden benadrukt, wat suggereert dat microbiële dysbiose geassocieerd is met T2DM en mogelijk bijdraagt aan de pathofysiologie ervan.
De wereldwijde toename van type 2 diabetes mellitus (T2DM) benadrukt de noodzaak om de onderliggende biologische mechanismen beter te begrijpen, met name die met interacties tussen gastheer en microbioom. Deze studie had als doel de darmmicrobiële diversiteit, taxonomische samenstelling en voorspelde metabole routes te karakteriseren bij nieuw gediagnosticeerde T2DM-patiënten in vergelijking met de niet-diabetisch gematchte (NM) groep. Verse ontlastingsmonsters werden geanalyseerd met 16S rDNA-sequencing. Alfa-diversiteit (Chao-, ACE-, Shannon- en Simpson-indices) en bèta-diversiteit werden berekend om de structuur van microbiële gemeenschappen te beoordelen. Taxonomische verschillen werden geëvalueerd met behulp van Wilcoxon rangsomtests en de grootte van de effectgrootte van lineaire discriminante analyse (LEfSe). Functionele padvoorspelling werd uitgevoerd met fylogenetisch onderzoek van gemeenschappen door reconstructie van niet-waargenomen toestanden (PICRUSt2) op basis van KEGG- en MetaCyc-annotaties. Mendeliaanse randomisatie (MR) analyse, inclusief inverse variantieweging, MR-Egger en gewogen mediaanmethoden, werd toegepast om genetisch voorspelde associaties tussen microbiële taxa en T2DM te beoordelen. De resultaten toonden een verminderde microbiële rijkdom, zoals blijkt uit lagere Chao- en ACE-indices, en een veranderde diversiteitsstructuur, zoals blijkt uit lagere Shannon- en hogere Simpson-indices, bij T2DM-patiënten, vergezeld van significante samenstellingsverschuivingen. Er werden een toename van de relatieve abundantie van Proteobacteriën en een afname van nuttige taxa zoals Lachnospiraceae en Blautia waargenomen. Functionele voorspelling wees op een verminderde abundantie van routes gerelateerd aan de niet-oxidatieve pentosefosfaatroute, isobutanolbiosynthese en L-isoleucine-biosynthese. MR-analyse leverde complementair bewijs dat associaties ondersteunt tussen specifieke microbiële taxa en T2DM-gevoeligheid. Samenvattend wordt T2DM geassocieerd met een verminderde microbiële rijkdom, veranderde diversiteitsstructuur en duidelijke taxonomische en functionele veranderingen. Deze bevindingen benadrukken de relevantie van darmmicrobiota in T2DM en ondersteunen het potentiële nut van microbiome-gebaseerde biomarkers en therapeutische strategieën. Verdere studies zijn nodig om deze bevindingen te valideren en de onderliggende mechanismen te verduidelijken.
Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is een van de snelst groeiende chronische ziekten ter wereld geworden, gedreven door snelle verstedelijking, verwesterde eetpatronen en steeds meer zittende levensstijlen 1,2. Het is een belangrijke bijdrage aan wereldwijde morbiditeit en mortaliteit en legt een aanzienlijke last op de volksgezondheidmet zich mee. Hoewel genetische vatbaarheid een rol speelt, benadrukt de snelle stijging van de incidentie van T2DM het belang van omgevings- en metabole determinanten4. Het identificeren van aanpasbare biologische mechanismen is daarom essentieel voor het verbeteren van vroege detectie- en preventiestrategieën. Recente ontwikkelingen hebben de darmmicrobiota geïdentificeerd als een belangrijke regulator van metabole homeostase5. Het darmmicrobiële ecosysteem beïnvloedt de glucosestofwisseling, immuunfunctie, integriteit van de darmbarrière en chronische laaggradige ontstekingen, die allemaal centraal staan in de pathogenese van T2DM6. Dysbiose is in verband gebracht met obesitas, insulineresistentie, endotoxemie en veranderde energiebalans, wat wijst op een mechanistisch verband tussen microbiële veranderingen en ziekteprogressie7. Daarnaast zijn microbiële metabolieten, waaronder korteketenvetzuren, galzuren en vertakte aminozuren, betrokken bij het moduleren van insulinegevoeligheid en gastheermetabolisme8.
Hoewel het verzamelen van bewijs de rol van het darmmicrobioom in T2DM ondersteunt, steunen de meeste bestaande studies op observationele ontwerpen, die causale inferentie beperken. Alternatieve benaderingen, zoals shotgun-metagenomica en gerichte metabolomics, kunnen functionele inzichten met hogere resolutie bieden, maar worden vaak beperkt door kosten, computationele complexiteit en beperkte haalbaarheid in verkennende of pilot-scale studies. Daarentegen is 16S rDNA-sequencing een kosteneffectieve, breed toegepaste methode om de samenstelling van microbiële gemeenschappen te profileren, hoewel de taxonomische resolutie beperkt is tot soortniveau en functionele metabolieten niet direct kan kwantificeren. Daarom werd 16S rDNA-sequencing geselecteerd voor deze studie als een kosteneffectieve, schaalbare aanpak geschikt voor verkennende klinische cohorten, terwijl integratie mogelijk is met downstream functionele voorspelling en complementaire analytische kaders. Daarom kan het integreren van 16S-gebaseerde microbiële profilering met bio-informatica, functionele voorspelling en complementaire benaderingen zoals Mendeliaanse randomisatie (MR) een evenwichtig kader bieden om zowel compositie- als mogelijk causale relaties te verkennen.
Opmerkelijk is dat er relatief weinig data is die zich specifiek richten op nieuw gediagnosticeerde, behandelingsnaïeve T2DM-patiënten. In dergelijke populaties worden microbiële veranderingen minder vaak verstoord door farmacologische interventies, met name metformine, waarvan bekend is dat het de samenstellingen functie van het darmmicrobiota aanzienlijk kan veranderen. Dit vormt een belangrijke leemte in de huidige literatuur, aangezien veel bestaande studies heterogene patiëntenpopulaties met uiteenlopende behandelingsblootstelling en beperkte integratie van microbioomprofilering met genetisch geïnformeerde analytische benaderingen bevatten.
In deze context was de huidige studie bedoeld om de diversiteit van darmmicrobiota, taxonomische samenstelling en voorspelde functionele routes te karakteriseren bij nieuw gediagnosticeerde T2DM-patiënten in vergelijking met de NM-groep, met gebruik van 16S rDNA-sequencing en bio-informatische analyse. Daarnaast werd Mendeliaanse randomisatie toegepast met behulp van publiek beschikbare genoombrede associatiegegevens om potentiële genetisch voorspelde verbanden tussen specifieke microbiële taxa en T2DM-risico te onderzoeken. Deze gecombineerde analytische strategie maakt complementaire inzichten mogelijk uit microbiële gemeenschapsprofilering en genetische data op populatieniveau. Specifiek biedt 16S rDNA-sequencing directe karakterisering van de microbiële samenstelling in de studiepopulatie, terwijl Mendeliaanse randomisatie genetische instrumenten uit onafhankelijke cohorten gebruikt om te beoordelen of waargenomen associaties consistent zijn met genetisch voorspelde relaties. Deze integratie is bedoeld om een belangrijke beperking van observationele microbiomestudies aan te pakken door complementair bewijs te leveren dat de robuustheid van microbiota–T2DM-associaties ondersteunt. Daarom is het integreren van deze benaderingen bedoeld om kruisvalidatie te bieden in plaats van redundantie, waardoor de interpreteerbaarheid van microbiota–T2DM-associaties wordt versterkt.
De huidige studie richt zich op drie aspecten. Ten eerste evalueert het veranderingen in darmmicrobiota bij nieuw gediagnosticeerde, therapie-naïeve T2DM-patiënten om verstoringen door farmacologische interventies te verminderen. Ten tweede integreert het taxonomische profilering met voorspelde functionele routes om een systeemniveau beeld te bieden van microbiota-geassocieerde metabole veranderingen. Ten derde maakt het gebruik van Mendeliaanse randomisatieanalyse om te beoordelen of waargenomen associaties consistent zijn met genetisch voorspelde relaties, waardoor methodologische triangulatie wordt geboden. Gezamenlijk bieden deze aspecten een complementair en reproduceerbaar kader voor microbioomanalyse in plaats van een puur beschrijvende studie, waarmee dit werk wordt onderscheiden van eerdere studies die doorgaans vertrouwen op observationele ontwerpen met één methode en microbiële profilering, functionele voorspelling en genetisch geïnformeerde inferentie niet integreren binnen een uniform analytisch kader.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Alle procedures waarbij menselijke deelnemers betrokken waren, werden beoordeeld en goedgekeurd door de Ethische Commissie van het Chongqing Chenjiaqiao Ziekenhuis (goedkeuringsnr. 20240131). Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd van alle deelnemers verkregen vóór de monsterafname. Alle ontlastingsmonsters en deelnemersinformatie werden behandeld met behulp van gedeïdentificeerde studiecodes, zoals vermeld in de Materiaaltabel.
Selectie en inschrijving van deelnemers
Nieuw gediagnosticeerde patiënten met T2DM die tussen juni 2023 en december 2023 het Chongqing Chenjiaqiao Ziekenhuis bezochten, werden gescreend op geschiktheid. Deelnemers werden ingeschreven in de DM-groep als ze tussen de 20 en 65 jaar oud waren, een nieuwe diagnose T2DM hadden, akkoord gingen met het afnemen van een verse ontlastingsmonster en de vereiste medische anamnesbeoordeling en klinische onderzoeken afrondden. Gezonde vrijwilligers die in dezelfde periode werden gerekruteerd, werden opgenomen als de niet-diabetisch gematchte (NM) groep en zo nauw mogelijk gekoppeld aan de DM-groep wat betreft leeftijd, geslacht en algemene demografische kenmerken. Deelnemers werden uitgesloten als zij hematologische aandoeningen, aandoeningen van het centrale zenuwstelsel, actieve reumatische ziekte, auto-immuunziekte, acute of chronische gastro-intestinale infectie, chronische diarree, constipatie, actieve of genezende gastro-intestinale ulcer, inflammatoire darmziekte, prikkelbare darmsyndroom, darmtuberculose, gastro-intestinale tumoren, andere maligniteiten, ernstige hartinsufficiëntie, ernstige leverinsufficiëntie, ernstige nierinsufficiëntie, andere ernstige metabole aandoeningen ziekten, ondervoeding, immunodeficiëntie, aangeboren stofwisselingsstoornissen, psychiatrische aandoeningen, gebruik van kalmeringsmiddelen-hypnose of drugsgebruik. Deelnemers werden ook uitgesloten als zij binnen 1 maand voor de ontlasting antibiotica, zuuronderdrukkende middelen, gastro-intestinale motiliteitsmedicijnen, probiotica, glucocorticoïden of immunosuppressiva hadden ontvangen. Daarnaast werden personen die diarree hadden gehad, een gastro-intestinale operatie of gastro-intestinale endoscopie hadden ondergaan, of binnen een maand voor de ontlasting plotselinge veranderingen in leefomgeving of eetgewoonten meldden, uitgesloten. Een unieke studiecode werd aan elke in aanmerking komende deelnemer toegekend vóór het verzamelen van monsters. Uit de in aanmerking komende cohort werden 12 nieuw gediagnosticeerde T2DM- en 12 NM-deelnemers geselecteerd voor downstream 16S rDNA-sequencing en microbiome-analyses op basis van de beschikbaarheid van monsters en de kwaliteit van de sequencing.
Ontlastingsmonsterverzameling en opslag
Elke deelnemer kreeg een container voor het verzamelen van steriele ontlasting voorzien van alleen het label van de toegewezen studiecode om deïdentificatie te waarborgen. Deelnemers kregen de instructie om hun blaas te legen vóór het ontlasten om urinevervuiling te minimaliseren en verse ontlasting direct in de steriele container te verzamelen zonder contact met toiletwater, urine, desinfectiemiddelen of andere mogelijke verontreinigingen. Direct na het verzamelen werd ongeveer 1–2 g ontlasting met een steriele wegwerplepel in een steriele cryogene buis overgebracht. De buis werd stevig afgesloten en direct op droogijs of in een voorgekoelde transfercontainer geplaatst. Alle monsters werden binnen 2 uur na de verzameling naar het laboratorium vervoerd. Bij aankomst in het laboratorium werd de studiecode geverifieerd en werd elke buis geïnspecteerd op lekkage of zichtbare besmetting. Verzamel- en opslagtijden werden voor alle monsters geregistreerd. Ontlastingsmonsters werden vervolgens opgeslagen bij −80 °C tot genomische DNA-extractie. Monsters werden als acceptabel beschouwd voor downstream analyse alleen als ze volledig bevroren bleven tijdens opslag en transport en geen bewijs van buislekkage of externe besmetting vertoonden.
Extractie van genomisch DNA
Ontlastingsmonsters werden uit een −80 °C opslag gehaald en op ijs gelegd vóór de verwerking. Elk monster werd alleen ontdooid totdat homogenisatie mogelijk was om de afbraak die samenhangt met herhaalde vries-dooicycli te minimaliseren. Ongeveer 200 mg ontlasting werd overgebracht in een steriele microcentrifugebuis, en de lysisbuffer die in de ontlasting DNA-extractiekit werd geleverd, toegevoegd volgens de instructies van de fabrikant in de Materiaaltabel. Monsters werden 30 seconden lang krachtig gevortexed om volledige homogenisatie te bereiken en vervolgens 5–10 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd om cellyse te bevorderen. Na de lyse werden monsters gecentrifugeerd op 12.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Het supernatant werd voorzichtig overgebracht in een nieuwe steriele microcentrifugebuis zonder de pellet te verstoren. Genomisch DNA werd vervolgens geëlueerd met behulp van de eluatiebuffer die bij de kit of nucleasevrij water werd geleverd, volgens het protocol van de fabrikant. Het geëxtraheerde DNA werd opgeslagen bij −20 °C voor kortdurend gebruik of bij −80 °C voor langdurige conservering. DNA-monsters die geschikt werden geacht voor downstream analyse leken helder en vrij van zichtbaar deeltjesmateriaal.
DNA-kwaliteitsbeoordeling
De DNA-kwaliteit werd beoordeeld met behulp van agarosegel-elektroforese en fluorescentie-gebaseerde kwantificatie. Een 1% agarosegel werd bereid in een elektroforesebuffer, en de geëxtraheerde DNA-monsters, gemengd met de laadbuffer, werden in de gelputten geladen. Elektroforese werd uitgevoerd totdat de DNA-banden voldoende gescheiden waren, waarna de gel werd onderzocht onder ultraviolet of blauw licht. DNA-integriteit werd als acceptabel beschouwd wanneer een intacte genomische DNA-band werd waargenomen zonder duidelijke degradatie of overmatige uitsmeering. De DNA-concentratie werd vervolgens gekwantificeerd met behulp van een fluorescentiegebaseerd DNA-kwantificatiesysteem. Monsters werden vervolgens verdund tot de concentratie die nodig is voor downstream PCR-versterking. Hoogwaardige DNA-monsters vertoonden doorgaans een duidelijk band op agarosegelelektroforese en waren voldoende geconcentreerd voor latere amplificatieprocedures.
PCR-amplificatie van het 16S rDNA V3–V4-gebied
Het V3–V4 hypervariabele gebied van bacteriële 16S rDNA werd versterkt met barcodeprimers. De primersequenties waren als volgt: voorste primer 5′-ACTCCTACGGGAGGCAG-3′ en achterste primer 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′. PCR-reacties werden op ijs voorbereid in een eindvolume van 20 μL met 4 μL PCR-buffer, 2 μL nucleotidmengsel (2,5 mmol/L), 0,8 μL elk van voor- en omgekeerde primers (5 μmol/L), 0,4 μL hoog-fideliteit DNA-polymerase, 10 ng sjabloon-DNA en nucleasevrij water per volume. Reactiemengsels werden voorzichtig gemengd door pipetten en kort gecentrifugeerd om de vloeistof op de bodem van de buis op te vangen. PCR-versterking werd uitgevoerd met de volgende cyclische condities: initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 5 minuten, gevolgd door 25 cycli denaturatie bij 95 °C gedurende 30 seconden, annealing bij 55 °C gedurende 30 s, en extensie bij 72 °C gedurende 30 s, met een laatste extensiestap bij 72 °C voor 10 minuten. Om amplificatiebias te minimaliseren, werd elk monster in driedubbele reacties versterkt, en werden de resulterende PCR-producten uit hetzelfde monster vervolgens samengevoegd in één buis. Succesvolle versterking werd bevestigd door de aanwezigheid van een duidelijke ampliconband van de verwachte grootte bij agarosegelelektroforese.
PCR-productverificatie en zuivering
PCR-producten werden geverifieerd met 2% agarosegelelektroforese. De gecombineerde PCR-producten van elk monster werden op de gel geladen en elektrofore geplaatst totdat de doel-ampliconbanden duidelijk gescheiden waren. Banden die overeenkwamen met de verwachte amplicongrootte werden verwijderd met een schoon steriel mes en gezuiverd met een gelextractiekit volgens de instructies van de fabrikant in de Materiaaltabel. Gezuiverde PCR-producten werden vervolgens geëlueerd in eluatiebuffer of nucleasevrij water. De concentratie van elk gezuiverd PCR-product werd gekwantificeerd met behulp van een fluorescentiegebaseerd DNA-kwantificatiesysteem, en de concentratiewaarden werden geregistreerd voor de downstream bibliotheekvoorbereiding. Succesvolle versterking en zuivering werden bevestigd door een enkele, heldere band bij de verwachte amplicongrootte bij agarosegel-elektroforese.
Bibliotheekvoorbereiding en pooling
Sequencing-bibliotheken werden voorbereid met behulp van een DNA-bibliotheekvoorbereidingskit volgens de instructies van de fabrikant in de Materiaallijst. Sequencing adapter-sequenties werden geligeerd aan de gezuiverde amplicons volgens de standaard workflow voor bibliotheekvoorbereiding. Adapter-geligeerde producten werden vervolgens gezuiverd met behulp van gelextractie of een op kralen gebaseerde zuiveringsmethode, afhankelijk van het geselecteerde bibliotheekvoorbereidingsprotocol. Gezuiverde bibliotheekproducten werden geëvalueerd met 2% agarosegelelektroforese om de juiste fragmentverdeling te bevestigen. Bibliotheekconcentraties werden gekwantificeerd met behulp van een fluorescentie-gebaseerd DNA-kwantificatiesysteem. Op basis van DNA-concentratie en fragmentgrootte werd elke bibliotheek genormaliseerd naar dezelfde molaire concentratie om een evenwichtige sequencingdiepte over de monsters te waarborgen. Gelijke molaire hoeveelheden individuele bibliotheken werden vervolgens samengevoegd in een verhouding van 1:1 om de uiteindelijke sequencing library pool te genereren. Voorafgaand aan het sequencen werd de gepoolde bibliotheek gedenatureerd volgens het sequencingplatformprotocol voordat de sample werd geladen. Bibliotheken die geschikt werden geacht voor sequencing vertoonden een duidelijke fragmentverdeling binnen het verwachte groottebereik en voldoende concentratie voor downstream sequencinganalyse.
Paired-end sequencing
De uiteindelijke gepoolde bibliotheek werd geladen op een paired-end sequencingplatform volgens de standaard operationele procedures van de fabrikant. Paired-end sequencing werd uitgevoerd met een runconfiguratie van 2 × 250 bp of 2 × 300 bp om voldoende sequencingdiepte te garanderen voor een uitgebreide karakterisering van microbiële diversiteit in elk monster. De sequencingkwaliteit werd gedurende de hele run gemonitord met behulp van door het platform gegenereerde kwaliteitsmetrics. Na voltooiing van de sequencing werden ruwe FASTQ-bestanden met gekoppelde eind voor elk monster geëxporteerd voor downstream bio-informatica-analyse. Sequencingdatasets werden als acceptabel beschouwd wanneer ze voldoende leesdiepte per monster aantoonden, geschikte Q30-kwaliteitsscores en succesvolle barcode-toewijzing.
Ruwe sequentieverwerking
Ruwe FASTQ-bestanden met gepaarde eind werden geïmporteerd in een microbiome-bioinformatica-analysepijplijn voor downstream-verwerking. Sequenties werden gedemultiplexeerd op basis van de barcodes die aan elk monster waren toegewezen. Kwaliteitsfiltering werd vervolgens uitgevoerd om reads te verwijderen met scores van lage kwaliteit, ambigue bases of sequencing-artefacten. Laagwaardige bases aan het einde van reads werden getrimd op basis van kwaliteitsscoreverdeling om de algehele betrouwbaarheid van de sequentie te verbeteren. Na kwaliteitscontrole werden gepaarde uiteindelijke reads samengevoegd over overlappende regio's om volledige reeksen te reconstrueren. Voor latere microbioomanalyses werden alleen hoogwaardige samengevoegde sequenties behouden.
Ampliconsequentievariant (ASV) generatie en taxonomische annotatie
Sequentie-denoising werd uitgevoerd met een gevalideerd denoising-algoritme, waaronder DADA2 of Deblur, om sequencingfouten te corrigeren en de sequentienauwkeurigheid te verbeteren. Chimerische sequenties werden geïdentificeerd en verwijderd tijdens het denoisatieproces. Vervolgens werden voor elk monster representatieve ASV-sequenties en bijbehorende ASV-abundantietabellen gegenereerd. De taxonomische toewijzing van ASV-sequenties werd uitgevoerd met een Naive Bayes-classifier, en taxonomische annotatie werd uitgevoerd op basis van de SILVA 138 referentiedatabase. Taxonomische abundantietabellen werden geëxporteerd op het niveau van het fylum, familie en geslacht voor downstream analyse. De uiteindelijke ASV-dataset bevatte representatieve sequenties, abundantie-informatie en bijbehorende taxonomische annotaties voor elke steekproef.
Alfa- en bètadiversiteitsanalyse
Alfa-diversiteitsindexen, waaronder Chao, ACE, Shannon, Simpson en Coverage-indices, werden berekend om de microbiële diversiteit en rijkdom binnen de steekproef te evalueren. Alfa-diversiteitsindices werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie. De normaliteit van de gegevens werd beoordeeld met behulp van de Shapiro–Wilk-test. Normaal verdeelde variabelen werden vergeleken tussen de DM- en NM-groepen met behulp van Student's t-tests, terwijl niet-normaal verdeelde variabelen werden geanalyseerd met Wilcoxon rangsomtests. Bètadiversiteitsafstanden werden vervolgens berekend met behulp van een geschikte afstandsmatrix om verschillen in de samenstelling van microbiële gemeenschappen tussen monsters te evalueren. Principal coördinatenanalyse (PCoA) werd uitgevoerd om verschillen in de structuur van microbiële gemeenschappen tussen groepen te visualiseren. Daarnaast werd een analyse van overeenkomsten (ANOSIM) uitgevoerd om te bepalen of de intergroepsverschillen de intragroepsvariatie overschreden, en werden de bijbehorende ANOSIM R- en p-waarden gerapporteerd. Alpha-diversiteitsanalyse weerspiegelde de microbiële diversiteit binnen de steekproef, terwijl de beta-diversiteitsanalyse verschillen in de samenstelling van microbiële gemeenschappen tussen groepen evalueerde.
Differentiële taxonomische analyse
De samenstelling van microbiële gemeenschappen werd samengevat op het niveau van het stam, de familie en het geslacht. Gestapelde bargrafieken werden gegenereerd om de relatieve overvloed van dominante taxa over individuele steekproeven en studiegroepen te visualiseren. Pan/Core-curves en Venn-diagrammen werden verder geconstrueerd om gedeelde en groepsspecifieke ASV's tussen de DM- en NM-groepen te vergelijken. Verschillen in taxonabundantie tussen groepen werden geëvalueerd met behulp van Wilcoxon rangsomtests. Vervolgens werd LEfSe-analyse uitgevoerd om microbiële taxa te identificeren die het sterkst bijdroegen aan intergroepsdiscriminatie. Differentiële taxonomische analyse maakte het mogelijk microbiële taxa te identificeren die verrijkt zijn in de DM- of NM-groep.
Functionele voorspelling
PICRUSt2 of een equivalente gevalideerde functionele voorspellingspijplijn werd gebruikt om microbiële functionele routes af te leiden uit 16S rDNA-sequencingprofielen. ASV-abundantiegegevens werden genormaliseerd volgens de eisen van de geselecteerde analytische pijplijn, en voorspelde functies werden gekoppeld aan KEGG- of MetaCyc-route-annotaties. Voorspelde route-abundanties werden vervolgens vergeleken tussen de DM- en NM-groepen. Significant verschillende paden werden gevisualiseerd met behulp van heatmaps of andere geschikte grafische benaderingen. Voorspelde functies werden geïnterpreteerd als het afgeleide microbiële metabole potentieel in plaats van als direct gemeten metabolietabundantie. Functionele voorspellingsanalyse maakte het mogelijk om kandidaat-microbiële routes te identificeren die tussen groepen verschilden, waaronder routes die geassocieerd zijn met koolhydraat- en aminozuurmetabolisme.
Mendeliaanse randomisatieanalyse
Genome-wide association study (GWAS) samenvattende statistieken voor darmmicrobiota zijn verkregen uit publiek beschikbare datasets10. Genoombrede significante associatiegegevens voor microbiële taxa werden gehaald uit de NHGRI-EBI GWAS-catalogus (https://www.ebi.ac.uk/gwas/) met toegangsnummers variërend van GCST90032172 tot GCST90032644. Extra metagenomische gegevens werden verkregen van de FINRISK 2002-cohort via het European Genome-Phenome Archive (Research ID: EGAS00001005020). GWAS samenvattende statistieken voor type 2 diabetes mellitus zijn ook verkregen uit de NHGRI-EBI GWAS Catalogus (toegangsnummer: EBI-A-GCST006867). Genetische varianten die geassocieerd zijn met microbiële taxa werden geselecteerd als instrumentele variabelen volgens vooraf gedefinieerde statistische drempels, en varianten in koppelingsdisequilibrium werden uitgesloten. Blootstellings- en uitkomstdatasets werden geharmoniseerd om een consistente alleloriëntatie te waarborgen. Mendeliaanse randomisatieanalyse werd vervolgens uitgevoerd met behulp van de inverse variantiegewogen (IVW) methode als primaire analytische benadering. Gevoeligheidsanalyses werden uitgevoerd met behulp van MR-Egger en gewogen mediaanmethoden. De instrumentsterkte werd geëvalueerd met behulp van F-statistieken, terwijl heterogeniteit tussen instrumentele variabelen werd beoordeeld met behulp van de Q-test van Cochran. Horizontale pleiotropie werd onderzocht met behulp van de MR-Egger interceptietest. Bonferroni-correctie werd toegepast om rekening te houden met meerdere vergelijkingen. Mendeliaanse randomisatiebevindingen werden geïnterpreteerd als genetisch voorspelde associaties in plaats van als definitief bewijs van causaliteit.
Data-uitvoer en eindpunt
De uiteindelijke analytische output omvatten ASV-abundantietabellen, taxonomische samenstellingsgrafieken, alfa-diversiteitsmetriek, bètadiversiteitsanalyses, differentiële taxonomische resultaten, voorspelde functionele padprofielen en Mendeliaanse randomisatieschattingen. Alle steekproefidentificaties in de sequencingdatasets werden geverifieerd om consistentie te waarborgen met de bijbehorende gedeïdentificeerde studiecodes. Ruwe sequencingbestanden, verwerkte ASV-tabellen, statistische outputs en bronbestanden van de figuur werden gearchiveerd voor downstream analyse en databeheer. Het protocol werd als compleet beschouwd zodra hoogwaardige sequencinggegevens, taxonomische profielen, diversiteitsmetrics, voorspelde functionele padanalyses en Mendeliaanse randomisatieresultaten succesvol waren gegenereerd en geverifieerd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Basisdemografische en klinische kenmerken van de aanvankelijk gescreende klinische cohort worden weergegeven in Tabel 1. Een representatieve subgroep bestaande uit 12 nieuw gediagnosticeerde T2DM- en 12 NM-deelnemers werd vervolgens geselecteerd voor 16S rDNA-sequencing en downstream microbiome-analyses.
Sequencing diepte-evaluatie
De Shannon-index werd berekend en de verdunningscurve werd uitgezet ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
In de afgelopen jaren is het menselijke microbioom, met name de darmmicrobiota, uitgegroeid tot een complexe en invloedrijke factor in het metabolisme van de gasther, immuunregulatie en de ontwikkeling van ziekten. Bij een gezonde gastheer draagt de darmmicrobiota bij aan de homeostase van het immuunsysteem en de integriteit van de darmbarrière11. Dysbiose is in verband gebracht met een reeks pathologische aandoeningen, waaronder stofwisselingsstoornissen, auto-im...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs stellen dat het onderzoek is uitgevoerd zonder commerciële of financiële relaties die als een potentieel belangenconflict kunnen worden opgevat.
BIJDRAGEN VAN AUTEURS:
Linrui Xie en Kemiao Chen voerden data-analyse uit en schreven het manuscript. Xican Pan nam deel aan monsterverzameling en experimentele procedures. Xuemei Zhong en Xiaoyu Li bedachten en ontwierpen de studeerkamer, superviseerden het project en reviseerden het manuscript kritisch. Alle auteurs beoordeelden en keurden het definitieve manuscript goed.
De auteurs bedanken alle deelnemers en medewerkers die betrokken zijn bij het verzamelen en verwerken van monsters voor hun bijdragen aan deze studie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 16S rRNA Primers (V3–V4) | Sangon Biotech | Custom | Universele primers voor bacteriële 16S-regio |
| 80 °C Freezer | Haier Biomedical | DW-86L626 | Langdurige monsteropslag |
| Agarose Gel System (Sub-Cell GT) | Bio-Rad | 170-4401 | Validatie van PCR-product |
| AMPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | DNA-zuivering en maatselectie |
| Bead-beating Tubes (Lysing Matrix E) | MP Biomedicals | 116913050 | Mechanische lysis van microbiële cellen |
| Bioinformatics Workstation | Dell | Precision 7920 | Gegevensanalyse met QIIME2 en R |
| DADA2 pipeline | Bioconductor | Versie 1.28 | Sequentie-denoising en ASV-generatie; https://benjjneb.github.io/dada2 |
| Deblur | QIIME2 | Versie 2023.5 | Sequentie-denoising en foutcorrectie; https://docs.qiime2.org |
| European Genome-Phenome Archive | EMBL-EBI | EGAS00001005020 | Openbare metagenomic dataset repository; https://ega-archive.org |
| GWAS Catalog | NHGRI-EBI | Accessions GCST90032172–GCST90032644 | Openbare genome-wide associatie-samenvattingsstatistieken database; https://www.ebi.ac.uk/gwas |
| Illumina MiSeq Sequencing System | Illumina | SY-410-1003 | High-throughput sequencing platform |
| KEGG database | Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes | Release 107 | Functionele pad-annotatiedatabase; https://www.genome.jp/kegg |
| MetaCyc database | SRI International | Versie 27.1 | Metabolische pad-database; https://metacyc.org |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424R | Koelcentrifuge voor monstervoorbereiding |
| Nextera XT Library Prep Kit | Illumina | 20018705 | Bibliotheekvoorbereiding voor sequencing |
| PCR Master Mix (2x PrimeSTAR Max Premix) | Takara Bio | RR350A | Voor hoog-fideliteit PCR |
| PCR Thermocycler | Bio-Rad | T100 | PCR-amplificatie-instrument |
| PICRUSt2 | PICRUSt2 Development Team | Versie 2.5.2 | Functionele pad-voorspelling uit 16S rDNA-sequencinggegevens; https://github.com/picrust/picrust2 |
| QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | DNA-extractie uit ontlastingsmonsters |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | DNA-zuivering uit agarosegel |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | DNA-kwantificering |
| R software | R Foundation for Statistical Computing | Versie 4.3.1 | Statistische analyse en Mendeliaanse randomisatie-analyse; https://www.r-project.org |
| SILVA 138 database | SILVA ribosomal RNA database project | Release 138 | Referentiedatabase voor taxonomische annotatie; https://www.arb-silva.de |
| Stool Collection Tube | Sarstedt | 76.9923.001 | Steriele ontlastingsmonsterverzamelbuis |
| Stool DNA Kit | Omega | D4015-02 | DNA-extractiekit |
| TwoSampleMR package | MR-Base | Versie 0.5.7 | Mendelian randomisatie-analyse in R; https://mrcieu.github.io/TwoSampleMR |