$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Liyuan Ziekenhuis, Tongji Medisch College, Huazhong Universiteit voor Wetenschap en Technologie [Goedkeuringsnummer: 2026IEC(RYJ016)]. Alle patiënten gaven geïnformeerde toestemming, en het verzamelen en gebruiken van klinische monsters voldeed aan de relevante ethische richtlijnen van de Verklaring van Helsinki. De belangrijkste experimentele materialen en instrumenten die in deze studie zijn gebruikt, zijn vermeld in de Materiaallijst.
Verzameling van klinische weefselmonsters en detectie van CDCP1-expressie
Chirurgisch weefselmonsters werden verzameld van zeven patiënten die tussen januari 2019 en december 2019 in ons ziekenhuis de diagnose nasofarynxcarcinoom kregen. Tegelijkertijd werden als controlegroep neusweefselmonsters van zes patiënten met rhinitis afgenomen. Alle weefselmonsters werden onmiddellijk ingevroren in vloeibare stikstof na verzameling voor latere RNA-extractie.
RNA-extractie en realtime kwantitatieve PCR-detectie
Het totale RNA werd uit weefselmonsters gewonnen volgens de instructies van de fabrikant. Voor elk monster werd 50–100 mg weefsel op ijs verwerkt in 1 ml extractiereagens met behulp van een weefselhomogenisator. Homogenisatie werd 30 seconden uitgevoerd en herhaald 3 keer om volledige verstoring van het weefsel te garanderen. Na weefselverstoring kreeg elk lysaat 200 μL chloroform. De buizen werden krachtig geschud door 15 seconden te vortexen, 3 minuten op kamertemperatuur gehouden en vervolgens 15 minuten op 12.000 × g gedraaid bij 4 °C om de fasen te scheiden. De heldere waterige laag werd verwijderd zonder de interfase te verstoren en overgebracht in een nieuwe buis.
RNA werd uit deze waterige fractie gewonnen door isopropanol toe te voegen in een volumeverhouding van 1:1. Na een incubatie van 10 minuten bij kamertemperatuur werden de monsters gecentrifugeerd op 12.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C om het RNA te pelleten. Het supernatant werd weggegooid en de pellet werd één keer afgespoeld met 1 ml 75% ethanol. Na een tweede centrifugatiestap bij 7.500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C, werd de ethanolwash verwijderd. De RNA-pellet werd vervolgens 5–10 minuten aan de lucht gedroogd bij kamertemperatuur en opnieuw opgehangen in 20 μL RNase-vrij water. RNA-hoeveelheid en zuiverheid werden spectrofotometrisch bepaald.
Voor cDNA-voorbereiding werd 1 μg totaal RNA gebruikt voor reverse transcriptie. De reactie werd uitgevoerd bij 37 °C gedurende 15 minuten en daarna verhit tot 85 °C gedurende 5 seconden. Vervolgens werd kwantitatieve real-time PCR (qPCR) uitgevoerd met TB Green Premix Ex Taq II op een Real-Time PCR-systeem. Elke 20 μL reactie bevatte 2 μL cDNA-template, voor- en omgekeerde primers met elk 0,4 μmol/L, 10 μL SYBR Green premix en nucleasevrij water. Het amplificatieprotocol begon met denaturatie bij 95 °C gedurende 30 seconden. Hierop volgden 40 cycli, waarbij elke cyclus bestond uit 95 °C voor 5 seconden en 60 °C voor 30 seconden voor annealing/extensie. Primersequenties worden vermeld in Tabel 1.
Immunohistochemische detectie van CDCP1-eiwitexpressie
Weefselmonsters werden eerst vastgesteld in 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur, gevolgd door standaard dehydratie, paraffine-inbedding en voorbereiding van secties van 4 μm dik. De paraffinesecties werden vervolgens behandeld met xyleen om paraffine te verwijderen en sequentieel gerehydrateerd via gegradueerde ethanoloplossingen. Voor antigeenontmaskering werden de glaasjes in citraatbuffer (pH 6,0) geplaatst en 3 minuten in een snelkookpan verwarmd nadat de oplossing het koken had bereikt. De endogene peroxidaseactiviteit werd onderdrukt door de secties 10 minuten te blootstellen aan 3% waterstofperoxide.
Na het blokkeren van endogene enzymactiviteit werden de secties 's nachts geïncubeerd bij 4 °C, waarbij het anti-CDCP1 primaire antilichaam verdund werd op 1:200. De volgende dag werden de preparaten 30 minuten bij kamertemperatuur behandeld met een mierikswortelperoxidase-geconjugeerd secundair antilichaam. Signaalvisualisatie werd uitgevoerd met een DAB-substraatkit, en de secties werden vervolgens tegengekleurd met hematoxyline. Tot slot werden de preparaten gedehydrateerd, gemonteerd en onderzocht onder een optische microscoop.
Celcultuur en groepering
CNE2- en HK1-cellen van menselijke nasofarynxcarcinoom werden behouden in DMEM met een hoog glucosegehalte gehalte aangevuld met 10% foetaal rundserum en 1% penicilline-streptomycine. Cellen werden gekweekt bij 37 °C in een broedmachine met 5% CO₂. Wanneer cellen 70%–80% confluentie bereikten, werden ze getransfecteerd volgens de volgende groepen: Controlegroep (Controle): getransfecteerd met lege vector of negatieve controle siRNA; CDCP1 overexpressiegroep (CDCP1-OE): getransfecteerd met CDCP1 overexpressieplasmide; CDCP1 silencinggroep (si-CDCP1): getransfecteerd met CDCP1 siRNA; Rescue-experimentgroep (CDCP1-OE + U0126): behandeld met de ERK1/2-specifieke remmer U0126 (10 μmol/L) gedurende 48 uur op basis van CDCP1-overexpressie .
De transfectie werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. Cellen werden 24 uur voor transfectie geplateerd in platen met 6 putten bij 2 × 105 cellen per put, waarbij elke put 2 ml antibioticavrij medium bevatte. Transfectie werd gestart toen de culturen ongeveer 70% samenvloeiing bereikten. Het kweekmedium werd vervolgens verwijderd en vervangen door een nieuw serumvrij medium. Voor elke put werd ofwel 2 μg plasmide-DNA of 100 pmol siRNA apart bereid uit 5 μL transfectiereagens, waarbij elk onderdeel verdund werd in 250 μL gereduzeerd serumhoudend medium. Beide mengsels werden 5 minuten op kamertemperatuur gehouden. Het verdund nucleïnezuur en het transfectie-reagens werden vervolgens gecombineerd en 20 minuten bij kamertemperatuur laten staan om de transfectiecomplexen te genereren. Deze complexen werden druppelwijs aan de cellen toegevoegd, zachtjes verdeeld over de put, en 6 uur lang met de cellen geïncubeerd. Na afloop van de incubatieperiode werd het transfectiemengsel verwijderd en kregen de cellen een volledig medium dat 10% FBS bevatte.
Celproliferatie-assay
Op 48 uur na transfectie werden CNE2- en HK1-cellen uit elke groep verzameld en gezaaid in 96-wellplaten met een dichtheid van 3 × 10 3-cellen per put met 100 μL medium per put, met vijf replicatieputten per groep. Nadat de cellen 24, 48 of 72 uur waren gekweekt, werd 10 μL MTT-oplossing met 5 mg/mL aan elke put toegevoegd. De platen werden vervolgens opnieuw geïncubeerd bij 37 °C met 5% CO₂ voor nog eens 4 uur. Na deze incubatie werd het kweeksupernatant zorgvuldig weggegooid en werd 100 μL dimethylsulfoxide (DMSO) aan elke put toegevoegd om de formazankristallen op te lossen. De platen werden 10 minuten geroerd om volledige oplossing te garanderen. De absorptie werd vervolgens geregistreerd met een microplaatlezer bij 570 nm, waarbij 630 nm de referentiegolflengte was.
Apoptose-activiteitsassay
48 uur na transfectie werden CNE2-cellen van elke groep verzameld en werd Caspase-3-activiteit gedetecteerd met een Caspase-3 Activity Assay Kit volgens de instructies van de fabrikant. In totaal werd 100 μL lysisbuffer toegevoegd aan 1 × 106 cellen, 15 minuten op ijs gelyseerd en vervolgens 10 minuten gecentrifugeerd op 12.000 × g bij 4 °C. Het resulterende supernatant werd overgebracht voor verdere analyse. Voor de Caspase-3 assay ontving elke put 50 μL reactiebuffer en 5 μL Caspase-3 substraat (DEVD-pNA). De plaat werd vervolgens 2 uur lang op 37 °C gehouden, en de absorptie werd gemeten op 405 nm met een microplaatlezer.
Western blot-analyse
48 uur na transfectie werden CNE2- en HK1-cellen uit elke experimentele groep geoogst voor eiwitextractie. Cellen werden verstoord in een RIPA-buffer met proteaseremmers en 30 minuten op ijs gehouden. De resulterende lysaten werden gecentrifugeerd op 12.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C, waarna de supernatantfracties werden verzameld. De eiwitconcentratie werd gemeten met een BCA-eiwitassaykit.
Voor western blot-analyse werd 30 μg totaal eiwit van elk monster gemengd met 5x laadbuffer en verhit op 100 °C gedurende 10 minuten om de eiwitten te denatureren. De monsters werden gescheiden op 10% SDS-PAGE gels bij 120 V gedurende 90 minuten, gevolgd door overdracht op PVDF-membranen met een constante stroom van 300 mA gedurende 90 minuten. Na de overdracht werden de membranen 1 uur lang geblokkeerd met 5% magere melk bij kamertemperatuur.
De membranen werden 's nachts geïncubeerd bij 4 °C met primaire antistoffen tegen CDCP1 (1:1.000), E-cadherine (1:1.000), Vimentin (1:1.000), p-ERK1/2 (1:2.000), ERK1/2 (1:1.000) en GAPDH (1:5.000).
De volgende dag werden de membranen 3x in TBST gespoeld, waarbij elke wasbeurt 10 minuten duurde. Daarna werden ze 1 uur lang blootgesteld aan mierikswortelperoxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen. Na drie extra TBST-washes werden de eiwitsignalen zichtbaar weergegeven met een ECL chemiluminescentiesubstraat. De bandintensiteit werd gemeten met ImageJ-software en GAPDH werd gebruikt als normalisatieregelaar.
Statistische analyse
Alle experimenten werden onafhankelijk drie keer onafhankelijk uitgevoerd. De resultaten worden gepresenteerd als het gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Verschillen tussen meerdere groepen werden geëvalueerd met eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA), en Tukey's methode werd gebruikt voor pargewijze post-hoc vergelijkingen. Een P-waarde van < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.