Transcriptomische analyse toont mitochondriale gedreven subgroepen bij atopische dermatitislaesies

Yingyao Yu; Yuanyuan Shang; Xinhong Ge; Lingdi Dong; Kexin Li

doi:10.3791/70240

Research Article

Transcriptomische analyse toont mitochondriale gedreven subgroepen bij atopische dermatitislaesies

DOI:

10.3791/70240

⸱

May 26th, 2026

Yingyao Yu¹ , Yuanyuan Shang¹ , Xinhong Ge¹ , Lingdi Dong¹ , Kexin Li¹

¹Department of Dermatology, General Hospital of Ningxia Medical University

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Atopische dermatitis (AD) is een chronische ontstekingsziekte van de huid met aanzienlijke moleculaire heterogeniteit. Deze studie identificeert twee transcriptologisch verschillende AD-subgroepen, gedreven door differentiële mitochondriale genexpressie en immuuninfiltratie, en onthult vier hubgenen als potentiële biomarkers voor patiëntstratificatie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Atopische dermatitis (AD) is een veelvoorkomende en chronische ontstekingsziekte van de huid met een wereldwijde prevalentie. De klinische heterogeniteit en complexe moleculaire mechanismen vormen aanzienlijke uitdagingen voor de ontwikkeling van effectieve therapieën. Het onderzoeken van de moleculaire heterogeniteit van AD met behulp van transcriptomische gegevens van de lesionele huid, het karakteriseren van hun biologische en immuunprofielen, en het identificeren van belangrijke genen die ten grondslag liggen aan de differentiatie. Differentieel tot expressie gebrachte genen werden geïdentificeerd met DESeq2, gevolgd door pathway- en co-expressieanalyses via respectievelijk GSEA en WGCNA. Mitochondriaal-gerelateerde genen werden geëxtraheerd door DEG's en WGCNA-modules te kruisen met de MitoCarta3.0-database, en hun functionele relevantie werd beoordeeld via GO- en KEGG-verrijking. Hubgenen werden geïdentificeerd door eiwit-eiwitinteractienetwerkanalyse, die vervolgens werden gebruikt om een classificatiemodel te construeren. Transcriptieregulatoren werden voorspeld met hTFtarget, terwijl de infiltratie van immuuncellen werd gekwantificeerd met CIBERSORT. Twee moleculaire subgroepen werden geïdentificeerd. Cluster 1 was verrijkt met celsignalerings- en adhesieroutes, terwijl Cluster 2 een opregulatie vertoonde van oxidatieve fosforylering en proteasoomgerelateerde processen. In totaal werden 85 mitochondriale genen, voornamelijk betrokken bij het energiemetabolisme, verschillend tot expressie gebracht tussen clusters. PPI-netwerkanalyse identificeerde vier hubgenen (BAD, BOLA1, CHCHD5 en ISOC2), die significant werden opgereguleerd in Cluster 1. Een op hubgen gebaseerde classifier toonde een sterke discriminerende kracht (gebied onder de curve > 0,7). Voorspelde belangrijke transcriptieregulatoren waren onder andere ATF3, BRD2, BRD4 en CEBPA. Immuunprofilering toonde een hogere regulatie-T-celinfiltratie aan in Cluster 1 en verhoogde folliculaire helper T-cellen in Cluster 2. Deze studie onthult twee moleculair en immunologisch verschillende AD-subtypes, gekenmerkt door differentiële mitochondriale functies en immuunmicro-omgevingssignaturen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Atopische dermatitis (AD) is een veelvoorkomende en chronische ontstekingsziekte van de huid die tot 20% van de kinderen en 10% van^{de volwassenen} treft. Het wordt gekenmerkt door intense jeuk en terugkerende eczemamateuze laesies². Klinisch ontstaat AD uit een dynamische wisselwerking van polygene vatbaarheid (bijv. mutaties bij verlies van functie door FLG), immuundysregulatie en omgevingsblootstelling zoals lage luchtvochtigheid en microbiële dysbiose³. Hoewel AD enkele pathofysiologische kenmerken deelt met psoriasis, sluiten hun klinische presentaties elkaar uit, met verschillende genetische effecten in gedeelde routes en verschillende immuunveranderingen⁴.

AD is een heterogene ziekte, gekenmerkt door diverse transcriptomprofielen tussen verschillende patiëntengroepen en ziektesymptomen⁵. Geïntegreerde analyses van huidweefsels en perifere bloedmononucleaire cellen hebben aangetoond dat klinische kenmerken zoals erythema en papulatie geassocieerd zijn met verschillende immunologische signaturen, wat de wisselwerking weerspiegelt tussen lokale huid- en systemische immuunresponsen⁶. Grootschalige transcriptomische studies benadrukken verder de rol van IL-13-routes in AD-pathogenese, terwijl AD een grotere moleculaire heterogeniteit vertoont dan psoriasis, met variaties in genexpressiepatronen die gekoppeld zijn aan de ernst van de ziekte, de beginleeftijd en genetische achtergrond ^5,7. Deze verschillen benadrukken de complexiteit van de AD-pathogenese en de noodzaak van gepersonaliseerde benaderingen in onderzoek en therapie.

Mitochondriale eiwitten spelen een belangrijke rol in de pathogenese van AD door ontregelde oxidatieve stress en metabole routes. Studies tonen een verhoogde mitochondriale activiteit van het mitochondriale complex I en II aan in niet-laesionele AD-keratinocyten, wat leidt tot overmatige oxidatie van langeketenvetzuren en verhoogde ROS-productie, wat de epidermale barrièredysfunctie^verhoogt ^8,9. Tegelijkertijd identificeren proteomische analyses verminderde NRF2-antioxidant route-eiwitten en mitochondriale componenten in de AD-epidermis, waardoor de resolutie van oxidatieve stress¹⁰ afneemt. Schade aan mitochondriaal DNA draagt verder bij aan ontstekingsreacties, terwijl interventies zoals het gebruik van mitochondriale gerichte antioxidanten effectiviteit aantonen bij het herstellen van epidermale homeostase door ROS^11,12 te verminderen. Deze bevindingen benadrukken mitochondriale eiwitten als zowel drijfveren van AD-pathologie als potentiële therapeutische doelwitten.

Recente transcriptoomanalyses van AD hebben het begrip van de genetische architectuur en moleculaire heterogeniteit aanzienlijk vergroot. De eerste RNA-sequencingprofilering van AD toonde de verhoogde expressie in de TREM-1-route en het IL-36 cytokine¹³ aan. Analyse van gewogen genco-expressienetwerken op basis van genexpressieprofiel heeft verder verschillende moleculaire modules en hubgenen aan het licht gebracht, zoals HSPA4, LCE3E en LCE3D, die ontstekingsreacties en keratinisatie orkestreeren, waarmee potentiële therapeutische doelen¹⁴ worden benadrukt. Deze studies benadrukken het belang van multiweefseltranscriptomics en polygene risicomodellering bij het verfijnen van ziektevoorspelling en het blootleggen van de complexe fundamenten van AD. Bestaande studies richten zich echter voornamelijk op de algehele AD-transcriptomica zonder specifiek de rol van mitochondriale genen bij het definiëren van moleculaire subgroepen op te lossen. De huidige studie gaat verder dan eerdere transcriptomische analyses door meerdere GEO-datasets te integreren om consensus-clustering gebaseerde AD-subgroepen te identificeren en systematisch differentieel tot expressie gebrachte genen, WGCNA-modules en een gecureerde mitochondriale genencatalogus te koppelen om hub-mitochondriale genen te identificeren die subgroepidentiteit definiëren en mogelijk als nieuwe biomarkers dienen.

Met de hypothese dat de laesionele AD-huid moleculair verschillende transcriptomische subgroepen herbergt die worden gekenmerkt door differentiële mitochondriale genexpressie, wat de basis kan liggen aan de klinische heterogeniteit van AD. Om dit te testen, integreerde deze studie RNA-sequencinggegevens uit gepubliceerde studies en verzamelde genexpressiegegevens van huidmonsters van laesies van 266 AD-patiënten. Moleculaire subgroepen werden geïdentificeerd op basis van consensusclustering van genexpressie, en de genexpressie werd vergeleken tussen de twee moleculaire subgroepen. De genen die dit verschil aandrijven, tonen functionele verrijking in celsignalering en oxidatieve fosforylering. Bovendien werden mitochondriale genen onderzocht die de twee moleculaire groepen onderscheiden, en werden de belangrijkste hubgenen geïdentificeerd binnen een eiwit-eiwit interactienetwerk. Deze bevindingen benadrukken de genetische heterogeniteit van de ziekte van AD en breiden de kennis uit over de rol van mitochondriale eiwitten in de pathologie van AD.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie maakte gebruik van openbaar beschikbare genexpressiedatasets uit de Gene Expression Omnibus (GEO) database. Er werden geen patiënt-identificeerbare gegevens geraadpleegd en er werden geen nieuwe patiëntenmonsters verzameld. Daarom was er geen goedkeuring van de institutionele beoordelingscommissie (IRB) of toestemming van de patiënt vereist voor deze secundaire analyse van openbaar beschikbare gegevens. De gebruikte software en databases staan vermeld in de Materiaallijst.

1 Data en bronnen

Transcriptomgegevens van patiënten met atopische dermatitis (AD) werden verkregen uit de GEO-database, waaronder vier studies: GSE121212 (N = 55)⁵, GSE157194 (N = 57)¹⁵, GSE193309 (N = 111)¹⁶ en GSE277961 (N = 43)¹⁷. Alle datasets bevatten ruwe of vooraf genormaliseerde telgegevens van laesionele huidbiopsieën. Ruwe tellingmatrices werden gedownload en geïntegreerd tussen de studies. Cross-study batcheffecten werden gecorrigeerd met de ComBat-seq-methode (sva R-pakket, v3.44.0) om expressieprofielen over de vier GEO-datasets te harmoniseren voorafgaand aan de downstream-analyse. Alle vier de datasets zijn gebaseerd op RNA-seq uitgevoerd op menselijke huidbiopsiemonsters en zijn uitgelijnd met het menselijke referentiegenoom GRCh38 via studiespecifieke pijplijnen. Kwantificatie van gen-niveau expressie werd uitgevoerd met behulp van Ensembl-genannotatie (v105).

2 Consensusclustering

Onbegeleide consensusclustering werd uitgevoerd met behulp van het ConsensusClusterPlus R-pakket (v1.64.0)¹⁸ om 266 letsels huidmonsters van AD-patiënten te stratificeren op basis van transcriptomische profielen. Voorafgaand aan clustering werden ruwe telgegevens uit alle studies samengevoegd en werden de batcheffecten van kruisstudies gecorrigeerd met behulp van de removeBatchEffect-functie uit het limma-pakket. Genexpressiegegevens werden vervolgens variantie-stabiliserend getransformeerd (VST) met DESeq2 en gefilterd om de top 5.000 meest variabele genen te behouden. Clustering werd uitgevoerd met hiërarchische clustering met Pearson-correlatie en gemiddelde koppeling over 1.000 iteraties, waarbij 80% van de steekproeven per iteratie werden gesubscopiciteerd. Het beste aantal clusters (k varieert van 2 tot 10) werd bepaald door het evalueren van de consensus cumulatieve distributiefunctie (CDF), delta-gebiedsplots en clusterconsensusscores. De resulterende clusters werden gevalideerd met consensus-heatmaps en PCA en gebruikt in downstream biologische en klinische analyses.

3 Analyse van differentiële genexpressie

De genexpressieniveaus werden vergeleken tussen moleculaire subgroepen met behulp van het DESeq2 R-pakket (v1.46.0)¹⁹. Ruwe telgegevens werden ingevoerd om gengewijze dispersie te schatten en pasten bij een negatief binomiaal model. Differentieel tot expressie gebrachte genen (DEGs) werden geïdentificeerd met behulp van de Wald-test, en de resultaten werden gefilterd met een significantiedrempel van aangepaste p-waarde < 0,01 en absolute log2-voudige verandering > 1.

4 Analyse van genensetverrijking

Gensetverrijkingsanalyse (GSEA) werd uitgevoerd met het clusterProfiler R-pakket (v4.12.6)²⁰. Alle genen werden gerangschikt op hun log2-voudige verandering volgens de differentiële expressieanalyse, en de GSEA-functie werd toegepast met parameters eps = 0, minGSSize = 10 en maxGSSize = 500, terwijl andere instellingen standaard werden gehouden. Verrijking werd uitgevoerd op basis van de MSigDB Hallmark-gensets. Voor elk moleculair cluster (Cluster 1 en Cluster 2) werden de top drie verrijkte routes geselecteerd op basis van de nominale p-waarde en de genormaliseerde verrijkingsscore (NES). De resultaten werden gevisualiseerd met het GseaVis R-pakket (v0.1.0)²¹.

5 Analyse van gewogen genco-expressienetwerken

WGCNA werd uitgevoerd op het genexpressieprofiel van AD-patiënten om genco-expressiemodules te identificeren die geassocieerd zijn met transcriptomische subtype-identiteit met behulp van het R-pakket WGCNA (v1.73)²². Genen werden gefilterd om de top 75% met de hoogste variantie over alle steekproeven te behouden. Een getekend co-expressienetwerk werd geconstrueerd met een zachte drempelkracht geselecteerd van 1 tot 30 om een schaalvrije topologie te benaderen. Genmodules werden geïdentificeerd door hiërarchische clustering en dynamisch boomkappen. Module-eigenschapsassociaties werden bestudeerd door co-expressieve module-eigengenen te correleren met de moleculaire subtypelabels, en modules met significante correlatie (p < 0,05) met moleculaire subtype werden geselecteerd voor downstream analyse.

6 Mitochondriale eiwitten in AD-moleculaire subgroepen

Om mitochondriale genen binnen de DEG's en WGCNA-modules te identificeren, werden deze gensets gecombineerd met de geselecteerde lijst van mitochondriale eiwitten uit MitoCarta3.0²³. De overlappende genen werden beschouwd als vermeende mitochondriale eiwitten die relevant zijn voor de context van de AD-ziekte.

7 Genontologie en KEGG-verrijkingsanalyse

Het identificeren van de belangrijkste celfuncties en biologische processen die moleculaire subgroepen onderscheiden. GO- en KEGG-verrijkingsanalyses werden uitgevoerd voor mitochondriale genen met behulp van clusterProfiler. GO-verrijking werd afzonderlijk uitgevoerd voor de categorieën Biologisch Proces (BP), Cellulaire Component (CC) en Moleculaire Functie (MF) met behulp van de enrichGO-functie met OrgDb = "org. Hs.eg.db", ont = "ALL", en standaardparameters. Verrijking van de KEGG-route werd uitgevoerd met behulp van de verrijkingKEGG-functie waarbij het organisme op "heeft" werd gezet. Verrijkte termen met aangepaste p-waarde < 0,05 werden als significant beschouwd.

8 Eiwit-eiwit interactienetwerken

De 85 DEG's en AD-geassocieerde mitochondriale genen overlappen in de STRING-database (https://string-db.org)²⁴ om bekende en voorspelde PPI's op te halen. Netwerktopologieanalyse werd uitgevoerd met behulp van zeven metingen (Degree, Closeness, Betweenness, Eigenvector, PageRank, Hub en Authorities) om het knooppuntbelang van elk eiwit te rangschikken. De top 30 gerangschikte genen van elke maat werden geselecteerd, en de snijpunten tussen alle zeven benaderingen werden weergegeven met behulp van een UpSet-plot. De vier elkaar snijdende genen uit de metingen werden gebruikt om een classificatiemodel te bouwen op basis van hun genexpressieniveaus. Modelnauwkeurigheid, gevoeligheid, specificiteit en oppervlakte onder de ROC-curve (AUC) werden berekend om de classificatieprestaties te evalueren.

9 Analyse van transcriptionele regulatie

De hTFtarget-database (http://bioinfo.life.hust.edu.cn/hTFtarget)²⁵ werd opgezocht om experimenteel ondersteunde TF-target interacties op te halen voor vier kruisende hubgenen. Het resulterende TF-gen regulatienetwerk werd geconstrueerd en gevisualiseerd met behulp van de igraph²⁶ en ggraph²⁷ R-pakketten.

10 Bulk RNA-seq immuuncelinfiltratieanalyse

Het CIBERSORT^28-algoritme (https://cibersort.stanford.edu/) werd gebruikt om de relatieve verhoudingen van 22 immuunceltypen in gegevens van laesionele huidtranscriptoom te schatten. Genormaliseerde genexpressiegegevens werden ingevoerd in de CIBERSORT (v0.1.0) samen met de LM22-handtekeningmatrix. De analyse werd uitgevoerd met 1.000 permutaties en kwantielnormalisatie uitgeschakeld. Monsters met CIBERSORT-output p-waarden < 0,05 werden overwogen voor downstream analyse. De geschatte fracties van immuuncellen werden vergeleken tussen moleculaire subgroepen met behulp van de Wilcoxon rank-sum test met FDR-correctie voor meervoudige vergelijkingen over de 22 immuunceltypen (p.adjust.method = "FDR"), en de resultaten werden gevisualiseerd met boxplots met behulp van het ggplot2²⁹ R-pakket.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transcriptionele subgroepen bij atopische dermatitis

RNA-seq-gegevens uit 266 AD-patiëntenmonsters werden geanalyseerd om transcriptionele heterogeniteit binnen de ziekte te onderzoeken. Na kwaliteitscontrole en correctie voor batcheffecten in meerdere studies, onthulde onbegeleide consensusclustering twee verschillende moleculaire subgroepen (Figuur 1A). Clusterstabiliteit en optimaal clusteraantal werden beoordeeld met behulp van de cumulatieve distributiefunctie (CDF) plot (Figuur 1B), delta-gebiedsplot (Figuur 1C) en consensusmatrix heatmap (Figuur 1D). Samen ondersteunen deze resultaten het bestaan van twee robuuste transcriptionele subtypes in AD, wat de onderliggende genetische heterogeniteit weerspiegelt.

Differentieel tot expressie gebrachte genen tussen AD-subgroepen

De t-SNE-grafiek gebaseerd op de genormaliseerde genexpressiematrix valideerde verder de transcriptionele subgroepen die door consensusclustering zijn geïdentificeerd. De t-SNE-grafiek toonde twee goed gescheiden clusters, elk overeenkomend met een van de eerder gedefinieerde subgroepen (Figuur 2A), wat de aanwezigheid van verschillende moleculaire profielen bij AD-patiënten ondersteunt. De differentiële expressie tussen de twee subgroepen werd vervolgens geanalyseerd met DESeq2, met een drempel van aangepaste p < 0,01 en |log₂ keer verandering| > 1. De resulterende vulkaangrafiek (Figuur 2B) toonde differentieel expressieve genen (DEGs), wat wijst op sterke transcriptionele divergentie. De top 10 upgereguleerde genen zijn ABHD2, ADAR, ADCY3, ADCY9, ADD1, ADIPOR2, AFF1, AGFG1, AGRN en AHNAK in cluster 1 en C2orf68, CTTN, GPR108, HERPUD1, LRPAP1, MAP1LC3B2, NKIRAS2, NR1H2, PDE5D en PMPCA in cluster 2 (Figuur 2C).

AD-subgroep geassocieerde genset

Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) toonde verschillende functionele verrijkingsprofielen aan tussen de twee transcriptomische clusters (Figuur 3A). Cluster 1 vertoonde significante verrijking voor routes die betrokken zijn bij celsignalering en adhesie, waaronder focale adhesie (Figuur 3B) en MAPK-signaalweg (Figuur 3C), wat wijst op een actieve toestand gekenmerkt door verbeterde cel-cel-extracellulaire matrixinteracties en proliferatie. Daarentegen vertoonde Cluster 2 sterke verrijking voor oxidatieve fosforylering (Figuur 3D) en proteasoomfunctie (Figuur 3E), wat wijst op een actief oxidatief en proteolytisch metabolisch fenotype.

Geco-expressieerde genen in AD-moleculaire groepen

Om co-expressiemodules te identificeren die geassocieerd zijn met transcriptomische subtypes, werd WGCNA uitgevoerd na datapreprocessing. Outlier-monsters werden eerst geïdentificeerd en verwijderd op basis van hiërarchische clustering van steekproefafstanden om de robuustheid van downstream netwerkconstructie te waarborgen (Figuur 4A). Vervolgens werd een zachte drempelkracht geselecteerd met behulp van het schaalvrije topologiecriterium, waarbij een kracht van 6 werd gekozen om een schaalvrije R² > 0,85 te bereiken (Figuur 4B). Genmodules werden geïdentificeerd door hiërarchische clustering en dynamisch boomkapen, gevolgd door eigengenclustering om nauw verwante modules te combineren (Figuur 4C en Figuur 4D). Het resulterende gennetwerk werd gevisualiseerd met behulp van een heatmap van topologische overlap, waarmee de aanwezigheid van verschillende genco-expressiepatronen werd bevestigd (Figuur 4E). Analyse van de relatie tussen module en eigenschap toonde een sterke en significante correlatie aan tussen de MEyellow-module (_N-gen = 743) en de moleculaire subgroep (Figuur 4F).

Functionele verrijking van de mitochondriale genen geassocieerd met de AD-subgroep

Vervolgens werd er een analyse van GO- en KEGG-verrijking uitgevoerd op de gekruiste genen (N = 85) tussen DEGs, genen in de MEyellow-module en een lijst van mitochondriale eiwitten uit MitoCarta3.0 (Figuur 5A) om de functionele rollen van mitochondriale geassocieerde genen te onderzoeken die de transcriptieverschillen tussen clusters aansturen. KEGG-routeanalyse stelde verrijking vast in oxidatieve fosforylering en metabole routes (Figuur 5B). GO-verrijkingsanalyse toonde een significante oververtegenwoordiging van termen die geassocieerd zijn met mitochondriale functie, waaronder protonen-motorkracht aangedreven mitochondriale ATP-synthese, respiratorische ketencomplex en NADH-dehydrogenase-activiteit (Figuur 5C), wat suggereert dat deze genen voornamelijk geassocieerd zijn met mitochondriale energiemetabolisme en energieregulatie.

Hubmitochondriale genen in AD moleculaire differentiatie

Om de sleutelgenen in de 85 mitochondriale transcriptoom-subgroep-geassocieerde genen te identificeren, werd een PPI-netwerk opgebouwd (Figuur 6A). Op basis van de rangschikking in elk van de zeven topologische maten (zie methoden) werden de top 30 genen geselecteerd en hun doorsneden geanalyseerd en gevisualiseerd in een UpSet-plot (Figuur 6B). Deze analyse resulteerde in vier hubgenen die consequent als centrale knooppunten werden geïdentificeerd op basis van alle rangschikkingscriteria (BAD, BOLA1, CHCHD5, ISOC2). Hun expressieprofielen werden onderzocht over de twee transcriptomische clusters en vonden dat alle vier de hubgenen significant waren opgereguleerd in Cluster 1 vergeleken met Cluster 2 (Figuur 6C). Paargewijze genexpressiecorrelatieanalyse toonde positieve correlaties tussen alle vier de genen, wat wijst op gecoördineerde regulatie, waarbij CHCHD5 en ISOC2 de sterkste correlatie vertoonden (Figuur 6D). Bovendien toonde een classificatiemodel dat we hebben gebouwd met de expressie van deze vier genen robuuste onderscheidingskracht tussen de twee clusters, waarbij de ROC-curve een oppervlakte onder de curve (AUC) > 0,7 toont (Figuur 6E). Daarnaast werd transcriptiefactor (TF) regulatienetwerkanalyse uitgevoerd om de regulerende mechanismen te bestuderen die de expressie van de vier geïdentificeerde hubgenen beheersen. Alle bekende en voorspelde transcriptiefactoren die deze hubgenen mogelijk reguleren, werden onderzocht bij hTFtarget, en de resultaten werden geïntegreerd en gevisualiseerd als een transcriptieregulatief netwerk (Figuur 7). In het TF-hub genregulatienetwerk had BAD het hoogste aantal TF's, en ATF3, BRD2, BRD4 en CEBPA hadden elk interactie met alle vier de hubgenen, wat wijst op een gedeeld regulerend mechanisme.

Vergelijking van immuuncelinfiltratie tussen AD-subgroepen

Om het immunologische landschap dat geassocieerd is met de transcriptomische subgroepen te onderzoeken, werd immunocelinfiltratieanalyse uitgevoerd met CIBERSORT, die de relatieve verhoudingen van 22 immuunceltypen schat op basis van bulktranscriptoomgegevens (Figuur 8). Onder de immuunsubsets bleken regulerende T-cellen (Tregs) significant talrijker te zijn in Cluster 1, wat wijst op een immunosuppressieve microomgeving die mogelijk geassocieerd is met mitochondriale activiteit en signaalroutes die in deze groep is opgereguleerd. Daarentegen werden folliculaire helper T-cellen significant verrijkt in Cluster 2, wat wijst op een mogelijk actievere adaptieve immuunrespons in deze subgroep.

BESCHIKBAARHEID GEGEVENS:

De transcriptomische gegevens die in deze studie zijn geanalyseerd, zijn openbaar beschikbaar in de Gene Expression Omnibus (GEO)-repository onder toegangsnummers GSE121212, GSE157194, GSE193309 en GSE277961 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).

figure-results-1
Figuur 1: Consensusclustering van atopische dermatitis-laesiemonsters op basis van transcriptomische profielen. (A) Heatmap en hiërarchische clustering van de consensusmatrix over atopische dermatitis (AD) monsters. (B) Consensus cumulatieve verdelingsfunctie (CDF) plot gebruikt om het optimale aantal clusters te bepalen (k = 2–10). (C) Delta-gebiedsplot dat de relatieve verandering in het oppervlak onder de CDF-curve voor elke k toont. (D) Consensusclustertoewijzing voor k = 2. Elke kolom vertegenwoordigt een individueel monster, en kleuren geven het lidmaatschap van de cluster aan (Cluster 1, rood; Cluster 2, teal). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Differentiële genexpressie van atopische dermatitis, moleculaire subtypes. (A) t-gedistribueerde stochastische buur-embedding (t-SNE) plot van AD-monsters. Elk punt vertegenwoordigt een monster dat in twee dimensies wordt geprojecteerd en is gekleurd volgens clustertoewijzing. (B) Vulkaangrafiek van differentieel expressieve genen (DEGs) tussen Cluster 1 en Cluster 2. Elk punt vertegenwoordigt een gen, uitgezet door log2-voudige verandering (x-as) en −log10 aangepaste p-waarde (y-as). Rode en blauwe punten geven respectievelijk significante opgewaardeerde genen in Cluster 1 en Cluster 2 aan, terwijl grijze punten niet-significante genen aangeven. (C) Heatmap van de top 10 hoogexpressieve genen in Cluster 1 en Cluster 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Analyse van genensetverrijking van atopische dermatitis-moleculaire subtypes. (A) Tweezijdige balkgrafiek die GSEA-resultaten toont tussen Cluster 1 en Cluster 2, waarbij de bovenste significant verrijkte paden zijn. Paden die in Cluster 1 zijn verrijkt, worden rechts weergegeven, en die in Cluster 2 zijn aan de linkerkant weergegeven. (B–E) Representatieve verrijkingsplots voor focale adhesie, MAPK-signaalroute, oxidatieve fosforylering en proteasoompaden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Analyse van gewogen genco-expressienetwerk van atopische dermatitismonsters. (A) Monsterclustering dendrogram gebaseerd op genexpressieprofielen. (B) Schaalvrije topologie-fitindex en gemiddelde connectiviteit over zachte drempelmachten (1–30). (C) Clustering en warmtekaart van module-eigengenen, waarbij kleuren paargewijze correlaties aangeven. (D) Hiërarchisch clustering dendrogram dat genen toont die zijn gegroepeerd in co-expressieve modules. (E) Heatmap van de topologische overlappingsmatrix (TOM), die co-expressie-gelijkenis tussen genparen weergeeft. (F) Heatmap van module–eigenschapsrelaties, die correlaties toont tussen module-eigengenen en klinische eigenschappen. Correlatiecoëfficiënten worden binnen elke cel weergegeven, en de kleurintensiteit geeft de sterkte en richting van de correlatie aan (rood, positief; blauw, negatief). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Genontologie en KEGG-routeverrijking van subtype-geassocieerde mitochondriale genen. (A) Venn-diagram dat overlap toont tussen DEGs, subtype-geassocieerde modulegenen en mitochondriale genen. (B) Bubbelgrafiek van de top 20 verrijkte KEGG-routes van elkaar kruisende genen. (C) Top 10 verrijkte genontologie (GO) termen voor Biologisch Proces (BP), Cellulaire Component (CC) en Moleculaire Functie (MF). Alle verrijkingsanalyses werden uitgevoerd met een aangepaste p-waarde < 0,05 (valse ontdekkingssnelheid) als significantiedrempel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Analyse van eiwit-eiwitinteracties en identificatie van hubgenen. (A) Eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerk van 85 kruisende genen. Knooppunten vertegenwoordigen eiwitten, en randen geven voorspelde of experimenteel gevalideerde interacties aan uit de STRING-database. (B) UpSet-grafiek met kruispunten tussen de top 30 gerangschikte genen op basis van zeven netwerkcentraliteitsmetingen. (C) Boxplots die expressieniveaus tonen van vier hubgenen in Cluster 1 en Cluster 2. (D) Pargewijze correlatieanalyse tussen de vier hubgenen. (E) Receiver operating characteristic (ROC) curve die classificatieprestaties toont, waarbij gevoeligheid wordt uitgezet tegen specificiteit. Het gebied onder de kromme (AUC) geeft de algehele nauwkeurigheid aan. De statistische significantie in paneel (C) werd beoordeeld met behulp van de Wilcoxon rangsomtest (*p < 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: Regulerend netwerk van hubgenen. Rode cirkels vertegenwoordigen hubgenen en blauwe cirkels vertegenwoordigen geassocieerde transcriptiefactoren (TF's). Randen geven regulatorische interacties aan. De grootte van elke hubgenknoop weerspiegelt het aantal interacterende TF's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-8
Figuur 8: Vergelijking van immuuncelinfiltratie tussen atopische dermatitis-subgroepen. Boxplots die de geschatte verhoudingen van 22 immuunceltypen in elk cluster tonen (Cluster 1, rood; Cluster 2, teal). Asterisken (*) geven statistisch significante verschillen tussen clusters aan, beoordeeld met de Wilcoxon rangsomtest met correctie voor valse ontdekkingssnelheid voor meervoudige vergelijkingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Atopische dermatitis is een veelvoorkomende en genetisch heterogene inflammatoire huidaandoening, die aanzienlijke uitdagingen vormt voor gepersonaliseerde behandelstrategieën. Deze studie geeft inzicht in de moleculaire heterogeniteit van AD door twee verschillende transcriptie-subgroepen te identificeren in 266 laesionele huidmonsters van AD-patiënten. Deze subgroepen vertonen verschillende biologische functieverrijking en infiltratie van immuuncellen, waarbij Cluster 1 wordt gekenmerkt door actieve celsignalerings- en adhesieroutes en een verrijking van regulerende T-cellen (Tregs), terwijl Cluster 2 wordt gekenmerkt door verhoogde oxidatieve fosforylering en proteasoomfunctie, samen met een toename van folliculaire helper T-cellen. Belangrijk is dat vier mitochondriaal-geassocieerde genen (BAD, BOLA1, CHCHD5 en ISOC2) zijn geïdentificeerd die in Cluster 1 zijn opgereguleerd. Het zijn hubgenen in het PPI-netwerk van 85 genen die de twee transcriptomische subtypes definiëren en gelijktijdig kunnen worden gereguleerd door transcriptiefactoren, waaronder ATF3, BRD2, BRD4 en CEBPA.

De twee verschillende clusters werden geïdentificeerd op basis van het genexpressiepatroon, wat suggereert dat AD een significante heterogeniteit in genexpressie vertoont. Eerdere studies hebben aangetoond dat deze heterogeniteit kan worden veroorzaakt door genetische, epigenetische en immuungemedieerde mechanismen die verschillende moleculaire endotypes ^5,30,31 definiëren. Tussen de twee clusters werd ook verschillende immuuncelinfiltratie waargenomen: cluster 1 gekenmerkt door regulerende T-cellen en cluster 2 verrijkt met folliculaire helper T (Tfh)-cellen, wat wijst op onderliggende immunologische heterogeniteit en mogelijk verschillende ziektemechanismen in de AD-cohort. Een door Treg gedomineerde cluster suggereert een immuunomgeving waar regulerende mechanismen prominent aanwezig zijn, mogelijk als teken van pogingen om ontsteking te beheersen of een compenserende reactie op chronische immuunactivatie^32,33. Bij AD kan de Treg-functie echter verzwakt zijn ondanks verhoogde aantallen, wat ontsteking mogelijk niet effectief onderdrukt. Daarentegen wijst een Tfh-verrijkt cluster op verbeterde B-celhulp, verhoogde kiemcentrumactiviteit en waarschijnlijk verhoogde IgE-productie, wat kenmerken zijn van allergische reacties en ernstigere of extrinsieke vormen van AD^34,35. Tfh-cellen staan bekend om hun ondersteuning voor B-celdifferentiatie en het wisselen van antistofklassen, en hun uitbreiding correleert met ziekteactiviteit en allergische sensitisatie³⁶. De aanwezigheid van deze verschillende clusters kan verschillende klinische fenotypes, ziekteernst of therapieresponsen weerspiegelen en benadrukt het belang van gepersonaliseerde benaderingen in AD-onderzoek en behandeling.

Het is bekend dat mitochondriale disfunctie een belangrijke rol speelt in de pathogenese van AD via mechanismen zoals het handhaven van de epidermale barrière³⁷, het produceren van reactieve zuurstofsoorten³⁸ en het reguleren van immuuncelrespons³⁹. Vier mitochondriale eiwitten werden geïdentificeerd als centrale knooppunten van genen die geassocieerd zijn met transcriptomische differentiatie, die het moleculaire subtype met hoge nauwkeurigheid kunnen voorspellen (AUC>0,7). Hoewel geen eerdere studie een directe link van deze genen met AD heeft aangetoond, suggereren deze resultaten dat ze potentiële biomarkers zijn voor het stratificeren van AD-patiënten en het beoordelen van mitochondriale disfunctie bij AD-patiënten. BAD (BCL2-geassocieerde agonist van celdood) is een pro-apoptotisch lid van de BCL-2-familie dat betrokken is bij mitochondriale apoptotische signalering; de upregulatie in Cluster 1 kan een verbeterde mitochondriale apoptotische priming in dit subtype weerspiegelen. BOLA1 is een mitochondriaal eiwit dat betrokken is bij de biogenese van ijzer-zwavelclusters en de regulatie van oxidatieve stress. CHCHD5 (coiled-coiled-helix-coiled-coiled-helix domein containing 5) is een mitochondriaal binnenmembraaneiwit dat geassocieerd is met de organisatie van cristae en de efficiëntie van de elektronentransportketen. ISOC2 (isochorismatase-domein met 2) is in verband gebracht met metabole processen en mitochondriale functie. De gecoördineerde upregulatie van deze vier genen in Cluster 1 wijst op een staat van verhoogde mitochondriale metabole activiteit en apoptotische signalering in deze AD-subgroep.

Deze studie kent verschillende beperkingen. Hoewel deze studie twee moleculaire subgroepen identificeerde met verschillende genexpressie in mitochondriale genen en gescheiden immuuncelinfiltratie, ontbreken we gedetailleerde klinische fenotypegegevens die het mogelijk maken de stratificatie te correleren met de ernst van de ziekte en longitudinale behandelingsresponsen. Om volledig te begrijpen wat de hoge expressie van deze vier hubgenen in Cluster 1 betekent, zouden toekomstige studies uitgebreide klinische metadata moeten integreren en idealiter functionele validatie moeten uitvoeren in keratinocyt- of muismodellen. Daarnaast is deze studie gebaseerd op publiek beschikbare bulk RNA-seq data; Hoewel het krachtig is in grootschalige analyse, mist het resolutie bij specifieke celtypen. Deze beperking maakt het lastig om te bepalen of de waargenomen differentiële expressie van mitochondriale genen afkomstig is van keratinocyten, infiltrerende immuuncellen of andere huidresidente celpopulaties. Met het brede gebruik van single-cell en ruimtelijke transcriptomische benaderingen zou toekomstig onderzoek veel profiteren van de kracht om de expressiesignalen te deconvoluteren en een nauwkeuriger overzicht te geven van het transcriptomische profiel op cellulair niveau. Daarnaast zijn alle gegevens verkregen uit punchbiopsiemonsters, die huid van volledige dikte bemonsteren. Toekomstige studies met tape-strip RNA-seq kunnen een complementaire niet-invasieve benadering bieden voor het profileren van het oppervlakkige epidermale transcriptoom en kunnen de geïdentificeerde subgroepsignaturen valideren in een minimaal invasieve omgeving. Toekomstige integratie van single-cell RNA-seq en ruimtelijke transcriptomische gegevens zou de resolutie van celtype-specifieke mitochondriale signaturen in de huid van AD verder bevorderen.

Concluderend onderzocht deze studie de transcriptomische heterogeniteit van AD in 266 monsters, identificeerde belangrijke mitochondriale genen en unieke immuuncelinfiltratie, waarbij de subgroepen werden onderscheiden. Deze bevindingen verbeteren het begrip van de moleculaire heterogeniteit van AD en benadrukken het potentieel voor het ontwikkelen van precisiebehandelingsmethoden gebaseerd op specifieke moleculaire profielen.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs geven geen belangenconflict aan.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
CIBERSORT	Stanford University	v0.1.0; immune cell deconvolution; https://cibersortx.stanford.edu
clusterProfiler	Bioconductor	v4.12.6; GSEA and GO/KEGG enrichment analysis; https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler
ConsensusClusterPlus	Bioconductor	v1.64.0; unsupervised consensus clustering; https://bioconductor.org/packages/ConsensusClusterPlus
DESeq2	Bioconductor	v1.46.0; differential gene expression analysis; https://bioconductor.org/packages/DESeq2
Gene Expression Omnibus (GEO)	NCBI	Public transcriptomic data repository; datasets GSE121212, GSE157194, GSE193309, GSE277961; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo
ggplot2	CRAN	Data visualisation; https://ggplot2.tidyverse.org
ggraph	CRAN	Graph and network visualisation; https://ggraph.data-imaginist.com
GseaVis	GitHub (junjunlab)	v0.1.0; GSEA visualisation; https://github.com/junjunlab/GseaVis
hTFtarget	Huazhong University of Science and Technology	Human transcription factor target database; http://bioinfo.life.hust.edu.cn/hTFtarget
igraph	CRAN	Network construction and visualisation; https://igraph.org
limma	Bioconductor	removeBatchEffect function; https://bioconductor.org/packages/limma
MitoCarta3.0	Broad Institute	Curated mitochondrial protein database; https://www.broadinstitute.org/mitocarta
MSigDB (Hallmark gene sets)	Broad Institute	Gene set database for GSEA; https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb
org.Hs.eg.db	Bioconductor	Human genome annotation database; https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db
R	R Core Team	Statistical computing environment; https://www.r-project.org
STRING	EMBL	v12.0; protein-protein interaction database; https://string-db.org
sva (ComBat-seq)	Bioconductor	v3.44.0; batch effect correction; https://bioconductor.org/packages/sva
WGCNA	CRAN	v1.73; weighted gene co-expression network analysis; https://cran.r-project.org/package=WGCNA

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Transcriptomische analyse toont mitochondriale gedreven subgroepen bij atopische dermatitislaesies

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Materials

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles