Een Mendeliaanse randomisatiestudie van immuunceleigenschappen en plasmametabolieten bij Hashimoto's thyreoïditis

Samenvatting

Met behulp van twee-steekproef Mendeliaanse randomisatie- en mediatieanalyses identificeert deze studie 32 fenotypes van immuuncellen en 9 plasmametabolieten die causaal geassocieerd zijn met Hashimoto's thyreoïditis en ondersteunt een gedeeltelijke CD39+Treg-isovalerylcarnitine (C5)-HT immunometabole as. Voorlopige flowcytometrie en metabolomische gegevens bieden initiële biologische plausibiliteit die consistent is met deze route.

Samenvatting

Hashimoto's thyreoïditis (HT) is een auto-immuunziekte van de schildklier. Hoewel immuuncellen betrokken zijn bij de pathogenese ervan, zijn hun specifieke rollen nog niet volledig verduidelijkt. Er werd een twee-steekproef Mendeliaanse randomisatieanalyse (MR) uitgevoerd waarin genome-wide association study (GWAS) samenvattende statistieken werden geïntegreerd uit grote publieke datasets voor immuunceleigenschappen (ebi-a-GCST90001391 tot ebi-a-GCST90002121), plasmametabolieten (GCST90199621-9020102) en HT (ebi-a-GCST90018855). Causale effecten werden geschat met inverse variantie-gewogen (IVW) methoden, met MR-Egger, gewogen mediaan en leave-one-out analyses om pleiotropie en robuustheid te beoordelen. Bidirectionele en mediatie-MR-analyses werden verder toegepast om richting te testen en potentiële metaboliet-gemedieerde routes te identificeren. CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD39⁺Treg-cellen werden gekwantificeerd in perifere bloedmonsters met behulp van flowcytometrie. Isovalerylcarnitine (C5) werd gemeten met vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie. IVW-analyse identificeerde 32 fenotypes van immuuncellen die significant geassocieerd zijn met het HT-risico (P < 0,05 na FDR-correctie). Omgekeerde MR-analyse toonde aan dat HT positief causaal geassocieerd was met 2 immuunkenmerken, terwijl 4 immuunkenmerken (allemaal P < 0,05) omgekeerd geassocieerd waren met HT. Gevoeligheidsanalyses toonden geen horizontale pleiotropie of heterogeniteit aan. Daarnaast identificeerde de IVW-methode voorlopig 9 plasmametabolieten als causaal gerelateerd aan HT, waaronder risicoverhogend C5 (OR = 1,120, 95% BI: 1,032-1,215, P = 0,006) en beschermende ergothioneïne (OR = 0,958, 95% BI: 0,927-0,990, P = 0,010). Tweestaps MR-mediatie identificeerde C5 als kandidaat-mediator die CD3⁺ CD39⁺ Treg met HT verbindt (mediatieverhouding 8,89%, 95% BI: 2,34%-15,4%, P = 0,008). Flowcytometrie verhoogde CD39⁺Treg-niveaus en plasma C5 bij HT-patiënten, waarbij C5 positief correleerde met de verhouding CD39⁺Treg-cellen. Deze studie stelt nieuwe oorzakelijke verbanden vast tussen immuuncelfenotypes en HT, en benadrukt plasmametabolieten, met name C5, als potentiële mediatoren in de pathogenese van HT. Deze bevindingen verdiepen het mechanistische begrip van auto-immuunziekte van de schildklier en kunnen toekomstige biomarker- en therapeutische doelwitontdekking sturen.

Inleiding

Hashimoto's thyreoïditis (HT) is een veelvoorkomende auto-immuunziekte waarbij het immuunsysteem de schildklier aanvalt, wat leidt tot hypothyreoïdie ^1,2. Recente studies hebben een gestage jaarlijkse toename van de incidentie van HT gemeld. In China wordt de prevalentie geschat op 0,2% tot 1,3^%. De exacte oorzaak van HT is onbekend, hoewel men denkt dat de pathogenese een complexe interactie omvat van genetische, omgevings- en immuunsysteemcomponenten ^4,5.

De ontwikkeling van HT wordt sterk beïnvloed door het immuunsysteem ^6,7,8. Afwijkende immuunresponsen richten zich op schildklierweefsel, waardoor de productie van autoantilichamen wordt gestimuleerd, waaronder anti-thyroïde peroxidase (anti-TPO) en anti-thyroglobuline (anti-Tg)⁹. Deze autoantilichamen interageren met schildkliercellen, wat immuungemedieerde celdood en ontstekingsreacties veroorzaakt, wat resulteert in een verminderde schildklierfunctie¹⁰. De specifieke pathogene routes, met name de metabole signalen die de dysfunctie van immuuncellen aansturen, zijn nog niet volledig begrepen. Regulerende T-cellen (Tregs), vooral die welke CD39 tot expressie brengen, spelen een cruciale rol bij het behouden van immunologische tolerantie door extracellulaire ATP te hydrolyseren tot immunosuppressieve adenosine. Verstoringen in de Treg-functie of hun metabole omgeving kunnen leiden tot een verstoring van de zelftolerantie, maar de causale relatie tussen specifieke Treg-subsets en HT moet nog worden opgehelderd 11,12,13,14,15,16.

Traditionele observationele studies worden vaak beperkt door verstorende variabelen en het potentieel voor omgekeerde causaliteit, wat het moeilijk maakt om definitieve causale relaties tussen immuuncelfenotypes en HT¹⁷ vast te stellen. Bovendien, omdat HT een systemische ziekte is die wordt beïnvloed door verschillende immuunsubsets en metabole intermediairen, kan een nauwe focus op individuele kandidaten nieuwe pathogene oorzaken over het hoofd zien¹⁸. Daarom is een grootschalige screeningsbenadering noodzakelijk om een onbevooroordeeld en uitgebreid landschap te bieden van de immunometabole factoren die bijdragen aan HT. Recente ontwikkelingen in genoombrede associatiestudies (GWAS) hebben uitgebreide gegevens opgeleverd over fenotypes van immuuncellen en plasmametabolieten, wat nieuwe wegen biedt om de onderliggende mechanismen van HT¹⁹ te onderzoeken. Mendeliaanse randomisatie (MR) volgt de principes van willekeurige toewijzing van Mendeliaanse gameten en vrije combinaties¹⁶ en het benutten van enkele nucleotidepolymorfismen (SNP's) als instrumentele variabelen (IV's) om potentiële causale effecten van blootstellingen op uitkomsten ^20,21 af te leiden. Deze methode helpt de invloed van confounding factors en omgekeerde causaliteit te beperken, die traditionele observationele studies vaak bemoeilijken^16,22.

In het licht van deze ontwikkelingen is het doel van deze studie tweeledig. Eerst werd een verkennende, hypothese-genererende analyse uitgevoerd met een MR-framework van twee steekproeven om systematisch 731 fenotypes van immuuncellen en 1.400 plasmametabolieten te screenen om nieuwe kandidaat-risicofactoren voor HT te identificeren. Ten tweede werd de overgang gemaakt naar een hypothese-gedreven onderzoek om de specifieke medicatierol van geïdentificeerde metabolieten, zoals isovalerylcarnitine, in het pad dat regulerende T-cellen koppelt aan het HT-risico te evalueren. Deze studie integreert daarom grootschalige MR-screening met mediatie-analyse en voorlopige klinische validatie om genetisch onderbouwd bewijs te leveren dat consistent is met een verondersteld immunometabolisch kader (Treg–metaboliet–HT), terwijl de verkennende aard van deze bevindingen wordt benadrukt. Door deze precieze causale ketens te identificeren, worden nieuwe perspectieven op de metabole regulatie van schildklierauto-immuniteit geboden, samen met sterke kandidaten voor toekomstige therapeutische targeting.

Protocol

De studie werd goedgekeurd door de Medische Ethische Commissie van het Affliated Hospital van de Inner Mongolia Medical University. Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en de relevante ethische richtlijnen. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd van alle deelnemers verkregen voorafgaand aan de start van de onderzoeksgerelateerde procedures. Deze studie omvatte twee groepen deelnemers: de groep met Hashimoto-thyreoïditis (HT, n = 10) en de gezonde controlegroep (gezond, n = 10). De twee groepen werden op leeftijd en geslacht gematcht. Alle perifere bloedmonsters werden afgenomen van poliklinische patiënten of personen die routinematig gezondheidsonderzoek ondergingen, waarbij bloed werd afgenomen in de ochtend na een nachtelijke vasten.

Studieontwerp

In deze studie werden een MR-analyse van twee steekproeven en een mediatieanalyse gebruikt om de causale relatie tussen 731 fenotypes van immuuncellen (7 groepen) en HT te evalueren, en onderzocht de potentiële modulerende rol van plasmametabolieten in deze relatie. De analytische workflow bestond uit 5 opeenvolgende stappen: (1) selectie van blootstellings-GWAS-datasets voor immuunfenotypen; (2) selectie van de uitkomst-GWAS-dataset voor HT; (3) instrumentele variabelenidentificatie en harmonisatie; (4) primaire twee-steekproef MR-analyse en bidirectionele validatie; en (5) tweestaps mediatie-MR-analyse. Een schematisch overzicht van het studieontwerp wordt weergegeven in Aanvullende Figuur 1. Bij MR-analyse dienen genetische varianten als proxy's voor aanpasbare blootstellingen. Voor geldige causale inferentie moeten instrumentele variabelen (IV's) aan drie fundamentele criteria voldoen: (1) ze zijn sterk geassocieerd met de relevante blootstelling; (2) ze onafhankelijk zijn van eventuele confounders die zowel de blootstelling als de uitkomst kunnen beïnvloeden; en (3) ze beïnvloeden de uitkomst uitsluitend via de blootstelling, zonder alternatieve causale paden.

GWAS van de HT-databron

Om datasetcompatibiliteit te waarborgen en populatiestratificatie te minimaliseren, werden alle GWAS-samenvattende statistieken voornamelijk afgeleid van individuen van Europese afkomst. De GWAS-database (https://gwas.mrcieu.ac.uk/) leverde de HT-uitkomstgegevens en de ebi-a-GCST90018855 dataset werd gebruikt. De studie voerde GWAS uit bij 395.640 Europeanen (N_geval = 15.654, N_controle = 379.986), na kwaliteitscontrole en na interpolatie werden 24.146.037 SNP's geanalyseerd. Voor HT-specifieke confounders (bijv. geslacht, leeftijd) nam de oorspronkelijke GWAS (ebi-a-GCST90018855) deze covariaten op in hun modellen, zoals standaard in GWAS-pijplijnen.

GWAS-gegevensbronnen voor immuuncellen

Samenvattende statistieken voor GWAS gerelateerd aan immuunceleigenschappen werden verkregen uit de GWAS Catalogus, die datasets met toegangsnummers van ebi-a-GCST90001391 tot ebi-a-GCST90002121 omvatte (beschikbaar op https://www.ebi.ac.uk/gwas/). In totaal werden 731 immunologische fenotypes in de analyse opgenomen, waaronder het relatieve celaantal (n = 192), morfologische parameter (MP) (n = 389), activatiecoëfficiënten (AC, n = 118) en gemiddelde fluorescentieintensiteit (MFI, n = 389) die de mate van oppervlakteantigeen²³ aangeven. De impact van bijna 22 miljoen polymorfismen op 731 fenotypen van immuuncellen in 3757 Sardiniërs werd gedocumenteerd door de initiële GWAS op immuuncellen.

GWAS-gegevensbronnen voor plasmametabolieten

GWAS-samenvattende gegevens voor in totaal 1.400 plasmametabolieten werden gehaald uit de GWAS Catalogus (https://www.ebi.ac.uk/gwas/studies/GCST90199621-90201020), bestaande uit 1.091 individuele metabolietconcentraties en 309 metabolietverhoudingskenmerken. De GWAS-datasets die voor MR-analyse in de huidige studie werden gebruikt, zijn afkomstig van individuen van Europese afkomst. Gedetailleerde kenmerken van de gebruikte GWAS-gegevens van het plasmametaboliet zijn weergegeven in Aanvullende Tabel 1.

De GWAS-datasets voor immuuncelfenotypes (Sardijnse cohort), HT (FinnGen/EBI-a-GCST90018855) en plasmametabolieten (Europese cohorten) zijn onafhankelijk zonder overlap in de monsters, zoals bevestigd door de respectievelijke publicaties van het consortium. Dit voldoet aan de onafhankelijkheidsaanname voor twee-steekproef MR.

Selectie van instrumentele variabelen (IV's)

Er werd aangenomen dat IV's sterk geassocieerd waren met de blootstelling, terwijl ze onafhankelijk bleven van de uitkomstvariabelen. Bovendien werd alleen verondersteld dat de blootstellingsfactor direct effect had op de uitkomst. Om geschikte IV's te identificeren, werden SNP's geassocieerd met blootstellingsfactoren geselecteerd met een significantieniveau van 5 × ^10-8. Om rekening te houden met linkage disequilibrium (LD) werden SNP's gebundeld met een^R2-drempel van 0,001 binnen een venstergrootte van 10.000 kilobases (kb). Varianten met paargewijze R² > 0,001 binnen deze afstand werden uitgesloten om de onafhankelijkheid van de geselecteerde instrumentele variabelen te waarborgen en mogelijke LD-correlaties uit te sluiten. Heterogeniteitstests sloten significant heterogene SNP's uit met een F-statistiek < 10. Ten slotte werd, om het effect van confounders op de IV's te controleren, P < 1×^10-5 genomen om palindromische SNP's en incompatibele SNP's te elimineren, waarbij geldige SNP's als instrumentele variabelen werden behouden.

Twee-steekproef Mendeliaanse randomisatieanalyse

Om de bidirectionele causale relatie tussen immuuncelfenotypes en HT te evalueren, werden zowel twee-steekproef Mendeliaanse randomisatie (MR) analyses als mediatie-MR-analyses uitgevoerd. Specifiek werd twee-steekproef MR toegepast om meerdere immuuncel-gerelateerde eigenschappen te beoordelen. Voor deze analyses werden verschillende complementaire MR-methoden gebruikt, waaronder inverse variantieweging (IVW)²⁴, MR-Egger regressie²⁵, de gewogen mediaan schatter (WME)²⁶, mode-gebaseerde eenvoudige schatting²⁷ en gewogen mode-gebaseerde schatting. Hiervan werd IVW aangewezen als de primaire analytische benadering, met statistische significantie gedefinieerd als P < 0,05. De IVW-methode werd gekozen als primaire MR-schatter vanwege de optimale balans tussen precisie en de aanname van gebalanceerde pleiotropie. De IVW-methode verhoogt de precisie door SNP's met kleinere varianties meer gewicht toe te kennen, waardoor betrouwbaardere causale schattingen worden opgeleverd. MR-Egger-regressie werd gebruikt voor pleiotropiebeoordeling, een proces waarbij genen meerdere fenotypen beïnvloeden. Als de interceptie aangaf dat er geen significante horizontale pleiotropie was (P > 0,05), combineerde deze benadering de interceptbeoordeling om pleiotropie te bepalen. Heterogeniteit werd geëvalueerd met behulp van de Q-statistiek van de MR-Egger- en IVW-methoden, die meet in hoeverre genetische variatie het fenotype beïnvloedt, als P > 0,05 aangeeft dat er geen significante heterogeniteit is in de effecten van genetische variatie. Bonferroni-gecorrigeerde drempels werden toegepast om rekening te houden met 731 immuunfenotypes (P < 6,84 × 10⁻⁵) en 1.400 metabolieten (P < 3,57 × 10⁻⁵). Belangrijke resultaten overleefden de correctie, tenzij anders vermeld. Daarnaast werd omgekeerde causaliteit geëvalueerd met dezelfde MR-methode om te onderzoeken of immuuncelkenmerken door HT werden beïnvloed. Bij de omgekeerde MR-studie werd HT beschouwd als de blootstellingsfactor en werden verschillende kenmerken van immuuncellen als uitkomst beschouwd.

In deze studie werd mediatieanalyse uitgevoerd met behulp van een tweestaps MR-kader om te onderzoeken of plasmametabolieten fungeren als tussenpersonen in de causale route die immuuncelfenotypen aan HT koppelt. Deze aanpak maakt het mogelijk om het totale causale effect van immuuncelfenotypes op HT te verdelen in een direct effect en een indirect effect dat via de geïdentificeerde metabole tussenproducten wordt overgedragen. Het totale effect van immuuncellen op HT werd eerst geschat, gevolgd door het effect van immuuncellen op metabolieten (β1), het effect van metabolieten op HT (β2) en het mediatoreffect (β1*β2), waarbij het directe effect werd berekend als het totale effect minus het mediatoreffect. Totaal effect (β_totaal) = Direct effect (β_direct) + Indirect effect (β_indirect); Indirect effect = β1 × β2; Het aandeel gemedieerd (%) = (β1 × β2)/βtotaal × 100%, waarbij β1 het causale effect is van het fenotype van de immuuncel op het plasmametaboliet, en β2 het causale effect van het plasmametaboliet op HT. De delta-methode werd gebruikt om 95% betrouwbaarheidsintervallen voor het indirecte effect te schatten. Verder werd een reverse intermediary MR-analyse uitgevoerd om de causale effecten van HT op metabolieten en metabolieten op immuuncellen te onderzoeken, om de resultaten van forward MR aan te vullen en de betrouwbaarheid van causale inferentie te vergroten. Alle analyses werden uitgevoerd door een statistische computeromgeving en relevante MR-gerelateerde softwarepakketten, die staan vermeld in de Materiaaltabel.

CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD39⁺ Tregdetectie

50 μL anticoagulerend volbloed werd grondig gemengd in een reageerbuis met elk 10 μL van de doelgerichte CD3, CD4, CD25 en CD39 monoklonale antilichamen. Het mengsel werd beschermd tegen licht en 15 minuten op kamertemperatuur gehouden. Vervolgens werd 2 mL van een 1:10 verdunde FACS Lysing-oplossing toegevoegd. De buis werd nog eens 10 minuten geïncubeerd op kamertemperatuur, terwijl hij tijdens de lysatie beschermd was tegen licht. De buis werd 5 minuten gecentrifugeerd op ~300 x g en het supernatant werd verwijderd. Na toevoeging van 2 mL fosfaatbufferoplossing (PBS) werd de buis opnieuw gecentrifugeerd op ~300 x g gedurende 5 minuten. De supernatant werd verwijderd en 500 μL PBS werd toegevoegd voor detectie. De detectie werd uitgevoerd met een multi-laser flowcytometer en geanalyseerd door de bijbehorende acquisitie- en analysesoftware om de verhouding CD3⁺CD4⁺CD25⁺Tregs en de subset die CD39 uitdrukt (CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD39⁺Tregs) te verkrijgen.

Meting van Isovalerylcarnitine (C5) niveaus

Gegevens over de C5-waarden van patiënten zijn verkregen van de afdeling Klinisch Laboratorium van het Ziekenhuis van de Inner Mongolia Medical University. Specifiek werd C5 gemeten als onderdeel van routinematige vloeistofchromatografie–tandem massaspectrometrie (LC–MS/MS), volgens gestandaardiseerde laboratoriumprocedures en kwaliteitscontroleprotocollen.

Statistische analyse

Alle statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van een statistische softwareomgeving. Continue variabelen werden vergeleken met behulp van de Student's t-test voor normaal verdeelde data of de Wilcoxon rangsomtest voor niet-normaal verdeelde gegevens. Categorische variabelen werden geanalyseerd met behulp van de chi-kwadraattest. Pearson-correlatieanalyse werd gebruikt om een correlatieanalyse uit te voeren. Een p-waarde < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

Genetische causale effecten van immuuncelfenotypes op HT

Na het uitsluiten van potentiële verrengelende factoren en de afwezigheid van horizontale pleiotropie (P > 0,05) werd een MR-analyse van twee steekproeven uitgevoerd om de oorzakelijke effecten van immuuncelfenotypes op het risico van HT te beoordelen. Voor elk fenotype van immuuncellen dat als blootstelling werd gebruikt, werd de F-statistiek berekend om de sterkte van instrumentele variabelen te evalueren. Alle instrumenten overschreden de conventionele drempel van F > 10, wat wijst op minimale zwakke instrumentbias. Gedetailleerde F-statistieken voor de belangrijkste immuuneigenschappen die in de hoofdtekst worden besproken, zijn opgenomen in Aanvullende Tabel 2. In totaal toonden 32 immuungerelateerde fenotypes significante associaties met HT-risico (P < 0,05) (Figuur 1). De robuustheid van deze bevindingen werd ondersteund door scatterplotanalyses (Aanvullende Figuur 2A,B) en gevoeligheidsanalyses met de leave-one-out-benadering (Aanvullende Figuur 3A,B).

Onder de belangrijkste bevindingen toonde het tregfenotype de meest uitgebreide betrokkenheid, waarbij CD3 op CD39+ Treg afscheidde (OR = 1,063; 95% BI: 1,023–1,105; P = 0,002) en CD39+ activeerde Treg %geactiveerd Treg (OR = 1,081; 95% BI: 1,008–1,161; P = 0,030) die naar voren kwamen als belangrijke risicogerelateerde kenmerken die vervolgens werden geprioriteerd voor mediatieanalyse. In de rijpingsstadia van T-cellen vertoonde CD3 op CM CD8br de grootste effectgrootte onder risicogerelateerde kenmerken (OR = 1,094; 95% BI: 1,040–1,150; P < 0,001), terwijl TD DN (CD4⁻CD8⁻) AC een opvallende beschermende associatie vertoonde (OR = 0,930; 95% BI: 0,881–0,982; P = 0,009). Onder B-celfenotypes vertoonden HLA-DR-expressieve myeloïde celsubsets consequent risicoverhogende effecten, waarbij HLA DR op CD33dim HLA DR+ CD11b⁻ OR = 1,095 bereikte (95% BI: 1,032–1,162; P = 0,003). Volledige resultaten over alle zes immuuncelcategorieën: cDC, Treg, T-celrijpingsstadia, TBNK, monocyten, B-cel en myeloïde celfenotypes worden samengevat in Figuur 1.

Gevoeligheidsanalyses bevestigden de resultaten verder. Er werd geen significant bewijs van heterogeniteit en horizontale pleiotropie vastgesteld op basis van relevante statistische beoordelingen (Aanvullende Tabel 3 en Aanvullende Tabel 4). Deze resultaten werden bevestigd door de "leave-one-out"-analyse.

De oorzakelijke effecten van HT op immuuncellen

De resultaten toonden aan dat HT positief causaal geassocieerd was met 2 immuunkenmerken: de Secreting CD4 regulerende T-cel (1.143: 1.023-1.277; P = 0,018) en monocytische myeloïde-afgeleide suppressorcellen (1,373: 1,058-1,782; P = 0,017). Daarentegen was HT negatief causaal geassocieerd met 4 immuunkenmerken: geactiveerde CD4 regulerende T-cel (0,818: 0,679-0,987; P = 0,036), geactiveerde CD4+ regulerende T-cel (0,790: 0,676-0,924; P = 0,003), geactiveerde en rustende CD4 regulerende T-cel (0,871: 0,780-0,974; P = 0,015) en CD25++ CD4+ T-cel (0,855: 0,747-0,980; P = 0,017) (Figuur 2). Deze bevindingen suggereren een wederzijdse relatie tussen HT- en Treg-activatiestaten, wat mogelijk een ziekte-gedreven immuunremodeling weerspiegelt. Spreidingsdiagrammen (Aanvullende Figuur 4) en de "leave-one-out"-methode (Aanvullende Figuur 5) verifieerden de stabiliteit van de resultaten. Gevoeligheidsanalyses valideerden de resultaten ook. De sterkte van deze resultaten werd bevestigd door beoordelingen van heterogeniteit en horizontale multipliciteit (Aanvullende Tabel 5 en Aanvullende Tabel 6). Deze conclusies worden ondersteund door de "leave-one-out"-analyse.

Genetische causale effecten van plasmametabolieten op HT

Na het selecteren van geschikte instrumentele variabelen en het uitsluiten van ketenonevenwichtigheden en zwakke instrumenten, werden in totaal 34.843 SNP's geassocieerd met plasmametabolieten geïdentificeerd, met een minimale F-statistiek van 19,50 (Aanvullende Tabel 7). Met de IVW-methode werden voorlopig 9 plasmametabolieten gevonden als causaal geassocieerd met HT. Hiervan waren 4 metabolieten positief geassocieerd met een verhoogd risico op HT: glucose-naar-maltoseverhouding (1,195: 1,082-1,319; P < 0,001), Taurocholiczuur (1,190: 1,073-1,321; P = 0,001), 5-hydroxymethyl-2-furoylcarnitine (1,127: 1,046-1,215; P = 0,002), en C5 (1,120: 1,032-1,215; P = 0,006) (Tabel 1).

Omgekeerd kunnen 5 metabolieten negatief geassocieerd zijn met het risico op HT, waaronder Ergothioneine (0,958: 0,927-0,990; P = 0,010), carnitine tot propionylcarnitine (C3) verhouding (0,895: 0,825-0,970; P = 0,007), adenosine 5'-difosfaat (ADP) tot N-acetylneuraminaat verhouding (0,890: 0,823-0,963; P = 0,004), arginine-glutamaatverhouding (0,882: 0,802-0,968; P = 0,009), en 1-(1-enyl-palmitoyl)-2-linoleoyl-GPE (p-16:0/18:2) (0,873: 0,798-0,955; P = 0,003).

Gevoeligheidsanalyses valideerden de resultaten ook. De sterkte van deze resultaten werd bevestigd door beoordelingen van heterogeniteit en horizontale multipliciteit (Aanvullende Tabel 8 en Aanvullende Tabel 9). Deze conclusies worden ondersteund door de "leave-one-out"-analyse.

Mediatie van het immuuncel-HT-risico door plasmametabolieten

Voortbouwend op de eerder geïdentificeerde fenotypes en plasmametabolieten van immuuncellen werd een MR-strategie van twee monsters toegepast om potentiële mediaterende effecten te schatten. In de eerste stap werden MR-analyses uitgevoerd met 32 immuuncelfenotypes als blootstelling en 9 plasmametabolieten als uitkomsten, waarbij 12 significante causale associaties werden aangetoond met 10 immuuncelfenotypes en 8 plasmametabolieten, met overeenkomstige effectschattingen β1 van immuuncellen naar metabolieten. Van deze werd de meest significante associatie vastgesteld tussen CD3 op CD39+ die Trog-cellen afscheiden en C5-niveaus (1,050: 1,016-1,085; P = 0,004). In de tweede stap werd C5 behandeld als de blootstelling en HT als het resultaat. MR-analyses werden uitgevoerd, waaronder MR-PRESSO uitschieters detectie en evaluaties op heterogeniteit en horizontale pleiotropie. Er werden geen uitschieters van SNP's of bewijs van heterogeniteit of pleiotropie gedetecteerd (Tabel 2), waardoor we het causale effect van het plasmametaboliet op HT (β2) kunnen schatten (Aanvullende Figuur 6).

In de laatste stap van de MR-analyse werden mediatieanalyses uitgevoerd om te verduidelijken of het causale effect van immuuncelfenotypes op HT werd gemedieerd via plasmametabolieten. De resultaten gaven aan dat verhoogde C5-niveaus als mediator fungeerden in de route die CD3 op CD39+ afscheidende Treg-cellen koppelde aan een hoger risico op het ontwikkelen van HT (Aanvullende Figuur 7 en Figuur 3). MR-PRESSO uitschietersdetectie, heterogeniteit en pleiotropietests toonden geen bevooroordeelde SNP's en geen tekenen van heterogeniteit of horizontale pleiotropie (Tabel 3, Aanvullende Tabel 10 en Aanvullende Tabel 11). Van hen was het mediarender aandeel van C5-niveaus 8,89% (2,34% tot 15,4%) (P = 0,008). Ten slotte werden omgekeerde mediatie-MR-analyses uitgevoerd om richtingsaannames rigoureus te testen. Voor metabolieten naar immuuncellen toonde reverse MR (C5-niveaus tot CD33 op CD39+ die Treg afscheidt) geen significante causale effecten (IVW P > 0,05 na Bonferroni-correctie), wat unidirectionaliteit ondersteunt (Tabel 4). Voor HT naar metabolieten toonde reverse MR (HT naar C5-niveaus) geen causale associaties (IVW P > 0,05 na Bonferroni-correctie), wat de veronderstelde richting ondersteunt (Tabel 5). Gezien het bescheiden totale effect en het gebrek aan wederzijds bewijs bij bidirectionele MR, moeten deze bemiddelingsresultaten als verkennend worden beschouwd.

Flowcytometrie-assay CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD39⁺ Treg-detectie

Om de bevindingen van de metabolomics-analyse te valideren, werd in vitro experimentele validatie uitgevoerd om de expressiekenmerken van CD39⁺ Treg en het plasma C5 te beoordelen. Flowcytometrie werd gebruikt om Treg-cellen (CD3⁺CD4⁺CD25⁺) en hun CD39⁺subsets (CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD39⁺) te kwantificeren in perifeer bloed van patiënten met HT en gezonde controles. Zoals weergegeven in Figuur 4A–C, waren zowel Treg-cellen (CD3⁺CD4⁺CD25⁺) als CD39⁺ Trog-subsets significant verhoogd bij HT-patiënten vergeleken met gezonde personen (P < 0,001). Gerichte plasmametabolomische profilering met behulp van tandemmassaspectrometrie toonde verder aan dat de C5-niveaus in de HT-groep aanzienlijk hoger waren (P < 0,001, Figuur 4D). Daarnaast toonde Pearson-correlatieanalyse een positieve associatie aan tussen plasma-C5-niveaus en de frequentie van CD39⁺Treg-subset (Figuur 4E), consistent met de veronderstelde CD39⁺Treg-C5-HT-route die door MR is geïdentificeerd. Het dwarsdoorsnedontwerp en de kleine steekproefgrootte sluiten echter causale inferentie uit alleen deze gegevens uit.

BESCHIKBAARHEID GEGEVENS:

De samenvattende statistieken voor Hashimoto's thyreoïditis voor de genome-wide association study (GWAS) zijn verkregen uit de GWAS Catalogus (ebi-a-GCST90018855; https://gwas.mrcieu.ac.uk/). Samenvattende statistieken voor immuuncelkenmerken zijn opgehaald uit de GWAS-catalogus (ebi-a-GCST90001391 tot ebi-a-GCST90002121; https://www.ebi.ac.uk/gwas/). Plasmametaboliet-GWAS-gegevens werden verkregen uit de GWAS Catalogus (GCST90199621-GCST90201020; https://www.ebi.ac.uk/gwas/studies/GCST90199621-90201020). Gegevens ter ondersteuning van de bevindingen van deze studie zijn beschikbaar in Aanvullend Dossier 1.

Figuur 1: Forest-grafiek die de causale effecten van immuuncelkenmerken op Hashimoto-thyreoïditis toont . Bosplot dat de causale effecten van alle immuuncelkenmerken samenvat, evalueerd in deze studie op Hashimoto-thyreoïditis (HT). Afkortingen: nsnp, aantal enkel-nucleotide polymorfismen (SNP's); pval, P-waarde; OF, kansverhouding; CI, betrouwbaarheidsinterval. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Forest plot dat de causale effecten van Hashimoto thyreoiditis op immuuncelfenotypes toont . Forest plot dat de causale effecten van HT op verschillende fenotypes van immuuncellen samenvat. Afkortingen: nsnp, aantal SNP's; pval, P-waarde; OF, kansverhouding; CI, betrouwbaarheidsinterval. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Forestplot dat het mediatie-effect van het plasma isovalerylcarnitine (C5) tussen CD39+ en Hashimoto-thyreoiditis toont. Forest plot die de causale effecten van plasma C5 samenvat die de associatie tussen CD39+ en HT bemiddelen. Afkortingen: OR, odds ratio; CI, betrouwbaarheidsinterval. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Expressie van CD39+ regulerende T-cellen en plasma isovalerylcarnitine (C5) niveaus bij patiënten met Hashimoto-thyreoïditis. (A) Flow cytometrie gatingstrategie voor regulerende T (Treg; CD3+CD4+CD25+) cellen en CD39+ Treg-cellen. (B) Totale Trek-celniveaus. (C) CD39+ Treg-celniveaus. (D) Plasma isovalerylcarnitine (C5) niveaus gemeten met tandem massaspectrometrie. (E) Pearson-correlatieanalyse tussen plasma isovalerylcarnitine (C5)-niveaus en het aandeel CD39+ Treg-cellen. Afkortingen: SSC-A, zijverstrooiingsgebied; FSC-A, voorste verstrooiingsgebied; FSC-H, voorwaartse verstrooiingshoogte. P < 0,001 versus gezonde controles. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Causale effecten van negen significant geassocieerde plasmametabolieten op Hashimoto-thyreoïditis.  Klik hier om dit bestand te downloaden.

Tabel 2: Causaal effect van isovalerylcarnitine (C5) niveaus op Hashimoto thyreoïditis (β₂). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Tabel 3: Causaal effect van CD3+CD39+ regulerende T-cellen op Hashimoto-thyreoïditis. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Tabel 4: Causaal effect van isovalerylcarnitine (C5) niveaus op CD3+CD39+ regulerende T-cellen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Tabel 5: Causaal effect van Hashimoto-thyreoïditis op isovalerylcarnitine (C5) niveaus. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 1: Studieontwerp en analyseworkflow. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 2: Scattergrafieken die causale schattingen tonen voor de associaties tussen 32 immuuncelkenmerken en Hashimoto-thyreodititis. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 3: Leave-one-out analyses die de robuustheid van de causale effecten van 32 immuuncelkenmerken op Hashimoto-thyreoitis evalueren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 4: Scatterdiagrammen die de oorzakelijke effecten van Hashimoto-thyreoïditis op zes immuuncelfenotypen tonen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 5: Leave-one-out analyses die de robuustheid van de causale effecten van Hashimoto-thyreoïditis op zes immuuncelfenotypes evalueren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 6: Oorzakelijk verband tussen isovalerylcarnitine (C5) niveaus en risico op Hashimoto-thyreoïditis. (A) Bosplot dat het causale effect van isovalerylcarnitine (C5) niveaus op het HT-risico (β₂) toont. (B) Scatterplot dat de schatting van het causale effect toont voor elke SNP op HT-risico. (C) Funnel plot dat de heterogeniteit van Mendeliaanse randomisatie (MR) schattingen beoordeelt voor het effect van C5-niveaus op het HT-risico. (D) Leave-one-out-analyse die aantoont dat de algemene risicoschatting niet substantieel werd beïnvloed door een individuele SNP. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 7: Causale associatie tussen CD3+CD39+ regulerende T-cellen en het risico op Hashimoto-thyreoïditis. (A) Bosplot dat het totale causale effect van CD3+CD39+ regulerende T-cellen op het HT-risico toont. (B) Scatterplot dat de schatting van het causale effect toont voor elke SNP op HT-risico. (C) Funnel plot die de heterogeniteit van MR-schattingen beoordeelt voor het effect van CD3+CD39+ regulerende T-cellen op het HT-risico. (D) Leave-one-out-analyse die aantoont dat de algemene risicoschatting niet substantieel werd beïnvloed door een individuele SNP. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Tabel 1: Kenmerken van genoombrede associatiestudiedatasets voor plasmametabolieten die worden gebruikt in Mendeliaanse randomisatieanalyse.   Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 2: Kenmerken van instrumentele variabelen (SNP's) en F-statistieken voor belangrijke fenotypes van immuuncellen die worden gebruikt als blootstellingen in Mendeliaanse randomisatieanalyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Tabel 3: Pleiotropie-beoordeling voor Mendeliaanse randomisatieanalyses van immuuncelfenotypes op Hashimoto-thyreoïditis. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Tabel 4: Heterogeniteitsbeoordeling voor Mendeliaanse randomisatieanalyses van immuuncelfenotypes op Hashimoto-thyreoiditis. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 5: Pleiotropie-beoordeling voor Mendeliaanse randomisatieanalyses van Hashimoto-thyreodie op immuuncelfenotypen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Tabel 6: Heterogeniteitsbeoordeling voor Mendeliaanse randomisatieanalyses van Hashimoto-thyreoïditis op immuuncelfenotypen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 7: Enkel-nucleotidepolymorfismen geassocieerd met plasmametabolieten. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Tabel 8: Pleiotropie-beoordeling voor Mendeliaanse randomisatieanalyses van plasmametabolieten op Hashimoto-thyreoïditis. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 9: Heterogeniteitsbeoordeling voor Mendeliaanse randomisatieanalyses van plasmametabolieten op Hashimoto-thyreoïditis. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 10: Pleiotropie-beoordeling voor mediatieanalyses van immuuncelfenotype–Hashimoto-thyreoïditis associaties door plasmametabolieten. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 11: Heterogeniteitsbeoordeling voor mediatieanalyses van associaties tussen immuuncelfenotype en Hashimoto-thyreodietis door plasmametabolieten. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend Dossier 1: Gegevens ter ondersteuning van de bevindingen van deze studie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

In deze studie werd Mendeliaanse randomisatie toegepast om de oorzakelijke impact van fenotypes van immuuncellen op Hashimoto's thyreoditis (HT) te onderzoeken en om de potentiële mediale rol van plasmametabolieten te onderzoeken. Tweeëndertig immuunfenotypen bleken geassocieerd met het risico op HT, waaronder dendritische cellen, regulerende T-cellen, T-celrijpingsstadia, B-cellen en myeloïde cellen, met zowel risicobevorderende als beschermende effecten. Bovendien vertoonden 9 plasmametabolieten causale verbanden met HT, en werd verder waargenomen dat C5 mogelijk gedeeltelijk de associatie tussen CD3-expressie op CD39⁺-afscheidende Treg-cellen en HT kan beïnvloeden. Deze bevindingen moeten worden geïnterpreteerd als bewijs van veronderstelde causale effecten die zijn afgeleid uit genetische instrumenten, in plaats van directe mechanistische bevestiging.

Onder cDC-fenotypes waren CD62L-plasmacytoïde DC %DC en HLA DR op plasmacytoïde DC geassocieerd met een verhoogd risico op HT, terwijl CCR2 op CD62L+ myeloïde DC, CD39+ activeerde Treg %geactiveerde Treg %geactiveerd Treg, en CD62L op monocyt. De vastgestelde verbanden tussen specifieke immuuncelfenotypes en HT bieden nieuwe inzichten in de pathogenese van de ziekte. Zo werd het HT-risico gecorreleerd met kenmerken zoals HLA DR op plasmacytoïde DC en CD62L-plasmacytoïde DC, wat aangeeft dat deze celtypen essentieel kunnen zijn voor het initiëren of in stand houden van auto-immuunreacties tegen de schildklier ²⁸. Talrijke onderzoeken hebben aangetoond dat HLA DR+ schildklierepitheelcellen actief immuunresponsen stimuleren binnen de schildklier van patiënten met HT 28,29,30,31. Deze studie toonde een verband aan tussen HLA DR op plasmacytoïde en een verhoogd risico op HT, wat aangeeft dat HLA DR op plasmacytoïde een oorzakelijke factor bij HT kan zijn. Eerdere studies hebben pivotale genen met hoge diagnostische nauwkeurigheid voor HT geïdentificeerd met bio-informatica-methoden, en immunoassays hebben aangetoond dat monocyteninfiltratie negatief correleert met pivotale genexpressie. Xu et ^al.32 rapporteerden dat hogere niveaus van CD62L-expressie op monocyten geassocieerd waren met een verminderd risico op HT, wat overeenkomt met de huidige bevindingen. Specifiek werden fenotypes zoals CCR2 op CD62L+ myeloïde dendritische cellen en CD62L op monocyten gekoppeld aan een beschermend effect, wat wijst op mogelijke regulerende of onderdrukkende rollen die de auto-immuniteit van de schildklier konden verminderen.

Tal van bewijzen wijzen op de cruciale rol die de balans van Th17 en Treg cellen spelen bij de ontwikkeling van HT^33,34. Dit onderzoek identificeerde een oorzakelijk verband tussen HT en verschillende kenmerken van Treg. Specifiek was het risico op het ontwikkelen van HT omgekeerd geassocieerd met CD25-expressie op CD39+ rustregulerende T-cellen, terwijl de Th17/Treg-verhouding steeg met de progressie van HT³⁵. De complexe functie van regulerende T-cellen bij het behouden van immunologische tolerantie en het voorkomen van auto-immuunziekten wordt benadrukt door de sterke correlaties van verschillende Treg-fenotypen met zowel een verhoogd als verlaagd HT-risico. Trog-cellen zijn tweevoudig, waarbij sommige subsets mogelijk auto-immuunreacties verergeren terwijl andere deze onderdrukken. Dit onderstreept de noodzaak van extra onderzoek om hun rollen in HT nauwkeurig te definiëren.

Bovendien werd binnen de T-celrijpingsstadia, TBNK, monocyten- en B-celgroepen, een consistent patroon waargenomen waarbij sommige immuunfenotypes gekoppeld waren aan een hoger risico op HT, terwijl andere een beschermend effect leken te geven 32,36,37,38. Dit benadrukt de complexe betrokkenheid van immuuncellen bij de ontwikkeling van HT. Er werd ook inverse MR-analyse uitgevoerd om het effect van HT op de kenmerken van immuuncellen te onderzoeken. De analyse toonde aan dat HT geassocieerd was met verhoogde niveaus van bepaalde immuuncelfenotypes, zoals het secreteren van CD4-regulerende T-cellen en monocytische MDSC's, en verlaagde niveaus van andere, met name geactiveerde CD4-regulerende T-cellen en CD25+ CD4+ T-cellen.

Opmerkelijk is dat de mediatieanalyse de causale rol van C5-niveaus benadrukt in de progressie van immuuncelfenotypen naar de ontwikkeling van HT. Eerdere studies hebben aangetoond dat plasma C5-niveaus bijdragen aan de ontwikkeling van diabetische perifere neuropathie³⁹ en gecorreleerd zijn met zowel sarcopenie als een verlaagde skeletspierindex⁴⁰. Daarnaast zijn in termen van het lipidmetabolisme lagere concentraties isovalerylcarnitine waargenomen bij personen met een zwak fenotype⁴¹. Het mediatiepercentage van 8,89% dat in deze studie werd waargenomen, suggereert dat C5 mogelijk een vermoedelijke mechanistische link in de CD39⁺ Treg–HT-route vertegenwoordigt, en rechtvaardigt verder onderzoek als kandidaatbiomarker en therapeutisch doelwit in prospectieve experimentele en klinische studies.

Hoewel deze studie waardevolle inzichten biedt, verdienen enkele beperkingen het overwegen. Ten eerste gaat de MR-benadering uit van de aanname dat de gebruikte instrumentele variabelen geldig zijn en niet worden beïnvloed door verstorende factoren of pleiotropie 42,43,44. Ten tweede waren de primaire MR-analyses gebaseerd op GWAS-gegevens van Europese afkomst, en de immuuncel-GWAS was afgeleid van een Sardijnse stichterpopulatie waarvan de aparte linkage-disevenwichtsstructuur de generaliseerbaarheid kan beperken; toekomstige studies in diverse, niet-Europese cohorten zijn nodig om populatie-specifieke toepasbaarheid te bevestigen. Ten derde identificeerde de bemiddelingsanalyse C5 als een factor die mogelijk een verkennende link vormt. Toekomstige studies met meer diverse cohorten zijn noodzakelijk om deze verbanden te bevestigen en mogelijke populatiespecifieke effecten te onderzoeken. Ten slotte leverden flowcytometrie- en plasmavalidatie-experimenten ondersteunend bewijs voor de MR-bevindingen; de steekproefgrootte was echter relatief beperkt. Grotere experimentele en klinische studies zijn noodzakelijk om deze immuunmetabole interacties te valideren en te onderzoeken of het richten op CD39⁺Treg-cellen of gerelateerde metabole routes nieuwe therapeutische mogelijkheden voor HT kan bieden.

Conclusie

Samenvattend biedt deze studie nieuwe inzichten in de causale relaties tussen immuuncelfenotypes, met name CD39⁺ Tregs, en HT, waarbij C5 is geïdentificeerd als kandidaat-mediator in deze route op basis van exploratie-mediatieanalyse. Deze bevindingen onthullen een nieuwe immunometabole as, die mechanistische inzichten en potentiële doelen biedt voor biomarkerontwikkeling en therapeutische interventie bij auto-immuun schildklierziekten. Toekomstige studies met grotere prospectieve cohorten kunnen deze bevindingen verder valideren en de potentiële toepassingswaarde van immunomodulatie in de behandeling van HT onderzoeken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
CD25-PE monoklonaal antilichaam	BD Biosciences	340938	Flow cytometry antilichaam voor humane CD25 detectie
CD39-PE-Cy7 monoklonaal antilichaam	BD Biosciences	567526	Flow cytometry antilichaam voor humane CD39 detectie
CD4-FITC monoklonaal antilichaam	BD Biosciences	340133	Flow cytometry antilichaam voor humane CD4 detectie
D3-APC monoklonaal antilichaam	BD Biosciences	555333	Flow cytometry antilichaam voor humane CD3 detectie
FACS Lysing Solution	BD Biosciences	349202	Rode bloedcel lysis buffer voor flow cytometry monstervoorbereiding
Flow cytometer	BD Biosciences	FACSCanto II	Multicolor flow cytometry instrument voor immunofenotypering
Flow cytometry analysesoftware (FACSDiva)	BD Biosciences	—	Software voor acquisitie en analyse van flow cytometry data
gwasglue package	R package	—	Harmonisatie van GWAS datasets
ieugwasr package	R package	—	Interface naar IEU GWAS database
Liquid chromatography–tandem mass spectrometry systeem (LC–MS/MS)	Thermo Fisher Scientific	—	Gebruikt voor kwantificering van plasma isovalerylcarnitine (C5)
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)	Thermo Fisher Scientific	AM9624	Steriele PBS, pH 7.4, gebruikt voor wassen en resuspenderen
R software	Open source software	Versie 4.4.1	Statistisch analyse omgeving
TwoSampleMR package	R package	—	Mendelian randomisatie analyse package
VariantAnnotation package	Bioconductor	—	Variant data annotatie