Effecten op RNA-kwaliteit van PBMC's onder verschillende cryopreservatietijden en verwerkingsmethoden bij patiënten met gevorderde niet-kleincellige longkanker

Samenvatting

Deze studie vergelijkt het Triple Isolation Reagent (TRIzol) en de klassieke oplossing (FBS + DMSO) voor het cryopreserveren van de PBMC's van NSCLC-patiënten. TRIzol behoudt een bevredigende RNA-integriteit tot 6 maanden, waardoor het wordt aanbevolen voor hoogwaardige RNA-conservering.

Samenvatting

Gecryopreserveerde perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC's) worden veel gebruikt in RNA-sequencing (RNA-seq), en de kwaliteit van hun RNA beïnvloedt direct de testuitkomsten. Cryopreservatie kan echter gemakkelijk leiden tot RNA-degradatie in PBMC's, en de vraag hoe RNA-kwaliteit tijdens langdurige cryopreservatie kan worden verbeterd, blijft onopgelost. PBMCS uit verse bloedmonsters verzameld van patiënten met gevorderde niet-kleincellige longkanker (NSCLC) werden als controlegroep gebruikt. De RNA-behoudseffectiviteit van PBMC-monsters werd vergeleken tussen de klassieke celcryopreservatieoplossing (90% fotaal rundereserum [FBS] + 10% dimethylsulfoxide [DMSO]) en het gebruikelijke RNA-extractiereagens (TRIzol) bij -80 °C gedurende 1, 3 en 6 maanden. RNA-concentratie, zuiverheid en integriteit (gemeten met het RNA-integriteitsgetal [RIN]) werden beoordeeld met behulp van een multi-sample microvolume UV-Vis spectrofotometer en een geautomatiseerde microfluidische elektroforetische bioanalyzer om een theoretische basis te leggen voor het behoud van hoogwaardige RNA-monsters. Deze studie toonde aan dat de concentratie, zuiverheid en integriteit van RNA in PBMC's afnamen met een verlengde cryopreservatieduur. Hoewel de twee verwerkingsmethoden geen effect hadden op de RNA-concentratie, beïnvloedden ze wel de zuiverheid en integriteit van RNA. De RNA-integriteit van PBMC's die 6 maanden met TRIzol waren gecryoppreserve bleef bevredigend. Onze resultaten geven aan dat TRIzol bijdraagt aan effectieve cryopreservatie en hoogwaardige RNA behoudt.

Inleiding

RNA-seq van PBMC bij NSCLC-patiënten speelt een cruciale rol bij het evalueren van de effectiviteit van immunotherapie. Niet-kleincellige longkanker (NSCLC) is wereldwijd een veelvoorkomende kwaadaardige tumor, en ongeveer 70% van de patiënten wordt in een gevorderd stadium gediagnosticeerd met een slechte prognose ^1,2. Immunotherapie heeft het behandelparadigma voor NSCLC gerevolutioneerd door innovatieve therapeutische strategieën^te bieden ^3,4. Bij de behandeling van immuuncheckpointremmers (ICI) kan RNA-sequencing (RNA-seq) van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC's) verkregen van NSCLC-patiënten de dynamische veranderingen in klinische voordelen van immunotherapie^{monitoren 5}. Monsterbronnen voor RNA-seq omvatten tumorweefsel en PBMC's ^6,7, waarbij PBMC's dienen als een essentieel biologisch monster in zowel klinische onderzoeken als fundamenteel wetenschappelijk onderzoek⁸. Cryopreservatie vormt de primaire methode voor langdurige monsteropslag, waarbij cellen en weefsels in rust blijven terwijl hun biologische potentieel en kenmerken behouden blijven. Daarom is cryopreservatie van PBMC's uitgegroeid tot een haalbare en breed toegepaste benadering. Cryopreserved PBMC faciliteert batchanalyse van monsters, minimaliseert variabiliteit binnen en tussen laboratoriums en interlaboratorium, en optimaliseert het gebruik van middelen ^8,9. Zo hebben studies aangetoond dat het gebruik van een bevroren RPMI-1640 medium aangevuld met 40% foetaal kalfsserum (FCS) en 20% dimethylsulfoxide (DMSO) voor PBMC cryopreservatie aantoont dat de verhoudingen T- en B-cellen die de combinatie van CD39 en CD73 tot expressie brengen binnen zes maanden na opslag^relatief stabiel bleven. Een studie vergeleek drie commerciële cryopreserveringskits en twee cryoprotectieve middelen (90% RPMI-10% DMSO, 90% plasma-10% DMSO), waarbij vergelijkbare cellevensvatbaarheid (81,0%) en herstelpercentages (73,7%) over verschillende methoden werden getoond. Alle cryoppreserve PBMC's vertoonden echter significant een verminderde levensvatbaarheid vergeleken met verse monsters⁵. Verder onderzoek toonde aan dat geresuspendeerde PBMC neerslaat in TRIzol-reagens en ze onmiddellijk bevroren bij -80 °C. Na 1–2 dagen observeerden ze dat de RIN-waarde van PBMC's hoger was dan die van volbloedmonsters¹¹.

Een ander onderzoek vergeleek leukocytenmonsters behandeld met TRIzol, RNAlater en andere reagentia, waaruit bleek dat alle methoden RNA-integriteitswaarden (RIN) >7 behaalden. De integriteit van RNA werd beoordeeld met behulp van een geautomatiseerde microfluïdische elektroforetische bioanalyzer, en RIN werd berekend als een kwantitatieve maat voor RNA-kwaliteit. Monsters met RIN ≥7 werden als geschikt beschouwd voor RNA-seq analyse¹². Opmerkelijk is dat de leukocyte + RNAlater-groep significant lagere RNA-opbrengst vertoonde vergeleken met de leukocyte + TRIzol groep¹². Echter, het huidige onderzoek naar PBMC-cryopreservatie richt zich voornamelijk op cellevensvatbaarheid en immuuncelfenotypeanalyse na ontdooi; Er is beperkte aandacht besteed aan systematische, langdurige beoordeling van RNA-kwaliteit onder verschillende conserveringsomstandigheden. Bovendien zijn gestandaardiseerde protocollen voor het cryoppreserve van PBMC-monsters om RNA-integriteit te behouden nog onontwikkeld 13,14,15. Deze kloof is vooral relevant voor NSCLC-immunotherapie, waar hoogvarig RNA uit longitudinaal verzamelde PBMC's essentieel is voor betrouwbare biomarkerontdekking en monitoring van de behandelingsrespons.

In deze studie stellen we de hypothese dat de keuze van cryopreservatiemethode een significante invloed heeft op de langetermijnintegriteit en kwaliteit van RNA dat afkomstig is van PBMC's, en dat een geoptimaliseerd protocol de geschiktheid van RNA voor gevoelige assays zoals RNA-seq kan behouden. Om dit aan te pakken werden vers geïsoleerde PBMC's uit bloedmonsters van gevorderde NSCLC-patiënten als controles gebruikt. De RNA-behoudseffectiviteit van PBMC-monsters werd vergeleken tussen twee behandelmethoden (90% FBS + 10% DMSO en TRIzol) bij -80 °C gedurende 1, 3 en 6 maanden (Figuur 1). RNA-concentratie, zuiverheid en integriteit (zoals gemeten door de RIN) werden geëvalueerd met een multi-sample microvolume UV-Vis spectrofotometer en een geautomatiseerde microfluidische elektroforetische bio-analyzer. Deze studie heeft als doel een theoretische basis te bieden voor hoogwaardige RNA-monsterconservering en om translationeel onderzoek en monsterconservering in tumorprecisiegeneeskunde te bevorderen.

Protocol

Alle procedures waarbij menselijke weefselmonsters en klinische monsters in deze studie betrokken zijn, zijn uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen en goedgekeurd door de Ethische Commissie van het Jilin Kankerziekenhuis (Ethische goedkeuring nr. 202507-002-01). Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle deelnemers of hun wettelijke voogden voorafgaand aan de monsterafname. Perifere bloedmonsters (10 mL per patiënt) werden verzameld van 19 patiënten met gevorderde niet-kleincellige longkanker (NSCLC) in het Jilin Cancer Hospital, wat resulteerde in een totaal van 133 RNA-monsters. Om de veiligheid van laboratoriums te waarborgen, werden alle operaties met gevaarlijke chemicaliën uitgevoerd in een biologische veiligheidskast.

Gedetailleerde informatie over de instrumenten, reagentia en verbruiksmaterialen die in het experiment werden gebruikt, werd verstrekt in de Materiaalkundige Tafel.

Isolatie van PBMC
Perifere bloedmonsters werden binnen 2 uur na afname voor PBMC-isolatie verwerkt. PBMC's werden geïsoleerd en gezuiverd door Ficoll-Paque dichtheidsgradiëntcentrifugatie bij 400 × g gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur met de rem uitgeschakeld. Na centrifugatie werd de intermediaire melkachtige witte lymfocytlaag (met PBMC's) zorgvuldig geaspireerd¹⁶. Belangrijk is dat we de PBMC-invoerconcentratie voor elk monster en elke groep strikt hebben gestandaardiseerd om consistente celaantallen te garanderen onder alle experimentele omstandigheden, waardoor variatie veroorzaakt door celinvoer en verwerking wordt geminimaliseerd. Dit zorgt ervoor dat de waargenomen verschillen echte effecten van verschillende conserveringsmethoden weerspiegelen in plaats van technische variabiliteit. Voor elke patiënt werden geïsoleerde PBMC's verdeeld in 7 buizen: één buis werd gebruikt voor onmiddellijke RNA-extractie, en de concentratie, zuiverheid en integriteit werden beoordeeld. De overige zes buizen werden gecryopserveerd met een koelsnelheid van -1 °C/min: drie werden behandeld met 1 mL 90% FBS + 10% DMSO, en de andere drie met 1 mL TRIzol, gevolgd door opslag bij -80 °C. RNA-extractie en kwaliteitsbeoordeling werden uitgevoerd na 1, 3 en 6 maanden bevroren opslag.

RNA-extractie
Monsters werden uit -80 °C opslag gehaald en ontdooid bij 4 °C tot volledig^{ontdooid op 17} was. Monsters die bewaard waren met 90% FBS + 10% DMSO- of TRIzol-cryopreservatieoplossing werden één keer gewassen met PBS, gecentrifugeerd op 200 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C, en het supernatant werd weggegooid om de celpellet vast te houden. Totaal RNA werd geëxtraheerd met behulp van TRIzol. Specifiek werd TRIzol-reagens toegevoegd aan de microcentrifugebuis met het verwerkte monster, gemengd door inversie en 5 minuten op kamertemperatuur geïncubeerd om volledige lyse te garanderen. Vervolgens werd 200 μL chloroform toegevoegd, grondig gemengd door schudden, en 15 minuten op kamertemperatuur geïncubeerd. Na centrifugatie bij 2400 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C werd de bovenste waterige fase zorgvuldig geaspireerd en overgebracht naar een nieuwe Eppendorf-buis. Isopropanol (0,5 mL) werd vervolgens toegevoegd, goed gemengd en 5–10 minuten op kamertemperatuur geïncubeerd. Na centrifugatie bij 2400 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C werd het supernatant afgevoerd, waardoor het RNA-precipitaat onderin de buis achterbleef.

Het neerslag werd opnieuw opgehangen in 75% ethanol (1 mL) met zacht schudden, gevolgd door centrifugatie bij 1600 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Het supernatant werd afgevoerd en de RNA-pellet werd 5–10 minuten aan de lucht laten drogen bij kamertemperatuur. Ten slotte werden de RNA-monsters opgelost in 50 μL DEPC-behandeld water en geïncubeerd in een 55–60 °C waterbad gedurende 5–10 minuten¹⁸. Detectie van RNA-concentratie en zuiverheid. RNA-concentratie en zuiverheid werden gemeten met de ultraviolet absorptiemethode met een multi-sample microvolume UV-Vis spectrofotometer (meetbereik: 2,5–3000 ng/μL). De RNA-concentratie werd bepaald op basis van de absorptiewaarde bij 260 nm, terwijl de RNA-zuiverheid werd beoordeeld met behulp van de A260/A280-verhouding. De meetsoftware werd gelanceerd; "Nucleïnezuur" werd aangeklikt op de hoofdinterface. Het detectieplatform werd twee keer afgespoeld met dubbel gedestilleerd water, waarna 1,5 μL van het RNA-monster erop werd gepipetteerd. RNA-40 werd geselecteerd voor het monstertype, "Measure" werd aangeklikt en de concentratie- en A260/280-zuiverheidswaarden werden geregistreerd. Een A260/A280-verhouding tussen 1,9 en 2,1 duidde op een hoge RNA-zuiverheid, terwijl waarden onder 1,8 op eiwitbesmetting duiden, en waarden boven 2,2 op mogelijke RNA-degradatie of residueel isothiocyanaat¹⁹.

RNA-integriteitsdetectie
RNA-integriteit (RIN) werd geëvalueerd met behulp van een geautomatiseerde microfluidische elektroforetische bioanalyzer en detectiekit. De RIN varieert van 1 tot 10, waarbij 1 sterk gedegradeerd RNA aangeeft en 10 intact RNA. Voor analyse werd 1,2 μL RNA in een PCR-buis geplaatst, thermisch gedenatureerd bij 70 °C gedurende 2 minuten met een thermische cycler, en onmiddellijk op ijs gelegd. Vervolgens werd 1 μL gedenatureerd RNA toegevoegd aan de detectieputten van de chip voor analyse²⁰. De software werd gelanceerd, "Assays" werd geselecteerd en "RNA" werd gekozen uit het keuzemenu. Het programma "Eukaryote Total RNA Nano Series II.xsy" werd geselecteerd op basis van het gebruikte reagens. "Start" werd ingedrukt om detectie te starten. Na ongeveer 10 minuten werden het piekgetal en de piekhoogte van de ladder gecontroleerd op normaliteit.

Statistische methoden
Er werden normaliteitstests uitgevoerd voor alle gegevens. Normaal verdeelde gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD), terwijl niet-normaal verdeelde gegevens werden uitgedrukt als mediaan (interkwartielbereik, IQR). Vergelijkingen tussen twee groepen werden geanalyseerd met behulp van de gepaarde t-test voor normaal verdeelde data en de niet-parametrische test voor niet-normaal verdeelde data in gerelateerde monsters. Voor vergelijkingen tussen drie of meer groepen werd herhaalde metingen van variantie gebruikt voor normaal verdeelde gegevens, en de niet-parametrische test voor niet-normaal verdeelde gegevens. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met SPSS 19.0 en GraphPad Prism 9.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.

Resultaten

Effecten van verschillende cryopreservatietijden en verwerkingsmethoden op RNA-concentratie in PBMC-monsters
Het effect van verschillende cryopreservatietijden: De verse PBMC-monsters van gevorderde NSCLC-patiënten dienden als controlegroep. De monsters werden behandeld met ofwel TRIzol of 90% FBS + 10% DMSO en bewaard bij -80 °C gedurende 1, 3 en 6 maanden; totale RNA werd geëxtraheerd om de RNA-concentratie te meten. Voor met TRIzol behandelde monsters waren de RNA-...

Discussie

Veel factoren beïnvloeden de kwaliteit van RNA in biologische monsters, waaronder pre-analytische variabelen, transportomstandigheden, verwerkingsduur bij omgevingstemperatuur, weefselnecrose, temperatuur en vriesproducten, aliquotgrootte en -aantal, evenals opslagduur, hebben een significante invloed op RNA-kwaliteit²¹. Voor identieke monsters kunnen variaties in cryopreservatietijd en verwerkingsmethoden de kwaliteit van RNA aanzienlijk beïnvloeden. Eerdere stud...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939B	Detectie van RNA-integriteit, evaluatie van RNA-kwaliteit door het genereren van het RNA-integriteitsnummer (RIN)
Agilent RNA 6000 Nanokit	Agilent	5067-1511	In combinatie met de Agilent 2100 Bioanalyzer, biedt specifieke reagentia en chips voor RNA-integriteit
Centrifuge	Eppendorf	5424R	Voor het extraheren van RNA
Centrifuge	Eppendorf	5810R	Voor het extraheren van PBMC
Chloroform	China National Pharmaceutical Group Corporation	20191031	Voor RNA-extractie met de Trizol-methode, gebruikt om de waterige fase met RNA te scheiden van de organische fase met onzuiverheden
Dimethyl sulfoxide	Beijing Dingguo Changsheng	DH105-2	Als cryo-conserveringsoplossing voor PBMC's, waardoor langdurige opslag van monsters bij -80 °C mogelijk is
Tube	Corning	MCT-150-C	Voor monsteropslag, reagensmengen, centrifugatie en andere experimentele bewerkingen
Ethanol	Shandong Lierkang	25071901A	Bij RNA-extractie met de Trizol-methode, gebruikt voor het wassen van RNA-precipitaten om restanten te verwijderen
Fetaal bovien serum	Xpbiomed	C04001-500	Als cryo-conserveringsoplossing voor PBMC's, waardoor langdurige opslag mogelijk is
Ficoll scheidingsoplossing	Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology CO., LTD	CC0161	Voor isolatie en zuivering van PBMC via dichtheidsgradiëntcentrifugering
GeneTouch(Plus) Thermische cycler	Bioer	TC-EA-48DA	Voor thermische denaturatie van RNA (70 °C gedurende 2 min), gevolgd door detectie met de bioanalyzer
Isopropanol	China National Pharmaceutical Group Corporation	20210929	Bij RNA-extractie met de Trizol-methode, gebruikt voor RNA-precipitatie
Nanodrop 8000 Spectrophotometer	GeneCompany	ND-8000	Voor RNA-concentratie (gebaseerd op absorptie bij 260 nm) en zuiverheid (gebaseerd op A260/A280-verhouding) met behulp van de ultraviolette absorptiemethode
PCR-buizen	Corning	PCR-02-C	Voor thermische denaturatie van RNA (70 °C gedurende 2 min), gevolgd door detectie met de bioanalyzer
Fosfaat-gebufferd zoutwater	Procell system	PB180327	Voor directe lysering en conservering van PBMC's, of daaropvolgend totaal RNA
Triple Isolation Reagent	Adsin	ads60154	Voor directe lysering en conservering van PBMC's, of daaropvolgend totaal RNA