Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
Dit onderzoek ontdekte verhoogde niveaus van HMGA1 en lagere niveaus van HAND1-expressie bij larynxkanker, wat wijst op een omgekeerde relatie en significante verbanden met metastase en klinisch stadium, wat suggereert dat beide bijdragen aan tumorprogressie.
Deze studie onderzocht de expressieprofielen van de HMGA1- en HAND1-genen in larynxplaveiselcelcarcinoom (LSCC) evenals in aangrenzende normale larynxmucosale weefsels door toepassing van immunohistochemie en RT-PCR-methodologieën. Het doel was hun mogelijke rol te onderzoeken in de initiatie, ontwikkeling, invasie en metastase van LSCC. Zowel HMGA1 als HAND1 werden aangetroffen in kankerachtige en aangrenzende normale weefsels. Desalniettemin toonde HMGA1 een significant verhoogde expressie in LSCC-weefsels, terwijl HAND1 aanzienlijk verminderde expressieniveaus liet zien. Verhoogde HMGA1-expressie was positief geassocieerd met lymfekliermetastasen (100,0% versus 50,0%) en een gevorderd klinisch stadium (91,7% versus 44,4%), maar was niet geassocieerd met tumorhistologische graad, klinisch type of patiëntleeftijd. Daarentegen was verminderde expressie van HAND1-eiwitten geassocieerd met lymfekliermetastase, klinisch stadium en pathologische graad, wat wijst op een rol in tumorprogressie en metastase. Bovendien werd een lineaire negatieve correlatie waargenomen tussen de expressies van HMGA1 en HAND1, wat wijst op een mogelijke regulatorische interactie waarbij HMGA1 de expressie van HAND1 kan onderdrukken. Deze resultaten impliceren dat HMGA1 en HAND1 complementaire functies hebben in de pathogenese van LSCC, waarbij HMGA1 mogelijk tumorontwikkeling bevordert en HAND1 als suppressor fungeert. De interactie tussen deze twee genen kan nieuwe perspectieven bieden op de moleculaire mechanismen die de progressie en metastase van LSCC aansturen.
Larynxkanker is de op één na meest voorkomende primaire kwaadaardige tumor van hoofd en hals, na nasofarynxkanker, en is goed voor 26%–30% van alle hoofd- en halstumoren wereldwijd1. Meer dan 90% van de larynxkankers wordt geclassificeerd als laryngeus plaveiselcelcarcinoom (LSCC)2. De belangrijkste behandelingen voor larynxkanker zijn chirurgie en radiotherapie. Lokale recidief en lymfekliermetastasen zijn de belangrijkste doodsoorzaken bij larynxkankerpatiënten. Daarom blijft effectief beheer van recidief en metastase een grote klinische uitdaging. Met de vooruitgang van de moleculaire biologie zijn verschillende genen met abnormale expressie bij larynxkanker geïdentificeerd. De mechanismen achter tumorinvasie en metastase bij larynxkanker blijven echter onduidelijk en vereisen verder onderzoek.
Eiwitten van groep A (HMGA) met hoge mobiliteit zijn eiwitten die niet histonchromatine binden en zich in de celkern bevinden. HMGA1 bindt aan DNA en bijbehorende eiwitten, wat chromatinestructurele veranderingen induceert die de gentranscriptiereguleren 3. Als chromatine-geassocieerde transcriptieregulator moduleert HMGA1 de expressie van meerdere tumorgerelateerde genen die betrokken zijn bij proliferatie en metastase. Eerdere studies hebben aangetoond dat HMGA1 overexpressief is in een breed scala aan menselijke kankers, waaronder schildklier-, colorectale, alvleesklier- en hoofd-halskankers 4,5,6,7, evenals andere epitheel- en solide tumoren die in de literatuur zijn gerapporteerd. HMGA1 reguleert de tumorigenese door de expressie van meerdere downstream doelgenen die betrokken zijn bij proliferatie en metastase8 te moduleren.
Hart- en neurale crestderivaten (HAND) genen behoren tot de bHLH (basis helix–lus–helix) familie, waaronder HAND1 en HAND2. HAND1 speelt als transcriptiefactor een rol bij de differentiatie van trofoblasten en de ontwikkeling van het hart9. Het expressiemechanisme van HAND1 in de extra-embryonale cellaag blijft echter onduidelijk. Het is bevestigd dat HMGA1 direct bindt aan de HAND1-promotor, waardoor de activiteit van HAND1 zowel in vivo als in vitro10 wordt geremd. HAND1, als repressoreiwit, is betrokken bij het reguleren van celdifferentiatie en kankervorming. Studies hebben aangetoond dat de expressie van HAND1 wordt gedempt en gehypermethyleerd in menselijke maagkanker11, alvleesklierkanker12, eierstokkanker13 en schildklierkanker14. Voor zover wij weten hebben er echter beperkte studies onderzocht naar de expressie van HAND1 in het weefsel van larynxkanker.
In de huidige studie werden immunohistochemie (tweestapsdetectiemethode) en reverse transcriptie polymerasekettingreactie (RT-PCR) gebruikt om de expressie van HMGA1- en HAND1-eiwitten en mRNA in LSCC en aangrenzende normale mucosale weefsels te detecteren. Immunohistochemie maakt visualisatie van eiwitlokalisatie binnen weefselarchitectuur mogelijk, terwijl RT-PCR een gevoelige detectie van genexpressie op transcriptieniveau mogelijk maakt, wat complementaire inzichten biedt in eiwit- en mRNA-expressiepatronen. In vergelijking met kwantitatieve PCR (qPCR), die een hogere gevoeligheid en precieze kwantificatie biedt, Western Blotting, die validatie op eiwitniveau mogelijk maakt maar ruimtelijke context mist, en RNA-sequencing (RNA-seq), die uitgebreide transcriptomische profilering biedt maar geavanceerde computationele analyse vereist, vertegenwoordigt het gecombineerde gebruik van immunohistochemie en RT-PCR een kosteneffectieve en klinisch toepasbare strategie voor biomarkeronderzoek. De studie had als doel de rol en correlatie van deze twee factoren in het optreden, de ontwikkeling, het voortgang en de metastase van LSCC te onderzoeken. Bovendien kan het evalueren van de expressie van HMGA1 en HAND1 biomarkers bieden voor diagnose en prognostische beoordeling bij larynxkanker, wat mogelijk de risicostratificatie verbetert en de klinische besluitvorming ondersteunt.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Deze studie werd beoordeeld en goedgekeurd door de Onderzoeksethische Commissie van het Shijiazhuang Volksziekenhuis (Goedkeuringsnummer YKLS 2026 Nr. 041; 27 maart 2026). De studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de Reglementen voor Ethische Beoordeling van Biomedisch Onderzoek Met Menselijke Proefpersonen, de Regelgeving voor Ethische Beoordeling van Levenswetenschappen en Medisch Onderzoek Met Menselijke Proefpersonen, de Verklaring van Helsinki en de Internationale Ethische Richtlijnen voor Gezondheidsgerelateerd Onderzoek Met Mensen. Menselijke weefselmonsters zijn verkregen uit gearchiveerde chirurgische monsters in overeenstemming met institutionele ethische vereisten, wat anonimisering en vertrouwelijkheid van patiëntgegevens waarborgt. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van de deelnemers, of een vrijstelling van toestemming werd verleend door de ethische commissie voor het gebruik van geanonimiseerde gearchiveerde exemplaren, indien van toepassing.
Experimentele materialen
Bron van exemplaren
In totaal werden 42 gevallen van LSCC-weefsels en 25 gevallen van aangrenzende normale laryngeale mucosaweefsels verkregen uit chirurgische resectiemonsters van LSCC op de afdeling Otolaryngologie-Hoofd- en Halschirurgie van Hebei tussen februari 2011 en augustus 2012. Hiervan werden 25 gevallen van aangrenzend normaal mucosa (genomen van een locatie > 1,0 cm van de kankerrand) pathologisch bevestigd als inflammatoire of normale mucosa. De 42 LSCC-monsters werden allemaal pathologisch bevestigd als plaveiselcelcarcinoom. Alle weefsels werden opgeslagen bij -80 °C. De 42 patiënten waren mannen, zonder vrouwelijke patiënten. Van de LSCC-gevallen waren er 15 goed gedifferentieerd, 18 matig gedifferentieerd en 9 slecht gedifferentieerd. Achttien gevallen hadden lymfekliermetastase, terwijl 24 gevallen dat niet hadden. De klinische stadiëring was gebaseerd op het TNM-classificatie- en stadiesysteem (UICC, 2002), met 20 gevallen in stadia I en II, en 22 gevallen in stadia III en IV. Er waren 30 gevallen van het supraglottische type, 11 gevallen van het glottische type en 1 geval van subglottisch type. De leeftijdsgroep van de patiënten was 40–75 jaar, met een mediane leeftijd van 60 jaar. Geen van de patiënten kreeg radiotherapie of chemotherapie vóór de operatie, en de klinische gegevens waren compleet.
Experimentele methoden en stappen
HE-kleuringsprocedure
Preparatvoorbereiding en hematoxyline–eosine-kleuring
Glasglaasjes voor immunohistochemie werden eerst 24 uur in geconcentreerd zuur geweekt, gevolgd door grondig wassen onder stromend kraanwater gedurende minstens 10 minuten om restzuur te verwijderen, en tweemaal onderdompelen in gedestilleerd water gedurende 30 minuten met voorzichtig roeren om volledige spoeling te garanderen. Na 2 uur in 95% ethanol te hebben gewekt, werden de glaasjes gedroogd in een oven van 60 °C en vervolgens 1 minuut ondergedompeld in een APES: aceton (1:49, v/v) mengsel met voorzichtig schudden om een uniforme coating te garanderen, gevolgd door spoelen met pure aceton. Tot slot werden ze aan de lucht gedroogd op kamertemperatuur (20–25 °C) om een goede weefselhechting te garanderen tijdens latere kleuring.
De paraffine-ingebedde weefselsecties werden achtereenvolgens 10 minuten in xyleen I en xyleen II ondergedompeld om paraffine te verwijderen, gevolgd door rehydratatie via gegradueerd ethanol (100%, 95%, 80%) gedurende elk 5–10 minuten, en vervolgens 2 minuten afgespoeld in gedestilleerd water. De secties werden vervolgens onderworpen aan hematoxyline–eosine (HE) kleuring als volgt: hematoxyline-kleuring gedurende 4 minuten, spoelen onder stromend kraanwater gedurende 3 minuten met continue stroom om overtollige kleuring te verwijderen, differentiatie met 1% zoutzuur in ethanol gedurende 30 seconden, drie keer wassen met kraanwater om de differentiatie te beëindigen, en eosinekleuring gedurende 10 seconden. Routinematige gegradeerde dehydratie werd achtereenvolgens uitgevoerd door achtereenvolgens 70% ethanol, 80% ethanol, 95% ethanol, watervrij ethanol I en anhydre ethanol II te gebruiken, elk 5 minuten. Na het drogen werd de schuif gemonteerd met neutrale balsem.
Immunohistochemische procedure
Paraffinesecties van 4 μm dikte werden gesneden, plat gelegd op APES-gecoate glaasjes en een nacht in een oven van 67 °C geplaatst, gevolgd door deparaffinisatie met Xyleen I en II gedurende elk 10 minuten. Geleidelijke dehydratatie werd uitgevoerd met 100%, 90% en 70% alcohol gedurende elk 5 minuten, gevolgd door wassen met kraanwater en gedestilleerd water gedurende 3 minuten. Om endogene peroxidase-activiteit te blokkeren, werden de glaasglaasjes geïncubeerd met een vers bereide 3% methanol-waterstofperoxide-oplossing, waarbij volledige dekking van de weefselsectie werd gegarandeerd bij kamertemperatuur (20–25 °C) gedurende 20 minuten, gevolgd door drie wasbeurten met gedestilleerd water gedurende 5 minuten in 0,01 M PBS.
Antigeenwinning werd uitgevoerd door de glaasjes in een citratbuffer (pH 6,0) te dompelen en te verhitten in een snelkookpan bij ~ 95–100 °C gedurende 8 minuten voor HMGA1 en 10 minuten voor HAND1 met deksels stevig gesloten om consistente drukcondities te behouden. De secties werden vervolgens afgekoeld op kamertemperatuur (20–25 °C) en drie keer gewassen in 0,01 M PBS gedurende 3 minuten elk onder zachte roering. Primaire antilichamen tegen HMGA1 en HAND1 werden verdund in antilichaamverdunner (respectievelijk 1:150 en 1:100) en voorzichtig gemengd door pipetten, voordat ze gelijkmatig werden aangebracht om elke weefselsectie volledig te bedekken. De preparaten werden 's nachts geïncubeerd bij 4 °C in een bevochtigde kamer. Na de nachtelijke incubatie werden de glaasjes uit de bevochtigde kamer gehaald en 10 minuten in evenwicht gehouden tot kamertemperatuur. De glaasjes werden drie keer gewassen met 0,01 M PBS (5 minuten per was) onder zachte beweging om ongebonden antilichamen te verwijderen. Overtollige vloeistof werd verwijderd en een secundair antilichaam (HRP-gelabeld polymeer anti-konijn/muis) werd toegevoegd om de weefseldoorsneden volledig te bedekken. Verdere incubatie vond plaats bij 37 °C gedurende 35 minuten.
DAB-substraatoplossing werd druppelgewijs aangebracht om het weefsel te bedekken, en de kleurontwikkeling werd 1–3 minuten onder een microscoop gevolgd totdat de bruine kleuring verscheen, waarna onmiddellijk werd gestopt door spoelen met gedestilleerd water zodra de optimale kleurintensiteit was bereikt. Hematoxyline herkleuring, differentiatie van zoutzuuralcohol en ammoniakoplossing voor blauwe omkering werden uitgevoerd. Hierna volgde routinematige alcoholdehydratie, xyleentransparantie en montage met neutrale balsem voor observatie onder een microscoop. PBS werd gebruikt als een lege controle in plaats van het primaire antilichaam. Daarnaast werden eerder bevestigde HMGA1-positieve secties van plaveiselcarcinoom en HAND1-positieve placentaweefselsecties gebruikt als positieve controles om de kleurkwaliteit en consistentie te waarborgen.
Resultaatbepaling
Het chromogeen dat in dit experiment wordt gebruikt is het DAB-H2O2-systeem. Na een herkleuring van hematoxyline wordt vooral HMGA1- en HAND1-positieve kleuring waargenomen in de celkern, met enige cytoplasmatische kleuring. Voor evaluatie werd het gebied met de hoogste dichtheid van positief gekleurde cellen geïdentificeerd onder lage vergroting (×40). Onder ×100 vergroting werden vijf velden met de hoogste positieve celdichtheid geselecteerd en werden 100 cellen in elk veld geteld. Het gemiddelde percentage positieve cellen uit de vijf velden wordt als resultaat voor elke dia gebruikt. De beoordelingscriteria waren als volgt: geen gekleurde cellen (-), positieve cellen < 25% (+), positieve cellen 25%–50% (++), en positieve cellen > 50% (+++), gebaseerd op een semi-kwantitatieve procentuele scoringsmethode die vaak wordt gebruikt bij immunohistochemische analyses. De evaluatie werd onafhankelijk uitgevoerd door twee gekwalificeerde pathologen op een dubbelblinde manier: 15,16,17. Als hun meningen verschillen, moeten ze discussiëren en tot een conclusie komen18.
RT-PCR-methode
Primers
Primers werden ontworpen met primerontwerpsoftware gebaseerd op doelgensequenties, met aandacht voor primerspecificiteit, smelttemperatuurcompatibiliteit en verwachte productgrootte. De gedetailleerde primersequenties, productgroottes en annealingtemperaturen worden samengevat in Tabel 1. De primers werden gesynthetiseerd tot een concentratie van 2 OD, verdeeld in twee buizen en verdund tot 10 pmol/μL met DEPC-behandeld water voor opslag bij -20 °C. De annealingtemperatuur werd berekend met de formule: Tm = 2(A + T) + 4 (G + C)
RNase-behandeling van experimentele materialen en apparatuur:
Plastic voorwerpen (bijv. pipetpunten, EP-buizen): De plastic voorwerpen werden in een gesteriliseerde breedmondreagensfles geplaatst, er werd voorbereid DEPC-behandeld water toegevoegd totdat de voorwerpen volledig waren ondergedompeld, en de materialen werden 's nachts geïncubeerd in een dampkap bij kamertemperatuur (20–25 °C). Daarna werden ze 120 minuten onder druk gesteriliseerd en gedroogd bij 65 °C.
Glasartikelen: Het glaswerk werd een nacht in zuur gedreekt, grondig afgespoeld, gedroogd, in aluminiumfolie gewikkeld en 6 uur in een oven van 200 °C gebakken en op een schone plek bewaard voor toekomstig gebruik.
Metalen voorwerpen (bijv. schaar, pincet): De metalen voorwerpen werden schoongemaakt, 6 uur in een oven van 200 °C gebakken en op een schone plek bewaard voor toekomstig gebruik.
Bereiding van oplossingen
0,1% (v/v) DEPC-oplossing: 1 mL DEPC werd toegevoegd aan 1000 mL gedestilleerd water om een uiteindelijke concentratie van 0,1% (v/v) te bereiken, goed geschud, 's nachts geïncubeerd bij 4 °C, gesteriliseerd door autoclaven en opgeslagen bij 4 °C.
75% (v/v) ethanoloplossing: 75 mL absolute ethanol werd gemengd met 25 mL DEPC-behandeld water om een uiteindelijke concentratie van 75% (v/v) te bereiken, en opgeslagen bij 4 °C.
Totale RNA-extractie uit weefsel
Na RNA-extractie werd de RNA-integriteit beoordeeld voorafgaand aan reverse transcriptie en downstream analyse. 80 mg weefsel werd gewogen met een elektronische weegschaal, in kleine stukjes gesneden en in een voorbehandeld glashomogenisator geplaatst. 1 mL voorgekoeld RNA-extractiereagens werd toegevoegd bij 4 °C, en het monster werd op ijs gehomogeniseerd door herhaald malen totdat een uniform lysaat zonder zichtbare weefselfragmenten werd verkregen, waardoor bubbelvorming werd voorkomen. Het gehomogeniseerde mengsel werd overgebracht naar een 1,5 mL RNase-vrije EP-buis en 5 minuten op ijs geïncubeerd. 400 μL chloroform werd aan elke buis toegevoegd, die krachtig werd 10–15 seconden vortex om volledige fasemenging te garanderen, gevolgd door 5 minuten incubatie op ijs. De buizen werden gecentrifugeerd op 4 °C, 12.000 x g gedurende 15 minuten. Na centrifugatie werd de bovenste waterige fase zorgvuldig geaspireerd met een RNase-vrije pipet, zonder de interfaselaag te verstoren in een nieuwe buis. Er werd een gelijk volume isopropanol toegevoegd, gemengd door de buis voorzichtig 8-10 keer om te keren totdat de lagen verdwenen waren, en geïncubeerd bij -20 °C gedurende minstens 10 minuten. Het mengsel werd gecentrifugeerd op 4 °C, 12.000 x g gedurende 10 minuten. De supernatantlaag werd weggegooid, 400 μL 75% ijskoude ethanol werd toegevoegd om de RNA-pellet te suspenderen. Het mengsel werd opnieuw gecentrifugeerd bij 4 °C, 12.000 x g. gedurende 5 minuten. De supernatantlaag werd weggegooid en de RNA-pellet werd licht gedroogd. De RNA-pellet werd opgelost in RNase-vrij water en opgeslagen bij -80 °C voor toekomstig gebruik.
RNA-integriteitsdetectie
Voor RNA-integriteitsdetectie werd 5 μL RNA-monster gemengd met 5 μL bromofenol blauwe laadbuffer, en elektroforese werd uitgevoerd op een 2% agarosegel. RNA-integriteit werd als acceptabel beschouwd wanneer duidelijke 28S-, 18S- en 5S-banden zichtbaar waren zonder duidelijke uitsmeering.
Reverse transcriptie (RT) om cDNA te synthetiseren
6 μL RNA werd voorverwarmd bij 70 °C gedurende 10 minuten, daarna werden 25 mM MgCl2 (4,0 μL), dNTP (2,0 μL), AMV (0,7 μL), 10× AMV Buffer (2,0 μL), oligo(dT) (1,0 μL), RNasin (0,5 μL) en gedeïoniseerd water sequentieel op ijs toegevoegd om een eindreactievolume van 20 μL te bereiken, gevolgd door zacht mengen en korte centrifugatie. De reactieomstandigheden waren 25 °C voor 1 minuut, 42 °C voor 60 minuten, 98 °C voor 5 minuten, en daarna voor onbepaalde tijd op 4 °C opgeslagen. Zodra de reactie 4 °C bereikte, werd het product uit de PCR-machine gehaald, gebruikt als cDNA-sjabloon voor de volgende PCR-reactie en opgeslagen bij -20 °C voor later gebruik.
PCR-versterking
Voor elke PCR-reactie bevatte het mengsel cDNA-template (1 μL), een forward primer specifiek voor de HMGA1, HAND1 of GAPDH (1 μL), reverse primer specifiek voor het doelgen of GAPDH (1 μL), PCR mastermix (10 μL) en DEPC-behandeld water (7 μL), voor een totaal volume van 20 μL. Voor elk doelgen werden afzonderlijke reacties voorbereid (HMGA1, HAND1) en het interne controlegen (GAPDH), waarbij elke reactie het respectievelijke genspecifieke voor- en omgekeerde primerpaar bevat.
Het totale reactievolume was 20 μL. Na het voorzichtig mengen van de reactiecomponenten en het kort centrifugeren van 5–10 seconden op lage snelheid, werd de buis in een voorverwarmde PCR-machine geplaatst en versterkt volgens de reactiecondities in Tabel 2.
Bevestiging en analyse van PCR-versterkte producten
Gelbereiding
2 g agarose werd gewogen en in een driehoekige fles geplaatst. 2 mL 50× TAE-elektroforesebuffer en 100 mL gedestilleerd water (bereid een 2% agarosegel) werden toegevoegd, waarna ze in een magnetron met intermitterende draaibewegingen (15–20 seconden) werden verwarmd totdat de agarose volledig was opgelost. Na afkoeling tot ongeveer 55 °C werd 10 μL EB-oplossing toegevoegd en grondig gemengd. De gel werd vervolgens in een schoon gelbakje op kamertemperatuur (20–25 °C) gegoten, gewassen met gedestilleerd water, en er werd een kam ingebracht om monsterputten te maken. De geldikte was 0,4 cm. De tray werd 30 minuten op een vlak oppervlak bij kamertemperatuur (20–25 °C) geplaatst totdat de gel volledig was gestold. De kam werd voorzichtig verwijderd.
Laadmonsters
4 μL van elk DNA-monster werd toegevoegd aan de putten van de gel, en de DNA-marker werd toegevoegd aan de meest linkse put.
Elektroforese
De geladen geltray werd in een elektroforesetank geplaatst die gevuld was met TAE-elektroforesebuffer, zodat het bufferniveau ongeveer 1 mm boven het geloppervlak bleef. Een uiteinde van de putten was bij de kathode (om DNA te laten migreren naar de anode). Het elektroforesesysteem was aangesloten op een voeding en draaide op 120 V en 60 mA gedurende ongeveer 45 minuten, totdat de laadbuffer voorbij de middenlijn van de gel trok, waarna de stroom werd uitgeschakeld.
Resultaatobservatie en beeldvorming
Na elektroforese werd de gel zorgvuldig verwijderd en werden de resultaten onder een UV-transilluminator waargenomen en vergeleken met de DNA-marker om te bepalen of het molecuulgewicht van de versterkte fragmenten op de verwachte posities stond. Het gelbeeldvormingssysteem werd gebruikt om beelden vast te leggen en de resultaten op de computer op te slaan.
Besturingsopstelling
Gedestilleerd water werd gebruikt in plaats van cDNA als negatieve controle.
Semi-kwantitatieve analyse
De resultaten van de agarosegel-elektroforese werden geanalyseerd en vastgelegd met behulp van het gelbeeldvormingssysteem. Beeldanalysesoftware werd gebruikt om de helderheid van de banden te analyseren. De absolute geïntegreerde OD-waarden van de doelgenamplificatieband en de bijbehorende interne controlegenamplificatieband werden gemeten. De resultaten werden uitgedrukt als de verhouding van de absolute geïntegreerde OD-waarde van de doelband tot de absolute geïntegreerde OD-waarde van de overeenkomstige interne controleband.
Dat wil zeggen, relatieve expressie = OD-waarde van het doelgen / OD-waarde van het interne controlegen (OD).
Statistische analyse
Alle gegevens werden georganiseerd met Excel en geanalyseerd met statistische software. Continue variabelen werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) en vergeleken tussen twee groepen met behulp van de onafhankelijke t-test. Nominale categorische variabelen, waaronder immunohistochemische positieve expressiesnelheden, werden geanalyseerd met behulp van de χ2-test . Ordinale categorische variabelen, waaronder pathologische graad en klinisch stadium, werden geanalyseerd met behulp van de rangsomtest (Mann-Whitney U-test voor tweegroepsvergelijkingen, indien van toepassing). De correlatie tussen de expressie van HMGA1 en HAND1 werd geëvalueerd met behulp van lineaire correlatieanalyse. Alle tests waren tweezijdig; P < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd, en P. < 0,01 als zeer significant.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten van immunohistochemische detectie
Er worden representatieve hematoxyline–eosine (HE) kleuringsbeelden getoond die de histologische morfologie van aangrenzende normale larynxmucosa en LSCC met verschillende graden van differentiatie (wel, matig en slecht) illustreren. Specifiek toont Figuur 1A aangrenzende normale larynxmucosa, Figuur 1B goed gedifferentieerde LSCC,
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Larynxkanker, een van de meest voorkomende tumoren van hoofd en hals, heeft de afgelopen jaren een toenemende incidentie laten zien, waarschijnlijk in verband met omgevings- en leefstijlgerelateerde factoren. Net als bij andere kwaadaardige tumoren blijven recidief en uitzaaiingen de belangrijkste doodsoorzaken. Met de vooruitgang in de moleculaire biologie zijn veel factoren geassocieerd met de ontwikkeling van larynxkanker geïdentificeerd, maar de mechanismen van ontstaan en metastase ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs willen de steun van hun instelling en alle personen die aan deze studie hebben bijgedragen, bedanken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Automatic Tissue Embedding Machine | Sakura Finetek, Tokyo, Japan | Tissue-Tek TEC 5 | Paraffin inbedding |
| Microtome | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | RM2135 | Seceren (4 μm) |
| Slide Dryer | Xiaogan Hongye Medical Instrument Co., Ltd., China | CS-VI | Slijpondering |
| Heating Incubator | Shanghai Yangguang Experimental Instrument Co., Ltd., China | 303-4A | Temperatuurgestuurde incubatie |
| Optical Microscope | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | BX41 | Histologische observatie |
| Image Capture System | QImaging, Canada | QCapture Pro 7 | Microscopie beeldvorming |
| Clean Bench | Beijing Xicheng Semiconductor Equipment Factory, China | SW-CJ-1FD | Steriele werkruimte |
| Refrigerated Centrifuge | Beijing Medical Instrument Repair Factory, China | LXJ-64-01 | RNA-scheiding |
| Tabletop Centrifuge | Shanghai Peiqing Technology Co., Ltd., China | PQ-1600A | RNA/DNA verwerking |
| Magnetic Stirrer | Jiangsu Jintan Medical Instrument Factory, China | HJ-3 | Oplossingsvoorbereiding |
| Mini Mixer | Shanghai Peng’s Industrial Co., Ltd., China | H-1 | Stapelen mixen |
| Electronic Balance | METTLER Toledo, Switzerland | PB3002-S | Stapelen weging |
| PCR Amplifier | Eppendorf AG, Germany | Mastercycler 5333 | PCR-amplificatie |
| Electrophoresis Power Supply | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | DYY-6C | Spanningscontrole |
| Electrophoresis Tank | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | DYCZ-24DN | Gelelektroforese |
| Microwave Oven | Shanghai Zhongda Medical Application Research Institute, China | WD800SL23 | Agarose voorbereiding |
| UV Transilluminator | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | WD-9403B | DNA-visualisatie |
| Gel Imaging System | Anlai Co., Ltd., China | AlphaImager HP | Geldocumentatie |
| Refrigerator (4 °C) | Haier Biomedical, China | BC-165D | Stapelenopslag |
| Ultra-Low Temperature Freezer | Haier Biomedical, China | DW-86L388 | Opslag (-80 °C) |
| Ice Box | Shanghai Fuzhi Technology Co., Ltd., China | FZ-IB-20L | Stapelentransport |
| Cryogenic Storage Bags | Shanghai Yili Technology Co., Ltd., China | YL-ULT-50 | Stapelenbewaring |
| Research Pipettes | Eppendorf AG, Germany | Research Plus | Vloeistofverwerking |
| RNA Extraction Reagent (TRIzol) | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific), USA | 15596026 | RNA-extractie |
| Reverse Transcription Kit | Takara Bio Inc., Japan | RR037A | cDNA-synthese |
| PCR Master Mix | Takara Bio Inc., Japan | RR820A | PCR-amplificatie |
| dNTP Mix | Takara Bio Inc., Japan | 4030 (typisch) | PCR-component |
| RNase Inhibitor (RNasin) | Promega, USA | N2111 | RNA-bescherming |
| Oligo(dT) Primer | Takara Bio Inc., Japan | 3806 (typisch) | cDNA-synthese primer |
| Agarose | Sigma-Aldrich, USA | A9539 | Gelvoorbereiding |
| TAE Buffer (50×) | Sigma-Aldrich, USA | TAE50X-1L (typisch) | Elektroforese buffer |
| DNA Marker (Ladder) | Takara Bio Inc., Japan | DL2000 (3421A) | Groottetekening |
| Ethidium bromide (EtBr) | Bio-Rad, USA | 1610433 | DNA-visualisatie |
| PBS Buffer | Gibco (Thermo Fisher Scientific), USA | 10010023 | Wasbuffer |
| DEPC-treated Water | Invitrogen, USA | AM9916 | RNA-bescherming |
| Chloroform | Sigma-Aldrich, USA | C2432 | RNA-extractie |
| Isopropanol | Merck, Germany | 109634 | RNA-precipitatie |
| Ethanol (absoluut) | Merck, Germany | 100983 | Dehydratie |
| Methanol | Merck, Germany | 106009 | Peroxidase blokkering |
| Hydrogen Peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich, USA | H1009 | Endogene peroxidase blokkering |
| Xylene | Sigma-Aldrich, USA | 534056 | Deparaffinisatie |
| Citrate Antigen Retrieval Buffer | Abcam, UK | ab93678 | Antigeen terugwinning |
| Antibody Diluent | Dako, Denmark | S3022 | Antilichaamverdunning |
| HMGA1 primaire antilichaam | Abcam, UK | ab129153 | Verdunning 1:150 |
| HAND1 primaire antilichaam | Abcam, UK | ab200040 | Verdunning 1:100 |
| Secundair antilichaam (HRP-geconjugeerd) | Dako, Denmark | K5007 | Detectiesysteem |
| DAB-substraatkit | Dako, Denmark | K3468 | Chromogene detectie |
| Hematoxyline-kleuring | Sigma-Aldrich, USA | H9627 | Kernkleuring |
| Eosine-kleuring | Sigma-Aldrich, USA | E4009 | Cytoplasmatische kleuring |
| Neutraal balsem montagemedium | Sinopharm Chemical Reagent Co., China | 10004160 | Slijmontage |
| HMGA1-primers | Op maat gemaakt (bijv. IDT/Sangon) | N/A | Genamplificatie |
| HAND1-primers | Op maat gemaakt (bijv. IDT/Sangon) | N/A | Genamplificatie |
| GAPDH-primers (interne controle) | Op maat gemaakt | N/A | Huishoudingsgen |
| APES (Aminopropyltriethoxysilaan) | Sigma-Aldrich | N/A | Slijcoating |
| RNase-vrije microcentrifugebuizen | Eppendorf | N/A | RNA-verwerking |
| RNase-vrije pipettentips | Eppendorf | N/A | Vloeistofverwerking |
| Agarose gelgietbak en kam | Generiek | N/A | Gelvoorbereiding |
| Primer ontwerpsoftware | Integrated DNA Technologies, USA | PrimerQuest Tool | Primer ontwerp |
| Beeldanalysesoftware | Media Cybernetics, USA | Image-Pro Plus 6.0 | Bandkwantificering |
| Statistische analysesoftware | IBM Corp., USA |