Methodenartikel

Infant Immuniteit in kaart brengen met minimale input: Integratieve single-cell en multiomic profiling

DOI:

10.3791/70279

⸱

3 april 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Yale University School of Medicine, 2Department of Biomedical Informatics and Data Science, Yale University School of Medicine, 3Department of Biostatistics, Yale University School of Public Health, 4Center for Systems and Engineering Immunology, Yale University, 5Department of Immunobiology, Yale University School of Medicine, 6Department of Obstetrics, Gynecology, & Reproductive Sciences, Yale University School of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft het verzamelen en conserveren van bloedmonsters van neonatale en pediatrische patiënten en de toepassing van scRNA-seq, proteomics en spectrale flowcytometrie om de populaties van immuuncellen uit deze monsters te karakteriseren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bij de geboorte wordt het neonatale immuunsysteem abrupt geconfronteerd met een radicaal andere omgeving, rijk aan microbiële en omgevingsprikkels. Steeds meer bewijs suggereert dat immuniteit in het vroege leven niet alleen onvolwassen is, maar juist uniek aangepast om te voldoen aan de specifieke eisen van dit ontwikkelingsvenster. In deze periode is het immuunsysteem zeer dynamisch en ondergaat het snelle veranderingen om het veranderende externe landschap op te vangen. Het begrijpen van dit complexe en evoluerende immuunlandschap vereist directe studie bij neonaten. Een grote beperking bij dergelijke onderzoeken is echter het lage totale bloedvolume bij pasgeborenen (~100 mL/kg), wat de hoeveelheid die veilig kan worden verzameld voor onderzoek beperkt, vooral bij extreem lage geboortegewichten (ELBW) of extreem premature baby's. In ons recente werk pakken we deze beperking aan door aan te tonen hoe hoogdimensionale immuunprofilering kan worden uitgevoerd met behulp van kleine hoeveelheden neonataal bloed. We introduceren een set geoptimaliseerde protocollen voor longitudinale bemonstering over de vroege levensfase en passen geavanceerde technieken toe, waaronder flowcytometrie, proteomica en single-cell RNA-sequencing, om de informatie die uit minimale input wordt verkregen te maximaliseren. Samen maken deze methoden een volledig beeld mogelijk van de transcriptomische en proteomische signaturen van circulerende immuuncellen bij neonaten, wat nieuwe inzichten biedt in het unieke traject van immuniteit in het vroege leven.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol is geoptimaliseerd voor 100-250 μL bloedmonsters die binnen 12 uur na afname worden verwerkt, hetzij gecryopreserveerd of direct gebruikt. Bij de geboorte wordt het neonatale immuunsysteem in een radicaal andere omgeving geplaatst, verrijkt met microbiële en omgevingsprikkels die voorheen ontbraken in de beschermde intrauteriene setting 1,2. Deze verschuiving vereist dat het immuunsysteem zich aanpast en reageert op een enorme reeks nieuwe antigenen, een proces dat essentieel is voor overleving maar ook aanzienlijke uitdagingen met zich meebrengt 1,2. Steeds meer bewijs suggereert dat immuniteit in het vroege leven niet simpelweg onvolwassen is of een miniatuurversie van het volwassen immuunsysteem. In plaats daarvan is het uniek afgestemd op de specifieke behoeften van deze cruciale ontwikkelingsperiode 3,4. Tijdens dit neonatale venster rijpen de cellulaire componenten van het immuunsysteem, waaronder verschillende typen T-cellen, B-cellen en myeloïde cellen, en ontwikkelen unieke kenmerken en functies die specifiek zijn voor het vroege leven 5,6,7,8. Ondanks het belang blijft neonatale immuniteit moeilijk direct te bestuderen vanwege ethische en praktische beperkingen. Een grote beperking is het kleine bloedvolume bij neonaten, gemiddeld ~100 mL/kg 9,10. Deze uitdaging wordt nog duidelijker bij het verzamelen van bloed van extreem premature baby's (geboren vóór 30 weken zwangerschap) en ELBW-baby's, die slechts 400 g kunnen wegen met slechts 40 ml circulerend bloed. Dit beperkt hoeveel bloed veilig kan worden verzameld, wat de noodzaak benadrukt van methoden die de data-opbrengst van minimale monsters maximaliseren. Om deze uitdaging aan te pakken, demonstreert ons werk geoptimaliseerde protocollen voor hoogdimensionale immuunprofilering met behulp van kleine bloedvolumes (100-250 μL), zoals die verkregen van ELBW-zuigelingen.

Recente ontwikkelingen in bloedafname en -verwerking hebben het mogelijk gemaakt immuunresponsen te bestuderen in populaties waar het verzamelen van monsters traditioneel moeilijk is. Micronaaldapparaten zoals de Tasso en Touch Activated Phlebotomy systemen werden aanvankelijk ontwikkeld voor gemakkelijke bloedafname thuis bij volwassenen. Sindsdien zijn ze aangepast voor gebruik bij zuigelingen, waardoor huisartsen en klinische teams monsters kunnen verzamelen met minimale ongemakken. Daarnaast kunnen ze thuis worden gebruikt zonder de stress van herhaalde klinische bezoeken11, wat naleving en toegankelijkheid bevordert. Een ethyleendiamintetraazijnzuur (EDTA) microbuisje moet samen met het apparaat worden gebruikt en 's nachts naar het laboratorium worden gestuurd, mits de juiste biohazardprotocollen worden gevolgd. De volgende ochtend, wanneer monsters arriveren, moeten ze worden verwerkt met behulp van rode bloedcellen (RBC) lysemethoden om circulerende immuuncellen6 vast te leggen. Opmerkelijk is dat EDTA-buizen isolatie van levende cellen mogelijk maken, maar tijdsoverwegingen zijn belangrijk. Voor functionele assays met stimulatie moeten monsters binnen minder dan 4 uur worden verwerkt en idealiter minder dan 2 uur na de verzameling. Voor de niet-functionele, fenotypische assays hieronder gepresenteerd, moeten monsters binnen 12 uur worden verwerkt om overnachting verzending mogelijk te maken en tegelijkertijd herstel te waarborgen, aangezien de cellevensvatbaarheid na verloop van tijd afneemt12. In vergelijking met traditionele dichtheidsgradiëntscheiding met Ficoll is lysis sneller, minder arbeidsintensief en levert het een hoger herstelop 13. Echter, isolatie van perifere mononucleaire cellen door lysis kan besmettende granulocyten achterlaten, waardoor de zuiverheid afneemt, maar het kan voordelig zijn voor studies die geïnteresseerd zijn in deze celtypen14. Deze afwegingen benadrukken hoe methodologische aanpassingen haalbaarheid en nauwkeurigheid in balans brengen bij het bestuderen van zeldzame of gevoelige klinische monsters, zoals die van neonaten. Ook de downstream behandeling van geïsoleerde cellen heeft geprofiteerd van methodologische verfijningen. Cryopreservatie met foetaal rundserum (FBS) en dimethylsulfoxide (DMSO) blijft een robuuste aanpak voor immuuncellen, vooral in foetaal en neonataal bloed, waar cellevensvatbaarheid en herstel cruciaal zijn. Naast het optimaliseren van het bloedafnameproces hebben we ook downstreamtechnieken toegepast die het mogelijk maken maximale informatie uit kleine monstervolumes te extraheren. We introduceren een reeks geoptimaliseerde protocollen die bemonstering over de vroege leeftijd mogelijk maken, waardoor een gedetailleerd onderzoek van de immuundynamiek in de loop van de tijd mogelijk is. Onze aanpak maakt gebruik van geavanceerde technieken zoals spectrale flowcytometrie, proteomica en single-cell RNA-sequencing, die samen een ongeëvenaard beeld bieden van de proteomische en transcriptiesignaturen van circulerende immuuncellen in het vroege leven. Daarnaast biedt spectrale flowcytometrie mogelijkheden om functioneel inzicht te verkrijgen met minimale celinput.

In de loop der jaren zijn verschillende technieken, zoals volledige bloedtellingen (CBC's), gebruikt om bloedafgeleide immuuncellen15 te analyseren, terwijl andere immuuncelverhoudingen in neonatale volbloedmonsters hebben geanalyseerd met DNA-methylering 16,17. Hoewel deze technieken nuttig zijn geweest om de verhoudingen van bekende immuuncellen te leren kennen, zijn er nog steeds beperkingen in ons vermogen om diepgaande inzichten te krijgen in cellen zonder een multi-omics-systeem. CBC's geven slechts brede metingen van belangrijke bloedceltypen, waardoor ze nuttig zijn voor het vaststellen van de algehele immuunstatus in een klinische setting, maar beperkt in hun vermogen om subtypen of functionele toestanden te onderscheiden. Recentelijk zijn studies begonnen deze beperking aan te pakken door plasma-afgeleide transcriptomische en metabolomische veranderingen bij zuigelingen al in de eerste levensweekvan 18 toe te passen. Op massaspectrometrie gebaseerde proteomics is aangepast om immuunprofielen in neonatale monsters te bestuderen19. Deze benadering is krachtig voor het meten van een breed scala aan eiwitten op een onbevooroordeelde manier en voor het identificeren van potentiële biomarkers. Belangrijke beperkingen zijn echter de noodzaak van relatief grote eiwitinvoer en het gebrek aan directe informatie over celidentiteit, ondanks het vastleggen van zowel oplosbare als onoplosbare eiwitten. Gerichte multiplex proteomics-assay (TMPA) biedt alternatieven voor monsters met lage input. Deze methoden maken gebruik van gerichte antistofdetectie, wat een hoge gevoeligheid biedt voor monsters met beperkt materiaal. Een van deze is in het bijzonder gebruikt om vroege levensontwikkelingen van immuunontwikkelingen in de longitudinale20 te volgen.

Flowcytometrie maakt kwantitatieve analyse van immuunceleiwitten op enkelcelniveau mogelijk door fluorescentief-gelabelde cellen door een gerichte laserstraal te laten lopen en de resulterende lichtverstrooiings- en fluorescentiesignalen te meten. Bij deze techniek binden fluorescentief-gelabelde antilichamen aan specifieke oppervlak- of intracellulaire eiwitten. Dit maakt gelijktijdige detectie en kwantificering mogelijk van meerdere immuuncelsubtypes en hun bepalende kenmerken op basis van hun fluorescentieprofielen. Spectrale flowcytometrie breidt deze benadering uit door het volledige emissiespectrum van elke fluorochroom vast te leggen, waardoor nauwkeurige spectrale ontmenging en gelijktijdige detectie van meer dan 35 markers in één enkele assaymogelijk is. Dit maakt analyse van veel meer markers mogelijk dan conventionele flowcytometriepanelen, die beperkt zijn tot ~8-12 markers. Als aanvulling op deze cytometrische technieken heeft single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) immunologisch onderzoek getransformeerd door hoogresolutie, onbevooroordeelde transcriptomische profilering mogelijk te maken vanuit minimaal inputmateriaal24. Ondanks hogere kosten en afhankelijkheid van cellevensvatbaarheid biedt scRNA-seq ongeëvenaarde inzichten in de heterogeniteit van het immuunsysteem in het vroege leven vergeleken met bulksequencing. Gezamenlijk tonen deze ontwikkelingen aan hoe innovaties in verzameling, behoud en analyse worden aangepast om de unieke uitdagingen van het bestuderen van foetale en neonatale immuniteit te overwinnen.

Dit protocol is geoptimaliseerd voor de analyse van cryoppreserve perifere immuuncellen die zijn geïsoleerd via seriële RBC-lyse. Onderzoekers zouden dit protocol moeten overwegen als hun studies hoogresolutie immuunprofilering vereisen uit kleine hoeveelheden bloed (100-500 μL), vooral wanneer longitudinale analyse cruciaal is. De methode is breed toepasbaar op zowel voldragen als vroeggeborenen en is compatibel met een breed scala aan downstream-analyses, waardoor het geschikt is voor diverse onderzoeksvragen in neonatale en pediatrische immunologie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geïnformeerde ouderlijke toestemming en volledige naleving van relevante nationale ethische regels werden gewaarborgd in overeenstemming met de Institutional Review Board (IRB) van Yale University. Zoals gespecificeerd in het goedgekeurde IRB-protocol, werden ouders in de eerste week na de geboorte van de baby benaderd door het onderzoeksteam om toestemming te verkrijgen voorafgaand aan inschrijving. Er zijn geen studieprocedures gestart met mensgemaakte materialen vóór gedocumenteerde ethische goedkeuring.

1. Monsterverzameling, verwerking en opslag (Figuur 1)

  1. Opname van bloed
    1. Verzamel en verwerk babymonsters na ontvangst, bewaar bij 4 °C en verwerk binnen 12 uur na het verzamelen.
    2. Verzamel ~250 μL volbloed en bewaar in een antistollings EDTA-bloedverzamelbuis. Keer de bloedverzamelbuis 8 keer om om het antistollingsmiddel te mengen.
    3. Ga verder met het verwerken van het hele bloed via rode bloedlyse zoals beschreven in Sectie 1.3 (volbloedmonsterverwerking).
    4. Om droge bloedplekken te verzamelen, gebruik je de steriele lancet om een prikje te maken op de schoongemaakte teen/hiel.
      1. Of pipette ~25-30 μL bloed van de EDTA-buis op het filterpapier. Raak het filterpapier zachtjes aan op de bloeddruppel.
    5. Vul minstens één cirkel met vrij stromend bloed, één druppel per cirkel. Laat de bloedvlek drogen. Houd het filterpapier open totdat de bloedvlekken goed opgedroogd zijn.
    6. Label correct met verzameltijd, verwerkingsdatum, tijdstip en specimenidentificatie.
    7. Plaats het in een doorzichtige plastic opbergtas. Bewaar bloedvlekkaarten bij −20 °C of −80 °C voor verlengde stabiliteit totdat ze klaar zijn voor proteomische analyse.
  2. Ambulante bloedafname
    OPMERKING: Met goedkeuring van de Institutional Review Board van Yale University kregen ouders van poliklinische deelnemers de mogelijkheid om thuis bloedmonsters te nemen met behulp van een micronaald zelfafnameapparaat. Dit apparaat verkrijgt capillairbloed via een lancet die op de huid wordt aangebracht. Ouders die voor deze methode kozen, kregen praktijktraining met behulp van demonstratiekits en kregen vervolgens gedetailleerde schriftelijke instructies en verzamelkits voor thuisgebruik.
    1. Was je handen en draag handschoenen voor gebruik. Verzamel alle benodigde items, inclusief een spiegel als slechts één ouder het bloed afneemt.
    2. Haal het apparaat uit de gereedschapskist en draai de dop van een compatibele buis.
    3. Druk de buis in het apparaat tot het strak zit met vulleidingen naar buiten gericht.
    4. Verwijder de luier van de baby en houd hem rechtop.
    5. Volg de instructies van het warmtepakket om te activeren.
      OPMERKING: Als er geen rugzak beschikbaar is, gebruik dan een andere verwarmingsmethode, zoals een hand.
    6. Houd het warmtezakje 2-4 minuten op de plek (bil) om op te warmen en de bloedtoevoer te verhogen.
    7. Maak het gebied schoon met een alcoholpad en laat het drogen.
    8. Verwijder de doorzichtige hoes van de rode knop. Trek het lipje van het apparaat los en plak stevig op het volle deel van de billen van de baby terwijl je hem rechtop houdt.
      OPMERKING: Pas hun houding aan indien nodig om de buis volledig verticaal te houden voor een goede bloedafname.
    9. Druk de knop één keer helemaal in en laat los. Zet de timer op 5 minuten. Bekijk hoe de buis vult met behulp van de spiegel indien nodig.
    10. Er kan de eerste 1-2 minuten geen bloed verschijnen. Verwijder het apparaat na maximaal 5 minuten of eerder als het bloed zich vóór 5 minuten tot de bovenste indicatorlijn heeft gevuld.
    11. Verwijder de buis van het apparaat met een lichte draai en trek naar beneden. Draai snel de dop helemaal op de buis. Draai de buis minstens 10 keer om, waarbij het bloed bij elke inversie de dop raakt om stolling te voorkomen.
    12. Verzend monsters 's nachts na het verzamelen.
  3. Verwerking van volbloedmonsters
    1. Verwerk bloedmonsters in een biologische veiligheidskast.
    2. Breng voorzichtig de 250 μL bloed over in een 50 mL conische buis met 10 mL 1x rode bloedcel lysisbuffer. Spoel de bloedafnamebuis met 10 ml rode bloedcel-lysisbuffer tot het leeg is. Laat de cellen 15 minuten op kamertemperatuur (RT) lyseren.
    3. Zodra de lysis voltooid is, voeg je ~30 mL PBS toe bij RT om te wassen en te centrifugeren op 430 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Aspireer het supernatant met een vacuüm, zonder de pellet te verstoren.
    4. Blijf het monster overbrengen en spoelen zoals beschreven in stap 1.3.2 totdat de celpellet vrij lijkt te zijn van zichtbare rode bloedcellen. Centrifugeer op 430 × g gedurende 5 minuten en verwijder dan voorzichtig het supernatant zonder de pellet te verstoren.
    5. Voor elke 250 μL bloed die wordt verzameld, wordt de resulterende celpellet opnieuw opgehangen in 2 mL vriesmedium (10% DMSO in FBS) en gesplitst in twee cryovialen voor conservering.
    6. Controleer de levensvatbaarheid van cellen door cellen te tellen die in feezing-medium zijn geresuspendeerd met een hemocytometer met trypan blue exclusion.
    7. Breng 1 mL over van stap 1.3.5 naar elke cryovial. Label correct met het verzameltijdstip, verwerkingsdatum, tijdstip en specimenidentificatie.
    8. Bewaar cryoviale (cellen) tussentijds bij -80 °C in een vriescontainer met isopropanol. Na 24 uur wordt de cryovial(s) overgebracht naar vloeibare stikstof totdat deze klaar is voor analyse.

2. TMPA van gedroogde bloedvlekken (DBS) (Figuur 2)

  1. Breng het filterpapier op de dag van de verwerking naar RT. Met een 3 mm metalen ponsmachine perforeren je 2-3 cirkels in het filterpapier waar het bloed doorheen is gegaan, zo centraal mogelijk op de bloedvlek.
  2. Pak elke 3 mm punch op met een pincet en voeg een 96-put plaat of een laagbindende PCR-buis met 20 μL elusjonsbuffer toe aan een put (1x PBS, 1x Protease Inhibitor, 0,05% Tween 20). Zorg dat de pons bedekt is met een elutionbuffer.
  3. Sluit de buizen of bedek de plaat met een plastic skirt, en plaats ze op een Digital Vortex die 600 rpm draait voor 60 minuten bij RT.
  4. Aan het einde van de incubatie brengt u het eluaat voorzichtig over in een nieuwe laagbindende buis of een plaat met 96 putten. Gooi de buizen of plaat weg met de filterponsen.
  5. Kwantificeer het eiwitgehalte met behulp van een BCA-assay.
    1. Neem 2 μL van elk monster of BSA-standaard om seriële verdunningen van 1:10 en 1:100 in water te maken. Bereid monsters en standaarden in duplicaat voor door 15 μL verdunde monsters of standaard toe te voegen tot 200 μL 1x werkoplossing. Incubeer monsters 30 minuten bij 37 °C.
    2. Lees het signaal op 562 nm op een platenlezer. Bereken de uiteindelijke eiwitconcentratie op basis van de BSA-standaardhelling en de achtergrond van de elutiebuffer.
  6. Maak aliquots van 30 μL voor monsters van 0,5-1 mg/mL in laagbindende 1,5 mL schroefdop microbuizen. Bevries monsters bij -80 °C voor latere indiening om te verwerken met de TMPA-service.

3. Spectrale flowcytometrie van door rode bloedcellen gelyseerd bloed (Figuur 3)

  1. Op de dag van het experiment ontdooi je snel een flesje met rode bloedcellen in een waterbad van 37 °C totdat er nog maar één klein druppeltje ijs overblijft.
  2. Voeg de celsuspensie toe aan een 15 mL conische buis met 10 mL voorverwarmde (37 °C) volledige RPMI (bereid met 500 mL RPMI 1640, 50 mL FBS, 5,6 mL penicilline-streptomycine en 5,6 mL glutamine supplement). Centrifugeer op 400 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant voorzichtig en gooi het weg.
  3. Suspendeer de pellet voorzichtig opnieuw in 3 mL volledige RPMI en bepaal het celaantal met een geschikte methode.
  4. Draai de hersuspendeerde cellen op 400 × g gedurende 5 minuten op kamertemperatuur. Aspireer en gooi het supernatant weg.
  5. Pas de celconcentratie aan naar 1 × 106 cellen/mL in volledige RPMI. Doseer 100 μL per put (0,1 × 10⁶ cellen) in een 96-put V-bodemplaat. Centrifugeer op 764 × g gedurende 2 minuten op 4 °C en verwijder het supernatant.
  6. Voeg 100 μL levend/dood kleurstof toe in PBS met een verdunning van 1:2.000 met Fc-blok en monocytblok (1:100 verdunning) aan alle monsters, behalve de ongekleurde controle. Broed 15 minuten uit op 4 °C.
  7. Was met 100 μL PBS en centrifugeer op 764 × g gedurende 2 minuten op 4 °C. Gooi het supernatant voorzichtig weg.
    OPMERKING: Het is essentieel om Fc-blok en monocytblok te gebruiken om niet-specifieke bindingen van de antilichamen te voorkomen.
  8. Voeg 100 μL van de oppervlaktecocktail verdund (1:200 verdunning) toe in FACS-buffer (500 mL PBS, 2,5 g rundserumalbumine (BSA), 2 mM EDTA, pH 8,5) aan alle monsters, behalve de ongekleurde controle. Broed 30 minuten uit op 4 °C.
  9. Was met 100 μL FACS-buffer en centrifugeer op 764 × g gedurende 2 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant voorzichtig weg.
  10. Fix de cellen door 100 μL 4% paraformaldehyde aan elk monster toe te voegen. Incubeer 15 minuten bij RT in het donker.
  11. Was met 100 μL FACS-buffer, centrifugeer op 764 × g gedurende 2 minuten bij 4°C, en sussen opnieuw in 200 μL FACS-buffer.
  12. Bereid ultra-comp kralen voor als eenkleurige regelaars. Kleur de eenkleurige controlekralen met hetzelfde protocol als de monsters, inclusief fixatie als de monsters gefixeerd waren.
  13. Bereid fluorescent Minus One (FMO) controles voor met dezelfde procedure als voor de monsters.
    OPMERKING: Het is belangrijk om de eenkleurige controles en de FMO's op dezelfde manier te behandelen als de samples. Als de monsters bijvoorbeeld na het kleuren worden vastgesteld, moeten ook de FMO's en de eenkleurige controles worden vastgesteld.
  14. Voer de monsters, enkelkleurcontroles, ongekleurde controles en FMO-controles uit op een conventionele/spectrale flowcytometer. Analyseer de data met software.
  15. Stel poorten in op basis van de juiste isotype- en FMO-controles. Ten eerste, poort cellen om de leukocytenpopulatie te selecteren met behulp van de forward scatter (FSC) versus side scatter (SSC) plot, wat helpt om puin uit te sluiten en cellen te selecteren op basis van grootte en granulariteit.
  16. Na leukocytselectie worden cellen gegated om doublets uit te sluiten met behulp van een plot van voorwaartse verstrooiingsgebied (FSC-A) versus voorwaartse verstrooiingshoogte (FSC-H).
    OPMERKING: Dit zorgt voor de selectie van losse cellen (singlets), waarbij cellen langs de diagonaal als singlets worden beschouwd, terwijl doublets en clumps worden uitgesloten.
  17. Gate-cellen voor levensvatbaarheid met behulp van een levensvatbaarheidskleurstof om dode cellen uit te sluiten, zodat de daaropvolgende analyse alleen levende cellen bevat.
  18. Na deze eerste gating-stappen wordt levende individuele cellen verder gegated voor specifieke lijnmarkers om verschillende immuuncelpopulaties te subcategoriseren. Verdeel de levende individuele cellen in CD33+ myeloïde cellen en CD33-lymfocyten op basis van CD33-expressie.
  19. Binnen de CD33+ populatie differentiëren we CD14+ monocyten en identificeren we CD11c+ dendritische cellen (DC's) als cellen die CD11c expresseren maar niet CD14.
  20. Binnen de CD33-lymfocytpopulatie worden CD3+ T-cellen en subgate gebruikt om CD4+- en CD8+ T-celsubsets te identificeren.
  21. Daarnaast identificeer CD56+ natural killer (NK) cellen via CD56-expressie en gate CD19+ B-cellen via CD19-expressie.

4. scRNA-sequ van RBC-gelyseerd bloed (Figuur 4)

  1. Ontdooi één buisje met cryopgeconserveerde RBC-gelyseerde cellen in een waterbad van 37 °C. Voeg het monster toe aan 10 mL T-cel media in een 15 mL conische buis. Centrifugeer op 430 × g gedurende 5 minuten op 4 °C. Gooi het supernatant weg.
  2. Voeg nog eens 10 ml 1x PBS toe aan het monster. Centrifugeer op 430 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg.
  3. Tel de cellen en beoordeel de levensvatbaarheid met trypan blue. Als de levensvatbaarheid minder dan 70% is, ga dan door met het verwijderen van dode cellen met de Dead Cell Removal Kit.
    1. Verwijdering van dode cellen
      1. Verdun de 20x Binding Buffer Stock met steriel, dubbel gedestilleerd water om een 1x werkoplossing te verkrijgen.
      2. Suspendeer de celpellet in 100 μL dode celverwijdering Microkorrels per 1 × 10 à7 cellen in totaal. Meng grondig en laat het 15 minuten incuberen op kamertemperatuur (RT).
      3. Plaats de magnetische scheidingskolom in de juiste magnetische standaard. Spoel de kolom met 500 μL 1x Binding Buffer om het in evenwicht te brengen voordat je het gebruikt.
      4. Breng het celvolume naar 500 μL met 1x bindingsbuffer. Breng de celsuspensatie aan op de kolom en vang de doorstroming op in een nieuwe 1,7 mL microcentrifugebuis.
      5. Was 2x met 500 μL bindingsbuffer. Verzamel de doorstroming in dezelfde microcentrifugebuis.
      6. Centrifugeer het eluaat op 300 × g gedurende 10 minuten. Gooi het supernatant weg.
    2. Tel de cellen en beoordeel hun levensvatbaarheid met trypanblauw.
    3. Sussen 20.000 levensvatbare cellen opnieuw in 40 μL PBS met 0,04% BSA in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,7 mL.
    4. Stuur de cellen onmiddellijk op ijs naar een genomische kernfaciliteit voor bibliotheekgeneratie en sequencing. Verzamel de sequencingresultaten in het formaat van Cell Ranger-uitvoeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We verzamelden DBS-kaarten van 10 extreem premature baby's op drie tijdstippen: 1 week (n = 12), 1 maand (n = 7) en 2 maanden (n = 3) voor TMPA-proteomische analyse6 (Figuur 2A). Deze monsters werden geanalyseerd samen met voldragen navelstrengbloed van zuigelingen (TCB; n = 4) en gezond volwassen bloed (AB; n = 5). De genormaliseerde eiwitexpressie (NPX) van 92 immuungerelateerde eiwitten werd gekwantificeerd met behulp van het TMPA-...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het verkrijgen van hoogwaardige immunologische gegevens uit minimale hoeveelheden neonataal en zuigelingenbloed vereist methodologische aanpassingen over meerdere stappen. In dit protocol beschrijven we vier complementaire strategieën: (i) geoptimaliseerde bloedverzameling en cryopreservatie om levensvatbare cellen te behouden voor downstream gebruik, (ii) toepassing van spectrale flowcytometrie voor multiparametrische immunofenotypering, (iii) scRNA-seq om immuunheterogeniteit bij hoge ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken de volgende kernfaciliteiten bij Yale: Yale Flow Cytometry kern; Yale Centrum voor Genoomanalyse. Wij danken het Yale Center for Clinical Investigation, het Yale Office of Physician-Scientist and Scientist Development, en het Pediatric Critical Care and Trauma Scientist Development Program/NICHD. Respirometriestudies werden uitgevoerd door de Chemical Metabolism Core aan Yale University. Dit werk werd gefinancierd door subsidies aan: P01 AI179570 (L.K.), R01AI171980 (L.K.), R01DK129552 (L.K.), R01HL163043 (L.K.), Cystic Fibrosis Foundation (L.K.); K08 AI177743 (N.N.B.), Hartwell-prijs (N.N.B.); K08DK133687 (O.O.), Yale School of Medicine, afdeling Kindergeneeskunde (O.O.); R01AI123204 (C.R.O.). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. Figuur 1 is gemaakt in BioRender. Gawon, K. (2025) https://BioRender.com/7embw10.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.5 M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher Scientific 15575-038 
1x RBC Lysis Buffer Invitrogen 3177165 
BCA Protein Assay Kit  Abcam ab287853 
BD Microtainer MAP MicrotubeFisher Scientific 22-253-270
Bel-Art Cryo-Safe -1°C Freeze Controller Millipore Sigma 41122800 
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-Aldrich A9647-100G 
Brilliant Ultra Violet 496 Anti-Human CD3 Thermo Fisher Scientific 364-0038-42 
Brilliant Ultra Violet 661 anti-Human CD11c BD BioScience 612968 
Brilliant Vil750 Anti-Human CD14 BioLegend 367135 
Brilliant Violet 570 Anti-Human CD8a BioLegend 301038 
Brilliant Violet 711 Anti-Human CD56 BioLegend 318336 
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor CocktailMillipore Sigma 11836170001 
Dead Cell Removal Kit Miltenyi Biotec 130-090-101 
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Thermo Fisher Scientific BP231-100 
Dulbecco’s Phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190144 
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco A5256801 
Fisherbrand Digital Vortex Mixer Thermo Fisher Scientific 02215418 
Fixation Buffer BioLegend 420801 
GlutaMAX SupplementGibco 35050061 
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 
MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201 
NameCompanyCatalog Number
OctoMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-109 
Pacific Blue Anti-Human CD4 BioLegend 344619 
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific 15140-122 
RB780 Anti-Human CD33 BD Biosciences 755606 
Rierdge 3mm Metal Puncher Rierdge sdd231031pc-01 
RPMI 1640 MediumGibco 11875-093 
Spark UV 387 Anti-Human CD19 BioLegend 302289 
Tasso Collection KitsTasso N/A
Thermo Scientific Screw Cap Micro TubesThermo Fisher Scientific 14-755-287 
Whatman 309 ProteinsaverCytiva 41111700 
Zombie NIR Fixable Viability Kit BioLegend 423105 
Software en pakketten
Adobe Illustrator2024
bbknn1.5.1
FlowJo10.8.1
GraphPad Prism9.4.0
NameVersion
Scanpy1.9.1
Srublet0.2.3
Commerciële assays
Chromium Single Cell 5’ Kit10X GenomicsPN-1000263
Olink Reveal or Target 96 Inflammatory panelOlinkhttps://olink.com/products/olink-target-96

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the newborn and young infant from infectious diseases: lessons from immune ontogeny. Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).
  2. Jain, N. The early-life education of the immune system: moms, microbes and (missed) opportunities. Gut Microbes. 12 (1), 1824564(2020).
  3. Konnikova, L., et al. Fetal and neonatal T cell immunity: unique features and challenges. Front Immunol. 11, 594939(2020).
  4. Pieren, D. K. J., Boer, M. C., De Wit, J. The adaptive immune system in early life: the shift makes it count. Front Immunol. 13, 1031924(2022).
  5. Brodsky, N. N., et al. Early-life human CD8+ T cells exhibit rapid, short-lived effector responses and a unique transcription factor landscape. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (31), e2421106122(2025).
  6. Olaloye, O., et al. A single-cell atlas of circulating immune cells over the first 2 months of age in extremely premature infants. Sci Transl Med. 17, eadr0942(2025).
  7. Watson, N. B., et al. The gene regulatory basis of bystander activation in CD8+ T cells. Sci Immunol. 9 (92), eadf8776(2024).
  8. Maymí, V. I., et al. Neonatal CD8+ T cells resist exhaustion during chronic infection. J Immunol. 212 (5), 834-843 (2024).
  9. Kandasamy, R., Kollmann, T. R. Challenges in neonatal immunology. Front Immunol. 8, 1756(2017).
  10. Howie, S. R. Blood sample volumes in child health research: review of safe limits. Bull World Health Organ. 89 (1), 46-53 (2011).
  11. Gross, R., et al. Researching COVID to enhance recovery (RECOVER) pediatric study protocol: rationale, objectives and design. medRxiv. , (2023).
  12. Bourguignon, P., et al. Processing of blood samples influences PBMC viability and outcome of cell-mediated immune responses in antiretroviral therapy-naïve HIV-1-infected patients. J Immunol Methods. 414, 1-10 (2014).
  13. Urbansky, A., et al. Rapid and effective enrichment of mononuclear cells from blood using acoustophoresis. Sci Rep. 7 (1), 17161(2017).
  14. Najar, M., et al. Proliferative and phenotypical characteristics of human adipose tissue-derived stem cells: comparison of purification methods. Cytotherapy. 16 (9), 1220-1228 (2014).
  15. Abebe, D. Diagnostic significance of complete blood cell count and hemogram-derived markers for neonatal sepsis. World J Clin Pediatr. 13 (2), 1-13 (2024).
  16. Martino, D., et al. DNA methylation signatures underpinning blood neutrophil to lymphocyte ratio during first week of human life. Nat Commun. 15, 8157(2024).
  17. Jones, M. J., et al. DNA methylation differences between cord and adult white blood cells reflect postnatal immune cell maturation. Commun Biol. 8, 237(2025).
  18. Lee, A. H., et al. Dynamic molecular changes during the first week of human life follow a robust developmental trajectory. Nat Commun. 10, 1092(2019).
  19. Mithal, L. B., et al. Evolution of the umbilical cord blood proteome across gestational development. Sci Rep. 15 (1), 2233(2025).
  20. Olin, A., et al. Stereotypic immune system development in newborn children. Cell. 174 (5), 1277-1292.e14 (2018).
  21. Spasic, M., et al. Spectral flow cytometry methods and pipelines for comprehensive immunoprofiling. Cancer Res Commun. 4 (3), 895-910 (2024).
  22. Park, L. M., Lannigan, J., Jaimes, M. C. OMIP-069: forty-color full spectrum flow cytometry panel. Cytometry A. 97 (10), 1044-1051 (2020).
  23. Sahir, F., et al. Development of a 43-color panel for comprehensive immune cell characterization. Cytometry A. , (2020).
  24. Tang, F., et al. mRNA-seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nat Methods. 6, 377-382 (2009).
  25. Wolf, F. A., Angerer, P., Theis, F. J. SCANPY: large-scale single-cell gene expression data analysis. Genome Biol. 19, 15(2018).
  26. Wolock, S. L., Lopez, R., Klein, A. M. Scrublet: computational identification of cell doublets. Cell Syst. 8 (4), 281-291.e9 (2019).
  27. Polanski, K., et al. BBKNN: fast batch alignment of single-cell transcriptomes. Bioinformatics. 36 (3), 964-965 (2020).
  28. Li, Y., et al. DMSO-free cryopreservation improves recovery and function of human T and NK cells. Cell Transplant. 31, 1-12 (2022).
  29. Meryman, H. T. Cryopreservation of living cells: principles and practice. Transfusion. 47 (5), 935-945 (2007).
  30. Wohnhaas, C., et al. RNA integrity in cryopreserved immune cells enables robust single-cell transcriptomics. Front Immunol. 10, 204(2019).
  31. Daae, L. N. W., et al. Comparison of haematological parameters in capillary and venous blood samples from hospitalized children. Scand J Clin Lab Invest. 51 (7), 651-654 (1991).
  32. Meites, S. Skin-puncture and blood-collecting technique for infants. Clin Chem. 34 (9), 1890-1894 (1988).
  33. Grüner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. Dried blood spots: preparing and processing. J Vis Exp. (97), e52619(2015).
  34. Waaijer, L. A., et al. Spectral flow cytometry panel for comprehensive immunophenotyping. Cytometry A. 107 (4), 226-232 (2025).
  35. Thieme-Ehlert, M. T., et al. OMIP-114: a 36-color spectral flow cytometry panel. Cytometry A. 107 (6), 364-371 (2025).
  36. Yamawaki, T. M., et al. Systematic comparison of high-throughput single-cell RNA-seq methods. BMC Genomics. 22, 66(2021).
  37. Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nat Methods. 14 (9), 865-868 (2017).
  38. Grandi, F. C., et al. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nat Protoc. 17 (6), 1518-1552 (2022).
  39. Kim, N., et al. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing. J Pathol Transl Med. 57 (1), 52-59 (2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Single cel profileringneonataal immuunsysteemflowcytometrielongitudinale immuunprofileringproteomische signaturensingle cell RNA sequencingimmuuncelclustersminimaal bloedvolume

Gerelateerde artikelen