Met de toenemende interesse in intratumorale immunotherapie is het kiezen van tumormodellen die toegankelijk en praktisch zijn, van essentieel belang. Subcutane tumoren zijn gemakkelijk vast te stellen, maar moeilijk te visualiseren en te manipuleren. In dit protocol beschrijven we methoden om intradermale tumoren te genereren die zorgen voor betere zichtbaarheid en toegankelijkheid.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Intradermale tumorimplantatie als robuust model voor intratumorale immunotherapiestudies bij muiskanker
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het opstellen van reproduceerbare muistumormodellen is essentieel voor het evalueren van kankerbiologie en immunotherapiestrategieën. Intratumorale immunotherapie behandelt gevestigde tumoren met immuunstimulerende reagentia om lokale immuunsuppressie om te keren en systemische antitumorimmuniteit te stimuleren. De meeste kankerstudies bij muizen tonen tumoren vast in de subcutane ruimte, wat inherente uitdagingen met zich meebrengt voor experimentele intratumorale immunotherapie vanwege het onvermogen om intratumorale injecties te visualiseren. Intradermale injectie van tumorcellen biedt een betrouwbare methode om visualiseerbare tumoren te genereren die nauwkeurige en reproduceerbare intratumorale injectie en monitoring van groeikinetiek en therapeutische responsen ondersteunen. Hier presenteren we een reproduceerbare methodologie voor het vaststellen en behandelen van intradermale tumoren met behulp van het muis B16F10 melanoommodel in C57BL/6 muizen als voorbeeld. Tumorcelsuspensies worden intradermaal geïnjecteerd, en 7–10 dagen na tumorimplantatie, zodra tumoren ~60 mm3 bereiken, kan een intratumorale injectie van immuunstimulerende middelen of een fysieke behandeling zoals elektroporatie of verwarming direct worden toegepast. Dit maakt precieze toediening van behandelingen en het meten van tumorgroei met schuifklampen mogelijk en voorkomt de uitdaging van de inherente variabiliteit van meerdere behandelingen van subcutane tumoren die niet zichtbaar zijn. Door gedetailleerd inzicht te geven in deze techniek, is dit artikel bedoeld om reproduceerbaarheid te ondersteunen en preklinisch onderzoek in intratumorale immunotherapie te bevorderen.
Inleiding
Modellen van muistumoren vormen een onmisbaar hulpmiddel in kankeronderzoek. In een optimaal muismodel zou het mogelijk zijn tumoren te induceren die menselijke tumoren nauw nabootsen, zowel op genetisch als morfologischniveau 1. Dit maakt de beoordeling en efficiëntie van nieuwe therapeutische benaderingen in verschillende vakgebieden mogelijk, waaronder intratumorale immunotherapie (ITIT). ITIT is een opkomend vakgebied in kankerbehandeling dat bestaat uit het direct toedienen van immuunstimulerende middelen in de tumormicro-omgeving (TME). Deze lokale toediening kan de lokale immuunactivatie versterken, de immunosuppressieve tumormicro-omgeving omkeren en systemische antitumor-immuunresponsen activeren, bekend als het abscopale effect2. De efficiëntie, nauwkeurigheid en consistentie van intratumorale toediening hangen echter af van het vermogen om injectieparameters in verschillende tumormodellen te visualiseren en te controleren.
De meeste preklinische kankerstudies gebruiken subcutane tumorimplantatie. Deze aanpak kent echter beperkingen voor intratumorale therapieën, omdat de tumor niet direct zichtbaar kan worden tijdens de injectie tenzij er een operatie wordt uitgevoerd. Veel intratumorale immunotherapiestrategieën vereisen nauwkeurige toediening van reagentia in kleine muistumoren en vereisen vaak dat deze taak meerdere keren wordt uitgevoerd. Zonder visuele bevestiging worden de nauwkeurigheid van de injectie en het reagensbehoud in subcutane tumoren slecht gecontroleerde variabelen. Dit kan leiden tot verkeerde interpretatie/variatie van experimentele gegevens3.
Intradermale tumorimplantatie biedt een direct, toegankelijk, visualiseerbaar en reproduceerbaar alternatief voor tumorobservatie, meting en intratumorale injectie, waardoor de consistentie wordt verbeterd. Bovendien hebben studies aangetoond dat tumoren die intradermaal worden geïmplanteerd, in tegenstelling tot subcutane injecties, immunogeniteit versterken en de tumorigeniteit van tumorcellen onderdrukken4. Intradermaal geïnjecteerde tumoren veroorzaakten snelle en sterke dendritische celtransport naar lymfeklieren, wat resulteerde in een eerdere en robuustere activatie van tumorspecifieke cytotoxische T-cellen4. De huidige studie beschrijft een gedetailleerd en reproduceerbaar protocol voor het vaststellen van intradermale B16F10-melanoomtumoren bij C57BL/6-muizen en het uitvoeren van daaropvolgende intratumorale behandelingen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd met goedkeuring van, en in overeenstemming met, de richtlijnenvan de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Alle dierprocedures werden uitgevoerd in de dierenfaciliteit van Dartmouth. Vrouwelijke C57BL/6 muizen, 6–8 weken oud, werden onder standaardomstandigheden ondergebracht op geventileerde rekken met voedsel en water. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.
1. Scheermuizen
OPMERKING: Alle medewerkers moeten institutionele training volgen in het omgaan met levende dieren en anesthesie voordat deze procedures worden uitgevoerd.
- Voor de intradermale injectie scheer je de flank van elke muis zoals hieronder beschreven; De rechterflank werd gebruikt voor injecties en de beschreven procedures. Scheer de muizen de dag voordat je tumorcellen injecteert.
- Plaats de muis op een stabiel oppervlak. Pak de muis met de linkerduim en wijsvinger bij de huid van de nek, en steek voorzichtig de linkerkant van het lichaam in de handpalm om de rechterkant bloot te leggen. Gebruik de ring- en/of pink om het linkerbeen en de staart vast te houden, zodat de rechterflank volledig zichtbaar is.
- Scheer de vacht van het achterbeen tot aan de onderste ribben om een vrij gebied voor injectie te creëren.
- Beide flanken kunnen worden afgeschoren als er extra oefenruimte nodig is.
OPMERKING: Beginners kunnen muizen verdoven bij het leren scheren en het juiste stoppelbaard.
2. Oefen injecties met kleurstof
OPMERKING: Oefening kan worden uitgevoerd op zowel levende (onder narcose genomen) als op geëuthanaseerde muizen, en op beide geslachten. Mannelijke muizen hebben doorgaans een dikkere en minder buigzame huid dan vrouwtjes, waardoor de procedure technisch uitdagender is. Om deze reden is oefenen op mannen nuttig om vaardigheid te ontwikkelen.
- Meng voedingskleurstof met fosfaatgeborduurde zoutoplossing (PBS) in een 1,5 mL Eppendorf-buis totdat de oplossing donker lijkt (blauwe voedingskleurstof werd in deze studie gebruikt).
- Haal oefenmuizen in en doe ze volgens de richtlijnen voor de institutionele dierenzorg.
- Plaats de verdoofde muis onder een neuskegel en kantel het lichaam zodat de rechterflank zichtbaar is. Bevestig voldoende verdoving door voorzichtig in het voetkussen te knijpen en geen reactie te zien.
- Laad 30 μL kleurstofoplossing in een 0,3 mL insulinespuit met een 29 G, 1/2" naald. Verwijder alle luchtbellen.
- Gebruik de niet-dominante hand om voorzichtig het been/de huid te knijpen en te rekken om een glad, strak oppervlak te creëren (vermijd het optillen van de huid). Steek de naald met de afschuining omhoog in de dermis onder een ondiepe, parallelle hoek met de huid. Houd de naald zichtbaar onder het oppervlak om de plaatsing van de huid te bevestigen.
OPMERKING: Test tijdens de oefening verschillende handgrepposities om de huidspanning stabiel te houden terwijl je vingers uit de buurt van het naaldpad houdt. Steek de naald ~2 mm in de huid. Om terugstroom te verminderen, steek je de naald ~3 mm in en trek je dan iets terug om een "pocket" te creëren vóór de injectie. Dit helpt de kleurstof op de injectieplaats vast te houden. - Injecteer langzaam alle 30 μL van de kleurstofoplossing totdat er een kleine, duidelijke "bubbel" onder het huidoppervlak ontstaat
OPMERKING: Het ontbreken van zichtbare belletjes suggereert dat de injectie subcutaan werd toegediend in plaats van intradermaal. Het omhoog houden van de schuine kant helpt om een nauwkeurige plaatsing van de huid te garanderen en voorkomt te diepe injectie. - Blijf oefenen totdat er consequent intradermale bubbels ontstaan. Er kunnen maximaal zes tot acht injecties per zijde worden uitgevoerd.
- Na het voltooien van oefeninjecties euthanasen de muizen volgens goedgekeurde protocollen van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)5.
3. Voorbereiding van tumorcellen voor injectie
OPMERKING: Voer alle cellengerelateerde stappen uit in een steriele kap. Wees je ervan bewust dat verschillende muistumorlijnen verschillend groeien.
- Ontdooi tumorcellen (B16F10 gebruikt in deze studie) enkele dagen voor intradermale injecties.
- Kweek cellen tot 70%–80% confluentie terwijl voldoende verse media behouden blijft
OPMERKING: Vermijd 100% confluence, die de proliferatie stopt en de tumorgroei belemmert. - Oogst en bereid cellen voor op 7 x 10 ×6 cellen/mL in ofwel 1x PBS, serumvrije RPMI of een ander medium dat wordt gebruikt voor de celkweek.
OPMERKING: Het B16F10 tumormodel dat in het laboratorium wordt gebruikt, gebruikt 2 x 10à 5 cellen in 30 μL. Het injectievolume van 30 μL is geschikt, maar het aantal cellen kan indien nodig worden aangepast om het gewenste tumormodel vast te stellen. Cellen zullen zich neerzetten en verzamelen zich onderin de buis, dus om de concentratie van cellen constant te houden, meng je de cellen periodiek voorzichtig om ze in de zweefte te houden. - Houd cellen na de verwerking op ijs en ga snel door met injecteren. Langdurige opslag op ijs vermindert de levensvatbaarheid van de cel, wat het aantal levende cellen kan verminderen en de tumorontwikkelingnegatief kan beïnvloeden.
OPMERKING: Cellen worden direct in het lab geoogst en gebruikt. De injecties worden binnen 20–60 minuten na het verwerken van de cellen en het bevriezen ervan uitgevoerd. Gebruik een partner bij het werken met grote groepen om de tijd op het ijs te minimaliseren.
4. Intradermale injecties
- Doof experimentele muizen.
OPMERKING: Anesthesie met isoflurangas wordt door het laboratorium gebruikt, maar injecteerbare anesthetica kunnen ook worden gebruikt. - Na de inleiding van de narcose plaats je de muis onder een neuskegel en positioneer je het lichaam zodat de rechterflank volledig zichtbaar is.
- Keer de celsuspensie voorzichtig om een gelijkmatige menging te garanderen.
- Trek 30 μL celsuspensie in een 0,3 mL spuit met een 29 G, 1/2" naald. Verwijder luchtbellen.
- Met de niet-dominante hand strek je voorzichtig het been/de huid opzij zodat het glad en strak zit (niet omhoog tilen). Steek de naald omhoog in de dermis onder een ondiepe, parallelle hoek. De naald moet zichtbaar blijven onder de huid, zodat het niet te diep zit.
OPMERKING: De naalddiepte moet ~2 mm in de huid zijn. Om terugstroming van de cellen te voorkomen, steek je de naald ~3 mm in de huid, trek je de naald iets naar achteren om een "pocket" te creëren waarin de cellen geïnjecteerd worden. Dit vermindert de terugstroom aanzienlijk. - Injecteer heel langzaam alle 30 μL celsuspensie totdat er een kleine, zichtbare "bubbel" onder de huid ontstaat. Wacht 5–10 seconden voordat je de naald verwijdert.
OPMERKING: Het te snel verwijderen van de naald kan ervoor zorgen dat de oplossing door de druk uit de huid komt. - Herhaal dit voor elke muis. Vervang de spuiten na elke kooi (4–5 muizen) om te voorkomen dat de naald stomp wordt.
- Houd alle muizen in de gaten totdat ze volledig zijn hersteld van de narcose.
- Houd muizen in de gaten op tumoroprichting.
5. Intratumorale injecties
OPMERKING: Tumoren zijn doorgaans 7–10 dagen na de implantatie klaar voor behandeling, zodra ze de juiste grootte hebben bereikt. De geschikte grootte die in het laboratorium wordt gebruikt is ~50 mm3 of groter volgens de formule: Volume = (Lengte/2) * (Breedte*Breedte)7,8.
- Bereid alle behandelingsoplossingen vooraf voor (bijvoorbeeld werd 1x PBS gebruikt in deze studie). Bewaar oplossingen op ijs of op kamertemperatuur, afhankelijk van de specifieke behandeling.
- Induceer anesthesie volgens de richtlijnen van de instelling.
- Plaats de muis onder een neuskegel om de verdoving te behouden en plaats deze zo dat de tumor blootgesteld is.
- Trek het benodigde volume (bijv. 30 μL die hier wordt gebruikt) in een 0,3 mL insulinespuit met een naald van 29 G, 1/2". Verwijder luchtbellen.
OPMERKING: Het volume zal verschillen afhankelijk van de gewenste behandeling en geoptimaliseerde omstandigheden. - Steek de naald horizontaal in de tumor en beweeg richting het midden van de tumormassa.
OPMERKING: Vermijd het inbrengen van bovenaf of onder een steile hoek, omdat dit kan resulteren in een te diep inbreng of te diep in het omliggende weefsel. De beschreven behandeling werd toegediend als een enkele injectie. De doseringen en frequentie zijn allemaal afhankelijk van de gewenste behandeling en de geoptimaliseerde omstandigheden. Bij kleine tumoren is één dosis voldoende om de behandeling te verdelen, maar bij grotere tumoren kunnen meerdere injecties nodig zijn om de behandeling gelijkmatig over de tumormassa te verdelen. - Injecteer de behandeling langzaam en gestaag. Pauzeer 10 seconden voordat je de naald langzaam terugtrekt om terugstroming of lekkage te minimaliseren. Sommige tumoren hebben een hoge interne druk, en er moet voorzichtig worden geacht dat de injectie niet via het naaldgaatje naar buiten lekt.
- Herhaal de procedure voor elke muis. Vervang spuiten na elke kooi met 4–5 muizen en bij het wisselen van behandelgroep om kruisbesmetting te voorkomen.
- Houd muizen na de narcose in de gaten totdat ze weer mobiliteit en normale ademhaling hebben. Blijf dagelijks de behandeling en algehele gezondheid monitoren.
OPMERKING: Wees je ervan bewust dat verschillende cellijnen tumoren op verschillende momenten kunnen laten ulcereren. Elk experiment en elk IACUC-protocol heeft duidelijk vastgestelde eindpunten en exclusiecriteria. In het laboratorium zijn de eindpunten voor muisexperimenten 1500 mm3 en worden de zweren die optreden geaccepteerd en niet uitgesloten van de studie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Bij het oefenen van injecties met kleurstof kan succesvolle intradermale toediening worden geverifieerd zonder de muis te laten inslapen door de vorming van een zichtbare "bel" op de injectieplaats te observeren. Een correct uitgevoerde intradermale injectie produceert een grote, goed gedefinieerde en verhoogde "bubbel" (Figuur 1A–F). Kleine of platte belletjes suggereren dat de injectie gedeeltelijk subcutaan kan zijn. Als er geen "bel" ont...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het succes van dit protocol (Figuur 4) hangt af van het behouden van een consistente intradermale injectiediepte en precieze naaldplaatsing om toediening in de dermis te garanderen in plaats van de subcutane laag. Als de naaldhoek te steil is of de injectiedruk te hoog, kunnen de kleurstof of tumorcellen via de huid in de subcutane ruimte worden afgezet. Na de injectie helpt kort pauzeren voordat de naald langzaam wordt teruggetrokken om lekkage of vorming v...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten om te melden.
Dankbetuigingen
AS erkent de Immunology Training Grant, T32 AI007363. KSK bedankt de Schlumberger Foundation met dank voor haar steun via het Faculty for the Future-programma.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL Natural Centrifuge Tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 150 cm2 Cell Culture Flask | Corning | 430825 | |
| Fluriso | Vet One | 13985-528-60 | isofluraan |
| Food Coloring | Durkee | voor oefening | |
| Insulin syringe 0.33 x 12.7 mm | Exel | 26018 | |
| Mini Arco | Wahl | 08787-450A | schaar om de muizen te scheren |
| PBS, 1X zonder calcium & magnesium | Corning | 06325002 | pH 7.4 +/- 0.1 |
| RPMI 1640, 1x | Corning | 12225004 | |
| SomnoFlo Low-Flow Electronic Vaporizer | Kent Scientific | SF-01 | anesthesieapparaat |
Referenties
- Zhang, W., Moore, L., Ji, P. Mouse models for cancer research. Chin J Cancer. 30 (3), 149-152 (2011).
- Silihe Kamga, K., Fiering, S. Intratumoral immunotherapy prior to cancer surgery a promising therapeutic approach. Front Immunol. 16, 1545000 (2025).
- Carlson, P. M., et al. Depth of tumor implantation affects response to in situ vaccination in a syngeneic murine melanoma model. J Immunother Cancer. 9 (4), e002107 (2021).
- Bonnotte, B., et al. Intradermal injection as opposed to subcutaneous injection enhances immunogenicity and suppresses tumorigenicity of tumor cells. Cancer Res. 63 (9), 2145-2149 (2003).
- Garber, J. C., et al. . Guide for the care and use of laboratory animals. , (2011).
- Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy. Curr Protoc Immunol. 109, 20.1.1-20.1.43 (2015).
- Mao, C., Beiss, V., Ho, G. W., Fields, J., Steinmetz, N. F., et al. In situ. vaccination with cowpea mosaic virus elicits systemic antitumor immunity and potentiates immune checkpoint blockade. J Immunother Cancer. 10 (12), e005834 (2022).
- Ho, G. W., et al. Intratumoral expression of IL-12 and CD40 ligand (CD154) from plasmids generates antitumor responses that eliminate tumoral T regs. Sci Rep. 15 (1), 24439 (2025).
- Kim, Y. C., Jarrahian, C., Zehrung, D., Mitragotri, S., Prausnitz, M. R. Delivery systems for intradermal vaccination. Curr Top Microbiol Immunol. 351, 77-112 (2012).
- Chen, X. Emerging adjuvants for intradermal vaccination. Int J Pharm. 632, 122559 (2023).
- Hickling, J. K., Jones, K. R., Friede, M., Zehrung, D., Chen, D., et al. Intradermal delivery of vaccines: potential benefits and current challenges. Bull World Health Organ. 89 (3), 221-226 (2011).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
