Methodenartikel

Een techniek voor het stabiliseren van membraaneiwitten in nanodiscs

DOI:

10.3791/70283

⸱

30 april 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Biology, Hunan University, 2State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, College of Life Science and Technology, Guangxi Key Laboratory for Sugarcane Biology, Guangxi University, 3Jinshan Hospital, Zhongshan Hospital, Institute for Translational Brain Research, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, MOE Frontiers Center for Brain Science, Fudan University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie beschrijft de procedure voor het reconstitueren van het membraaneiwit TWIK-gerelateerd zuurgevoelig K+ -kanaal 2 (Task2) in nanodiscs. De succesvolle assemblage werd bevestigd door single-particle cryo-elektronenmicroscopie, die goed gedefinieerde tweedimensionale klassegemiddelden opleverde.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veel membraaneiwitten vertonen slechte stabiliteit, verlies van activiteit en heterogeniteit van het monster wanneer ze worden geëxtraheerd in detergent-gebaseerde omgevingen, wat aanzienlijke uitdagingen vormt voor high-resolution cryo-elektronenmicroscopie-analyse. De nanodisc-technologie pakt deze beperkingen aan door membraanscaffold-eiwitten (MSP's) en fosfolipiden te gebruiken om doeleiwitten te reconstrueren tot een inheemse lipide-dubbellaag. In deze studie werd het humane kaliumkanaal Task2 tot expressie gebracht, opgelost en gezuiverd in aanwezigheid van geschikte detergenten voorafgaand aan de montage van de nanodisc. Het resulterende protocol stelt een reproduceerbare workflow vast voor de reconstructie van Task2-nanodiscs, zoals aangetoond door belangrijke validatiestappen: een duidelijke verschuiving in grootte-uitsluitingschromatografie (SEC)-profielen die deeltjesvergroting bevestigen, co-migratie van Task2 en MSP op SDS-PAGE, en goed gedefinieerde 2D-klassegemiddelden met zichtbare secundaire structuurkenmerken. Een eerste 3D-reconstructie bevestigt verder de integriteit van het nanodisc-ingebedde eiwit. Door de zuiverheid, homogeniteit en deeltjeskwaliteit van monsters te verbeteren, biedt deze aanpak een robuust platform voor hoogresolutie structurele studies van Task2 en biedt het een methodologisch kader dat toepasbaar is op andere membraaneiwitten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Membraaneiwitten spelen een cruciale rol bij de transductie van cellulaire signalen, het transport van metabolieten, het behouden van de structuur van cellen en immuunresponsen. Ontregeling van membraaneiwitten wordt in verband gebracht met verschillende ziekten, waardoor ze prominente doelwitten zijn voor geneesmiddelontwikkeling1. De komst van cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) heeft structurele studies van grote en dynamische membraaneiwitten mogelijk gemaakt2. Een grote uitdaging bij het verkrijgen van structuren met hoge resolutie ligt in het extraheren van deze eiwitten uit hun natuurlijke lipide-dubbellagen, terwijl hun natuurlijke conformaties en biochemische functies behouden blijven. Bovendien vormen de zeer dynamische conformatie van membraaneiwitten en de complexiteit van antistofscreening extra obstakels voor gerichte geneesmiddelenontdekking 3,4. Traditionele methoden voor membraaneiwitextractie maken vaak gebruik van detergenten om de eigenschappen van de hydrofobe lipide-dubbellaag na te bootsen. Deze aanpak verstoort echter vaak de stabiliteit van membraaneiwitten, wat leidt tot aggregatie of gedeeltelijke ontvouwing5. Daarnaast kunnen detergenten essentiële lipidemoleculen verwijderen die cruciaal zijn voor het stabiliseren van de eiwitconformatie, wat mogelijk de eiwitconformatie kan veranderen of zelfs de functie kan aantasten, waardoor hun toepassing bij antistofscreening en andere latere toepassingen beperktwordt 6.

Nanodisc-technologie werd voor het eerst geïntroduceerd door Sligar en collega's7. Deze zelfassemblerende structuur wordt meestal gevormd door apolipoproteïne A1 (ApoA1)-derivaten, namelijk MSP's, samen met synthetische of natuurlijke lipiden, wat een stabiele omgeving biedt voor membraaneiwitten 7,8,9. De MSP vormt een schijfvormige structuur door de hydrofobe randen van de lipidedubbellaag te omsluiten. Deze structuur heeft een hydrofobe oppervlakte die interageert met de azillipidenstaarten, waardoor het membraaneiwit wordt gestabiliseerd, en een hydrofiel oppervlak dat naar buiten wijst, waardoor het membraaneiwit oplosbaar blijft in waterige oplossingen10. Nanodiscs dienen als een veelzijdig platform voor membraaneiwitstudies. Door gezuiverde membraaneiwitten te behouden in een bijna-natuurlijke lipidenomgeving, overwinnen ze de beperkingen van traditionele detergent-gebaseerde methoden en behouden ze de conformatie en biologische functie van de eiwitten in vitro. Daarom is deze methode een krachtig hulpmiddel geworden voor structurele studies van membraaneiwitten. In vergelijking met traditionele detergentomgevingen biedt de lipide-dubbellaag in nanodiscs structurele ondersteuning voor membraaneiwitten, waardoor hun natuurlijke conformatie wordt gestabiliseerd—een kenmerk dat cruciaal is voor eiwitten die gevoelig zijn voor inactivatie, zoals G-eiwitgekoppelde receptoren en ionenkanalen11. Daarnaast biedt de zeer uniforme aard van nanodiscdeeltjes na assemblage sterkere ondersteuning voor het verkrijgen van hoogwaardige cryo-EM-gegevens en betrouwbare oppervlakteplasmonresonantie/bio-laag interferometrie kinetische data12.

In het afgelopen decennium is nanodisctechnologie een krachtig hulpmiddel geworden voor het bestuderen van membraaneiwitten in natuurlijke lipidenomgevingen. Zo hebben Vilela en collega's13 een systematisch kader voor nanodisc-assemblage opgezet door de reconstitutievoorwaarden te optimaliseren en de kwaliteit van de eindcomponenten te verifiëren. Specifiek combineerden zij grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) met kwantitatieve indicatoren (waaronder assemblage-efficiëntie en pieksymmetrie) om de homogeniteit van de13 monsters objectief te beoordelen. Tegenwoordig zijn nanodiscs een veelzijdig platform geworden. Door gebruik te maken van single-particle cryo-EM om de geassembleerde, nanodisc-gereconstitutieerde eiwitten te detecteren, kunnen hoogresolutiestructuren van membraaneiwitten worden verkregen en is hun toepasbaarheid stevig vastgesteld. De dubbel-ringdichtheidseigenschap van de MSP-band is het beslissende structurele bewijs voor succesvolle binding 10,14,15. Bovendien dienen nanodiscs als een waardevol hulpmiddel voor zowel de functionele analyse van membraaneiwitten in lipide-dubbellaagomgevingen als hun toepassing in oplossingen kernmagnetische resonantiestudies16,17.

Dit protocol beschrijft een methode om het menselijke Task2-membraaneiwit samen te voegen tot nanodiscs. Human Task2 is een pH-gebonden lid van de twee-porien domein K+ (K2P) kanaalfamilie18,19. Net als andereK2P-kanalen is Task2 een domein-geswapt homodimeer, waarbij elke protomeerketen vier transmembrane-overspannende helixen bevat (TM1–TM4), twee reentrante poriënhelices (PH1 en PH2), twee selectiviteitsfilters (SF1 en SF2) en twee extracellulaire kapvormende helixen (CH1 en CH2). Het doeleiwit was een afgeknotte vorm van Task2 zonder de C-terminale 166 aminozuren—een gebied dat naar verwachting grotendeels ongestructureerd was—en waarvan werd aangetoond dat het de eiwitexpressie en biochemische stabiliteit verbeterde. Het molecuulgewicht van gerecombineerde Task2 is ongeveer 72 kDa met een GFP-tag. Het was van tevoren opgelost en gezuiverd met een wasmiddel. Het werd gecombineerd met lipiden en MSP in een nauwkeurig berekende stoichiometrische verhouding. Na detergentverwijdering met Bio-Beads werd het monster verder gezuiverd door grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) om een preparaat te verkrijgen dat geschikt is voor cryo-EM. Tweedimensionale (2D) klassegemiddelden werden vervolgens gegenereerd uit single-particle cryo-EM-data om de integriteit van het monster te valideren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van lipidenvoorraad

  1. Lipidevoorbereiding
    1. Bereid lipidmengsels voor met drie fosfolipiden: 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine (DOPE), 2-oleoyl-1-palmitoylglycero-3-fosfocholine (POPC) en 1-palmitoyl-2-oleoylfosfatidylserine (POPS).
    2. Gebruik voorbereide bouillonoplossingen van deze lipiden in chloroform, elk met een concentratie van 25 mg/mL.
      OPMERKING: Persoonlijke beschermingsmiddelen zijn vereist bij het hanteren van chloroform, en alle procedures moeten worden uitgevoerd in een dampkap. Bewaar chloroform in een speciale chemische kast.
    3. Vanwege de vluchtigheid van chloroform, controleer bij het meten met een microspuit dat het volume van de lipidevoorraadoplossing overeenkomt met het aanvankelijk geregistreerde volume vóór elk gebruik. Als er verdamping optreedt, vul de oplossing dan aan met pure chloroform tot het oorspronkelijke volume en meng grondig.
      OPMERKING: Spoel de microspuit voor elke meting twee keer met chloroform.
    4. Maak een 100 μL lipidenmengsel met een massaverhouding DOPE:popc:pops = 2:1:1. Op basis van deze verhouding combineer je 50 μL VDOPE, 25 μL VPOPC en 25 μL VPOPS. Meet het bijbehorende volume volgens het berekende getal. Voeg het toe aan het glazen reageerbuisje en meng het grondig.
    5. Plaats het glazen reageerbuisje in een waterbad om de verdamping van chloroform te verminderen en de omgevingstemperatuur stabiel te houden.
  2. Lipidefilmvoorbereiding
    1. Laat de chloroform verdampen onder een zachte stroom stikstofgas totdat alle vloeistof is verwijderd en er een transparante, homogene gelachtige film ontstaat op de bodem van het reageerbuisje.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat er een uniforme, droge lipidefilm zichtbaar is aan de onderkant van de glazen buis, zonder resterende vloeistofdruppels. Vermijd overmatige stikstoftoevoer, omdat dit bubbels kan veroorzaken en volledige droging van chloroform kan voorkomen.)
    2. Voeg ongeveer 2 ml n-pentaan druppelgewijs toe aan een glazen reageerbuis. Verdamp vervolgens het oplosmiddel met de stikstofdroogmethode beschreven in 1.2.1 om een droge, transparante lipidefilm te verkrijgen. n-Pentaan wordt verdampt in een glazen reageerbuis vanwege zijn chemische inertie en compatibiliteit met organische oplosmiddelen. Glas voorkomt het risico op uitloging of degradatie van plastic die bij veel plastic laboratoriummaterialen samenhangt, waardoor de lipidenzuiverheid tijdens de filmvorming behouden blijft.
      OPMERKING: n-Pentane moet worden bewaard in een speciale reagentiakast en, wanneer gebruikt, zorgvuldig worden behandeld in een afzuigkap terwijl de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen worden gedragen.
    3. Maak de dop van het reageerbuisje los en plaats het in een vacuüm uitdroger. Ontruim de desiccator en houd het vacuüm om eventuele resterende oplosmiddelen te verwijderen. Plaats zelfaangevende silicagel onderin de desiccator om vocht op te nemen.
      OPMERKING: Verdamp rest-chloroform en n-pentaan tot het droog wordt in een dampkap.
  3. Lipidhydratatie en bereiding van de voorraadoplossing
    1. Verwijder de lipidefilm uit de vacuümdesiccator en hydrateer deze door 250 μL detergentvrije laagzoutbuffer (LSB) toe te voegen (Aanvullende Tabel 1). Dit levert een uiteindelijke lipidenconcentratie van 10 mg/mL op.
      OPMERKING: Een kaliumionen-gebaseerde buffer werd gekozen omdat Task2 een kaliumionkanaal is
    2. Na het opnieuw ophangen van het lipide verdeel je het evenmatig in vier glazen buizen en sonicaer je de suspenties totdat ze helder en transparant zijn, wat wijst op succesvolle liposoomvorming (ongeveer 1,5 uur). Voer sonicatie uit op 60% amplitude met een cyclus van 4 s aan en 6 s uit.
    3. Combineer de geklarifiseerde lipideoplossing en aliquot 1,5 mL in individuele microcentrifugebuizen. Spoel direct de kopruimte van elke buis door met stikstofgas en bewaar het bij -80 °C tot gebruik.

2. Overexpressie en zuivering van MSP

  1. Prokaryote expressie van MSP
    1. Plasmidtransformatie: Gebruik het MSP1D1-plasmide met een 7×His tag om de E. coli BL21 (DE3) competente cellen te transformeren. Plat het transformatiemengsel op Luria-Bertani (LB) agarplaten met kanamycine (50 μg/mL) en incubeer een nacht bij 37 °C om losse kolonies te verkrijgen.
    2. Kweekversterking: Kies een enkele kloon en inoculeer deze in 5 mL LB-medium met kanamycine en breng deze nacht uit bij 37 °C met schudden. Inoculeer de nachtkweek in een vloeibaar LB-medium in een verhouding van 1:100, en laat dan groeien bij 37 °C met schudden totdat de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) 2,0–3,0 bereikt.
    3. Eiwitexpressie-inductie: Induceer MSP-expressie door isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) toe te voegen aan een eindconcentratie van 0,5–1 mM. Blijf de cellen cultiveren op 16 °C gedurende 16–20 uur met schudden.
  2. Celverstoring
    1. Pelletverzameling: Centrifugeer de bacteriecultuur op 4 °C gedurende 10 minuten. Gooi het supernatant weg en houd de celpellet vast.
    2. Bacteriële lysis: Sussie de pellet die is afgeleid van 1 L kweek in 100–150 ml lysisbuffer (Aanvullende Tabel 1). Homogeniseer grondig totdat een uniforme suspensie zonder zichtbare klonten is bereikt. Voeg PMSF toe aan de suspensie om proteasen te remmen en schuimvorming te verminderen.
    3. Sonicatie: Gebruik een gekoelde ultrasone celverstoorder om de bacteriën te breken. Stel het vermogen in op 35% en pas cycli van 3 s pulsen toe, gevolgd door pauzes van 6 s. Om oververhitting te voorkomen, neem een rustinterval van 2 minuten na elke 15 minuten cumulatieve sonicatietijd. Ga door totdat het lysaat helder en lichtbruin van kleur is.
    4. Ter verduidelijking: Centrifugeer het lysaat bij 30.000 g gedurende 45 minuten bij 4 °C en verzamel het supernatant voor de volgende stappen.
  3. MSP-zuivering
    1. Ni-NTA hars voorbereiding: Neem 3–5 mL Ni-NTA hars en pak deze in een zwaartekrachtkolom (grootte: 26,4×134,8 mm). Was de hars met 3 kolomvolumes (CV) gedestilleerd water en evenwicht dit met 3 CV Wash Buffer 1 (Aanvullende Tabel 1).
    2. Binding van MSP aan de hars: Na centrifugatie van het cellysaat wordt het supernatant gemengd met de evenwichtige Ni-NTA-hars. Voeg imidazol toe aan een uiteindelijke concentratie van 5 mM en incubereer het mengsel bij 4 °C gedurende 2 uur met zachte rotatie in het donker.
    3. Wassen om onzuiverheden te verwijderen: Was sequentieel met gradiënten van Wash Buffer 1, Wash Buffer 2 (Aanvullende Tabel 1) en Wash Buffer 3 (Aanvullende Tabel 1), waarbij minstens 50 mL van elke buffer wordt gebruikt. Controleer de UV-absorptie bij 280 nm (A280) van de doorstroming en ga door met wassen totdat de A280-waarde onder 0,01 daalt.
    4. Elutie: Eluteer het doeleiwit met Elution Buffer (Aanvullende Tabel 1) en verzamel de eluaatfracties. Ga door met het eluatieproces, waarbij fracties worden verzameld totdat de A₂₈₀ van het eluaat onder de 0,01 daalt.
    5. Procesmonitoring en -analyse: Verzamel monsters uit belangrijke zuiveringsfasen—waaronder de supernatant, neerslag, doorstroom, wasfracties en elusiefracties. Analyseer ze met SDS-PAGE om de zuiveringsefficiëntie te beoordelen (Aanvullende Figuur 1).
    6. Dialyse voor bufferruil: Breng het gepoolde eluaat over in de dialysebuis en dialyse het tegen Dialysebuffer (Aanvullende Tabel 1) bij 4 °C met zacht roeren gedurende de nacht.
    7. Ultrafiltratie en concentratie: Concentreer de gedialyseerde oplossing met een ultrafiltratieapparaat tot een uiteindelijke MSP-concentratie van 2–5 mg/mL. De gezuiverde en geconcentreerde MSP is nu klaar voor gebruik bij de assemblage van membraaneiwit-nanodiscs.

3. Activatie van Bio-Kralen

  1. Wegen
    1. Weeg ongeveer 250 mg Bio-Beads in een 50 mL centrifugebuis met behulp van een analytische weegschaal.
  2. Methanolwassingen
    1. Voeg 25–30 mL methanol toe aan de buis. Draai het mengsel grondig of laat het in het donker vortexen en breng dan 20 minuten uit. Gooi het supernatant na de incubatie voorzichtig weg.
    2. Herhaal deze stap met het wassen van methanol in totaal drie keer.
      OPMERKING: Vanwege de vluchtigheid van methanol moet deze procedure worden uitgevoerd in een dampkap met passende persoonlijke beschermingsmiddelen. Verzamel gebruikte methanol en behandel het als biologische afvalvloeistof.
  3. Waterige washes
    1. Voeg 25–30 mL ddH2O toe aan de kralen. Schud of draai de tube om te mengen en 20 minuten te incuberen.
    2. Gooi het supernatant weg. Herhaal deze waterige wasstap drie keer.
  4. Evenwicht met LSB
    1. Voeg 25–30 ml wasmiddelvrije LSB toe aan de kralen. Schud of draai de buis op een draaitafel om te mengen en 20 minuten te incuberen.
    2. Gooi het supernatant weg. Herhaal deze LSB-evenwichtsstap drie keer om de kralen volledig te conditioneren.
  5. Aliquotering en opslag
    1. Verdeel de geactiveerde Bio-Beads gelijkmatig in drie microcentrifugebuizen van 1,5 mL. Zorg ervoor dat de kralen vochtig blijven met een kleine hoeveelheid LSB.
    2. Wikkel de buizen in aluminiumfolie om ze tegen licht te beschermen en bewaar ze op ijs voor direct gebruik.

4. Het assembleren van de nanodisc

  1. Bereiding van lipide en MSP
    1. Lipidenvoorraad Clarification: Haal één aliquot van de vooraf voorbereide lipide voorraad en ontdooi deze. Centrifugeer de buis onmiddellijk op 7.000 x g gedurende 5 seconden bij 4 °C om de inhoud op de bodem op te vangen.
    2. Laat een echosone uitvoeren in een waterbad en controleer elke 5–10 minuten de helderheid en temperatuur om oververhitting te voorkomen. Voer sonicatie uit op 60% amplitude. Ultrasonicaer de lipidevoorraad totdat deze helder en transparant is.
    3. MSP Ontdooiing: Ontdooi 1 aliquot van de bereide MSP-oplossing in een ijswaterbad.
  2. Bereid de buffer voor volgens de stoichiometrische verhouding.
    1. Kwantificeer het membraaneiwit: Isoleer het gezuiverde membraaneiwit (Task2), opgelost in 0,025% DDM/0,005% CHS, met grootte-uitsluitingschromatografie (SEC). Injecteer een monstervolume van 500 μL met een debiet van 0,5 mL/min in een Superose 6 Increase-kolom (Cytiva). Verzamel de piek die elueert bij 14,8 mL en concentreer deze (Figuur 1). Bepaal de eiwitconcentratie met een NanoDrop.
    2. Bereken de molaire hoeveelheid eiwit: Bereken de molaire hoeveelheid (n) van het doelmembraaneiwit met de formule: n = C × V, waarbij C de molaire concentratie is en V het volume.
    3. Bepaal de MSP- en lipidenvolumes: Bereken de benodigde volumes MSP- en lipidevoorraadoplossingen op basis van een molaire stoichiometrische verhouding van doeleiwit : MSP : lipide = 1 : 5 : 250.
    4. Bereid de Master Mix voor: Op basis van de berekeningsresultaten combineer je de bijbehorende volumes lipide en MSP om een 300 μL master mix te maken.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat detergent in deze mix wordt opgenomen om een concentratie te behouden die overeenkomt met die in de eiwitoplossing, zodat voortijdige aggregatie wordt voorkomen.
  3. Detergentverwijdering en nanodisc-assemblage
    1. Eerste incubatie met Reconstitutiemix: Broed de voorbereide mengbuffer (Aanvullende Tabel 1) 10 minuten op ijs. Voeg vervolgens langzaam 50 μL van het mengsel toe aan de geconcentreerde eiwitoplossing, waarbij je zachtjes mengt door te pipetteren om homogeniteit te waarborgen.
    2. Evenwicht van het eiwit-lipidenmengsel: Plaats het gecombineerde mengsel 1 uur op ijs. Draai de buis voorzichtig om elke 15 minuten om goed te mengen.
    3. Eerste incubatie met Bio-Beads: Centrifugeer het mengsel kort op 7.000 x g gedurende 5 seconden bij 4 °C om de eiwitoplossing onderin de buis op te vangen. Neem één aliquot van de voorgeactiveerde Bio-Beads, aspireer de resterende LSB, voeg de eiwitoplossing toe aan de kralen en incubeer met rotatie in het donker gedurende 1 uur om lichtgeïnduceerde afbraak van het doeleiwit te voorkomen.
    4. Tweede incubatie met Bio-Beads: Centrifugeer het mengsel op 7.000 x g gedurende 5 seconden bij 4 °C en breng het supernatant zorgvuldig over naar een tweede aliquot Bio-Beads (waarvan de LSB ook is geaspireerd) en meng goed door zachte inversie in het donker gedurende 4–8 uur of 's nachts.
    5. Laatste incubatie met Bio-Beads: Haal de eiwitoplossing na de overnachting op, centrifugeer deze kort en breng de supernatant over naar het derde en laatste deel van de vooraf geactiveerde Bio-Beads. Broeden met rotatie op 4 °C in het donker gedurende 1 uur.
    6. Na een korte centrifugatie wordt het supernatant overgebracht naar een schone microcentrifugebuis en 10 minuten centrifugeerd op 17.000 x g bij 4 °C om eventuele aggregaten te verwijderen.
      OPMERKING: Gooi gebruikte Bio-Beads weg als biologisch afval.
    7. Zuivering van nanodiscs: Zuiver de nanodisc-Task2-complexen met grootte-uitsluitingschromatografie (SEC): Injecteer een monstervolume van 500 μL met een debiet van 0,5 mL/min op een kolom Superose 6 Increase en verzamel de piek-eluering bij 15 mL (Figuur 2).
    8. Concentratie van het eindproduct: Bundel de piekfracties van de SEC-elusie en concentreer ze tot een eindconcentratie van 1,2–1,5 mg/mL, geschikt voor cryo-EM monstervoorbereiding.

5. Controleer of de nanodisc-assemblage succesvol is

  1. SDS-PAGE analyse: Aliquot monsters van de door SEC gezuiverde fracties.
    1. Analyseer de monsters met 12% SDS-PAGE om de aanwezigheid van belangrijke componenten (bijv. MSP en doelmembraaneiwit) te bevestigen, wat wijst op succesvolle nanodiscassemblage (Figuur 3).
  2. Cryo-EM monstervoorbereiding en analyse.
    1. Concentreer het succesvol samengestelde monster tot een uiteindelijke concentratie van 1,2–1,5 mg/mL voor cryo-EM monstervoorbereiding.
    2. Begin met het centrifugeren van het monster op 17.000 x g en 4 °C gedurende 10 minuten. Deponeer een druppel van 3 μL op vers gloeiende Quantifoil R1.2/1.3 gouden roosters (300 mesh, holrijke koolstof).
    3. Incubeer bij 4 °C bij 100% luchtvochtigheid gedurende 5 seconden. Debert het rooster 4 seconden in een Vitrobot Mark IV en dompel het in vloeibare ethaan dat op vloeibare stikstoftemperatuur wordt gehouden.
    4. Verzamel superresolutie filmstacks met EPU-software op een Titan Krios G4 cryo-EM die werkt op 300 kV en is uitgerust met een Falcon G4i directe elektronendetector.
    5. Stel de belichtingstijd in op 2,78 s, wat overeenkomt met een pixelgrootte van 0,73 Å (165k ×) en een totale cumulatieve dosis van ongeveer 50 e⁻/Å2 per EER-filmstack.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Succesvolle voorbereiding van de lipidevoorraad werd aangetoond door de vorming van een heldere, transparante oplossing na de sonicatie. Voor de MSP leverde nikkelaffiniteitschromatografie een hoogzuiver product op van ongeveer 3 mg/mL. De assemblage van nanodiscs werd bevestigd door SEC, dat een karakteristiek elutieprofiel liet zien (Figuur 2). In vergelijking met het Task2 SEC-profiel dat vóór de nanodiscassemblage werd verkregen (Figuur 1), verschuift de...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De methode wordt gepresenteerd voor het reconstitueren van detergent-oplosbare membraaneiwitten tot nanodiscs via detergentverwijdering, waardoor een meer native lipide-dubbellaagomgeving ontstaat. Het succes van dit assemblageproces hangt af van verschillende belangrijke factoren. De belangrijkste hiervan is de precieze stoichiometrische verhouding tussen het membraaneiwit, MSP en lipiden. Onjuiste stoichiometrische verhoudingen kunnen leiden tot eiwitaggregatie of mislukte assemblage. ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten om te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken het personeel van het cryo-EM Centrum van de Universiteit van Henan, evenals professor Wei Wang, voor hun deskundige ondersteuning. De financiering werd verstrekt door de National Natural Science Foundation of China (subsidies 32371261 aan B.L. en 32301011 aan R.Z.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bio-beadsBio-rad1523920
Cholesteryl hemisuccinateAnatraceCH210
ChloroformSinoreagentGebruik in een afzuigpunt
DOPEAvanti850725P
MethanolSinoreagent
n-Dodecyl-beta-D-maltosideAnatraceD310
n-pentaneAdamasGebruik in een afzuigpunt
POPCAvanti850457P
POPSAvanti840034P
SECBio-radVolg het protocol van de fabrikant voor correct gebruik
SnakeSkin Dialysis TubingThermo68011
Superose 6 Increase10/300 GLCytiva29091596
Ultrafiltration Spin Columns Amicon Ultra-15MilliporeUFC905008

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rask-Andersen, M., Almén, M. S., Schiöth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nat. Rev. Drug Discov. 10 (8), 579-590 (2011).
  2. Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
  3. Dodd, R., Schofield, D. J., Wilkinson, T., Britton, Z. T. Generating therapeutic monoclonal antibodies to complex multi-spanning membrane targets: overcoming the antigen challenge and enabling discovery strategies. Methods. 180, 111-126 (2020).
  4. Hutchings, C. J., Colussi, P., Clark, T. G. Ion channels as therapeutic antibody targets. MAbs. 11 (2), 265-296 (2019).
  5. Kotov, V., et al. High-throughput stability screening for detergent-solubilized membrane proteins. Sci. Rep. 9 (1), 10379(2019).
  6. Barrera, N. P., Zhou, M., Robinson, C. V. The role of lipids in defining membrane protein interactions: insights from mass spectrometry. Trends Cell Biol. 23 (1), 1-8 (2013).
  7. Bayburt, T., Grinkova, Y., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Lett. 2 (8), 853-856 (2002).
  8. Carlson, J. W., Jonas, A., Sligar, S. G. Imaging and manipulation of high-density lipoproteins. Biophys. J. 73 (3), 1184-1189 (1997).
  9. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Self-assembly of single integral membrane proteins into soluble nanoscale phospholipid bilayers. Protein Sci. 12 (11), 2476-2481 (2003).
  10. Vinogradova, O. Nanodiscs and solution nuclear magnetic resonance. Curr. Opin. Struct. Biol. 93, 103067(2025).
  11. Popot, J. L. Amphipols, nanodiscs, and fluorinated surfactants: three nonconventional approaches to studying membrane proteins in aqueous solutions. Annu. Rev. Biochem. 79, 737-775 (2010).
  12. Li, S. Detergents and alternatives in cryo-EM studies of membrane proteins. Acta Biochim. Biophys. Sin. 54 (8), 1049-1056 (2022).
  13. Vilela, F., Sauvanet, C., Bezault, A., Volkmann, N., Hanein, D. Optimizing transmembrane protein assemblies in nanodiscs for structural studies: a comprehensive manual. Bio Protoc. 14 (21), e5099(2024).
  14. Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. Lipid nanodiscs as a tool for high-resolution structure determination of membrane proteins by single-particle cryo-EM. Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).
  15. Grant, A. J., Schmidt-Krey, I. Nanodisc-reconstitution for single particle cryo-EM structure determination of membrane proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 93, 103072(2025).
  16. Yokogawa, M., Fukuda, M., Osawa, M. Nanodiscs for structural biology in a membranous environment. Chem. Pharm. Bull. 67 (4), 321-326 (2019).
  17. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nat. Struct. Mol. Biol. 23 (6), 481-486 (2016).
  18. Enyedi, P., Czirják, G. Molecular background of leak K+ currents: two-pore domain potassium channels. Physiol. Rev. 90 (2), 559-605 (2010).
  19. Reyes, R., et al. Cloning and expression of a novel pH-sensitive two pore domain K+ channel from human kidney. J. Biol. Chem. 273 (47), 30863-30869 (1998).
  20. Notti, R. Q., Walz, T. Native-like environments afford novel mechanistic insights into membrane proteins. Trends Biochem. Sci. 47 (7), 561-569 (2022).
  21. Pocanschi, C. L., Kleinschmidt, J. H. The thermodynamic stability of membrane proteins in micelles and lipid bilayers investigated with the ferrichrom receptor FhuA. J. Membr. Biol. 255 (4-5), 485-502 (2022).
  22. Hiotis, G., Notti, R. Q., Bao, H., Walz, T. Nanodiscs remain indispensable for cryo-EM studies of membrane proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 92, 103042(2025).
  23. Nakao, K., et al. Home is where the lipids are: a comparison of MSP and DDDG nanodiscs for membrane protein research. Soft Matter. 21 (33), 6596-6602 (2025).
  24. Dalal, V., et al. Lipid nanodisc scaffold and size alter the structure of a pentameric ligand-gated ion channel. Nat. Commun. 15 (1), 25(2024).
  25. Knowles, T. J., et al. Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer. J. Am. Chem. Soc. 131 (22), 7484-7485 (2009).
  26. Tao, X., Zhao, C., MacKinnon, R. Membrane protein isolation and structure determination in cell-derived membrane vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 120 (18), e2302325120(2023).
  27. Zhang, S., et al. One-step construction of circularized nanodiscs using SpyCatcher-SpyTag. Nat. Commun. 12 (1), 5451(2021).
  28. Ren, Q., et al. DeFrND: detergent-free reconstitution into native nanodiscs with designer membrane scaffold peptides. Nat. Commun. 16 (1), 7973(2025).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Nanodisc technologiemembraansteunprote nenlipide dubbellaagTask2 kaliumkanaalprote nereconstitutiegrootte uitsluitingschromatografieSDS PAGEcryo elektronenmicroscopieprote nezuivering

Gerelateerde artikelen