Fructus xanthii Extract verlicht artrose door de integriteit van kraakbeen te behouden

Samenvatting

Dit studieprotocol is ontworpen om systematisch de potentiële chondroprotectieve effecten van Fructus Xanthii-extract bij artrose te onderzoeken via geïntegreerde multi-omics-analyses en in vivo-experimenten .

Samenvatting

Artrose (OA) is een progressieve degeneratieve gewrichtsaandoening waarbij huidige farmacologische en chirurgische ingrepen vooral symptomen verlichten in plaats van de onderliggende pathologische veranderingen omkeren, wat de dringende behoefte aan nieuwe therapeutische middelen benadrukt. Dit protocol was bedoeld om de potentiële chondroprotectieve effecten van Fructus Xanthii-extract tegen OA te onderzoeken. Ten eerste werd niet-gerichte metabolomics-profilering uitgevoerd met ultra-high-performance vloeistofchromatografie in combinatie met hoogresolutie tandemmassaspectrometrie (UHPLC-HRMS/MS) om de chemische bestanddelen van het extract te karakteriseren. Een geïntegreerde strategie die netwerkfarmacologie en transcriptomic mining combineert, werd vervolgens toegepast om bioactieve componenten en veronderstelde doelen van het extract te identificeren, gevolgd door kruisanalyse met OA-gerelateerde ontregelde genen om kerngenen te verkrijgen. Gene Ontology (GO) en Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) verrijkingsanalyses werden uitgevoerd om de belangrijkste biologische processen en signaalroutes die door het extract worden gemoduleerd, te annoteren. Voor in vivo validatie werden zebraviskraakbeenbeschadigingsmodellen en muis-OA-modellen gebruikt om de chondroprotectieve effecten van het extract te evalueren. RNA-sequencing (RNA-seq) werd verder toegepast om transcriptomische veranderingen in chondrocyten na behandeling te analyseren, met de nadruk op OA-geassocieerde routes en genexpressieprofielen; Vervolgens werd een enzym-gekoppelde immunosorbentassay (ELISA) uitgevoerd om de expressieniveaus van belangrijke eiwitten/receptoren die door RNA-seq werden gescreend te verifiëren, om zo de regulerende effecten van Fructus Xanthii-extract op kern-OA-doelwitten verder te bevestigen. Dit geïntegreerde multi-omics en experimentele protocol biedt een systematische benadering om het potentieel van Fructus Xanthii-extract als veelbelovende botanische kandidaat voor OA-interventie te verkennen.

Inleiding

Artrose (OA) is een degeneratieve gewrichtsaandoening die wordt gekenmerkt door de progressieve afbraak van gewrichtskraakbeen, subchondrale botsclerose, synoviale ontsteking en osteofytenvorming¹. Volgens de Global Burden of Disease (GBD) studie is de prevalentie van OA gestaag toegenomen in 204 landen en gebieden van 1990 tot 2020, waarbij deze trend naar verwachting zal versnellen naast de wereldwijde demografische veroudering^{van 3}. Huidige schattingen geven aan dat wereldwijd meer dan 250 miljoen mensen getroffen zijn, wat een aanzienlijke druk legt op het welzijn, de gezondheidszorgsystemen en de sociaaleconomische structuren⁴. De huidige behandelingen zijn voornamelijk gericht op verlichting van symptomen, waarbij niet-steroïde ontstekingsremmers (NSAID's) en intraarticulaire viscosupplementatie met hyaluronzuur (HA) de meest voorkomende interventies zijn. Deze benaderingen bieden echter beperkte klinische voordelen en zijn geassocieerd met aanzienlijke bijwerkingen ^5,6. Dit benadrukt de cruciale noodzaak van effectieve ziekte-modificerende artrosegeneesmiddelen (DMOAD's).

Traditionele Chinese Geneeskunde (TCM) wordt al lange tijd gebruikt bij de behandeling van OA, gebaseerd op het concept van "bone bi", een subtype van het "bi-syndroom^". In dit kader wordt de pathogenese van OA voornamelijk toegeschreven aan een tekort aan lever- en nieressence, een tekort aan qi en bloed, en de daaropvolgende invasie door wind, kou en vocht⁸. Daarom richten therapeutische strategieën zich op het verhelpen van windvocht, het verspreiden van kou en het ontstoppen van de neven^. TCM-behandelingen staan bekend om hun multi-doeleffecten effecten, gunstige bijwerkingprofielen en klinisch significante effectiviteit¹⁰. Opmerkelijke formuleringen zoals Buqi Tongluo Capsule (BQTL) en Fuzi Decoction (FZD) hebben duidelijke anti-OA-effecten laten zien in de klinische praktijk, terwijl Du Huo Ji Sheng Tang (DHJST) OA-symptomen verlicht door het NLRP3-inflammasoompad te onderdrukken, ondersteund door eeuwenlang empirisch gebruik. Evenzo vermindert Shenjinhuoxue Mixture (SHM) pijn en kraakbeendegeneratie door afregulering van pro-inflammatoire mediatoren zoals IL-1β en TNF-α 11,12,13. Op monomeerniveau zijn verbindingen zoals icariïne (Cyanoside A, CyA) en erianine, afkomstig van medicinale planten, gerapporteerd als bevorderaar van chondrocytproliferatie, remmen ze de afgifte van inflammatoire cytokinen en behouden ze de gewrichtshomeostase^14,15. TCM biedt samen een allesomvattende therapeutische aanpak met ontstekingsremmende, chondroprotectieve en symptoomverlichtende eigenschappen. De complexiteit van de mechanismen en kwesties rond standaardisatie vereisen echter doorlopend, rigoureus onderzoek.

De gedroogde rijpe vruchten van Fructus Xanthii (Compositae), algemeen bekend als "Cang-Er-Zi", vertonen een breed scala aan farmacologische activiteiten, waaronder antimicrobiële, ontstekingsremmende, antioxidante, pijnstillende, antineoplastische en immunomodulerende effecten¹⁶. Fenolzuren geïsoleerd uit Fructus Xanthii verminderen effectief synoviale hyperplasie bij reumatoïde artritis (RA)¹⁷. Onder deze is chlorogenzuur (CGA), een representatief afgeleid caffeoylquininezuur, gevonden dat het de proliferatie en differentiatie van osteoblasten stimuleert terwijl het de door RANKL gemedieerde osteoclastogenese remt, waardoor skelethomeostase¹⁸ behouden blijft. Andere fenolzuur die in hetzelfde extract zijn geïdentificeerd, zoals neochlorogeen zuur (5-CQA), cryptochlorogeen zuur (CCA) en protocatechuïnezuur, vertonen ook antimicrobiële, ontstekingsremmende, antitumor- en antioxidante eigenschappen 19,20,21. Naast fenolzuur dragen verschillende secundaire metabolieten in Cang-Er-Zi bij aan deze bioactiviteiten^{: 16,20,22,23,24,25}. De precieze rol en onderliggende mechanismen van Fructus Xanthii-extract in OA zijn echter grotendeels ononderzocht.

Non-Targeted Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) Metabolomics wordt gekenmerkt door hypothesevrije, hoge doorvoer en wereldwijde dekkingsmogelijkheden. Het maakt gelijktijdige detectie van duizenden metabolietkenmerken mogelijk, biedt een panoramisch beeld van metabole netwerken en maakt systematische ontdekking van nieuwe biomarkers en abnormale metabole routes mogelijk zonder voorafgaande doelprespecificatie^26,27. In combinatie met hoogresolutie massaspectrometrietechnologie is deze aanpak geschikt voor de uitgebreide analyse van verschillende soorten biologische monsters (bijv. serum, synoviale vloeistof, urine, kraakbeenweefsel, enz.) en heeft het aanzienlijke voordelen aangetoond in artrose (OA)-onderzoek. Enerzijds kan het uitgebreid screenen naar differentiële metabolieten die nauw samenhangen met de pathologische progressie van OA (zoals verschillende klassen metabolieten die in synoviale vloeistof en synoviaal weefsel worden geïdentificeerd) en deze in kaart brengen naar belangrijke routes, waaronder energiemetabolisme, kraakbeenherstel, osteogenese en lipidmetabolisme, waardoor het begrip van OA-pathogenese wordt verdiept. Aan de andere kant helpt het integreren van multi-omics-gegevens zoals transcriptomics en proteomics om de rol van metabole herprogrammering bij kraakbeendegeneratie, ontstekingsreacties en schade aan de gewrichtsstructuur te onthullen, wat cruciaal bewijs levert voor het identificeren van vroege diagnostische biomarkers, het evalueren van ziekteprogressie en het ontwikkelen van gerichte metabole interventiestrategieën (bijv. het reguleren van galzuur, tryptofaan of vetzuurmetabolisme), waarbij het translationele potentieel in onderzoek naar OA-precisie-typing en gepersonaliseerde behandeling.

Zebravis dient als een uitstekend modelorganisme dankzij meerdere voordelen: zijn genoom is sterk geconserveerd met dat van mensen en deelt homologie met ongeveer 70% van de menselijke eiwitcoderende genen^28,29. Het vertoont belangrijke kenmerken zoals snelle ontwikkeling, in-vitrofertilisatie, transparante embryo's die gemakkelijke in vivo beeldvorming mogelijk maken, hoge vruchtbaarheid en lage onderhoudskosten 30,31,32,33^. In skeletonderzoek maken zebravissen een duidelijke visualisatie van botvorming, mineralisatieprocessen en regeneratievermogen mogelijk, en kunnen ze worden gebruikt om pathologische aandoeningen zoals osteoporose en kraakbeenschade te simuleren. In de studie van artrose (OA), een complexe aandoening van het hele gewricht die wordt gekenmerkt door degeneratie van het gewrichtskraakbeen, synoviale ontsteking en subchondrale botveranderingen, blijft de toepassing van het zebravismodel echter relatief beperkt.

Dit artikel presenteert een protocol dat UHPLC-HRMS/MS-gebaseerde niet-gerichte metabolomics, netwerkfarmacologie, transcriptomic mining en in vivo experimentele validatie integreert om het potentieel van Xanthium sibiricum-extract als een levensvatbare plantkandidat voor OA-interventie te verkennen. Het doel is niet alleen om de bioactieve componenten, potentiële doelwitten en kernregulerende routes van Xanthium sibiricum-extract gerelateerd aan OA te identificeren via multi-omics-integratie en computationele analyse, maar ook om het chondroprotectieve effect op OA te verifiëren via in vivo-modellen en het regulerende mechanisme op het chondrocyttranscriptoom verder te verduidelijken.

Protocol

Alle experimenten met klinische monsters en muizen werden uitgevoerd volgens het protocol dat is goedgekeurd door de Ethische Beoordelingscommissie van het Provinciaal Medisch Biotechnologisch Onderzoekscentrum van Shandong. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Isolatie en kweek van menselijke gewrichtschondrocyten

Menselijke articulaire kraakbeenmonsters zijn verkregen van patiënten die een arthroscopische operatie of totale gewrichtsartroplastiek ondergaan in het First Affiliated Hospital van de Shandong First Medical University. Kraakbeenplakjes werden binnen 30 minuten na chirurgische excisie op ijs naar het laboratorium vervoerd. Het weefsel werd grondig gewassen met ijskoude Dulbecco's fosfaatgebakken zoutoplossing (DPBS; 3–5 wasbeurten), waarna het met een steriele chirurgische schaar fijn werd gehakt tot ongeveer 1 mm³ fragmenten. Sequentiële enzymatische vertering werd uitgevoerd, beginnend met voorverteering met 0,25% trypsine-EDTA gedurende 30 minuten bij 37 °C. Het verteringsproces werd gemonitord totdat de kraakbeenfragmenten verdund, kleiner en doorschijnend werden, waarna de kraakbeenfragmenten werden verzameld door centrifugatie (200 × g, 5 min) bij kamertemperatuur. Hierop volgde een nachtelijke spijsvertering (8 uur, 37 °C) met 0,2% type II collagenase onder continue zachte agitatie. Het verteringsproces werd gecontroleerd totdat alle macroscopisch zichtbare kraakbeenfragmenten volledig waren opgelost. De vrijgekomen cellen werden verzameld door centrifugatie (200 × g, 5 min) bij kamertemperatuur, opnieuw opgehangen in een complete DMEM, aangevuld met 10% foetaal rundserum, 100 U/mL penicilline en 100 μg/mL streptomycine, en gezaaid in 75 cm² kweekkolven. Cellen werden op 37 °C gehouden in een bevochtigde atmosfeer met 5%_CO2. Adherente chondrocyten werden losgemaakt met 0,25% trypsine-EDTA, en de cellen werden subgekweekt in een verhouding van 1:3 wanneer de adherente cellen 80% samenvloeiing van het kweekflesoppervlak bereikten.

2. Bereiding van Fructus Xanthii-extract

Gedroogde rijpe vruchten van Xanthium strumarium L. (Fructus Xanthii) werden verzameld uit natuurlijk voorkomende populaties in Noord-China en geverifieerd door een senior farmakognos. Het exemplaar werd gedeponeerd in het herbarium van de Eerste Medische Universiteit van Shandong. 20 g fijn gemalen Fructus Xanthii werd in een extractie-vingerhoed gedaan, en een uitputtende Soxhlet-extractie werd uitgevoerd met 95% ethanol (ongeveer 250 mL) totdat zeven tot acht sifoncycli waren voltooid. Het ethanolische extract werd gefilterd en het filtraat werd geconcentreerd tot droogte onder verminderde druk van 45 °C met behulp van een roterende verdamper. Het resulterende residu werd opnieuw opgehangen in 60 ml dubbel gedestilleerd water en achtereenvolgens verdeeld met 60 ml ethylacetaat in een scheidingstrechter. Het mengsel werd krachtig geschud en liet fase-scheiding ondergaan bij 4 °C gedurende 24 uur. De waterige laag werd vervolgens verzameld, gelyofilieerd en opgeslagen bij −80 °C tot verder gebruik.

3. Gestandaardiseerde workflow voor niet-gerichte LC-MS/MS metabolomics

1. UHPLC-HRMS/MS-gebaseerde niet-gerichte metabolomics-analyse
   Niet-gerichte metabolomische profilering werd uitgevoerd op een ultra-high-performance vloeistofchromatografie-hoogresolutie tandem massaspectrometrie (UHPLC-HRMS/MS) platform. Metabolieten werden snel gekoeld en geëxtraheerd met een gekoeld methanol–watersysteem. Chromatografische scheiding werd bereikt op een UHPLC-systeem uitgerust met een C18/T3 chromatografische kolom (100 × 2,1 mm, 1,8 μm) die op 40 °C werd gehouden. Een binaire gradiënt (0–28 min) bestaande uit 0,1% mierenzuur in water (A) en 0,1% mierenzuur in acetonitril (B) werd toegepast met een debiet van 0,3 mL/min. Massaspectrometrische detectie werd uitgevoerd op een hybride quadrupool-Orbitrap-instrument dat werd bediend in polariteitsschakelende volledige MS/data-afhankelijke MS2 (Full MS/dd-MS2) modus, met een volledig scanbereik van m/z 70–1.050 en een resolutie van 120.000 (FWHM bij m/z 200). Fragmentatie van botsingsdissociatie (HCD) met hogere energie werd uitgevoerd bij 20, 40 en 60 eV, met dynamische uitsluiting ingesteld op 10 s.
2. Ruwe gegevens werden omgezet naar mzXML-formaat met behulp van ProteoWizard. Peak picking, retentietijd-uitlijning en de-isotoping werden uitgevoerd op XCMS Online met HRMS-geoptimaliseerde parameters (ppm = 5, bw = 5, snthresh = 6). Kenmerken met meer dan 50% ontbrekende waarden over de monsters werden uitgesloten, en de resterende piekgebieden werden genormaliseerd naar de totale ionenstroom (TIC). Metabolieten werden geannoteerd door nauwkeurige massa, MS2-spectra en retentietijd te vergelijken met een interne referentiebibliotheek, met een massafouttolerantie van ≤ 5 ppm en een dot-product score drempel van ≥80.
   OPMERKING: Strikte standaardprocedures werden gedurende de hele workflow gevolgd. Monsters werden direct na het verzamelen ingevroren in vloeibare stikstof (−80 °C), getransporteerd met een droogijsketen en verwerkt met willekeurige extractie-, injectie- en batchprocedures. Na elke 10 studiemonsters werden gepoolde kwaliteitscontrolemonsters (QC) ingevoegd om instrumentele drift te monitoren.

4. Netwerkfarmacologieanalyse

1. Netwerkfarmacologie-gebaseerde screening van actieve verbindingen en doelvoorspelling
   De actieve ingrediënten van Fructus Xanthii werden opgehaald uit de TCMID-database (https://www.tcmsp-e.com/tcmspsearch.php) en de HERB-database (http://herb.ac.cn/). De teruggewonnen verbindingen werden gefilterd volgens de aanbevolen ADME-drempels van orale biobeschikbaarheid ≥30% en geneesmiddelgelijkheid ≥0,18. Voorspelde menselijke doelen van de gekwalificeerde verbindingen werden verkregen uit de twee databases. De screeningsresultaten werden verzameld en samengevoegd, wat resulteerde in de identificatie van 15 actieve verbindingen en 151 unieke eiwitdoelen geassocieerd met Fructus Xanthii.
2. Integratie van transcriptomische gegevens en identificatie van OA-geassocieerde kerndoelen
   Differentieel tot expressie gebrachte genen (DEGs) in kraakbeen tussen normale en artrose (OA) monsters werden geëxtraheerd uit de GEO-databasedatasets GSE51588 (n = 5 normaal, 6 OA) en GSE169077 (n = 10 normaal, 40 OA) met behulp van de GEO2R-webtool (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r). OA-upregulated genen werden gedefinieerd met behulp van de criteria log2-voudige verandering >0,5 en aangepaste p-waarde <0,05. De kruising tussen OA-upreguliere genen en de 151 Fructus Xanthii-gerelateerde eiwitdoelen werd gevisualiseerd met het R-pakket ggvenn. Eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerken van de snijdoelen werden geconstrueerd met behulp van de STRING-database (https://string-db.org/). De PPI-netwerkgegevens werden geïmporteerd in Cytoscape, en de top 10 hubgenen werden gescreend voor latere functionele verrijkingsanalyse met behulp van de CytoHubba-plug-in met het MCC-algoritme.

5. Bepaling van de maximaal tolerante concentratie (MTC) bij zebravissen

Transgene zebravislarven (Tg col2a1a:EGFP) werden 2 dagen na bevruchting (2 dpf) willekeurig verdeeld over 6-wellplaten met een dichtheid van 30 larven per put. Elke put werd aangevuld met 3 mL blootstellingsmedium met seriële verdund Fructus Xanthii-extract . Stervende of overleden larven werden dagelijks verwijderd. De larven werden continu blootgesteld bij 28 °C gedurende 72 uur, waarna de maximaal tolereerde concentratie (MTC) werd bepaald als de hoogste concentratie waarbij de larvale sterfte niet boven de 10% uitkwam.

6. Vaststelling van het zebravisbotletselmodel

Tg col2a1a: EGFP zebravislarven werden 2 dagen na bevruchting (2 dpf) ingedeeld in vier groepen: controle, model, chondroïtinesulfaat (CS) positieve controle en Fructus Xanthii-extractbehandeling . Alle groepen behalve de controlegroep werden 24 uur blootgesteld aan Staphylococcus aureus (OD600 = 0,8, 1 × 10⁸ CFU/mL) om botschade te induceren. Het succesvolle modelopzetten werd bevestigd door een vermindering van minstens 50% in kraakbeenspecifieke groene fluorescentieintensiteit in het craniofaciale gebied ten opzichte van de controlegroep onder een epifluorescentiemicroscoop te verifiëren.

7. Kwantitatieve beoordeling van kraakbeenspecifieke fluorescentie bij zebravislarven

De larven werden continu blootgesteld aan gegradueerde concentraties van Fructus Xanthii-extract of 1.000 μg/mL natriumchondroïtine sulfaat A (positieve controle) bij 28 °C gedurende 72 uur. Vervolgens werden 10 larven willekeurig geselecteerd uit elke 6-put replicatie (n = 30 per groep). De geselecteerde larven werden verdoofd met 0,016% tricaïne en lateraal geplaatst op 1% laagsmeltende agarosekussens. Fluorescentiebeelden werden gemaakt met 2× vergroting (excitatie 488 nm, emissie 525/50 nm) met een stereomicroscoop uitgerust met een fluorescentiecamera. Kraakbeenspecifieke EGFP-intensiteit in het craniofaciale gebied, inclusief het ceratohyale en Meckel-kraakbeen, werd gekwantificeerd met behulp van beeldanalysesoftware. Achtergrondcorrectie werd uitgevoerd op de geïntegreerde dichtheidswaarden, en de gecorrigeerde waarden werden genormaliseerd naar de controlegroep voor statistische analyse van chondroprotectieve effectiviteit.

8. Inductie van OA bij C57BL/6J-muizen

Mannelijke C57BL/6J muizen (6–8 weken oud, 20–22 g) werden gehuisvest onder specifieke pathogenevrije (SPF) omstandigheden bij 22 °C ± 2 °C met een licht/donker cyclus van 12 uur. De muizen mochten een week acclimatiseren en werden vervolgens willekeurig ingedeeld in drie groepen (n = 8 per groep) met behulp van een willekeurige getalletabel: (1) schijngecontroleerde controle, (2) ACLT-geïnduceerde OA (ACLT), en (3) ACLT plus Fructus Xanthii-extractinterventie (ACLT + Fructus Xanthii-extract ). Alle chirurgische ingrepen werden uitgevoerd onder steriele omstandigheden volgens een eerder gevalideerd protocol.

De muizen werden verdoofd met intraperitoneale natriumpentobarbital (50 mg/kg) (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen), en er werd een mediale parapatellaire incisie gemaakt om de rechter kniegewrichtscapsule bloot te leggen. Het voorste kruisband werd onder een operatiemicroscoop doorgesneden om gewrichtsinstabiliteit te induceren, waarna de gewrichtscapsule en huid in lagen werden gesloten met behulp van 6-0 absorberbare hechtingen. Sham-opererende muizen ondergingen identieke arthrotomieprocedures zonder ligamentdoorsnijding. De gewrichtsstabiliteit werd geëvalueerd en het succesvolle modelopzetten werd bevestigd door het uitvoeren van de drawer test of door het beoordelen van de mate van gewrichtsletsel in histologische secties van de muis uit de modelgroep.

Postoperatieve analgesie met buprenorfine (0,1 mg/kg, subcutane injectie) werd drie opeenvolgende dagen toegediend. De behandelmiddelen werden eenmaal per dag toegediend via gavage. De ACLT + Fructus Xanthii-extractgroep kreeg 100 μL van 1.000 μg/mL Fructus Xanthii-extract verdund in normale zoutoplossing, terwijl de andere twee groepen 100 μL normale zoutoplossing als voertuigcontrole ontvingen. Acht weken na de operatie werden de muizen geëuthanaseerd door CO-2-verstikking gevolgd door een cervicale ontwrichting, en werden de kniegewrichten geoogst voor histologische analyses.

9. Histopathologische kleuring

1. Histologische voorbereiding en kleuring van het kniegewrichtsweefsel
   De geopereerde kniegewrichten werden in week 8 na de operatieve operatie en in een blok verwijderd en 4% paraformaldehyde (PFA) vastgezet bij 4 °C gedurende 48 uur. De vaste gewrichten werden 14 dagen gedecalcificeerd in 10% ethyleendiamintetraazijnzuur (EDTA; pH 7,4), gedehydrateerd via een gegradueerde ethanolreeks en ingesloten in paraffine. Seriële sagittale doorsneden (5 μm) werden gemaakt van de ingebedde gewrichten, en de volgende histologische kleuringsprocedures werden uitgevoerd.
   1. Hematoxyline en eosine (H&E) kleuring
      Hematoxyline- en eosinekleuring (H&E) werd uitgevoerd om de algemene weefselarchitectuur, kraakbeenintegriteit en synoviale hyperplasie te beoordelen.
   2. Safranin-O/Fast Green kleuring
      Safranin-O/Fast Green-kleuring werd uitgevoerd om proteoglycanen in het kraakbeen te detecteren. De gekleurde secties werden onderzocht met een lichtmicroscoop uitgerust met een digitale camera, en beelden werden gemaakt met vergrotingen van 10× en 20×.
2. OARSI-gebaseerde semi-kwantitatieve scoring van kraakbeendegeneratie
   Voor semi-kwantitatieve beoordeling van kraakbeendegeneratie werden de gekleurde secties retrospectief opnieuw geëvalueerd en gescoord volgens het Osteoarthritis Research Society International osteoarthritis kraakbeen-histopathologiesysteem, dat de ernst van kraakbeenschade beoordeelt op basis van graad (0–6; omvang van kraakbeenverlies) en stadium (0–4; ruimtelijke verdeling van schade) van degeneratie van gewrichtskraakbeen.
   Voor alle evaluaties werd een post-hoc blindingstrategie toegepast. Alle secties werden gedeïdentificeerd door de oorspronkelijke groepslabels te verwijderen en opnieuw gecodeerd met anonieme serienummers. Twee ervaren pathologen beoordeelden onafhankelijk de secties zonder kennis van groepsverdeling. Er werd kruisvalidatie uitgevoerd tussen de twee sets scoreresultaten. Wanneer het scoreverschil ≥1 was, werden de verschillende secties gezamenlijk door de twee pathologen opnieuw geëvalueerd om een consensusscore vast te stellen. De uiteindelijke consensusscores werden gebruikt voor latere statistische analyse om de objectiviteit, robuustheid en reproduceerbaarheid van de histopathologische resultaten te waarborgen.

10. RNA-sequencing (RNA-seq)

Primaire menselijke articulaire chondrocyten (passages 2–3) werden gezaaid in 6-wellplaten met een dichtheid van 5 × 10⁵ cellen per put. De cellen werden 24 uur lang serum-uitgehongerd en vervolgens verdeeld in twee groepen (n = 3 per groep): (1) Controlegroep: cellen werden behandeld met alleen het voertuig (0,1% DMSO); (2) Fructus Xanthii-extractgroep : cellen werden behandeld met 1.000 μg/mL Fructus Xanthii-extract opgelost in DMSO.
De cellen werden 24 uur behandeld, waarna het totale RNA werd geëxtraheerd met behulp van TRIzolreagens volgens het protocol van de fabrikant. RNA-integriteit (RIN ≥7,0) en concentratie werden beoordeeld met een RNA-analyzer. Streng-specifieke cDNA-bibliotheken werden voorbereid met een RNA-sequencing library voorbereidingskit en gesequenced op een high-throughput next-generation sequencing (NGS) platform in paired-end 150 bp (PE150) modus. Kwaliteitscontrole van de ruwe FASTQ-bestanden werd uitgevoerd met FastQC, gevolgd door adapter- en kwaliteitstrimning met Trimmomatic voorafgaand aan de downstream-analyse.

11. RNA-seq gegevensverwerking

Differentieel tot expressie gebrachte genen worden verlaagd door Fructus Xanthii-extract (in tegenstelling tot controlegroep; p < 0,05 en logFC < −0,5) werden geëxtraheerd uit de RNA-seq dataset en gekruist met de top 10 hub-doelen. De resulterende kerndoelen geassocieerd met Fructus Xanthii-extract en artrose werden gevisualiseerd met behulp van het ggvenn-pakket.

12. ELISA

Primaire menselijke articulaire chondrocyten bij passages 2–3 werden gezaaid in 6-well platen met een dichtheid van 5 × 10⁵ cellen per put. Cellen werden 24 uur lang geïncubeerd in serumvrij medium om rust te brengen. De cellen werden vervolgens verdeeld in de volgende drie groepen (n = 3 per groep):
(1) Blanke controle: cellen werden alleen met voertuig behandeld (0,1% DMSO); (2) Positieve controle: cellulaire ontsteking werd geïnduceerd met IL-1β, gevolgd door behandeling met vehicle (0,1% DMSO); (3) Fructus Xanthii-extractgroep : cellulaire ontsteking werd geïnduceerd met IL-1β, gevolgd door behandeling met 1000 μg/mL Fructus Xanthii-extract opgelost in 0,1% DMSO. Cellcultuursupernatanten werden na 24 uur incubatie verzameld en bewaard bij −80 °C tot gebruik. De niveaus van MMP1 en PGR in de kweeksupernatanten werden bepaald met commercieel verkrijgbare enzymgekoppelde immunosorbentassay (ELISA) kits die specifiek zijn voor respectievelijk humane MMP1 en PGR. De assays werden uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant.

13. Statistische analyse

Alle statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van statistische analyse- en grafieksoftware, en de gegevens werden gepresenteerd als gemiddelde ± standaardafwijking (SD). De normaliteit van de gegevens werd beoordeeld met de Shapiro–Wilk-test, en de homoscedasticiteit werd geëvalueerd met de Levene-test. Intergroepsvergelijkingen werden uitgevoerd met eenrichtings- of tweerichtingsvariantieanalyse (ANOVA), gevolgd door Tukey- of Šidák-post-hoc tests, afhankelijk van toepassing. Paargewijze vergelijkingen werden uitgevoerd met behulp van een tweezijdige Student's t-test. Niet-parametrische gegevens werden geanalyseerd met behulp van de Mann–Whitney U-test. Een tweezijdige P-waarde < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

Kwaliteitsbeoordeling en metabolisch landschap van niet-gerichte LC-MS/MS-gegevens

QC-monsters toonden uitstekende reproduceerbaarheid, zoals blijkt uit sterk overlappende TIC-chromatogrammen in zowel positieve als negatieve ionmodi, waarbij de retentietijddrift onder de 0,05 minuten bleef over de gehele analytische batch. Ruwe data ondergingen XCMS-gebaseerde preprocessing, waaronder piekdetectie, integratie en uitlijning tijdens retentietijd. Veronderstelde metabolieten werd...

Discussie

OA is een veelvoorkomende degeneratieve gewrichtsaandoening en een van de belangrijkste oorzaken van invaliditeit wereldwijd³⁶. De pathogenese is complex en multifactorieel, en omvat biochemische, cellulaire en moleculaire veranderingen in gewrichtsweefsels. Ooit beschouwd als een eenvoudig "slijtagefenomeen" van gewrichtskraakbeen, wordt OA nu algemeen erkend als een chronische aandoening van het hele gewricht die wordt gekenmerkt door kraakbeenafbraak, synoviale...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
4% PFA	Biosharp, China	BL539A	pH 7.4, steriel
C57BL/6 Muizen	Vital River Laboratory Animal Technology Co.,Ltd, China	N/A	Mannetje, 8-10 weken oud, 20-25g
Chondroitinesulfaat	MCE, Amerika	HY-B2162	Zuiverheid ≥98%
ClusterProfiler (R-pakket)	Bioconductor	Gratis toegang	Geïntegreerd in R v4.2.2
Collageenase, Type II, poeder	Gibco, Amerika	17101015	≥125 U/mg
Cytoscape	Cytoscape Consortium	Gratis toegang (https://cytoscape.org/)	v3.9.1 (met CytoHubba)
Cytoscape	Cytoscape Consortium	Gratis toegang	Versie 3.9.1
DESeq2 (R-pakket)	Bioconductor	Gratis toegang	Geïntegreerd in R v4.2.2
DMEM, hoge glucose	Gibco, Amerika	11965092	Steriele medium
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd, China	10009218	Analytische kwaliteit, 95%
Ethylacetaat	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd, China	10009418	Analytische kwaliteit
Fetaal bovien serum (FBS)	Cellmax, China	SA102.02	Warmte-geïnactiveerd
Fluorescentiemicroscoop	Nikon, Japan	Eclipse Ti2-U	Uitgerust met GFP-filter (488nm excitatie) & digitale camera
GEO Database	NCBI	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r	GEO2R analysetool
GraphPad Prism	GraphPad Software, LLC, Amerika	Commercieel	Versie 9.5.1
Hematoxiline-Eosine(HE) Kleurkit	Solarbio, China	G1120	Klaar voor gebruik kit
HERB Database	Chinese Academy of Sciences	http://herb.ac.cn/	V2.0
Human MMP-1 ELISA Kit	Yamei Biotechnology, China	HJ088	Voor mensen, 96-well plaat
Human Progesterone Receptor (PR) ELISA Kit	Shanghai Enzyme-Linked Biotechnology Co., Ltd., China	ml05997	Voor mensen, 96-well plaat
ImageJ	National Institutes of Health (NIH)	Gratis toegang	Versie 1.53t
Lichtmicroscoop	Olympus, Japan	BX53	10×/20× objectieven & digitale camera
Lyofiliseerapparaat	Christ, Duitsland	Alpha 1-4 LDplus	Vriesdroogsysteem
Gewijzigde Saffron-O En Fast Green Stain Kit	Solarbio, China	G1371	Voor bot/kraakbeenkleuring
Neutral Balsam	Solarbio, China	G8590	Montagemedium
Penicilline-Streptomycine	Gibco, Amerika	15070063	100×, sterieel
Fosfaat-bufferoplossing (PBS)	Sparkjade, China	CR0013-500ML	pH 7.2-7.4, sterieel
R software	R Foundation for Statistical Computing	Gratis toegang (https://www.r-project.org/)	v4.4.1 (met ggvenn)
Serumvrij celvriesmedium	Biosharp, China	BL203B	Sterieel
Staphylococcus aureus	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 25923	Standaard stam
STRING Database	STRING Consortium	https://string-db.org/	Eiwitinteractieanalyse
TCMID Database	Shaanxi Qinling Qiyao Collaborative Innovation Center	https://www.tcmsp-e.com/tcmspsearch.php	V3.0
Tg(col2a1a:EGFP) Zebravis	Zebrafish International Resource Center (ZIRC)	N/A	Larvae (2 dpf), AB-stam
TRIzol Reagens	Thermo Fisher, Amerika	15596018CN	Voor totale RNA extractie
Trypsine-EDTA (0,25%), fenol rood	Gibco, Amerika	25200056	Steriele oplossing
Ultra-hoog prestatie vloeistof chromatografie (UHPLC)	Thermo Fisher, Amerika	Q Exactive Focus	Gekoppeld met HRMS/MS
XCMS-online	Scripps Research Institute	Gratis toegang	Webgebaseerd platform