Bex-Plex maakt gelijktijdige visualisatie van eiwitmarkers en transcripties van ribonucleïnezuur mogelijk voor diepe ruimtelijke profilering van intact weefsel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor het combineren van iteratieve eiwitkleuring (IBEX) met RNAscope in situ hybridisatietechnologie voor diepe ruimtelijke fenotypering van intact vastgelegd bevroren weefsel voor toepassingen met hoge resolutie ruimtelijke profilering.

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om gelijktijdige ruimtelijke profilering van eiwit- en ribonucleïnezuur (RNA)-markers mogelijk te maken met enkelcelresolutie in intacte weefsels. Een van de kernproblemen rondom solide tumorkankers is het onvermogen om de respons van patiënten op therapeutische interventie te voorspellen. Het ontcijferen van deze complexiteiten vereist kwantitatieve metingen van cellulair gedrag, interacties en fenotypes binnen intacte weefsels. Specifiek bieden het proteoom en transcriptoom overlappende maar niet-redundante informatie die cruciaal kan zijn voor het ontwerpen van rationele immunotherapeutica. Er is echter momenteel geen eenvoudige en kosteneffectieve manier om zowel de transcriptionele als functionele toestand van alle cellen in de tumormicroomgeving diepgaand te profileren, terwijl hun cruciale ruimtelijke lokalisatie-informatie behouden blijft. Daartoe hebben we met succes het IBEX (iteratieve bleking verlengt multiplexiteit) platform gecombineerd met HiPlex RNAscope om tegelijkertijd high-plex eiwitmarkers en high-plex ribonucleïnezuur (RNA) transcripten met single-cell resolutie te visualiseren. Deze aanpak omvat een aangepaste RNA-doelopsporingsstap om de nucleaire morfologie te behouden en nauwkeurige beelduitlijning over cycli mogelijk te maken. "Bex-Plex" stelt ons in staat een ongemodificeerd IBEX-protocol uit te voeren op vaste bevroren weefsels, gevolgd door het HiPlex RNAscope-protocol, waarbij we een aangepaste RNA-doelopvang gebruiken om nucleaire uitlijning met IBEX-cycli te waarborgen. Dit protocol is geoptimaliseerd voor vaste bevroren weefsels en maakt geïntegreerde ruimtelijke analyse van transcriptie- en functionele cellulaire toestanden mogelijk. De mogelijkheid om op dit enkelcelniveau te profileren biedt niet alleen een diepe bron van informatie over het weefsel zelf, maar kan ook voorspellingen mogelijk maken over de genuanceerde cellulaire interacties die therapeutische responsiviteit aansturen, wat een kader biedt voor het bestuderen van ruimtelijke biologie in tumormicroomgevingen en gerelateerde systemen.

Inleiding

Sinds hun introductie in 2011 zijn kankerimmunotherapieën die de onderdrukking van cytotoxische T-cellen verminderen door remmende immuuncontrolepuntmoleculen zoals PDL-1 en CTLA-4 te blokkeren, uitgegroeid tot de gouden standaard^{voor de behandeling} van solide tumoren. Echter, ondanks grootschalig gebruik bij patiënten, variëren de klinische effectiviteiten van deze medicijnen sterk omdat veel solide tumorkankers intrinsiek aanwezig zijn bij of uiteindelijk resistentie tegen deze therapieën opwekken^. In veel gevallen komt dit door de extreem heterogene aard van solide tumoren, zelfs binnen dezelfde type^3-kanker. Een diepgaand begrip van de celrelaties die optreden in solide tumoren is essentieel voor het ontwikkelen van verbeterde behandelmethoden. Het identificeren van de exacte mechanismen en interacties die deze resistentie versterken en in stand houden, staat dus centraal in het kankeronderzoek. Hier streven we ernaar een methode te ontwikkelen die geïntegreerde ruimtelijke analyse van eiwit- en RNA-expressie binnen intacte weefsels mogelijk maakt om deze complexe cellulaire interacties beter te karakteriseren.

De tumormicro-omgeving (TME) bestaat uit de niet-kankerachtige cellulaire en structurele componenten die de tumorgroei en immuunrespons vormgeven, waaronder kankergeassocieerde fibroblasten, infiltrerende immuuncellen, vasculaire componenten en de extracellulaire matrix⁴. Onlangs is duidelijk geworden dat de samenstelling en organisatie van de TME sterk invloed hebben op de vraag of tumoren tolerant of resistent zijn tegen immuuninfiltratie, een van de belangrijkste factoren die de respons op immunotherapie^bepalen. Bij veel kankers correleert een fenotype van "immuunwoestijn", gekenmerkt door een laag aantal T-cellen en de aanwezigheid van sterk immunosuppressieve myeloïde populaties, met een slechte respons op checkpoint-blokkadetherapieën ^6,7. Chemocinesignalering bepaalt veel van deze rekruteringsdynamiek. Zo trekken CXCL1 en CCL2 immunosuppressieve myeloïde cellen aan, terwijl de CXCR3-CXCL9/CXCl10-as zowel cytotoxische als regulatieve T-cellen in tumor⁸ rekruteert. Daardoor kan de niche-specifieke signaalomgeving het celfenotype en de functie sterk beïnvloeden. Zo regelt bij patiënten met darmkanker de CCL5-CCR5-as de suppressieve functie van tumorgeassocieerde macrofagen (TAM's) en het blokkeren van dit signaal verschuift TAM naar een antitumorigent fenotype en correleert met verbeterde klinische responsen⁹. Bovendien kunnen directe interacties tussen immuuncellen, kankergeassocieerde fibroblasten en/of tumorcellen via ICAM en PDL-1 immuunuitputting veroorzaken en de antitumorimmuniteit^{stompe 10} verminderen. Samen onderstrepen deze bevindingen het belang van ruimtelijk opgeloste analyses om te begrijpen hoe TME de therapeutische effectiviteit beïnvloedt.

Immunofluorescent (IF) beeldvorming blijft een fundamentele benadering voor het visualiseren van eiwitexpressie en cel-celinteracties in weefsel. Het vakgebied is geëvolueerd van conventionele 3-4 kleuren IF naar high-content imaging workflows die vertrouwen op iteratieve kleuring en imaging. Bij deze methoden worden grote datasets gegenereerd via herhaalde cycli van antistoflabeling, beeldvorming en fluoroforinactivatie of -verwijdering, zodat extra markers kunnen worden gekleurd en gefotografeerd^{kunnen worden}. Iteratieve Bleaching Extends Multiplexity (IBEX) werd onlangs geïntroduceerd als een gebruiksvriendelijk en kosteneffectief iteratieve beeldplatform¹². Compatibel met het gebruik van commerciële antilichamen en conventionele microscopen, gebruikt IBEX lithiumborhydride (LiBH₄) om de fluorescentie van de meest gebruikte kleurstoffen te dempen zonder de weefselepitopen te beschadigen, waardoor tot 75 parameters voor één weefsel¹³ kunnen worden verworven. De beelden die uit deze cyclische kleuring worden verkregen, worden uitgelijnd met behulp van de SimpleITK open-source software om samengestelde datasets te produceren die geschikt zijn voor ruimtelijke analyses in hoge dimensies.

Als aanvulling op fenotypering op eiwitniveau kunnen ruimtelijke transcriptomische methoden waardevolle informatie verschaffen over de transcriptietoestand van cellen binnen hun natuurlijke omgeving. Opmerkelijk is in-situ hybridisatie (ISH) een populaire techniek om de lokalisatie van DNA- of RNA-sequenties in een specifiek weefsel^te identificeren. RNAscope is een goed gevestigde ISH-benadering die probes met een unieke Z-chemie gebruikt om RNA-transcripten specifiek te amplificeren met enkelmolecuulresolutie en is compatibel met veel verschillende monstertypes¹⁴. Als een breed geadopteerd en commercieel beschikbaar platform via Advanced Cell Diagnostics (ACD) biedt RNAscope gevalideerde probes tegen een breed scala aan doelen, waardoor experimenteel ontwerp voor diverse toepassingen wordt vereenvoudigd.

Een completer beeld van celidentiteit en functies kan worden verkregen door eiwit- en RNA-detectie binnen hetzelfde weefsel te combineren. Kortstondige afgescheiden eiwitten, zoals cytokinen en chemokinen, hebben traditioneel geen betrouwbare antistofkleuring door IHC, maar informatie over hun expressie kan worden verkregen door de kwantificatie van hun mRNA-transcripten. Eerdere pogingen om RNA en eiwitten samen te detecteren, zoals conventionele chromogene IHC of TSA-OPAL, zijn beperkt door niet-lineaire signaalversterking en tijdrovende antigeenopsporingsprotocollen¹⁵. In vergelijking met deze benaderingen maakt de Bex-Plex-methode gelijktijdige detectie van high-plex eiwitten en RNA's mogelijk, terwijl ruimtelijke context en nucleaire morfologie behouden blijven voor nauwkeurige beeldregistratie.

Hier presenteren we "Bex-Plex", een protocol dat de IBEX- en RNAscope-platforms integreert voor gelijktijdige, kwantificeerbare karakterisering van de transcriptie- en translatietoestanden van cellen binnen hun natuurlijke weefsels. In Bex-Plex ondergaan vaste OCT-ingebedde weefsels het standaard IBEX-protocol, gevolgd door een licht aangepaste RNAscope HiPlex-workflow, waarbij doelopvang wordt uitgevoerd bij 60°C met een incubatietijd van 1 uur in vergelijking met de oorspronkelijke incubatie van 99°C gedurende 5 minuten. Dit behoudt de architectuur van de kernen, waardoor een nauwkeurige uitlijning van fiduciale markers mogelijk is bij het registreren van de afzonderlijke beelden uit de IF- en ISH-cycli tot één. Dit protocol is het meest geschikt voor studies die gelijktijdige ruimtelijke analyse van eiwit- en RNA-expressie in intacte weefsels vereisen, vooral wanneer de beschikbaarheid van weefsels beperkt is of wanneer het behouden van ruimtelijke architectuur cruciaal is, zoals bij tumormicro-omgevingsanalyse of immuunprofileringsstudies.

Met behulp van breed beschikbare reagentia en compatibel met de meeste beeldvormingsplatforms, kan Bex-Plex worden uitgevoerd door elk technisch opgeleid onderzoekspersoneel dat bekend is met fluorescerende beeldvorming en toegang heeft tot een conventionele microscoop. Het hier gepresenteerde protocol is geoptimaliseerd voor vaste bevroren monsters. Op dit moment is het protocol gevalideerd in vaste bevroren weefsels, en verdere optimalisatie kan nodig zijn voor toepassing op andere monstertypen zoals FFPE of menselijke klinische monsters.

Deze workflow is van onschatbare waarde in elke context waarin weefsel beperkt of kostbaar is, zoals weefselbiopten of dierproeven met een beperkte steekproef, evenals voor het fenotyperen van cellen die moeilijk te extraheren zijn met dissociatieve technieken. Bex-Plex levert gelijktijdige, kwantificeerbare informatie over de transcriptie- en translationele profielen van afzonderlijke cellen, terwijl hun ruimtelijke context behouden blijft, data die uniek geschikt is om vragen te beantwoorden over de relaties en crosstalk tussen cellen in hun oorspronkelijke omgeving.

Protocol

De procedures die in dit protocol zijn beschreven, zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de University of California, San Diego (protocolnummer S24049). Mannelijke en vrouwelijke muizen van 7-12 weken oud op een C57BL/6 genetische achtergrond en ondergebracht onder specifieke ziekteverwekkervrije omstandigheden werden voor deze experimenten gebruikt.

1. Weefselvoorbereiding

1. Euthanaser experimentele muizen met goedgekeurde primaire en secundaire maatregelen (bijv. CO2-euthanasie en cervicale dislocatie) en oogst van interessant weefsel in aangevuld medium.
2. Bereid een verse voorraad weefselfixatief voor door een 4% voorraadoplossing paraformaldehyde (PFA) te verdunnen tot 0,5% of 1% PFA in 1X PBS. Gebruik 0,5% PFA voor laagvolumeweefsels zoals lymfeklieren en 1% PFA voor weefsels met een hoger volume zoals tumoren.
   VOORZICHTIG: Paraformaldehyde is brandbaar en giftig als het wordt ingenomen of doorgeslikt. Behandel met de juiste PBM en vermijd contact met huid of ogen.
3. Breng weefsels over in een 24-wells plaat met 2 mL fixatief per put en incubeer ze een nacht bij 4°C.
   Opmerking: Incubatietijden van meer dan 16 uur kunnen leiden tot overfixatieproblemen.
4. Vul de holen van een nieuwe 24-put plaat met 1x PBS en breng weefsels over van de fixatieplaat.
   Pauzepunt: Indien nodig kunnen weefsels tot 7 dagen worden opgeslagen in 1X PBS op 4°C.
5. Verwijder overtollig vet/vuil één voor één uit de weefsels met behulp van een dissectiescoop en gereedschap. Voeg een klein volume 1x PBS direct aan het weefsel toe om uitdroging tijdens het trimmen te voorkomen.
6. Bereid een sucroseoplossing van 30% met v/V door poeder van sucrosebouillon te verdunnen in 1x PBS.
7. Breng de weefsels over in een 24-put plaat met 2 ml 30% sucrose per put en breng ze een nacht uit bij 4°C om te dehydrateren. De weefsels worden voldoende uitgedroogd wanneer ze naar de bodem van de putten zakken.
8. Vul gelabelde cryomolds met OCT en plaats de zakdoekjes één voor één in de mallen. De weefseloriëntatie hangt af van de oorsprong, maar onze standaardaanbeveling is dat het grootste oppervlak parallel is aan de cryomoldbodem. Zorg ervoor dat de weefsels volledig in de OCT worden ondergedompeld.
9. Leg het 10 minuten op droogijs om in te vriezen en bewaar het op -80°C.

2. Weefselsectie

Opmerking: Alle reagentia en laboratoriummaterialen die voor dit protocol worden gebruikt, moeten vrij zijn van RNase. Let goed op besmetting bij het hanteren van slides.

1. Bedek RNase-vrije microscoopglaasjes met 15 μL chromaluinlijm en incubeer 1 uur bij 60°C in een oven. Chromaluin gecoate glaasjes kunnen tot een maand op kamertemperatuur (RT) worden bewaard voordat ze worden gebruikt.
2. Haal de in OCT ingesloten weefsels uit de -80°C vriezer en plaats het in een -20°C cryostaat/cryotoom om minstens 20 minuten in balans te komen.
3. Snijd weefsels op met chroomaluin gecoate glaasjes met een dikte van 10–15 μm.
4. Bewaar preparaten met gesneden secties bij 4°C of, als ze dezelfde dag kleuren, laten ze in evenwicht komen tot RT. Gesneden preparaten kunnen tot 5 dagen voor gebruik op 4°C worden bewaard.

3. Eiwitkleuring

1. In een dompelbak wek je de slide, die gekleurd wordt, 5 minuten in RNase-vrije 1x PBS om overtollige OCT uit de weefsels te verwijderen.
2. Gebruik een hydrofobe barrièrepen om dozen rond de zakdoekjes op de dia's te tekenen en laat het 2 minuten drogen.
3. Bereid een blokkerende oplossing voor van 10 μg·mL⁻¹ anti-muis FC-receptorblok in RNase-vrije 1X PBS. Voeg de blokkeringsbuffer toe aan de monsters op de preparat, waarbij je genoeg gebruikt om een bel te creëren die het weefsel volledig bedekt (100–150 μL·^sectie-1).
   Opmerking: Soms is het toevoegen van FBS of BSA (meestal 1–2%) aan de blokkeringsbuffer nodig voor moeilijke weefsels en/of markers.
4. Incubeer de slides bij RT 1 uur in een vochtige kleurdoos, en was ze daarna door ze volledig onder te dompelen in een dompelbak gevuld met RNase-vrije 1x PBS gedurende 5 minuten.
5. Bereid de primaire antilichaamkleuringsoplossing voor in RNase-vrije 1X PBS, met een inname van 100-200 μL per weefselsectie. Standaard antistofverdunningen variëren van 1:50-1:200, maar het wordt aanbevolen om enkele kleurtitraties uit te voeren om de beste verdunningsfactor voor een bepaald antilichaam en/of weefseltype te identificeren. Vortex- en pulsspin laten de antilichamen draaien voordat ze pipetteren om fluorescerende aggregaten te voorkomen.
6. Haal de dia's uit de was en zuig voorzichtig het overtollige vocht uit de hoek van de monsterdoosjes met een absorberend taaktvemiddel om te voorkomen dat de antistofoplossing verdund.
7. Breng de antistofoplossing aan op dezelfde manier als de blokkerende oplossing, waarbij een bel over het weefsel ontstaat.
8. Plaats de glaasjes horizontaal in een oven van 37°C en bebroeus 1 uur. Alternatief incubeer je de glaasjes 3–4 uur in een vochtige bak. Standaard IF-protocollen die al geoptimaliseerd zijn voor het gewenste weefsel van interesse kunnen worden gebruikt. Houd de glijbanen tijdens de incubatie in een vochtige omgeving om uitdroging te voorkomen. (bijvoorbeeld gebruik een natte papieren handdoek onderin de kleurtray).
9. Was de dia's door ze 2 minuten onder te dompelen in RNase-vrije 1x PBS. Herhaal dit twee keer voor in totaal drie wasbeurten. Indien nodig voor uw kleurpaneel, bereid dan een secundaire antilichaamkleuringsoplossing voor in RNase-vrije 1X PBS tijdens deze periode. Standaard antistofverdunningen variëren van 1:500-1:1000, maar het wordt aanbevolen om enkele kleurtitraties uit te voeren om de beste verdunningsfactor voor een bepaald antilichaam en/of weefseltype te identificeren.
10. Verwijder overtollig PBS van de preparaten met een absorberend taaktvemiddel en voeg 100–200 μL secundaire antilichaamkleuringsoplossing toe aan elke weefselsectie. Plaats de glaasjes horizontaal in een oven van 37°C en laat ze 30 minuten incuberen. Als alternatief kunnen de glaasjes 1–2 uur in een vochtige bak bij RT worden gekleurd.
11. Was de dia's door ze 2 minuten onder te dompelen in 1x RNase-vrije PBS. Herhaal dit twee keer voor in totaal drie wasbeurten.
12. Verdun DAPI nucleaire kleurstof tot een uiteindelijke concentratie van 0,2 μg·mL⁻¹ in RNase-vrije 1x PBS en voeg 100–200 μL toe aan elke weefselsectie.
13. Incubeer dia's 10 minuten bij RT in een vochtige box, en spoel dan één keer door onder te dompelen in RNase-vrije 1x PBS en kort op en neer te dompelen.
14. Week het overtollige vocht van de slides met een absorberend taakdoekje en voeg 20–30 μL waterige antifade montagemedium toe aan elke sectie. Leg voorzichtig een deklaag op de slide, waarbij je eventuele bellen minimaliseert, en laat het montagemedium 15–30 minuten uitharden.
15. Stel je de bevlekte preparaten voor. Voor een meer gedetailleerde uitleg van panelontwerpoverwegingen en beeldverwerving voor IBEX, zie de oorspronkelijk gepubliceerde IBEX-protocollen^12,13.
    Pauzepunt: Bewaar gemonteerde glaasjes tot 3 dagen in het donker bij 4°C, hoewel we aanraden direct door te gaan om minimale RNA-degradatie te garanderen.

4. Fluoroforebleking en iteratieve eiwitkleuring

1. Dompel de dia's onder in RNase-vrije 1X PBS totdat de deksel gemakkelijk zonder kracht afschuift. Afhankelijk van hoe lang de dekmantel is gemonteerd, kan dit tot 16 uur duren.
2. Terwijl de glaasjes worden gewekt, bereid je een 1 mg·mL^⁻1 oplossing van LiBH₄ voor in RNase-vrije DI H₂O door voorzichtig te mengen tot deze volledig is opgelost en wacht 10 minuten tot het activeert. Activatie vindt plaats wanneer er belletjes in de oplossing aanwezig zijn en de activiteit tot 4 uur duurt.
   Let op: LiBH₄ is waterreactief, vermijd overmatige blootstelling van poedermateriaal aan vocht en voer afval op de juiste manier af.
3. Was de dia's één keer gedurende 2 minuten in RNase-vrije 1X PBS om eventueel residu van het montagemedium te verwijderen, en pipetteer vervolgens 100–150 μL van de LiBH_4-oplossing op elk weefsel. Broed 15 minuten in een vochtige bak.
   Opmerking: Afhankelijk van de fluoroforen die voor kleuring worden gebruikt, kan deze incubatietijd verlengd moeten worden (uitvoerig besproken in de IBEX-methodenartikelen)^12,13.
4. Was de dia's één keer door het onder te dompelen in RNase-vrije 1X PBS en het kort op en neer te dompelen.
5. Ga verder met het kleuren van de preparaten met extra eiwitmarkers door stappen 3.5-3.15 te volgen. Het is niet nodig om de nucleaire kleurstof opnieuw te kleuren omdat deze niet bleekt met LiBH₄. Herhaal eiwitkleuring indien nodig.
   Pauzepunt: Gemonteerde glaasjes kunnen een nacht bij 4°C worden bewaard voordat de laatste eiwit/IBEX-cyclus wordt gebleken en overgaat naar RNA.
6. Ga direct door met RNAscope HiPlex nadat je de fluoroforen van de laatste cyclus hebt gebleekt. Hoewel tot zes cycli standaard IBEX zijn uitgevoerd zonder weefsel- of epitoopverlies, raden wij niet aan om meer dan drie cycli eiwitkleuring te gebruiken voor dit protocol vanwege de mogelijkheid dat de kwaliteit van RNA-transcripten over langere periodes afneemt.

5. Slidevoorbereiding voor RNAscope HiPlex

1. Dompel de dia's volledig onder in RNase-vrije 1X PBS totdat de dekmantel gemakkelijk zonder kracht afschuift. Afhankelijk van hoe lang de dekmantel is gemonteerd, kan dit tot 16 uur duren. Was één keer gedurende 2 minuten in RNase-vrije 1x PBS om eventueel residu van het montagemedium te verwijderen.
2. Maak 200 ml 50% ethanol, 200 mL 70% ethanol en 400 mL 100% ethanol.
3. Zet een hybridisatieoven aan en zet hem op 60°C. Verdunn het 10X Target Retrieval Reagens tot een 1X werkmateriaal in RNase-vrije DI H_{2 O}en verwarm het door het in de oven te plaatsen tot stap 5.8.
   Opmerking: Het niet vooraf verwarmen van het doelophaalreagens tot 60°C zal de downstream registratie van beelden uit de afzonderlijke cycli beïnvloeden. Het doelreagens moet gedurende de hele terugwinningsstap op 60°C blijven.
4. Dompel de glaasjes onder in 50% ethanol. Incubeer 5 minuten bij RT.
5. Haal de glaasjes uit de 50% ethanol en dompel ze onder in 70% ethanol. Incubeer 5 minuten bij RT.
6. Haal de slides uit de 70% ethanol en dompel ze onder in 100% ethanol. Incubeer 5 minuten bij RT en herhaal dit met verse 100% ethanol.
7. Haal de slides uit de 100% ethanol en laat ze 5 minuten drogen bij RT.
8. Voeg 100–150 μL van het 60°C 1X Target Retrieval Reagens toe aan elke weefselsectie en plaats de glaasjes in de hybridisatieoven. Broed 1 uur uit bij 60°C.
9. Verwijder de glaasjes en spoel af door ze 15 seconden onder te dompelen in RNase-vrije DI H2O. Op dat moment zet je de ingestelde temperatuur van de oven op 40°C.
10. Zet de glaasjes over naar 100% ethanol en laat ze 5 minuten incuberen, daarna minstens 5 minuten in RT drogen.
11. Breng Protease III aan op de glaas, 1–2 druppels per weefselsectie. Plaats de glaasjes in de hybridisatieoven en laat ze 30 minuten incuberen op 40°C.
12. Doe de slides onder in RNase-vrije DI_{H 2 O}en was door kort op en neer te dompelen. Herhaal dit met vers gedestilleerd water voor in totaal 2 wasbeurten.

6. RNAscope-reagensvoorbereiding en probe-hybridisatie

1. Bereid de RNAscope HiPlex-probevoorraad en HiPlex-probeverdunningsmiddel voor door ze 10 minuten in een oven of waterbad te verwarmen tot 40°C.
2. Kort pulse spin naar beneden alle 50X probe-aandelen. Bereid een werkend probemengsel voor door elke unieke doelprobe te verdunnen tot 1X met de RNAscope Probe Diluent. Plan om 50–100 μL probe-mengsel per weefsel te gebruiken en dit goed te mengen door vortex te laten vortexen voordat je het gebruikt. Het RNAscope HiPlex-protocol kan tot 3 cycli van 4 probes accommoderen (in totaal 12 probes die worden aangeduid als T1-12). Voor advies over probe-ontwerp, raadpleeg het oorspronkelijk gepubliceerde RNAscope-protocol¹⁴.
3. Plaats de RNAscope HiPlex Amp 1–3 en HiPlex Fluoro T1-T4 reagentia bij RT om in evenwicht te komen.
4. Breng de met Protease III behandelde glaasjes en pipetteer 50–100 μL van het probemengsel op elke weefselsectie. Plaats het horizontaal in de hybridisatieoven en laat het 2 uur incuberen op 40°C.
5. Was de slides door ze helemaal onder te dompelen in 1x Wash buffer gedurende 2 minuten. Herhaal met verse buffer voor in totaal 2 wasbeurten.
   Pauzepunt: Slides kunnen 's nachts worden opgeslagen in een 5X SSC-buffer bij RT, zoals beschreven in het RNAscope-protocol van ACD. Als dit pauzepunt wordt gebruikt, let dan op dat de volgende ochtend twee wasbeurten van 2 minuten in een 1x wasbuffer nodig zijn.

7. Probeversterking

Let op: Zorg ervoor dat alle reagentia in balans zijn gebracht met RT voordat je het op de dia's aanbrengt.

1. Voeg 1–2 druppels HiPlex Amp1-reagens toe aan de glaasjes en breng 30 minuten in de hybridisatieoven bij 40°C. Was de slides door ze helemaal onder te dompelen in 1x Wash buffer voor 2 minuten. Herhaal dit voor in totaal 2 wasbeurten.
2. Voeg 1–2 druppels van het HiPlex Amp2-reagens toe aan de glaasjes en incubeer in de hybridisatieoven bij 40°C gedurende 30 minuten. Was de slides door ze helemaal onder te dompelen in 1x Wash buffer voor 2 minuten. Herhaal dit voor in totaal 2 wasbeurten.
3. Voeg 1–2 druppels HiPlex Amp3-reagens toe aan de glaasjes en breng 30 minuten in de hybridisatieoven bij 40°C. Was de slides door ze helemaal onder te dompelen in 1x Wash buffer voor 2 minuten. Herhaal dit voor in totaal 2 wasbeurten.
4. Voeg 1–2 druppels HiPlex Fluoro T1-T4 reagens toe aan de glaasjes en incubeer in de hybridisatieoven bij 40°C gedurende 15 minuten. Was de slides door ze helemaal onder te dompelen in 1x Wash buffer voor 2 minuten. Herhaal dit voor in totaal 2 wasbeurten.
5. Voeg 3–4 druppels HiPlex DAPI-reagens toe aan elke weefselsectie en incubeer 1 minuut bij RT.
6. Verwijder de DAPI door de vloeistof van de slides te wicken met een absorberend taakdoekje. Voeg onmiddellijk 100 μL waterige basis antifade montagemedium toe (kan hetzelfde zijn als tijdens de IBEX-kleurstappen) aan elke sectie. Leg voorzichtig een dekmantel op de glijbaan, waarbij je belletjes minimaliseert, en laat de montage medium 15–30 minuten drogen.
7. Ga verder met beeldvorming.
   Pauzepunt: Gemonteerde glaasjes mogen tot 3 dagen in het donker worden bewaard bij 4°C, hoewel we aanraden snel te handelen om minimale RNA-degradatie te waarborgen.

8. Het splijten van de fluoroforen en iteratieve RNA-hybridisatie

1. Om de dekselsglijden van de slides te verwijderen, laat je minstens 30 minuten weken in 4X SSC-buffer bij RT. Was één keer door de slides volledig onder te dompelen in een verse 4X SSC-buffer en kort op en neer te dompelen.
2. Open een verse ampul met splijtende oplossing en maak een 10% werkmateriaal door te verdunnen met 4X SSC-buffer.
3. Plaats de glaasjes in een vochtige doos en voeg 3–4 druppels van de 10% spleetoplossing toe. Incubeer 15 minuten bij RT, en was de glaasjes daarna door ze helemaal onder te dompelen in 0,5% PBST voor 2 minuten. Herhaal dit met verse PBST voor in totaal 2 wasbeurten.
4. Om verder te gaan met beeldvormingscyclus 2 van het RNAscooppaneel, evenwichtig het HiPlex Fluoro T5-T8 reagens naar RT.
5. Zet de hybridisatieoven aan en zet de temperatuur op 40°C.
6. Voeg het HiPlex Fluoro T5-T8 reagens toe aan de glaasjes en incubeer in de hybridisatieoven bij 40°C gedurende 15 minuten. Was de slides door ze helemaal onder te dompelen in 1x Wash buffer voor 2 minuten. Herhaal dit voor in totaal 2 wasbeurten.
7. Week voorzichtig het overtollige vocht van de glaasjes. Voeg onmiddellijk 100 μL montagemedium toe aan elk gedeelte en plaats voorzichtig een dekmantel op de geleide. Laat het montagemedium 15–30 minuten drogen en ga dan over met beeldvorming.
8. Herhaal stappen 8.1–8.7 met het HiPlex Fluoro T9-T12 reagens voor in totaal 3 RNAscoopcycli indien van toepassing. Let op dat hoewel 3 cycli mogelijk zijn met het RNAscope HiPlex-protocol, de extra tijd die nodig is voor eiwitkleuring met dit protocol de kwaliteit van RNA kan beïnvloeden. Daarom zijn 3 cycli niet altijd haalbaar, afhankelijk van de specifieke transcripties die worden beoogd.

9. Beeldverwerking

1. Individueel de ruwe bestanden van elke ronde verwerken en beeldverwerking uitvoeren met consistente parameters, waaronder achtergrondaftrekfuncties, gladstrijkfilters en registratietransformatietype. Kanalen moeten een consistent scheidingsteken hebben (bijv. Cyclus 1: CD45 AF532, waarbij ":" het onderscheid maakt tussen cyclus en marker/fluor).
2. Start de SimpleITK-software (https://github.com/niaid/sitk-ibex) en klik op Imaris-extensies > SimpleITK > Affine-registratie van z-stack met behulp van een gemeenschappelijke kanal.
3. Upload één afbeeldingsbestand uit elk van de multiplexcycli en voer het scheidingsteken in voor alle benoemde kanalen (bijv. ":").
4. Selecteer het kanaal dat gebruikt moet worden voor beeldregistratie en de vaste afbeelding waarop alle andere afbeeldingen worden uitgelijnd. Het wordt aanbevolen om DAPI als fiduciale marker te gebruiken, hoewel elk gemeenschappelijk benoemd kanaal tussen alle cycli kan worden gebruikt.
5. Klik op "Registreren" en vervolgens op "Resample en save combined image".
6. Ga verder met downstream analyse met de software van jouw keuze. Voor meer informatie over beeldverwerking en registratie, raadpleeg het oorspronkelijke IBEX-protocol ^12,13.

Resultaten

Figuur 1: Overzicht van de Bex-Plex workflow.
Vaste bevroren weefsels die op chrom-aluin gecoate glaasjes zijn gesneden, ondergaan tot 3 cycli standaard IBEX, gevolgd door maximaal drie cycli RNAScope HiPlex, waarbij de eerste doelophaalstap wordt uitgevoerd bij 60°C gedurende 1 uur. Beelden uit afzonderlijke cycli worden vervolgens geregistreerd en uitgelijnd met een fiduciale marker...

Discussie

De Bex-Plex-workflow integreert het iteratieve eiwitkleuringsplatform, IBEX, met RNAscope in situ hybridisatie om gelijktijdige detectie van eiwitten en RNA-transcripten met enkelcelresolutie mogelijk te maken. Het primaire doel van dit protocol is het bieden van een reproduceerbare methode voor geïntegreerde ruimtelijke analyse van eiwit- en RNA-expressie binnen intacte weefsels. Het vermogen om zowel eiwit- als RNA-expressie in hetzelfde weefsel te meten, bracht eerder technis...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.5 ml microcentrifuge tubes	Biopioneer	MCNT-1.5F
200 proof EtOH	Fisher Scientific	BP28184
20X SSC buffer	Invitrogen	AM9765
24 well plates
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD11b Antibody	Biolegend	101217
Alexa Fluor 523 anti-mouse CD3e Antibody	Invitrogen	58-0032-82
Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G Antibody	Biolegend	127610
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD68 Antibody	Biolegend	137025
BD Cytofix/Cytoperm fixation and permeablization solution	BD	554722
Chrome alum gelatin	Fisher	NC1692262
Confocal microscope (e.g Leica Stellaris)
Cryomolds	VWR	25608-922
Cryostat (e.g CryoStar NX50 Cryostat)	Thermofisher Scientific	957100
Cryostat blades (e.g Leica Low Profile Disposable Blades DB80LX)	Leica Biosystems	14035843496
DAPI	Thermofisher Scientific	62248
Dissection microscope (e.g Zeiss SteREO Discovery.V8)
Dissection tools
Dry Ice
Dunk tank for slide staining (e.g Simport Scientific EasyDip Slide Staining Jars)	Fisher Scientific	22-038-489
Fluoromount-G	Fisher	OB10001
Heated water bath
Histology brushes (e.g. Ted Pella Camel Hair Brushes)	Fisher Scientific	NC2023341
Hybridization oven (e.g. HybEZ II Hybridization System)	ACD	321710
Image analysis software of choice
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen	Vector Laboratories	H-4000
Kimwipes	VWR	21905-026
Lithium borohydride	STREM Chemicals	93-0397
Micropipettes (P-10, P-20, P-200, P-1000)
Mini Microcentrifuge (e.g. Corning LSE Mini Microcentrifuge)	Corning