Methodenartikel

Een hypoxie-reoxygenatie-schademodel bij zelf-assemblerende menselijke cardioïden

DOI:

10.3791/70310

⸱

17 maart 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, Duke University School of Medicine, 2Department of Pathology, Duke University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zelfassemblage menselijke cardiale organoïden (hCO's) zijn een opkomend systeem voor het modelleren van menselijke hartontwikkeling en ziekte. Hier wordt een methodologie gegeven voor het genereren en beschadigen van hCO's met hypoxie-reoxygenatie en details van verwachte histologische en functionele uitkomsten na een verwonding.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zonder snelle revascularisatie leidt ischemische hartziekte tot onomkeerbaar verlies van cardiomyocyten, littekenvorming en verminderde hartfunctie. Het vermogen om hypoxie-reoxygenatie-letsels te modelleren en potentiële therapeutische interventies in menselijk weefsel te evalueren is een onvervulde behoefte. Menselijke cardiale organoïden (hCO's) zijn een opkomend modelsysteem, maar het starten van werk met hCO's kan uitdagend zijn vanwege hun kleine omvang, vereisten voor suspensiecultuur en variabiliteit in differentiatie-efficiëntie. Dit protocol biedt een gebruiksvriendelijke gids voor het genereren en onderhouden van menselijke iPSC-afgeleide zelfassemblerende hCO's; methoden om hCO's te verwerken en histologisch te analyseren; en een benadering om hCO's te beschadigen met hypoxie-reoxygenatie die de fibrose en apoptose nabootst die wordt gezien bij menselijke ischemie/reperfusie. Dit protocol biedt richtlijnen voor het gebruik van hCO's als aanvulling op diermodellen van ischemie-reperfusieschade en kan worden gebruikt om factoren te identificeren en te testen die het herstel van het menselijke myocardiale geheugen kunnen bevorderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ischemische hartziekte is wereldwijd een belangrijke oorzaak van morbiditeit en sterfte en treft minstens 20,5 miljoen mensen in de Verenigde Staten alleen al 1,2,3. Zonder voldoende perfusie leidt langdurige hypoxie tot cardiomyocytdood (CM) en myocardfunctie. Myocardiale ischemie wordt voornamelijk behandeld met revascularisatie via percutane interventie, trombolytische therapie of coronaire bypass-transplantatie. Revascularisatie is echter een tweesnijdend zwaard en kan extra schade veroorzaken door de afgifte van reactieve zuurstofsoorten 4,5. Hoewel reperfusiestrategieën enorm succesvol zijn geweest, zijn methoden om CM-verlies te beperken tijdens ischemische insultes of na reperfusie moeilijker te vinden. Hoewel veel pogingen om geïnfarcterd weefsel te redden effectief blijken in diermodellen van ischemie-reperfusie, zijn dezezelfde therapieën grotendeels niet in staat geweest significant voordeel te behalen in humane proeven, wat de behoefte heeft gecreëerd aan menselijke modellen om CM-besparende of aanvullende therapieënte evalueren 6,7,8,9,10,11,12.

Menselijke platforms die worden gebruikt om hartschade te modelleren omvatten primaire weefsels en door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC)-afgeleide systemen13,14. Omdat primaire weefsels worden beperkt door de beschikbaarheid van monsters, zijn hiPSC-systemen uitgegroeid tot het dominante menselijke platform voor het modelleren van hartziekten, met als duidelijke voordelen dat ze genetisch hanteerbaar en schaalbaar zijn 15,16,17,18,19. Traditionele 2D hiPSC-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CM) worden beperkt door de onvolwassenheid van de resulterende CM's, het ontbreken van complexe weefselarchitectuur en het onvermogen om de volledige cellulaire diversiteit in het menselijk hartte reproduceren. Om deze tekortkomingen aan te pakken, zijn gemanipuleerde 3D-hartweefsels (EHT's) steeds vaker toegepastmet 20,21,22,23,24,25,26. EHT-benaderingen omvatten het mengen van pre-gedifferentieerde hartcellen in sferoïden24 of het zaaien van gedifferentieerde hartcellen in steigers of mallen 21,22,27. Hoewel EHT's heterotypische cellulaire interacties beter kunnen modelleren en relatief meer rijpheid hebben dan 2D-culturen, beperken de eisen voor aangepaste steigers of bioreactoren om EHT's te creëren en te onderhouden momenteel hun schaalbaarheidtot 21,27,28.

Zelfassemblage cardiale organoïden (hCO's), of cardioïden, zijn een nieuw en krachtig in vitro menselijk modelsysteem 20,25,26,29. hCO's hebben verschillende voordelen. Ten eerste kunnen ze meerdere celtypen omvatten, waaronder endotheelcellen, fibroblasten en epicardiale cellen, zonder dat meerdere gespecialiseerde differentiatieprotocollennodig zijn. Ten tweede vindt het grootste deel van hun differentiatie plaats in 3D-suspensiecultuur, waardoor de vereisten voor gespecialiseerde mallen of weefselmatrix 25,26,29,30 overbodig zijn. Ten slotte hebben hCO's een stereotiepe sferische morfologie met een centrale holte, waardoor morfologische analyses mogelijk zijn. HCO's hebben daardoor schaalbaarheid vergelijkbaar met 2D-kweeksystemen, terwijl ze een deel van de weefselcomplexiteit van EHT's behouden. hCOs zijn gebruikt voor geneesmiddeltoxiciteitstesten, patiëntspecifieke ziektemodellering en om aspecten van de hartontwikkeling te modelleren 20,26,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. Hoewel veelbelovend, hebben hCO's verschillende beperkingen ten opzichte van EHT's, waaronder het onvermogen om krachtoutput direct te meten. Bovendien is er geen inheemse immuuncelpopulatie in de beschreven hCO-modellen, hoewel het mogelijk is om hCO's te bevolken met macrofagen. Desalniettemin zijn hCO's een opkomend en snel evoluerend menselijk modelsysteem 20,26,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39.

Tot op heden is het modelleren van hartletsel met hCO's beperkt. Er is een cryoinjury-model beschreven, maar de verwondingen zijn zeer variabel, en de noodzaak om hCO's individueel te verwonden beperkt de schaalbaarheidmet 29. Dit manuscript beschrijft een gebruiksvriendelijk protocol voor het genereren en verwonden van zelf-assemblerende hCO's met hypoxie-reoxygenatie (H/R) letsel. In vergelijking met andere protocollen voor het genereren van hCO's gebruikt dit protocol een vereenvoudigd differentiatiemedium en bevat het de 2D-3D mesodermdifferentiatiestrategie beschreven door Hofbauer et al.29. Het protocol voor H/R-letsel kan op elk moment worden uitgevoerd nadat hCO's beginnen te kloppen, wat meestal plaatsvindt rond differentiatiedag 8 (D8) naar D11. De H/R-duur kan worden getitreerd tussen 6 uur en 24 uur om het gewenste niveau van blessure te bereiken, variërend van minimaal tot bijna volledig CM-verlies. Daarnaast ontwikkelen hCO's stereotiep een collageenkern met Vimentin+- cellen na H/R-schade, die ook in ernst schaalt met de H/R-duur. Dit hoogdoorvoerbare, schaalbare hCO-model van H/R-letsel kan mogelijk de behoefte aanpakken voor menselijke modellen om nieuwe therapeutische wegen te ontwikkelen en te testen ter bevordering van CM-herstel of regeneratie na een blessure.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures voor het omgaan met menselijke cellijnen moeten lokale bioveiligheidsprotocollen volgen. Alle experimenten werden uitgevoerd met behulp van de iPSC-cellijn DU11, die afkomstig is van gezonde pasgeboren mannelijke fibroblasten door de iPSC-kernfaciliteit aan Duke University.

1. Generatie van hCO's

OPMERKING: Deze sectie beschrijft een standaardprotocol voor het genereren van hCO's uit iPSC's (Figuur 1). Alle stappen die in dit protocol zijn beschreven, moeten worden uitgevoerd in een laminaire flow hood om steriliteit te waarborgen. Zie Tabel 1 voor recepten voor differentiatiemedia.

DagVoorraadconcentratieWerkconcentratieVerdunningsfactorBasismedia
D010 mM CHIR9902110 μM CHIR990211:1000RPMI-1640, 2% B27 min insuline
100 mg/mL ascorbinezuur50 μg/mL ascorbinezuur1:2000
10 mg/mL Activin A60 ng/mL Activin A1:167
D15 mM IWP25 μM IWP21:1000RPMI-1640, 2% B27 min insuline
100 mg/mL ascorbinezuur50 μg/mL ascorbinezuur1:2000
D25 mM IWP25 μM IWP21:1000RPMI-1640, 2% B27 min insuline
100 mg/mL ascorbinezuur50 μg/mL ascorbinezuur1:2000
10 mM Thiazovivin2 μM Thiazovivine1:5000
D35 mM IWP25 μM IWP21:1000RPMI-1640, 2% B27 min insuline
100 mg/mL ascorbinezuur50 μg/mL ascorbinezuur1:2000
D45mM IWP25 μM IWP21:1000RPMI-1640, 2% B27 min insuline
D6+N.v.t.N.v.t.RPMI-1640, 2% B27 plus insuline

Tabel 1: Differentiatiemedia-tafel. Voorraadconcentraties, werkconcentraties en verdunningsfactor voor elke differentiatiefactor tot en met differentiatiedagen 0-6. Bereid alle werkende oplossingen vers voor op het moment van het voeren.

figure-protocol-1
Figuur 1: Schema van hCO-differentiatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. iPSC-onderhoud
    1. Bedek de bodem van elke put van een 12-put plaat volledig met een basale membraanmatrix in een verhouding van 1:100, verdund in koud DMEM/F12-medium. Incubeer behandelde platen bij 37 °C gedurende 1 uur om polymerisatie mogelijk te maken. Als ze niet direct worden gebruikt, kunnen platen worden afgesloten met een folie en tot 2 weken bij 4 °C worden bewaard en minstens 60 minuten bij 37 °C worden geïncubeerd voordat ze worden gebruikt.
  2. Differentiatiedag -3 (D-3): plating van iPSC's voor latere differentiatie
    1. Bereid basale membraanmatrix-gecoate platen voor zoals beschreven in stap 1.1.1.
    2. Aspireer onderhoudsmedia uit iPSC-kweek en voeg voldoende celloskoppelingsoplossing toe om cellen volledig te bedekken (~500 μL per put van een 12-wellplaat of 1 mL per put van een 6-well plaat). Incubeer 5 minuten op 37 °C.
    3. Voeg een gelijke hoeveelheid iPSC-onderhoudsmedia toe aan elke put en tik voorzichtig op de plaat om cellen los te maken. Kantel de plaat naar jezelf toe en pipetteer voorzichtig op en neer over de bodem van de put om de hechtende cellen verder los te maken, niet meer dan drie maal. Gebruik een pipet om de celsuspensie naar een 15 mL conische buis te verplaatsen.
    4. Pelletcellen door centrifugatie op 300 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur in een zwaaiende emmercentrifuge. Aspireer supernatant en laat cellen voorzichtig opnieuw ophangen in 1 mL iPSC-onderhoudsmedia.
    5. Verplaats 10 μL van de celsuspensie naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 mL. Voeg 10 μL Trypan blue toe en pipetteer om te mengen. Voeg 10 μL van het iPSC/Trypan blauw mengsel toe aan de hemocytometer en tel levende cellen.
    6. Verdun de celsuspensie tot een uiteindelijke concentratie van 100.000-200.000 cellen/mL in iPSC-onderhoudsmedium met ROCK-remmer (ROCKi). Voeg 1 mL/put van de celsuspensie toe aan elke put van een 12-put plaat die is bedekt met een basale membraanmatrix.
      OPMERKING: De platingdichtheid vóór differentiatie hangt af van de groeisnelheid van een bepaalde cellijn. De beplatingsdichtheid moet mogelijk worden aangepast voor elke iPSC-lijn. De concentratie ROCKi moet mogelijk worden getitreerd, afhankelijk van het merk/de gebruikte formulering.
  3. Differentiatie D-2: Media uitwisselen om ROCKi te verwijderen
    1. Vervang media voor 1 mL verse iPSC-onderhoudsmedia, zonder ROCKi. Cellen zouden kleine kolonies moeten gaan vormen. Kolonies moeten er plat uitzien (Figuur 2A). Als cellen er uitzien als keien, dun of langwerpig, is dit een teken van spontane differentiatie en kan de differentiatie-efficiëntie worden beïnvloed.
  4. Differentiatie D-1: Blijf cellen incuberen zonder behandeling.
  5. Differentiatie D0: Begin van differentiatie en mesoderm-inductie
    1. Controleer met een microscoop de celdichtheid om te zorgen dat er 70%-90% confluentie is (Figuur 2B) op het moment van differentiatie. Als subconfluent is, voed cellen dan met iPSC-onderhoudsmedia en wacht 24 uur. Als de cellen te confluent zijn, splits je de cellen zoals in stap 1.2
    2. Bereid 12 mL per 12-wells plaat D0 mesoderm inductiemedium voor (10 μM CHIR99021, 50 μg/mL ascorbinezuur, 60 ng/mL Activine A in RPMI-1640 met 2% B27 supplement zonder insuline (RB-)).
    3. Verwijder het bestaande medium en vervang het door 1 mL/put D0 mesoderm inductiemedia. Let op het moment van media-uitwisseling.
  6. Differentiatie D1: Specificatie van het hartmesoderm
    1. Precies 24 uur na toevoeging van D0 mesoderm inductiemedium wordt het medium vervangen door D1 cardiac mesoderm specificatiemedia (5 μM IWP2, 50 μg/mL ascorbinezuur in RB).
  7. Differentiatie D2: hCO-vorming
    1. Voeg genoeg celdissociatiereagens toe om de cellen te bedekken en incubeer bij 37 °C gedurende 5 minuten (Figuur 2C). Voeg een gelijke hoeveelheid D2-mesodermmedia van het hart toe aan elke put en pipetteer voorzichtig op en neer om hechtende cellen vrij te laten. Breng de celsuspensie over naar een 15 mL conische buis.
    2. Pelletcellen door centrifugatie op 300 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer in 1 mL D2 cardiac mesoderm specificatiemedium (5 μM IWP2, 50 μg/mL ascorbinezuur in RB-).
    3. Neem 10 μL celsuspensie en voeg daar 10 μL Trypan Blue aan toe. Tel cellen met een voorkeursmethode. Verdun cellen tot een concentratie van 100.000 cellen/mL in D2 hartmesoderm specificatiemedia, met 2 μM thiazovifine. Gebruik 10 mL celsuspensie per 96-well ultra-low attachment plate.
    4. Breng de celsuspensie over naar een passend reagensreservoir en gebruik een multikanaals pipet om 100 μL naar elke put van een ultra-low attachment 96-well plaat te transporteren, voor een uiteindelijke concentratie van 10.000 cellen per put.
    5. Om hCO-vorming in suspensiecultuur te induceren, centrifugeer je platen op 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Na centrifugatie is er een grote pellet van cellen (Figuur 2D) - als deze pellet niet wordt begrensd, herhaal je centrifugatie.
      OPMERKING: Niet alle cellen zullen zich opnemen in de hCO, die zal verschijnen als een omschreven celpellet, waarbij individuele cellen zichtbaar zijn op brightfield-microscopie. Er is wat enkelcellig afval in de plaat rondom de hCO normaal.
  8. Differentiatie D3: Toevoeging van media om ROCKi te verdunnen
    1. Bereid 10 mL D3-medium voor (5 μM IWP2, 50 μg/mL ascorbinezuur in RB-) per plaat. Voeg met een multikanaals pipet 100 μL D3-media toe aan elke put, zonder dat er een verwijderd is.
      OPMERKING: In dit stadium zijn hCO's gecondenseerd tot een donkere, goed omschreven sferoïde. Individuele cellen zullen niet zichtbaar zijn (Figuur 2E).
  9. Differentiatie D4: Overstappen naar D4-media
    1. Verwijder 100 μL D3-media en vervang door 100 μL D4-media (5 μM IWP2 in RB-). Om het risico op aspiratie te verkleinen, kantel je de plaat naar jezelf toe met een hoek van ongeveer 45° en houd je een multikanaals pipet onder een hoek van ongeveer 90° ten opzichte van de zijwand van de plaat. Plaats de multikanaals pipet stevig op de zijwand van de put en aspireer langzaam 100 μL media, waarbij je de pipettoppen af en toe controleert op geaspireerde hCO's.
      OPMERKING: hCO's bevinden zich in suspensiecultuur en het aspireren van hCO's tijdens het verwijderen van media is gebruikelijk. Om het risico op aspiratie te verkleinen, kantel je de plaat naar je toe tot een hoek van ongeveer 45° en houd je een multikanaals pipet onder een hoek van ongeveer 90° ten opzichte van de zijwand van de plaat. Plaats de multikanaals pipet stevig op de zijwand van de put en aspireer langzaam 100 μL media, waarbij je af en toe de pipetpunten controleert op aspireerde hCO's.
    2. Vervang door 100 μL D4-media.
  10. Differentiatie D6: hCO onderhoudsmedium
    1. Verwijder 100 μL van het D4-medium en vervang door 100 μL D6+-media (RPMI-1640 met 2% B27 Supplement (RB+)).
  11. Differentiatie D8
    1. Blijf elke 2 dagen media wisselen door 100 μL te verwijderen en te vervangen door 100 μL verse D6+ media. hCOs moeten groter worden, de gladde randen behouden en beginnen te slaan rond D6-11 als ze succesvol worden onderscheiden (Figuur 2F). hCO's zullen nog steeds verschijnen als donkere, goed afgebakende sferoïden, en individuele cellen zullen niet zichtbaar zijn.

figure-protocol-2
Figuur 2: Tijdlijn van hCO-differentiatie. Tijdlijn van organoïde differentiatie. (A) iPSC-kolonies 1 dag voor differentiatiestart (D-1). Let op duidelijke, vlak ogende kolonies. (B) iPSC's op de dag van differentiatiestart (D0) bij ~90% confluentie. (C) Organoïde bij differentiatie D2 direct na organoïdevorming in een 96-well ultra-low hechtingsplaat. Pijl duidt een voorbeeld aan van naaldvormige IWP2-kristallen. (D) Organoïden bij differentiatie D3. Let op significante organoïde verdichting door de vorming van cel-cel junctions; Enige niet-incorporeerde celresten zijn normaal in dit stadium. (E) Organoïden bij differentiatie D10. (F) Pijl geeft een iPSC-kolonie aan met langgerekte, dunne cellen met een keienuiterlijk, wat wijst op mogelijke spontane differentiatie. Schaalbalk = 1000 μm voor panelen A-E, schaalbalk = 400 μm voor paneel F. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Het verzamelen en vaststellen van hCO's voor immunokleuring

  1. Met een 1000 μL pipet zonder afgesneden punt breng hCO's over naar een 1,7 mL microcentrifugebuis. Zodra alle hCO's zijn overgebracht, wacht je tot de hCO's naar de bodem van de buis zijn gezakt en verwijder je voorzichtig overtollig media. Was hCO's één keer met PBS, wacht een paar seconden tot hCOs naar de bodem van de buis zijn gezakt, en verwijder voorzichtig overtollige PBS.
  2. Fix hCOs met 4% PFA gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Sommige antilichamen kunnen aceton- of methanolfixatie vereisen voor optimale prestaties. Raadpleeg de richtlijnen van de fabrikant.

3. Volledige immunokleuring

  1. Breng het gewenste aantal vaste hCO's over naar een 1,7 mL microcentrifugebuis. Verwijder de fixatieve oplossing en was met PBS die 0,1% Tween-20 bevat (PBS-T).
    1. Om hCO's te wassen, verwijder je zoveel mogelijk van het overtollige fixatiemiddel. Wees voorzichtig dat je de hCO's onderin de buis niet verstoort. Voeg ~1 mL PBS-T toe en wacht een paar seconden tot de hCO's naar de bodem van de buis zijn gezonken voordat je doorgaat naar de volgende stap.
  2. Verdun het primaire antilichaam tot een gewenste concentratie in kleuringsoplossing (10% neonatale kalfsserum, 1% DMSO in 0,1% PBS-T). Voeg 50-100 μL primaire antistofoplossing toe per microcentrifugebuis (of genoeg volume om alle hCO's in elke buis te dekken).
  3. Incubeer 24 uur op 4 °C op een shaker/rocker. Verwijder overtollig primaire antilichaam en voer daarna drie wasbeurten van 1 uur uit in PBS-T op kamertemperatuur. Voer een laatste wasbeurt uit in PBS-T op 4 °C om zeker te zijn dat overtollige antistoffen worden verwijderd.
  4. Verdun het secundaire antilichaam tot een gewenste concentratie in kleuroplossing en voeg 50-100 μL antistofoplossing toe per microcentrifugebuis (of genoeg volume om alle hCO's in elke buis te bedekken).
  5. Incubeer hCO's met het secundaire antilichaam gedurende 24 uur bij 4 °C op een schudplatform. Verwijder overtollig secundair antilichaam en voer daarna drie wasbeurten van 1 uur uit in PBS-T op kamertemperatuur. Voer een laatste wasbeurt uit in PBS-T op 4 °C om zeker te zijn dat alle overtollige antistoffen worden verwijderd.
  6. Voor beeldvorming van de hele montage breng je hCO's over met een 1000 μL pipet waarbij de tip is afgesneden naar een positief geladen glazen slede. Verwijder overtollige PBS-T en voeg een paar druppels montagemateriaal toe om de hCO's te bedekken. Leg voorzichtig een deksel om de hCO's plat te maken.
    OPMERKING: Om de 3D-architectuur van de hCO te behouden, gebruik een rubberen pakking of dubbelzijdig tape rond de randen van de slede om de hoogte van de deksel te verhogen. Het gebruik van een clearing-montagemedium kan helpen om de beeldvorming door de hCO te verbeteren, vooral als hCO's niet worden afgevlakt.

4. Sectie en inbedding

  1. Na fixatie bedek je hCO's 's nachts met 30% sucrose bij 4 °C voor cryobescherming. Met een 1000 μL pipet zonder punt afgesneden, breng je het gewenste aantal hCO's over in een kunststof mal van 12 mm x 12 mm. Verwijder voorzichtig overtollige sucroseoplossing en zorg ervoor dat je geen hCO's aspireert.
    OPMERKING: Het is nuttig om 30% sucrose op en neer te pipeten in de pipettip voordat je het overzet, om te voorkomen dat hCO's aan de zijkant van de tip blijven plakken.
  2. Voeg een klein beetje OCT toe, net genoeg om de hCO's te dekken. Met een fijne pincet of een pipettip verplaats je hCO's voorzichtig in OCT zodat hCO's niet samenklonteren en er geen hCO's dicht bij de randen van de schimmel zitten. Zorg ervoor dat alle hCO's zo dicht mogelijk bij de bodem van de mal liggen, met als doel het maximale aantal hCO's dat in één cryosectie wordt gevonden te maximaliseren.
  3. Bevries deze eerste laag OCT door de mal in een piepschuim koeler te plaatsen met een laag droogijs onderin. Wacht een paar minuten tot de OCT is uitgehard en verplaats de mal dan van droogijs naar het werkblad. Voeg extra OCT toe totdat de mal gevuld is. Wacht tot de eerste laag OCT volledig is gesmolten voordat je weer droogijs gebruikt.
  4. Bewaar bevroren, ingebedde hCO's bij -80 °C tot ze klaar zijn voor cryosectie.
  5. Als je klaar bent om te snijden, lijn dan het hCO-blok zo goed mogelijk uit en begin met het trimmen van het blok. Plaats periodiek een sectie op een geladen glijbaan en inspecteer elke sectie visueel op hCO's. Wanneer hCO's worden gevisualiseerd, verander dan naar secties van 6 μm.
    OPMERKING: Het uitvalpercentage van hCO's tijdens het inbedden en doorsnijden is minstens 10%. Plan dienovereenkomstig.

5. TUNEL- en immunokleuringsweefseldoorsneden

  1. Gebruik een pappen om een hydrofobe rand te trekken rond weefselsecties die gekleurd moeten worden. Wash slides één keer in PBS 0,1% Tween (PBS-T) om OCT op te lossen.
  2. Voeg blokkerende buffer toe (10% neonatale kalfserum, 1% DMSO, in PBS-T) gedurende 1 uur op kamertemperatuur.
  3. Bereid een primaire antistofoplossing voor. Begin met de door de fabrikant aanbevolen concentratie voor immunofluorescentie, maar de concentratie moet mogelijk empirisch worden getitreerd.
    OPMERKING: Alternatief kan TUNEL-kleuring op dit moment worden uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant.
  4. Verwijder de blokkeringsdemper van de slide. Voeg voldoende primaire antistofoplossing toe om hCO-secties te dekken. Incubeer de primaire antistof 's nachts bij 4 °C of 3 uur bij 37 °C. Was de slides 3 keer gedurende 5 minuten elk in een Coplin Jar gevuld met PBS-T op kamertemperatuur.
  5. Bereid een secundaire antistofkleuringsoplossing voor in blokkerende buffer, inclusief DAPI of een andere pan-nucleaire marker. Voeg voldoende secundaire antistofkleuringsoplossing toe om hCO-secties te bedekken. Incubeer 1 uur beschermd tegen licht bij kamertemperatuur.
  6. Wash slides 3 keer gedurende 5 minuten in een Coplin Jar gevuld met PBS-T op kamertemperatuur. Bevestig met een dekmantel met het gewenste bevestigingsmedium.

6. Kwantificering van nucleaire colocalisatie met CardioCount

OPMERKING: CardioCount is een op diep leer gebaseerde methode om CM-kernen te scoren op basis van microscopiebeelden40. Oorspronkelijk ontwikkeld om de cyclus van CM te beoordelen, presteert CardioCount goed voor meerdere nucleaire kleuringen, waaronder TUNEL40.

  1. Om CardioCount te gebruiken, download je het CardioCount-pakket van GitHub of importeer je het in Google Colab (https://github.com/karraresearchgroup/CardioCount.git, https://drive.google.com/file/d/13iwp9JoHPhs2ONSFkZTGxbEXCGwBFVYx/, https://drive.google.com/drive/folders/1-f9h7MvCBsiCngJnV8-f_lplAJpUeeE3). CardioCount versie 1 draait op een Python 3-omgeving.
  2. Exporteer afbeeldingen voor kwantificering als individuele 512 x 512 pixel .tif bestanden met samengevoegde rode, blauwe en groene kanalen, waarbij het rode kanaal een CM-nucleaire marker is, blauw een algemene nucleaire marker en groen een cyclerende nucleaire marker (d.w.z. Ki67) of apoptotische marker (d.w.z. TUNEL). Maak een oudermap aan in Google Drive voor dit experiment en upload samengevoegde tiffs als submap.
    OPMERKING: CardioCount is getraind op nucleaire kleuringen die de kern vullen. Cyclingmarkers die meer puntig zijn, zoals Aurora B of PH3, zijn mogelijk niet compatibel met CardioCount.
  3. Open CardioCount Notebook in Google CoLab. Voer Cell 1.1 uit om te controleren op toegang tot de grafische verwerkingsunit (GPU). Start Cell 1.2 om CoLab Notebook te verbinden met Google Drive.
  4. Start Cell 1.3 om CardioCount en afhankelijkheden in Google Collaboration te laden. Bewerk kfile om de padnaam te lezen naar de plek waar de PRODUCTION_LVADMLPaper_Colab_Libraries-map was opgeslagen bij het downloaden.
  5. In Cell 2.0 bewerk base_folder om de padnaam te lezen naar de oudermap die de submap met te analyseren afbeeldingen bevat. Voer Cell 2.0 uit om deze map te koppelen aan CoLab.
  6. In Cell 2.1.1 bewerk orig_image_folder om de naam van de map met afbeeldingen voor analyse te matchen. Bewerk channel_to_remove om groen te lezen en bewerk new_image_folder om de submap onder base_folder te benoemen waar alle afbeeldingen met het groene kanaal verwijderd (rood/blauw) worden opgeslagen. Herhaal deze stap om het rode kanaal te verwijderen, waarbij je new_image_folder bewerkt om de submap met afbeeldingen te onderscheiden waarvan het rode kanaal is verwijderd (groen/blauw).
  7. In cel 2.1.2 snijd je afbeeldingen bij tot 512 x 512 afbeeldingen voor de rode/blauwe afbeeldingen. Zorg ervoor dat de uncropped_image_folder overeenkomt met de new_image_folder naam die in stap 6.6 is aangemaakt. Voor rode/blauwe afbeeldingen. Geef destination_image_folder een naam om de submap aan te duiden waar bijgesneden, rood/blauwe afbeeldingen worden opgeslagen. Herhaal deze stap om de groene/blauwe afbeeldingen bij te snijden. Herhaal deze stap tenslotte om de oorspronkelijke 3-kanaals, samengevoegde tiffs in base_folder te croppen.
  8. Voer cel 2.2 uit om waarschijnlijkheidskaarten te genereren. De naam data_specific_folder de naam van de rode/blauwe en groene/blauwe afbeeldingen die in destination_image_folder worden gegenereerd vanuit cel 2.1.2. Voer voor model_dir het bestandspad in naar een map die segmentatiemodellen bevat. Om rode kernen te segmenteren, gebruik je model erg_rb_opt en voer je 200 in voor het epoch. Hernoem probmap_directory_name om de map aan te duiden waar rode/blauwe waarschijnlijkheidskaarten worden opgeslagen. Herhaal deze stap voor groene/blauwe afbeeldingen. Om groene kernen te segmenteren, gebruik je model edu_mouse_bg_opt en voer je 100 in voor het epoch.
  9. In cel 2.3.1 worden objectkaarten gemaakt op basis van de waarschijnlijkheidskaarten die in stap 6.8 zijn gegenereerd. De input_folder wordt genoemd naar de destination_image_folder uit cel 2.1.2 die rood/blauwe waarschijnlijkheidskaartafbeeldingen bevat die in cel 2.1.2 zijn gegenereerd. Noem de output_folder waar rood/blauwe afbeeldingen met drempelwaarde worden opgeslagen. Stel drempel in voor betrouwbaarheidsniveau voor nucleaire segmentatie (bereik van 0,0-1,0). Start cel 2.3.1. Herhaal deze stap voor groene/blauwe afbeeldingen.
    OPMERKING: Drempels voor het betrouwbaarheidsniveau over kernen zijn afhankelijk van de dataset. Begin met een drempel van 0,9 en pas hoger aan als je te soepel bent en lager als je te streng bent, gebaseerd op willekeurige inspectie van kanskaarten.
  10. In cel 2.3.2 wordt het aantal cellen in objectkaarten dat in stap 6.10 is gegenereerd, geteld en geëxporteerd naar een .csv bestand. De count_folder wordt vernoemd naar de output_folder uit cel 2.3.1 waar rood/blauwe afbeeldingen met drempelwaarde worden opgeslagen. Om objecten die de rand van een afbeelding raken uit te sluiten, zorg ervoor dat ignore_border_cells True leest. Hernoem csv_path naar de padnaam van de base_folder waarin alle submappen worden opgeslagen. Bewerk de csv-naam om de tellingen voor rode/blauwe objecten weer te geven. Herhaal deze stap voor blauwe/groene afbeeldingen.
  11. In cel 2.4 worden groene/rode dubbelpositieve kernen geteld. Hernoem img_folder naar de naam van de submap die in stap 6.8 is gegenereerd en die bijgesneden, 3-kanaals afbeeldingen bevat. Hernoem childcell_folder naar de output_folder van cel 2.3.1 waar rood/blauwe afbeeldingen met drempels worden opgeslagen. Hernoem parentcell_folder naar de output_folder vanuit cel 2.3.1 waar groene/blauwe afbeeldingen met drempelwaarde worden opgeslagen. Hernoem dest_folder om de map aan te duiden waar dubbele positieve objectkaarten worden opgeslagen. Hernoem csv_path om de padnaam en bestandsnaam aan te wijzen op de base_folder waar alle submappen zijn opgeslagen en bewerk de csv-naam om de tellingen voor dubbel positieve objecten weer te geven.
  12. Controleer nauwkeurige segmentatie door de rode, groene en dubbele positieve tellingen per afbeelding te vergelijken met de ruwe afbeelding.
    1. Als CardioCount consequent het aantal kernen in een afbeelding overschat ten opzichte van wat een geblindeerde reviewer zou tellen, herhaal dan stap 6.9 met een hogere betrouwbaarheidsdrempel, en herhaal stappen 6.10-6.11. Als CardioCount het aantal kernen in een afbeelding onderschat ten opzichte van wat een geblindeerde beoordelaar zou tellen, herhaal dan stap 6.9 met een lagere betrouwbaarheidsdrempel en stap 6.10-6.11.
  13. Tel alle tellingen op voor elke hCO voor rode kernen, groene kernen en dubbel positieve kernen. Bereken % cyclische kernen als (dubbel-positieve kernen / totaal rood CM-kernen) x 100 voor elke organoïde.

7. Hypoxie-reoxygenatieschade

  1. Bereid hypoxie-media voor (119 mM NaCl, 12 mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4, 1,3 mM MgSO4, 0,5 mM MgCl2, 0,9 mM CaCl2, 20 mM natriumlactaat en 5 mM HEPES, pH = 6,4)5.
  2. Naar een celkweekkolf, breng 5 ml hypoxie-medium over per 96-well hCO-plaat. Plaats de celkweekfles in de hypoxiekamer en spoel 3 minuten met anoxisch gas (5% CO2, 95% N2). Incubeer bij 37 °C gedurende minstens 1 uur voordat je hypoxie start.
  3. Verwijder alle media uit hCO's. Begin met het verwijderen van ~150 μL met een multikanaals pipet uit alle putten. Gebruik vervolgens een 200 μL pipet om het resterende medium voorzichtig uit individuele putten te verwijderen, zonder de hCO's te verstoren.
    OPMERKING: Het verwijderen van alle media uit alle putten is cruciaal om reproduceerbare schade te bereiken.
  4. Voeg 50 μL hypoxie-medium toe aan elke put. Plaats de hCO-plaat in de hypoxiekamer en spoel 3 minuten met anoxisch gas (5% CO2, 95% N2). Plaats de hypoxiekamer in de broedmachine op 37 °C gedurende 6 uur.
  5. Om de reoxygenatie te starten, verwijder je hCO's uit de hypoxiekamer en voed je met 150 μL voorverwarmde RB+ media. Laat minstens 3 uur reoxygenatie toe bij 37 °C voordat je stroomafwaarts assays uitvoert.

8. Lactaatdehydrogenase-afgiftetest

  1. Verzamel 20 μL media uit putten met gewonde en niet-beschadigde hCO's op het gewenste tijdstip na het starten van reperfusie. Verdun 1:10 in 180 μL LDH-opslagbuffer (200 mM Tris-HCl (pH 7,3), 10% glycerol, 1% BSA). Bewaar op -20 °C tot het klaar is om de test uit te voeren. Pipetteer meerdere keren op en neer om het medium te mengen voordat je het verzamelt.
  2. Ontdooi bevroren media. Voeg 45 μL LDH-opslagbuffer toe aan één put van een zwartwand, een transparante 96-put plaat voor elk mediamonster dat geanalyseerd moet worden. Voeg 5 μL van 1:10 verdund medium toe aan elke put voor een uiteindelijke verdunning van 1:100. Bereid LDH detectiereagens voor door 50 μL LDH Detectieenzymmengsel en 0,25 μL reductasesubstraat te mengen voor elk monster dat wordt geanalyseerd.
  3. Voeg 50 μL LDH-detectiereagens toe aan elke put met 1:100 verdund media. Incubeer 60 minuten op kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Test op bioluminescente signaal op een compatibele plaatlezer.

9. Calciumbeeldvorming

  1. Maak een calciumkleurstofkleuringsoplossing met fenolroodvrij RPMI-1640, 0,04% pluronic en 5 μM Cal520-AM. Bescherm monsters tegen licht.
  2. Verwijder 100 μL medium uit elke put die bedoeld is voor calciumbeeldvorming. Voeg 100 μL calciumkleurstofkleuringsoplossing toe en incubeer bij 37 °C, beschermd tegen licht, gedurende 30 minuten.
  3. Verwijder 100 μL medium uit elke put met calciumkleurstof en vervang door 100 μL fenol roodvrije RPMI-1640. Incubeer 30 minuten tot 1 uur op 37 °C om de verf te laten wegspoelen.
  4. Met een microscoop met continue beeldvorming/streaming capaciteit plaats je de 96-wells ultra-low bevestigingsplaat in de werkpositie. Met een 10x doel identificeer je de basis van een hCO en let op Cal520-transiënten.
  5. Leg 30 seconden opnames vast van calciumtransiënten bij kamertemperatuur. Bij gebruik van een confocale microscoop is het niet mogelijk om door de hele hCO te beelden. Kies een focale vlak nabij de basis van de hCO, waar celcontouren zichtbaar zijn tijdens calciumtransiënten.

10. Calciumtransiënt analyse (Figuur 3)

  1. Calciumtransiënte analyse kan worden uitgevoerd met verschillende piekanalysesoftware. Hieronder staan instructies voor analyse met de Spiky ImageJ plugin41 (https://pccv.univ-tours.fr/ImageJ/Spiky/).
  2. Voeg vijf interessegebieden van 2 x 2 pixels (ROI's) toe aan de ROI Manager over zichtbare cellen in elke hCO. Let erop dat ROI's niet overlappen met celkernen of celgrenzen, omdat beweging van de hCO de transiënte analyse kan beïnvloeden.
  3. Selecteer onder Analyseren > Set Metingen Gemiddelde Grijze Intensiteit. Selecteer in ROI manager Multi-Measure om de gemiddelde grijsintensiteit vast te leggen bij alle ROI's en alle frames van de opname.
  4. Bewaar een .csv bestand met de Mean Gray Intensity voor alle ROIs. Bewaar alle ROI-posities voor elke afbeelding voor latere referentie.
  5. Voeg in een nieuwe spreadsheet een kolom toe voor Tijd(en). Bereken de tijd per frame door de 30 frames te delen door het totale aantal frames en vervolgens te vermenigvuldigen met het framenummer. Bewaar dit als een bewerkte .csv.
  6. Open het bewerkte .csv-bestand in Fiji en open de Spiky Plugin. Selecteer onder Analyseopties de gewenste analyseparameters.
  7. Plottijd(en) op de X-as, en gemiddelde grijsintensiteit voor ROI #1 op de Y-as. Selecteer Pieken analyseren en bevestig de correcte annotatie van de basislijn, piekbegin/-einde en piekamplitude. Als het verkeerde aantal pieken wordt geïdentificeerd, verander parameters in Analyseopties, inclusief minimale piekamplitude vanaf de basislijn, en start de piekdrempel totdat piekidentificatie succesvol is.
  8. Sla alle tussenbestanden op. Beats per minuut (bpm) kunnen worden berekend door 60 te delen door het gemiddelde van het piek-tot-piekinterval(s) voor elke ROI.
  9. Herhaal bovenstaande analyse voor alle ROI's per hCO.

figure-protocol-3
Figuur 3: Calciumtransiënt analyse. (A) Het rode vakje geeft de knop aan die het dropdownmenu opent voor het kiezen van analyseparameters. (B) Het rode vakje geeft de knop aan om Tijd(s) versus Gemiddelde Grijsintensiteit uit te zetten vanuit een ROI binnen een vertegenwoordigende ongedeerde hCO. (C) Het rode vakje geeft de knop aan om piekanalyse te selecteren. (D) Representatieve calcium-transient-trace en piekanalyse van een niet-beschadigde hCO. Rode driehoeken geven het maximale maximum aan, roze vierkanten geven de maximale helling voor de piek op- en neerwaartse slag, groen vakje geeft het begin van de piek aan en het blauwe vakje geeft de basislijn aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het volgen van het bovenstaande protocol zou goed gevormde hCO's moeten opleveren die beginnen te kloppen tussen differentiatiedagen 7-12 (D7-12). Naarmate hCO's na dag 25 rijpen, is het mogelijk dat spontane weeën niet meer zichtbaar zijn zonder elektrische stimulatie. H/R-letsel kan op elk moment worden uitgevoerd nadat hCO's beginnen te slaan - we doen een blessure meestal bij 15 dagen oude (D15) hCO's of later.

Bevestiging van verwonding

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wordt een stapsgewijs protocol gepresenteerd voor het genereren en beschadigen van zelf-assemblerende hCO's met H/R. Ischemische hartziekten worden gekenmerkt door pathofysiologische remodellering, waaronder cardiomyocytsterfte, fibrotische remodellering, elektrische disfunctie en functionele achteruitgang. Deze verstoringen worden waargenomen in het hCO-modelsysteem, waaronder verhoogde TUNEL+ CM's, een toename van LDH-afgifte, een toename van het Vimentin+- w...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen enkele

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk wordt ondersteund door R01 HL157277 (RK), AHA 24PRE1186062 (LP), F30 HL175908-01 (LP) en het Duke University Medical Scientist Training programma T32 5T32GM145449-03 (LP).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Accutase oplossingSigma-AldrichA6964-500ML
Anti-Cardiac Troponin T antilichaamAbcamEPR20266
B-27 Supplement (50X), serumvrijGibco17504044
B-27 Supplement, minus insulineGibcoA1895602
BioTek Synergy Neo2 Plate ReaderBioTek
Cal-520, AMAAT Bioquest21131
CardioCount V1Karra LabPMID: 38984052
Cellijn (Homo sapiens, man)- DU11 iPSC LijnDuke University Stem Cell Core
Gelaaide microscoopglaasjes, wit glasVWR89500-496
CHIR 99021Tocris4423
CloneRSTEMCELL Technologies5888
Corning 96-Well Clear Ultra Low Attachment MicroplatesFisher7007
Beschikbare pipettenreservoirsVWR89094-678
DMEM/F-12, HEPESGibco11330057
EVOS Fluorescerende MicroscoopEVOS
Geltrex Reduced-Growth Factor Basement-Membrane Matrix, LDEV-vrij, stamcel gekwalificeerdGibcoA1413302
Human Activin A Recombinant EiwitPEPROTECH INC/Life Technologies120-14E-50UG
IWP-2STEMCELL Technologies72124
L-Ascorbinezuur (Kristallijn/Gecertificeerd ACS)Fisher ScientificA61-100
Muis anti-VimentinDSHBAMF-17b
mTeSR PlusSTEMCELL Technologies100-0276
Multiwell Cell Cultuur Platen – 12 wellVWR10062-894
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443
ReLeSRSTEMCELL Technologies100-0483
RPMI 1640 MediumGibco11875119
RPMI 1640 Medium, geen fenolroodGibco11835-030
ThiazovivinSTEMCELL Technologies72254
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSAKURA FINETEK USA INC (VWR)25608-930
Zeiss Spinning Disk Confocal MicroscoopZeiss

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bozkurt, B., et al. Heart failure epidemiology and outcomes statistics: A report of the Heart Failure Society of America. J Card Fail. 29 (10), 1412-1451 (2023).
  2. Groenewegen, A., Rutten, F. H., Mosterd, A., Hoes, A. W. Epidemiology of heart failure. Eur J Heart Fail. 22 (8), 1342-1356 (2020).
  3. Ss, M., et al. 2025 heart disease and stroke statistics: A report of us and global data from the american heart association. Circulation. 151 (8), e41-e660 (2025).
  4. Sebastião, M. J., et al. Bioreactor-based 3d human myocardial ischemia/reperfusion in vitro model: A novel tool to unveil key paracrine factors upon acute myocardial infarction. Transl Res. 215, 57-74 (2020).
  5. Chen, T., Vunjak-Novakovic, G. Human tissue-engineered model of myocardial ischemia-reperfusion injury. Tissue Eng Part A. 25 (9-10), 711-724 (2019).
  6. Frangogiannis, N. G. Why animal model studies are lost in translation. J Cardiovasc Aging. 2 (2), 22(2022).
  7. Forrest, M. J., et al. Torcetrapib-induced blood pressure elevation is independent of cetp inhibition and is accompanied by increased circulating levels of aldosterone. Br J Pharmacol. 154 (7), 1465-1473 (2008).
  8. Barter, P. J., et al. Effects of torcetrapib in patients at high risk for coronary events. New Engl J Med. 357 (21), 2109-2122 (2007).
  9. Wilensky, R. L., et al. Inhibition of lipoprotein-associated phospholipase a2 reduces complex coronary atherosclerotic plaque development. Nat Med. 14 (10), 1059-1066 (2008).
  10. Investigators, T. S. Darapladib for preventing ischemic events in stable coronary heart disease. New Engl J Med. 370 (18), 1702-1711 (2014).
  11. Debenedittis, P., et al. Coupled myovascular expansion directs cardiac growth and regeneration. Development. 149 (18), dev200654(2022).
  12. Hojo, Y., et al. Expression of vascular endothelial growth factor in patients with acute myocardial infarction. J Am College Cardiol. 35 (4), 968-973 (2000).
  13. Lodrini, A. M., et al. Modeling cardiac injury using human cardiac slices to test therapeutic approaches for cardiac regeneration and repair. Eur Heart J. 44 (Supplement_2), ehad655.730(2023).
  14. Arstall, M. A., et al. Human ventricular myocytes in vitro exhibit both early and delayed preconditioning responses to simulated ischemia. J Mol Cell Cardiol. 30 (5), 1019-1025 (1998).
  15. Chen, I. Y., Matsa, E., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells: At the heart of cardiovascular precision medicine. Nat Rev. Cardiol. 13 (6), 333-349 (2016).
  16. Narsinh, N., Narsinh, K. H., Wu, J. C. Derivation of human induced pluripotent stem cells for cardiovascular disease modeling. Circ Res. 108 (9), 1146-1156 (2011).
  17. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22 (14), 1991-2002 (2013).
  18. Lyra-Leite, D. M., Fonoudi, H., Gharib, M., Burridge, P. W. An updated protocol for the cost-effective and weekend-free culture of human induced pluripotent stem cells. STAR Protoc. 2 (1), 100213(2021).
  19. Lyra-Leite, D. M., et al. A review of protocols for human ipsc culture, cardiac differentiation, subtype-specification, maturation, and direct reprogramming. STAR Protoc. 3 (3), 101560(2022).
  20. Hofbauer, P., Jahnel, S. M., Mendjan, S. In vitro models of the human heart. Development. 148 (16), dev199672(2021).
  21. Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nat Commun. 8 (1), 1825(2017).
  22. Baar, K., et al. Self-organization of rat cardiac cells into contractile 3-d cardiac tissue. Faseb J. 19 (2), 275-277 (2005).
  23. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  24. Kahn-Krell, A., et al. A three-dimensional culture system for generating cardiac spheroids composed of cardiomyocytes, endothelial cells, smooth-muscle cells, and cardiac fibroblasts derived from human induced-pluripotent stem cells. Front Bioeng Biotechnol. 10, 908848(2022).
  25. Lewis-Israeli, Y. R., Volmert, B. D., Gabalski, M. A., Huang, A. R., Aguirre, A. Generating self-assembling human heart organoids derived from pluripotent stem cells. J Vis Exp. (175), e63097(2021).
  26. Lewis-Israeli, Y. R., et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nat Commun. 12 (1), 5142(2021).
  27. Jackman, C. P., et al. Engineered cardiac tissue patch maintains structural and electrical properties after epicardial implantation. Biomaterials. 159, 48-58 (2018).
  28. Deluca, S., et al. Engineered cardiac tissues as a platform for crispr-based mitogen discovery. Adv Healthc Mater. 14 (1), e2402201(2025).
  29. Hofbauer, P., et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 184 (12), 3299-3317.e22 (2021).
  30. Schmidt, C., et al. Multi-chamber cardioids unravel human heart development and cardiac defects. Biorxiv. , (2022).
  31. Hoang, P., et al. Engineering spatial-organized cardiac organoids for developmental toxicity testing. Stem Cell Rep. 16 (5), 1228-1244 (2021).
  32. Richards, D. J., et al. Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity. Nat Biomed Eng. 4 (4), 446-462 (2020).
  33. Abdallah, H., Toomey, K., O'riordan, A. C., Davidson, A., Marks, L. A. Familial occurrence of discrete subaortic membrane. Pediatr Cardiol. 15 (4), 198-200 (1994).
  34. Lin, H., McBride, K. L., Garg, V., Zhao, M. T. Decoding genetics of congenital heart disease using patient-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs). Front Cell Dev Biol. 9, 630069(2021).
  35. Keung, W., et al. Human cardiac ventricular-like organoid chambers and tissue strips from pluripotent stem cells as a two-tiered assay for inotropic responses. Clin Pharmacol Ther. 106 (2), 402-414 (2019).
  36. Kupfer, M. E., et al. In situ expansion, differentiation, and electromechanical coupling of human cardiac muscle in a 3d bioprinted, chambered organoid. Circ Res. 127 (2), 207-224 (2020).
  37. Marini, V., et al. Long-term culture of patient-derived cardiac organoids recapitulated duchenne muscular dystrophy cardiomyopathy and disease progression. Front Cell Dev Biol. 10, 878311(2022).
  38. Mills, R. J., et al. Drug screening in human psc-cardiac organoids identifies pro-proliferative compounds acting via the mevalonate pathway. Cell Stem Cell. 24 (6), 895-907.e6 (2019).
  39. Mills, R. J., et al. Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (40), E8372-E8381 (2017).
  40. Karpurapu, A., et al. Deep learning resolves myocardial dynamics in the failing human heart. JACC Basic Transl Sci. 9 (5), 674-686 (2024).
  41. Pasqualin, C., et al. Spiky: An imagej plugin for data analysis of functional cardiac and cardiomyocyte studies. J Imaging. 8 (4), 95(2022).
  42. Kuppe, C., et al. Spatial multi-omic map of human myocardial infarction. Nature. 608, 7924(2022).
  43. Karra, R., et al. Vegfaa instructs cardiac muscle hyperplasia in adult zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (35), 8805-8810 (2018).
  44. Ab, A., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. J CliniInvest. 124 (3), 1382-1392 (2014).
  45. Lai, S. L., et al. Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration. Elife. 6, e25605(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Hypoxia ReoxygenationCardiac OrganoidsHuman CardioidsIschemia ReperfusioniPSC Derived OrganoidsSuspension CultureCryosectioningFluorescence MicroscopyScar FormationCardiomyocyte Apoptosis

Gerelateerde artikelen