Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Meting van stikstofmonoxideproductie in muizen-tracheale epitheelcelculturen, onderscheiden aan de lucht-vloeistofgrens

131 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70311

⸱

3 juli 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Maryland School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een methode om de productie van stikstofoxide (NO) te kwantificeren in luchtwegepitelculturen die gedifferentieerd zijn bij het lucht-vloeistofinterface (ALI) door nitriet te meten in apicale secreties met behulp van een trijodide-gebaseerde chemiluminescentie-assay.

Samenvatting

Luchtwegepitheelculturen, gedifferentieerd aan het lucht-vloeistofinterface (ALI), bieden een fysiologisch relevant model om stikstofoxide (NO) signalering in gecilieerde cellen te bestuderen. Hier beschrijven we een protocol om de productie van NO te kwantificeren door nitriet (NO₂⁻), een stabiel oxidatieproduct van NO, te meten in monsters verzameld van ALI-gedifferentieerde muizen-tracheale epitheelcellen. Apicale washes, basale media en cellysaten worden verzameld en geanalyseerd met behulp van een triiodide-gebaseerde chemiluminescentietest gekoppeld aan een stikstofoxide-analyzer (NOA). Bij injectie in het reactievat wordt nitriet chemisch gereduceerd tot NO, wat wordt gedetecteerd door ozongebaseerde chemiluminescentie. De signaalintensiteit wordt gekwantificeerd en omgezet in picomole van nitriet met behulp van een standaard kalibratiecurve, en waarden worden genormaliseerd tot de totale celproteïne-inhoud. De assayprestaties worden gevalideerd met farmacologische modulatie van NO-niveaus. Na behandeling met de NO-donor Diethylenetriamine NONOate (DETA-NONOate) en de NO-synthase-remmer N(ω)-Nitro-L-arginine methylester (L-NAME) observeren we significante verschillen in nitrietniveaus tussen aandoeningen. Het meest robuuste en reproduceerbare signaal wordt waargenomen in apicale washes, overeenkomend met de hoeveelheid NO die vrijkomt uit het luchtwegepitel. Deze methode detecteert NO betrouwbaar in monsters van ALI-gedifferentieerde luchtwegepitheel, waardoor een nauwkeurig in vitro platform wordt geboden om NO-productie te kwantificeren en ziekten te modelleren die geassocieerd zijn met abnormale NO-metabolisme.

Inleiding

Een kenmerk van verschillende luchtwegaandoeningen, waaronder astma, chronisch obstructieve longziekte (COPD), cystische fibrose (CF) en primaire ciliaire dyskinesie (PCD), is veranderde homeostase van stikstofmonoxide (NO), meetbaar als veranderingen in uitgeademde NO-niveaus, die sterk kunnen variëren bij deze ziekten, met verhoogde bij COPD en astma 1,2, terwijl het drastisch verminderd is bij CF en PCD3. 4. Deze ziekten vertonen vaak afwijkingen in luchtwegepitel, beweeglijke cilia, de belangrijkste effecten van mucociliaire clearance5. Omdat NO en de downstream signaalroutes cruciale regulatoren zijn van ciliaire motiliteit, is het essentieel om te begrijpen hoe NO-productie en signaaloverdracht in deze contexten worden veranderd om mechanismen van mucociliaire disfunctie te verduidelijken. Daarom biedt een methode die nauwkeurige detectie van NO productie en afgifte in luchtwegepitel mogelijk maakt, een waardevol hulpmiddel om de regulatie en fysiologische rol van dit signaalmolecuul te analyseren. Dergelijke benaderingen zijn vooral nuttig in experimentele omgevingen waar directe meting van NO uitdagend is vanwege de korte halfwaardetijd en snelle reactiviteit.

NO reguleert de biogenese en functie van de cilia in de luchtwegen door invloed te hebben op de polariteit van ciliatiecellen en het gecoördineerde kloppen van beweeglijke cilia 6,7,8. De mechanismen die echter GEEN homeostase in de luchtwegen in stand houden, zijn nog steeds onvolledig begrepen. Luchtwegepitheelculturen, gedifferentieerd aan de lucht-vloeistofinterface (ALI), bieden een waardevol in vitro-systeem voor het onderzoeken van deze mechanismen. Momenteel wordt dit model veel gebruikt om de impact van milieuschade op het luchtwegepitel 9,10,11 te bestuderen en om de pathofysiologie van luchtwegaandoeningen te verduidelijken 12. In vergelijking met conventionele ondergedompelde culturen13,14 reproduceren ALI-gedifferentieerde epitheel de architectuur en functie van de natuurlijke luchtweg nauwkeuriger, waaronder epitheelpolarisatie, mucociliaire differentiatie en realistische gas-vloeistofuitwisseling, waardoor ze bijzonder geschikt zijn voor het bestuderen van apikale NO-afgifte, signaaloverdracht en gerelateerde ciliaire functie. Dit systeem is daarom zeer geschikt voor experimenten die gericht zijn op het kwantificeren van NO-afgeleide metabolieten die in de luchtweglumen worden vrijgegeven, met name onder omstandigheden van epitheeldifferentiatie of farmacologische manipulatie.

Nauwkeurige meting van de NO-concentratie is essentieel, aangezien zowel te hoge als tekortschieten van NO-niveaus de ciliaire functie kunnen verstoren. Momenteel zijn fluorescente-probe-gebaseerde methoden (bijv. diaminofluoresceinen, DAFs) beschikbaar voor het detecteren van NO slechts semi-kwantitatief en worden ze beperkt door pH-gevoeligheid, zuurstofafhankelijkheid en gebrek aan specificiteit, omdat ze kunnen reageren met cellulaire oxidanten en antioxidanten, wat resulteert in semi-kwantitatieve metingen15. Daarnaast maken elektrochemische sensoren (bijv. NO-gevoelige amperometrische elektroden) realtime detectie van NO16 mogelijk, maar kunnen ze moeilijk te implementeren zijn in complexe biologische systemen vanwege NO korte halveringstijd, interferentie door redoxactieve soorten biofouling van het elektrodeoppervlak en uitdagingen bij het behouden van stabiele kalibratie17. Alternatieve chemiluminescentie-gebaseerde benaderingen, waaronder directe gasfase NO-detectie en reductieve assays gericht op verschillende stikstofoxidesoorten, zijn ook beschreven, maar hun toepassing op luchtwegepitelculturen blijft onontplooid. Deze beperkingen benadrukken de noodzaak van gevoelige, kwantitatieve methoden die betrouwbare lage niveaus van NO-afgeleide soorten in kleine biologische monsters kunnen detecteren. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we een protocol opgezet om NO te kwantificeren in apicale secreties verzameld uit ALI-gedifferentieerde luchtwegepitel met behulp van een stikstofoxide-analyzer (NOA). De NOA is een zeer gevoelige chemiluminescentie-gebaseerde detector die traditioneel wordt gebruikt om GEEN metabolieten in chemische monsters te meten en recentelijk is aangepast voor de analyse van biologische monsters, waaronder bloed, weefselhomogenaten en celkweeksupernatanten 7,18,19. NO is een zeer reactief signaalmolecuul dat snel oxideert tot nitriet in weefsels onder normale zuurstofniveaus, met een uitzonderlijk korte halveringstijd. Nitriet als eindproduct van NO-oxidatie dient dus als indicator van totale NO-productie in biologische systemen 20,21,22. Deze gevoelige en reproduceerbare chemiluminescentiemethode maakt het mogelijk nitriet/NO te detecteren op picomolaire niveaus23,24, waardoor het ideaal is voor het meten van kleine veranderingen in laagvolume-biologische monsters, zoals afkomstig van MTEC ALI-culturen. Deze aanpak is echter het beste geschikt voor omstandigheden waarin nitrietophoping de recente NO-productie weerspiegelt en kan worden beïnvloed door factoren zoals monsterbehandeling, achtergrondnitrietvervuiling en de epitheeldifferentiatietoestand. Daarom zijn passende controles en zorgvuldig experimenteel ontwerp nodig om een nauwkeurige interpretatie van de resultaten te waarborgen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierprocedures werden beoordeeld en goedgekeurd door de University of Maryland Institutional Animal Care and Use Committee (Protocol # AUP–00004632).

OPMERKING: Het protocol vereist ongeveer 2 dagen voor isolatie van muizen-tracheale epitheelcellen (MTEC), gevolgd door 7–10 dagen voor expansie, 5–6 dagen voor proliferatie in transwell-inserts, 21 dagen voor differentiatie (tijd nodig om voldoende multi-ciliated cellen te verkrijgen), 24 uur medicamenteuze behandeling en één extra dag voor monsterafname, NOA-kalibratie. injecties en data-acquisitie.

1. Voorbereiding van media en oplossingen

OPMERKING: Zie Tabel 1 voor details over media-ingrediënten.

  1. Ham's F–12 media
    1. Bereid de oplossing voor in een steriele laminaire stroomkap. Voeg 5 ml 100× penicilline/streptomycine antibiotica en 0,5 ml amfoterine B (fungizone) toe aan 500 ml Ham's F12-medium in een steriele fles.
    2. Meng door de fles voorzichtig 5–10 keer om te draaien om een volledige menging te garanderen. Filter de oplossing met een 0,22 μm filter onder steriele omstandigheden en bewaar bij 4 °C.
      VOORZICHTIG: Penicilline/streptomycine en amphotericine B zijn antimicrobiële middelen die irritatie of allergische reacties kunnen veroorzaken. Behandel met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder handschoenen en een labjas.
  2. Pronase-oplossing
    1. Voeg 15 mg pronase toe aan 10 mL steriel Ham's F12-medium in een steriele buis om 0,15% pronaseoplossing te verkrijgen. Meng door voorzichtig om te keren of te pipetten tot de pronase volledig is opgelost. Bereid direct vers voor gebruik.
  3. DNase I-oplossing
    1. Voeg 5 mg ruwe pancreas-DNase I toe aan 9 ml Ham's F12-medium en 1 ml 10 mg/mL rundere-serumalbumine (BSA)-oplossing in een steriele buis om een 0,5 mg/mL DNase I-oplossing te verkrijgen.
    2. Meng voorzichtig door op en neer te pipetteren tot de DNase I volledig is opgelost, zodat er geen bubbelvorming ontstaat. Zodra volledig opgelost, aliquot de oplossing in 1 mL steriele microcentrifugebuizen en bewaar je deze bij -20 °C.
  4. Ham's F12 media met foetaal rundereserum (FBS)
    1. Bereid de oplossing op kamertemperatuur voor in een steriele laminaire stromingskap. Voeg 10 ml foetaal rundserum (FBS) toe aan 40 ml Ham's F12-medium met antibiotica in een steriele kegelbuis om 20% FBS in F12-medium te verkrijgen.
    2. Meng voorzichtig door de buis 5–10 keer om te draaien totdat de oplossing homogeen is. Filter de oplossing met een 0,22 μm filter onder steriele omstandigheden en bewaar bij 4 °C.
  5. MTEC-uitbreidingsmedia
    1. Bereid het MTEC-expansiemedium voor bij kamertemperatuur in een steriele laminaire stromingskap door de in Tabel 1 vermelde componenten te combineren in een steriele fles.
    2. Meng grondig door de container voorzichtig te draaien of om te keren totdat alle componenten volledig zijn gemengd. Filter de oplossing met een 0,22 μm filter onder steriele omstandigheden.
    3. Voeg ROCK-remmer Y–27632 (5 mM stockoplossing) toe aan een uiteindelijke concentratie van 10 μM en Notch γ–secretase-remmer DAPT (10 mM stockoplossing) direct voor gebruik aan een eindconcentratie van 5 μM, en meng voorzichtig door inversie.
  6. MTEC-proliferatiemedia
    1. Bereid het MTEC-proliferatiemedium voor bij kamertemperatuur in een steriele laminaire stromingskap door de in Tabel 1 vermelde componenten te combineren.
    2. Meng grondig door zachte omkering of te draaien totdat alle componenten volledig gecombineerd zijn. Filter het medium met een 0,22 μm filter onder steriele omstandigheden.
    3. Voeg direct voor gebruik ROCK-remmer Y–27632 (5 mM voorraadoplossing) toe aan een uiteindelijke concentratie van 10 μM en retinoïnezuur (5 μM voorraadoplossing) aan een eindconcentratie van 0,05 μM. Meng voorzichtig door omkering voor gebruik.
  7. MTEC-differentiatiemedia
    1. Bereid het MTEC-differentiatiemedium voor bij kamertemperatuur in een steriele laminaire stromingskap door de in Tabel 1 vermelde componenten te combineren in een steriele container.
    2. Meng grondig door zachte omkering of te draaien totdat alle componenten volledig gecombineerd zijn. Filter het medium met een 0,22 μm filter onder steriele omstandigheden.
    3. Voeg direct voor gebruik retinoïnezuur toe tot een uiteindelijke concentratie van 0,05 μM en meng voorzichtig door inversie.

2. Isolatie van muizen-tracheale epitheelcellen (MTEC)

  1. Euthanaceer drie volwassen muizen (8–20 weken oud) door kooldioxide (CO2) inademing in een goedgekeurde euthanasiekamer volgens de richtlijnen van de institutionele IACUC. Bevestig de dood vóór weefselafname.
  2. Plaats het dier dorsaal (borst naar boven) op een aseptisch oppervlak. Met schone tangen til je voorzichtig de huid op en knip deze met een chirurgische schaar open van de onderlip tot de buik om de luchtpijp bloot te leggen.
  3. Schuif de speekselklieren opzij en verwijder het bindweefsel en de trachealisspier om de kraakbeenringen bloot te leggen. Ontleed de volledige lengte van de luchtpijp en plaats deze in een petrischaal met steriele Ham's F12 medium. Combineer drie luchtpijpen in één gerecht.
  4. Overbreng het gerecht in een laminaire flow-kap en plaats de luchtpijpen in een ander gerecht met verse Ham's F12 medium. Verwijder eventueel extratracheaal weefsel en snijd de luchtpijp longitudinaal door het lumen.
  5. Breng alle luchtpijpen over in een 50 mL schroefdop conische buis met een steriele 10 mL 0,15% pronase-oplossing. Broeden op 4 °C gedurende 16–18 uur.

3. Celisolatie en initiële uitbreiding

  1. De volgende dag keer je de buis om en de weefsels 10–15 keer om epitheelcellen los te maken en incubeer je 45 minuten bij 4 °C. Stop de pronase-reactie door 10 ml Ham's medium toe te voegen met 20% FBS en meng door 10–15 keer om te keren.
  2. Voeg 10 ml Ham's F12 medium met FBS toe aan drie 15 mL buizen. Met een Pasteur-pipet wordt het tracheale weefsel sequentieel van de 50 mL-buis naar de eerste, tweede en derde 15 mL-buis overgebracht en 10–15 keer in elke buis omgekeer om de tracheale epiteelcellen los te maken. Gooi het weefsel weg na de laatste overdracht.
  3. Combineer het hele medium van de drie 15 mL conische buizen met het medium in de 50 mL buis. Centrifugeer op 360 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verwijder voorzichtig het supernatant en voeg 0,5 mL 0,5 mg/mL DNase I-oplossing toe. Broed 5 minuten op ijs.
  4. Centrifugeer op 360 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder voorzichtig het supernatant en suspendeer de celpellet opnieuw in 7–10 mL MTEC-expansiemedium.

4. Uitbreiding en differentiatie van MTEC

  1. Bereid een collageengecoate T75-celkweekfles voor met 10 mL collageen I (rattenstaart) bij 50 μg/mL en incubeer bij 37 °C gedurende 16–18 uur. Aspiraat de collageenoplossing uit de T75-kolf en was de kolf drie keer met PBS (1×). Laat de kolf volledig drogen.
  2. Zaad de celsuspensie, bestaande uit 7–10 mL MTEC-expansiemedium met de cellen, in de collageengecoate kolf. Plaats de kolf in een broedmachine op 37 °C en 5%CO2. Vervang het expansiemedium elke 2 of 3 dagen en monitor het aantal cellen tot 70% confluentie.
  3. Bij 70% confluentie voeg je 1 mL Accutase-oplossing toe en incubeer je 10–15 minuten bij 37 °C om de celmonolaag los te maken. Sussen de cellen opnieuw in 10 mL MTEC-proliferatiemedium. Centrifugeer op 1057 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Gooi het supernatant weg, suspendeer de cellen opnieuw in het proliferatiemedium en tel de cellen.
  5. Zaad 2 × 105 cellen in 0,5 mL volume per transwell-insert (12 mm membraandiameter, 0,4 μm membraanporiegrootte) voorbekleed met collageen. Voeg 1,5 mL medium toe aan de basale kamer van elke insert en plaats de transwell in de incubator op 37 °C.
  6. Verander het medium in zowel de apicale als basale kamer op dag 3 en laat de cellen 100% confluentie bereiken, meestal op dag 5 of 6. Voeg één inzet zonder cellen toe als controle.
  7. Zodra ze samenvloeien, was je de cellen apix met 0,5 mL MTEC differentiatiemedium. Initieer lucht-vloeistofinterface (ALI) door 0,75 mL differentiatiemedium alleen aan de basale kamer toe te voegen, waarbij de cellen in de apicale kamer blootgesteld blijven aan lucht.
  8. Elke 2–3 dagen spoel je cellen in het apicale oppervlak met differentiatiemedium en vervang je het basale medium. Laat cellen 21 dagen differentiëren bij ALI.

5. Immunolabeling en beeldvorming van trilhaarachtige epitheelcellen

  1. Op ALI-dag 7, 14 en 21 fixeer je de cellen met 4% paraformaldehyde (PFA).
  2. Voer immunolabeling uit van cellen met anti-FoxJ1-antilichaam om FoxJ1 te detecteren, een transcriptiefactor die essentieel is voor beweeglijke ciliogenese25,26, en anti-acetyleerde α–tubuline-antilichamen om acetyleerde α-tubuline te detecteren, een structurele marker van beweeglijke cilia volgens gepubliceerde protocollen 27,28,29.
    VOORZICHTIG: PFA is een gevaarlijke chemische stof, dus draag het juiste PBM (minimaal nitrilhandschoenen en een labjas) bij het vastzetten van de cellen.
  3. Maak beelden van de immunogelabelde cellen met behulp van confocale microscopie met een 40× of 60× objectief. Verzamel Z-stacks met een diepte van 10 μm bij elke stapgrootte van 0,5 μm.
  4. Stel laservermogen, detectorversterking en belichtingsinstellingen in om signaalverzadiging te voorkomen en vergelijkbare opnameparameters te behouden voor verschillende monsters.
  5. Kwantificeer de FoxJ1-positieve of geacetyleerde tubuline-positieve cellen als een percentage van het totale aantal cellen (DAPI-positief) per interessegebied (ROI) met behulp van de celteller-plugin in FIJI-beeldvormingssoftware.
  6. In de GraphPad Prism-software (v. 10.0) genereer men grafieken en voert statistische analyse uit met een tweezijdige Student's t-test na het beoordelen van de dataverdeling op normaliteit met de Shapiro-Wilk test.

6. Medicatiebehandeling van gedifferentieerde luchtwegepiteel

  1. Bereid op ALI-dag 21 differentiëringsmedium voor (3 mL voor cellen in drie inserts) in een steriele buis bij kamertemperatuur.
  2. Voeg 7,5 μL Diethyleentriamine–NONOate of DETA/NO toe uit een 100 mM voorraadoplossing (bereid in 10 mM NaOH) aan het differentiatiemedium om de uiteindelijke concentratie van 250 μM in 3 mL te bereiken. Meng voorzichtig door omkering en gebruik direct.
  3. Voeg 750 μL van de eindoplossing toe aan elk van de drie basale kamers van gedifferentieerde cellen en incubeer 24 uur bij 37 °C.
  4. Bereid 1 mM Nω-Nitro-L-Arginine Methylester (L–NAME) door 30 μL toe te voegen uit de 100 mM L-NAME voorraadoplossing (bereid in DMSO) aan het MTEC-differentiatiemedium voor een totaal volume van 3 mL.
  5. Voeg 750 μL van de eindoplossing toe aan elk van de drie basale kamers en incubeer 24 uur bij 37 °C.
  6. Voeg 30 μL dimethylsulfoxide (alleen DMSO) (onbehandelde groep) toe aan 3 mL basaal medium (1% v/v).
  7. Voeg 750 μL van de eindoplossing toe in de basale kamer van drie inserts (onbehandeld).

7. Monsterverzameling

OPMERKING: Voor NOA-analyse is het noodzakelijk om media, apikale wash en cellysaatmonsters van drie inserts samen te voegen.

  1. Op ALI-dag 22 verzamel je monsters uit de differentiërende luchtwegepiteel, beginnend met 750 μL basaal medium uit elk van de drie inserts per experimentele groep.
  2. Verzamel basaal media dat in inserts zonder cellen wordt geïncubeerd om als blankcontrole te dienen en rekening te houden met mogelijke externe nitrietbesmetting.
  3. Verzamel het basale medium uit drie inserts en bewaar direct bij -20 °C tot injectie in NOA.
  4. Om het nitriet/NO te verzamelen dat aanwezig is in het apicale slijm van het epitheel, voeg je 50 μL voorverwarmde PBS (1×) buffer (steriel, gealiquoteerd en bevroren) toe bovenop de cellen in elke insert en incubeer je 30 minuten bij 37 °C.
    OPMERKING: Tijdens de 30 minuten durende incubatie van cellen met PBS om apicale wash op te vangen, kan PBS ook in de basale kamer worden toegevoegd om hydratatie aan beide zijden van de cellen te behouden.
  5. Verzamel de PBS die het slijm boven het epitheel bevat.
  6. Combineer de PBS-washes van drie inserts om ongeveer 150 μL apicaal slijm/PBS uit elke experimentele conditie te verkrijgen, wat voldoende is voor twee NOA-injecties.
  7. Bewaar de apicale wasmonsters bij -20 °C tot verder gebruik.
  8. Bewaar ook de PBS-wasbuffer voor gebruik als blanke controle tijdens NOA-injecties.
  9. Was de apicale en basale zijde van de cellen in drie inserts met 500 μL voorverwarmde PBS twee keer.
  10. Voeg 500 μL Accutase-oplossing apicaal toe en incubeer 15–20 minuten totdat de cellen volledig loskomen van de membranen.
  11. Zodra het volledig is losgekoppeld, voeg je serumvrij RPMI-1640 medium toe aan de cellen (bij een verhouding van 3:1 medium tot accutase).
  12. Verzamel de losgekoppelde cellen van de drie inserts in één buis.
  13. Draai de cellen op 3000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  14. Sussief de celpellet opnieuw in 50 μL lysisoplossing (RIPA-buffer + Halt 1× proteaseremmercocktail) en incubeer 45 minuten op ijs.
  15. Draai het lysaat op 14.800 × g gedurende 20 minuten bij 4 °C en verzamel supernatant.
  16. Gebruik 3 μL hele cel lysaat om de eiwitconcentratie te bepalen via de Bicinchonininezuur (BCA) test.
  17. Verdun de resterende lysaatoplossing 1:1 in de RIPA-buffer om voldoende volume te maken voor twee 50 μL NOA-injecties.
  18. Bewaar de lysaten bij -80 °C voordat je ze in de NOA injecteert bij -20 °C.
  19. Bewaar de RIPA-buffer die wordt gebruikt om de celpellet opnieuw te suspenderen bij -20 °C om te worden gebruikt als blank en besmettingscontrole voor lysaatmonsters.

8. NOA-kalibratie en monsterinjecties

  1. Bereid trijodide reagens voor door 400 mg kaliumjodide en 250 mg jodium op te lossen in 28 ml glaciale azijnzuur en 8 ml ultrazuiver water.
  2. Voer de trijodide-reagensbereiding uit in een chemische dampkap met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (labjas, handschoenen en oogbescherming).
    VOORZICHTIG: Jodium en glaciaal azijnzuur zijn gevaarlijk en kunnen irritatie en corrosie veroorzaken op huid en ogen.
  3. Bewaren op kamertemperatuur en gebruik binnen 2 weken na voorbereiding.
  4. Maak 1 mM voorraadoplossing van natriumnitriet in nitrietvrij water.
  5. Bewaar de bouillonoplossing op -20 °C tot gebruik.
  6. Bereid verse werkstandaarden (0,125–4,0 μM) voor in PBS direct voor de injecties.
    OPMERKING: Gebruik voor NOA-kalibratie steriele, strak afgesloten PBS om nitrietbesmetting te minimaliseren.
  7. Zet het stikstof (N2) draaggas aan en start de gasstroom door het systeem.
  8. Assembleer het glazen spoelvat en voeg 4 ml triiodide-reagens toe aan het vat met 20 μL antischuim verdund in 1:10.
  9. Sluit het stevig af met een septum dat door de schroefdop op zijn plaats wordt gehouden om een luchtdichte afdichting te garanderen.
  10. Giet 10 ml natriumhydroxide (NaOH) in de NaOH-val.
  11. Selecteer op het displayscherm van het NOA-instrument (nCLD 88) Meting, Selecteer Gas en Bereik.
  12. Stel het instrument in op MR2:50.00, overeenkomend met een meetbereik tussen 0 en 50 delen per miljard NO, en selecteer Fast voor filterinstelling.
  13. Pas de stikstofgasdruk aan totdat de reactordruk stabiliseert tussen 27–29 psi (186–200 kPa).
  14. Open de eDAQ-grafieksoftware op de computer die op de NOA is aangesloten.
  15. Stel het opnamebereik in op 10/s en de spanning op 10 V.
  16. Ga naar Instellen > Kanaalinstellingen, selecteer Kanaal 1.
  17. Stel de displayschaal in op 2:1 in de NOA-software.
  18. Start de gegevensverzameling op het NOA-instrument en in de software.
  19. Houd de basislijn in de gaten totdat deze stabiel is.
  20. Injecteer 10 μL PBS via het septum in het spoelvat met een Hamilton-spuit om de basisstabiliteit te bevestigen.
  21. Neem het chemiluminescente signaal op voor elke injectie.
  22. Injecteer 10 μL van de 0,125 μM nitrietstandaard in het spoelvat.
  23. Herhaal twee keer voor elke nitrietstandaard om dubbele metingen te verkrijgen die later worden gemiddeld.
  24. Noteer elke injectie in het tabblad Reacties (bijv. 10 μL 0,5 μM nitriet).
  25. Veeg de spuit af op een pluisvrij weefsel en spoel 3–4 keer af met steriel nitrietvrij water om overtollig triiodide te verwijderen.
  26. Herhaal deze reinigingsstap na elke injectie.
  27. Laat het signaal tussen injecties (20–30 s) terugkeren naar de basislijn.
  28. Open het venster Flowanalyse .
  29. Bekijk de piekhoogte en tijdwaarden voor elke injectie in de analysetabel.
  30. Markeer elke top en pas de selectie aan om het oppervlak onder de kromme (AUC) te berekenen.
  31. Schakel het scherm van S naar C om de kalibratiemodus in te schakelen.
  32. Voer de bekende nitriethoeveelheden voor elke standaard in de kolom Hoeveelheid .
  33. Klik op de Calibratiecurve-knop om de standaardcurve te genereren.
  34. Controleer of de kalibratiecurve voldoet aan de acceptatiecriteria (R2 ≥ 0,99).
  35. Ontdooi biologische monsters die eerder zijn verzameld van ALI-culturen op ijs.
  36. Injecteer 50 μL blank-celvrij medium in het spoelvat.
  37. Injecteer 50 μL van elk basaal mediamonster in het spoelvat.
  38. Noteer het chemiluminescentiesignaal voor elke injectie.
  39. Voer dubbele injecties uit (50 μL elk) voor elk monster.
    OPMERKING: De injecties van 50 μL zorgen voor frequente bellenvorming. Om dit probleem te beperken, vervang je regelmatig het triiodide-reagens door anti-schuim in het spoelvat.
  40. Annoteer elk voorbeeld in het tabblad Commentaar vóór de injectie.
  41. Injecteer 50 μL celvrije PBS (apikale leeg) in het spoelvat.
  42. Injecteer apicale wash-monsters (twee injecties van 50 μL per monster) en registreer de bijbehorende signaalpieken.
  43. Injecteer de RIPA-buffer twee keer, gevolgd door lysaatmonsters (twee injecties van 50 μL per monster) en registreer de bijbehorende signaalpieken.
    OPMERKING: Laat altijd de chemiluminescente spoor teruggaan naar de basislijn en stabiliseren. Wacht 20–30 seconden en injecteer dan het volgende monster.
  44. Open aan het einde van de monsterinjecties het venster Flowanalyse .
  45. Markeer elke steekproefpiek om het oppervlak onder de curve (AUC) te berekenen.
  46. Bepaal nitrietconcentraties voor elk monster met behulp van de kalibratiecurve die wordt gegenereerd uit standaardoplossingen.

9. Dataverzameling, normalisatie en analyse

  1. Exporteer de gegevens, inclusief piekhoogte (V), oppervlakte onder de curve (V.s) en gemiddelde oppervlakte onder de curve, van de Flow Analysis-functie in de eDAQ-software naar een Excel-bestand. Het geëxporteerde bestand zal de hoogte (V) versus tijd (s) van signaalsporen voor het gehele NOA-experiment tabelleren.
  2. Bepaal de picomole (pmol) nitriet die in de NOA worden geïnjecteerd door de nitrietconcentratie (μM) te vermenigvuldigen met het injectievolume (μL).
  3. Gemiddeld de picomolen (pmol) nitriet gemeten in controles (celvrije media, PBS wash buffer of RIPA buffer).
  4. Trek de overeenkomstige controlewaarden af van de pmol die in elke 50 μL monsterinjectie wordt gemeten.
  5. Bepaal het totale aantal picomolen (pmol) nitriet in elk monster door het gemeten pmol in het geïnjecteerde deel van het monster te vermenigvuldigen met het exacte totale verzamelde monstervolume. Gebruik 750 μL voor het medium, 150 μL voor de apicale wash en ongeveer 90–100 μL voor het lysaat.
  6. Daarnaast vermenigvuldigen we voor alleen lysaten het totale nitrietpmol met 2 om rekening te houden met de verdunningsfactor.
  7. Normaliseer het pmol nitriet dat voor elk monster wordt verkregen door deze waarden te delen door de totale eiwithoeveelheid (μg) aanwezig in het lysaat van het betreffende monster, eerder verkregen via de BCA-assay.
  8. Gemiddeld de nitrietniveaus (pmol/μg) uit dubbele injecties per monster.
  9. Plot genormaliseerde nitrietniveaus (pmol/μg van het totale eiwit) voor elk monster met behulp van GraphPad Prism-software.
  10. Beoordeel de gegevensverdeling op normaliteit met behulp van de Shapiro-Wilk-test.
  11. Voer statistische analyse uit met een tweevoudige Studenten-t-test.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het algemene doel van deze procedure is het kwantificeren van stikstofoxideniveaus (NO) in muizen-tracheale epitheelcel (MTEC)-culturen die gedifferentieerd zijn bij lucht-vloeistofinterface (ALI). Primaire cellen worden geïsoleerd en gedifferentieerd volgens vastgestelde protocollen27,28. Gedurende 21 dagen bij ALI worden de cellen gedifferentieerd tot een pseudogestratificeerd luchtwegepitheel met gehulde cellen

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Multiciliatiecellen binnen het luchtwegepitheel zijn cruciaal voor NO synthese en signaaloverdracht, wat op zijn beurt essentieel is voor het reguleren van ciliaire slag, mucociliaire clearance en de homeostasevan de luchtwegen 6,7,8. NO is een zeer reactief molecuul en zelfs kleine veranderingen in NO-niveaus zijn geassocieerd met luchtwegaandoeningen 1,2,3,4...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs geven geen belangenconflicten aan.

Dankbetuigingen

Wij danken Dr. Mark T. Gladwin (decaan en hoogleraar aan de University of Maryland School of Medicine) voor de begeleiding bij het ontwerpen van de studie. We danken ook de Confocal Microscopy Core (Baltimore, MD) van de University of Maryland School of Medicine voor de toegang tot confocale microscopiebronnen. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het National Institutes of Health (NIH) 5R01HL168775 aan Dr. Paola Corti.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4′,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)ThermoFisher Scientific62248verdund 1:2000 voor immunokleuring
50 mL Centrifuge tube filter (0.22 µm)CellTreat229710Voor de bereiding van steriele oplossingen
500 mL Filter unitsThermoFisher Scientific566-0020Voor steriele media bereiding
AccutaseSigmaA6964
Amphoterecin BThermoFisher Scientific15290026
Bovine Pituitary ExtractThermoFisher Scientific13028014
Bovine Serum AlbuminSigmaA7906
Cholera toxinSigmaC8052
Collagen IThermoFisher ScientificA1048301
Confocal MicroscopeNikonW1 Spinning disk Ti2 inverted microscope met Hamamatsu sCMOS camera
Corning Transwell insertsSigmaCLS3460
Diethylenetriamine NONOate (DETA-NONOate)Cayman Chemical82120
DMEM/F-12 mediaThermoFisher Scientific11330032
DNAse ISigmaDN25
Fetal Bovine SerumSigmaF4135
Halt 1X Protease inhibitor cocktailThermoFisher Scientific1860932
Ham's F1-12 Nutrient mixThermoFisher Scientific11765054
Insulin solutionSigmaI0516
Isoproterenol hydrochlorideSigmaI6504
Keratinocyte Serum-free mediaThermoFisher Scientific17005042
Murine Epidermal growth factorSigmaE4127
N(G)-Nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)SigmaN5751
NuSerumCorning355100
Penicillin-StreptomycinSigmaP4333
Phosphate buffer saline (PBS)ThermoFisher Scientific10010023
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23227
PronaseSigma10165921001
Retinoic acidSigmaR2625
Rho kinase inhibitor (Y-27632 hydrochloride)Cayman ChemicalTOM-C837Z37
RIPA bufferSigmaR0278
RPMI-1640 mediaThermoFisher Scientific11875093
Sodium nitrite SigmaS2252
TransferrinSigmaT8158
α-Acetylated tubulin antibody (muis)SigmaT6793verdund 1:200 voor immunokleuring
α-FoxJ1 antibody (muis)ThermoFisher Scientific14-9965-80verdund 1:200 voor immunokleuring
α-mouseCy3 secondary antibodyThermoFisher ScientificA10521verdund 1:1000 voor immunokleuring
γ-secretase inhibitor IX (DAPT)SigmaD5942

Referenties

  1. Alcázar–Navarrete, B., Ruiz Rodríguez, O., Conde Baena, P, Romero Palacios, P. J., Agusti, A. Persistently elevated exhaled nitric oxide fraction is associated with increased risk of exacerbation in COPD. Eur Respir J. 2018;51(1):1701457.
  2. Krantz, C., Janson, C., Alving, K., Malinovschi, A. Nasal nitric oxide in relation to asthma characteristics in a longitudinal asthma cohort study. Nitric Oxide 2021;106:1–8.
  3. Thomas, S. R., Kharitonov, S. A., Scott, S. F., Hodson, M. E., Barnes, P. J. Nasal and exhaled nitric oxide is reduced in adult patients with cystic fibrosis and does not correlate with cystic fibrosis genotype. Chest 2000;117(4):1085–9.
  4. Shapiro, A. J. et al. Nasal nitric oxide measurement in primary ciliary dyskinesia. A technical paper on standardized testing protocols. Ann Am Thorac Soc. 2020;17(2):e1–e12 .
  5. Legendre, M., Zaragosi, L. E., Mitchison, H. M. Motile cilia and airway disease. Semin Cell Dev Biol. 2021;110:19–33.
  6. Li, D., Shirakami, G., Zhan, X., Johns, R. A. Regulation of ciliary beat frequency by the nitric oxide–cyclic guanosine monophosphate signaling pathway in rat airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 2000;23(2):175–81.
  7. Rochon, E. R. et al. Cytoglobin regulates NO-dependent cilia motility and organ laterality during development. Nat Commun. 2023;14(1): 8333.
  8. Mikhailik, A. et al. nNOS regulates ciliated cell polarity, ciliary beat frequency, and directional flow in mouse trachea. Life Sci Alliance 2021;4(5):e202000981.
  9. Schamberger, A. C., Staab–Weijnitz, C. A., Mise–Racek, N., Eickelberg, O. Cigarette smoke alters primary human bronchial epithelial cell differentiation at the air–liquid interface. Sci Rep. 2015;5:8163.
  10. Gindele, J. A. et al. Intermittent exposure to whole cigarette smoke alters the differentiation of primary small airway epithelial cells in the air–liquid interface culture. Sci Rep. 2020;10(1):6257.
  11. Ghosh, B. et al. Effect of sub-chronic exposure to cigarette smoke, electronic cigarette and waterpipe on human lung epithelial barrier function. BMC Pulm Med. 2020;20(1):216.
  12. Baldassi, D., Gabold, B., Merkel, O. Air-liquid interface cultures of the healthy and diseased human respiratory tract: promises, challenges and future directions. Adv Nanobiomed Res. 2021;1(6):2000111.
  13. Bessa, M. J. et al. In vitro toxicity of industrially relevant engineered nanoparticles in human alveolar epithelial cells: Air-liquid interface versus submerged cultures. Nanomaterials (Basel) 2021;11(12):3225.
  14. Allouche, Y. et al. Comparison of submerged and air liquid interface exposure: limitations and differences in the toxicological effects evaluated in bronchial epithelial cells. Environ Res. 2025;279(Pt 2):121856.
  15. Li, J., LoBue, A., Heuser, S. K., Leo, F., Cortese-Krott, M. M. Using diaminofluoresceins (DAFs) in nitric oxide research. Nitric Oxide. 2021;115:44–54.
  16. Jiang S. et al. Real–time electrical detection of nitric oxide in biological systems with sub–nanomolar sensitivity. Nat Commun. 2013;4:2225. 
  17. Brown M. D, Schoenfisch M. H. Electrochemical nitric oxide sensors: Principles of design and characterization. Chem Rev. 2019;119(22):11551–75.
  18. Corti, P. et al. Globin X is a six-coordinate globin that reduces nitrite to nitric oxide in fish red blood cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2016;113(30):8538–43.
  19. Zhao, X. J. et al. Mechanisms for cellular NO oxidation and nitrite formation in lung epithelial cells. Free Radic Biol Med. 2013;61:428–37.
  20. Lundberg, J. O. Weitzberg E, Gladwin MT. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2008;7(2):156–67.
  21. Rochon, E. R., Corti, P. Globins and nitric oxide homeostasis in fish embryonic development. Mar Genomics 2020;49:100721.
  22. Giordano, D., Verde, C., Corti, P. Nitric oxide production and regulation in the teleost cardiovascular system. Antioxidants (Basel) 2022;11(5):957.
  23. MacArthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. Measurement of circulating nitrite and S–nitrosothiols by reductive chemiluminescence. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2007;851(1–2):93–105.
  24. Basu, S., Ricart, K., Gladwin, M. T., Patel, R. P, Kim-Shapiro, D. B. Tri-iodide and vanadium chloride based chemiluminescent methods for quantification of nitrogen oxides. Nitric Oxide 2022;121: 11–19.
  25. Brody, S. L., Yan, X. H., Wuerffel, M. K., Song, S. K., Shapiro, S. D. Ciliogenesis and left-right axis defects in forkhead factor HFH-4-null mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 2000;23(1): 45–51.
  26. Jain, R. et al. Temporal relationship between primary and motile ciliogenesis in airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 2010;43(6): 731–9.
  27. Eenjes, E. et al. A novel method for expansion and differentiation of mouse tracheal epithelial cells in culture. Sci Rep. 2018;8(1): 7349.
  28. You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2002;283(6): L1315–21.
  29. Pfeiffer, S., Leopold, E., Schmidt, K., Brunner, F., Mayer, B. Inhibition of nitric oxide synthesis by NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME): requirement for bioactivation to the free acid, NG-nitro-L-arginine. Br J Pharmacol 1996;118(6):1433–40. 
  30. Rochon, E. R., Corti, P., Gladwin, M. T. Hemoglobin α in Pulmonary Endothelium: Ironing Out Nitric Oxide Signaling. Am J Respir Cell Mol Biol. 2017;57(6):639–41.
  31. van Faassen, E. E. et al. Nitrite as regulator of hypoxic signaling in mammalian physiology. Med Res Rev. 2009;29(5):683–741. 

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

GeneeskundeEditie 233Editie 233AlleEditieLege waardeEditie
Meting van stikstofmonoxideproductie in muizen-tracheale epitheelcelculturen, onderscheiden aan de lucht-vloeistofgrens
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.